UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA VETERINARIA
PRÁCTICA: PREPARACIÓN E INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLOGICOS Introdución
La microbiología nace como ciencia con la invención del microscopio y la observación de los primeros microorganismos, mas son el desarrollo de los medios de cultivo y la utilización del agar como solidificante dos importantes puntos de inflexión en su evolución. La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, quien consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio líquido. Koch realizó sus investigaciones utilizando inicialmente rodajas de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las colonias microbianas. En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walther Hesse introduce el agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.
Medios de Cultivo en Microbiología
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en medios artificiales preparados en el laboratorio. El material en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han diseñado más de 10.000 medios de cultivo diferentes, ideados esencialmente con tres fines: el aislamiento, la identificación y el mantenimiento o preservación. Los dos primeros tienen suma importancia en el trabajo diagnóstico. El aislamiento de las bacterias se hace siempre por sembrado en la superficie de una placa de agar incubada en condiciones apropiadas al organismo en cuestión. La finalidad de la siembra es repartir el inóculo de forma que se desarrollen colonias aisladas, las cuales pueden recogerse para la identificación. Las características de las colonias ayudarán a la identificación final, por tanto, es indispensable que se emplée una técnica adecuada para la siembra, incluyendo una buena técnica estéril para evitar la contaminación de los medios de cultivo.
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial, se debe satisfacer una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
1- Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas que proporcionen elementos esenciales como calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos pueden utilizar los aminoácidos y otros compuestos de nitrógeno presentes. En algunas ocasiones se podrá incluir suero, sangre completa, bilis o líquido ascítico entre otras, para promover el crecimiento de los microorganismos exigentes como algunas bacterias patógenas, ya que estas adiciones proporcionarán nutrientes complejos similares a los presentes en el cuerpo del hospedero. En otras ocasiones se podrán incluir carbohidratos para aumentar el valor energético del medio y para detectar reacciones de fementación que faciliten la identificación de los organismos.
2- Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. El agar es un elemento solidificante polisacárido muy empleado para la preparación de medios de cultivo, ya que se licúa completamente durante la esterilización del medio (punto de fusión 85 ºC), pero una vez líquido se solidifica a los 40 ºC. Con mínimas excepciones el agar no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina, un agente solidificante protéico, es menos empleado ya que muchas bacterias no se desarrollan adecuadamente a temperaturas por debajo del punto de fusión de la gelatina (~35 ºC), y que muchas tienen la capacidad de degradarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio. No todos los microorganismo son capaces de crecer en medios sólidos.
3- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno reducida), mientras los anaerobios facultativos son capaces de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. Otros microorganismos pueden requerir concentraciones de CO2 por encima de la concentracion atmosférica.
4- Condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5- Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.
6- pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de lo microorganismos de interes veterinario se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo alterar procesos metabólicos.
7- Temperatura:Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0 ºC y los termófilos a 80 ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertermófilos). En gener, los patógenos humanos y animales crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37 ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
8- Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave, que utiliza temperaturas de 121 ºC a altas presiones para prevenir la ebullición.
Tipos de Medios de Cultivo
1. De acuerdo a su estado físico: Líquidos, semisólidos, sólidos 2. De acuerdo a su utilidad práctica:
a. Medios de transporte: son utilizados para asegurar la viabilidad de la bacteria sin multiplicación significativa de los microorganismos desde el momento de su extracción hasta su posterior estudio. Se utilizan generalmente cuando las muestras deben ser enviadas de un laboratorio a otro. Se recomienda un límite de dos horas desde la recolección de las muestras y su estudio en el laboratorio, pero este límite de tiempo es superado. Esta demora hace necesario el uso de medios de transporte adecuados. Los medios de transporte más frecuentemente utilizados son los de Stuart, Amies y Carey - Blair.
b. Medios para aislamientos primarios: Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos de fácil crecimiento. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc).
c. Medios selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Por ejemplo, la Violeta de Genciana se puede usar como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina).
d. Medios enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).
e. Medios para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein, Leptospira).
f. Medios diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Por ejemplo, el Rojo Fenol se puede usar como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación).
CUESTIONARIO
1. Realice una breve reseña histórica de la diferentes modificaciones ó mejoras de los medios de cultivo para el crecimiento y aislamiento de microorganismos.
2. ¿Por qué son importantes los medios de cultivo en el diagnóstico microbiológico?
3. ¿Por qué es menos frecuente el uso de la gelatina como agente solidificante en la preparación de medios de cultivo?
4. ¿Para que es útil la la gelatina como agente solidificante en la preparación de medios de cultivo?
5. Enumere las condiciones generales para el cultivo de microorganismos.
6. Teniendo en cuenta el concepto de “Disponibilidad de nutrientes adecuados” ¿Cuáles son los productos mas utilizados, para garantizar las condiciones mínimas de crecimiento bacteriano? 7. Teniendo en cuenta el concepto de “Disponibilidad de nutrientes adecuados” ¿Cuáles son los productos mas utilizados, para garantizar las condiciones ideales de crecimiento de bacterias con necesidades nutritivas específicas?
8. ¿En la práctica diagnóstica, en qué casos se usa un medio de cultivo a. Líquido, b. Sólido y c. semisólido?
9. ¿En el laboratorio cómo podemos garantizar las necesidades específicas de a. Tensión de oxígeno, b. pH, c. Temperatura y d. Esterilidad?
10. Mediante un cuadro comparativo, de acuerdo a su utilidad práctica defina la principal utilidad de los diferentes Medios de cultivo.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS 1. PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
Recomendaciones Iniciales:
• Los medios de cultivo comercialmente disponibles se presentan como polvos deshidratados, estériles y deben ser conservados en sus frascos originales con la tapa fuertemente ajustada. • Antes de preparar cualquier medio se debe leer cuidadosamente el rótulo del envase y fijarse
la fecha de vencimiento. Deben prepararse empleando material de vidrio limpio y seco. • Se calcula la cantidad de polvo, de acuerdo a las instrucciones del rótulo del envase y el
volumen total que se desee preparar. Se pesa sobre papel de aluminio y se vuelca en el recipiente en el que será preparado (debe ser un recipiente graduado, caso contrario se medirá el volumen de líquido en otro recipiente auxiliar limpio y graduado). Se le va agregando el agua destilada y se agita vigorosamente hasta obtener una suspensión o solución (si es caldo) homogénea.
• Los caldos suelen dar soluciones transparentes que no necesitan calentamiento ni ninguna otra manipulación antes de ser llevados al autoclave. Las soluciones con agar requieren calentamiento casi hasta ebullición con agitación constante y a fuego suave (o a Baño María o microondas) para lograr su solubilización completa. Se debe observar con cuidado la solución durante el calentamiento ya que una vez que aparecieron las primeras burbujas tiende a desbordar por ebullición. Luego los medios se dosifican teniendo en cuenta el uso que se les dará.
• Los tubos que contengan estas soluciones que serán esterilizadas en autoclave deben contener sólo dos terceras partes de su volumen total ocupado por el líquido para evitar desbordes. Así preparadas las soluciones deben esterilizarse en autoclave (15 minutos a 121
ºC). Una vez retirados del autoclave, los medios deben dejarse enfriar y conservarse así refrigerados.
• Si van a ser utilizados en el momento se colocarán en un baño de agua a 55 ºC para que se enfríen antes de servirlos sobre las placas. Si sobre la superficie de una placa recién preparada aparecieran burbujas, éstas pueden eliminarse al pasar rápidamente la llama del mechero de Bunsen sobre la superficie del agar.
Procedimiento
1. Prepare 50 mL de Medio de cultivo sólido, para servir una caja de petri de 100x20mm, una caja de petri de 150x30mm y un tubo de ensayo (Pico de flauta).
2. Prepare 20 mL de Medio de cultivo líquido (Caldo) para servir un tubo tubo de ensayo. 3. Prepare 15 mL de Medio de cultivo semisólido para servir un tubo tubo de ensayo.
4. Diseñe un diagrama de flujo del procedimiento para la preparación de Medios de Cultivo para el creciemiento y aislameinto bacteriano.
2. INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVO: Familiarizarse con las diferentes técnicas de inoculación e incubación. MATERIALES:
•
Placas de petri con medio de cultivo.•
Tubos con medios sólidos•
Tubos con medios líquidos•
Tubos con medios semisólidos•
Asas bacteriológicas•
Mecheros de Bunsen•
InóculosPROCEDIMIENTO:
a. Siembre en placa (caja de petri) por estrías b. Siembre en medio liquido (caldo).
c. Siembre por punción o puntura, medio semi-sólido (tubo).
d. Siembre en tubos inclinados por punción y agotamiento en superficies e. Incubación
a. INOCULACIÓN EN PLACA (CAJA DE PETRI) POR ESTRÍAS
1.
Quite el tapón de rosca (o el algodón) del tubo que contiene la muestra.2.
Tome con el asa una delgada porción del especimen. La cantidad de inoculo utilizada depende del número de organismos en el espécimen: tiene que ser lo bastante ligera para obtener colonias aisladas.3.
Vuelva a poner el tapón de rosca (o el algodón) en el tubo y póngalo a un lado.4.
Levante la cubierta de la placa de cultivo y haga estrías en una cuarta parte (ver diagrama), más o menos, del área de la superficie. Flamee el asa y déjela enfriar.5.
Repita #4 para cada uno de los cuartos restantes de acuerdo al diagrama.b. INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVOS EN TUBO: Los medios en tubo pueden ser en formas de sólidos de agar, inclinados, caldos o semisólidos. En algunos procedimientos se utiliza el asa de alambre; en otros, la “aguja” recta de inoculación. Para la inoculación de especimenes se emplea generalmente el asa; para la transferencia de cultivos puros, de placas a tubos, la aguja es habitualmente el instrumento elegido.
1. Flamee el asa como se ha descrito anteriormente y déjela enfriar.
2. Quite el tapón de rosca o el algodón del tubo y tome con el asa, una porción del espécimen. 3. Vuelva a colocar el tapón o el algodón en el tubo que contiene el el espécimen.
4. Quite el tapón del tubo que se va a inocular. Cuando se trata de caldo o medios semisólidos, introduzca hacia abajo el asa dentro del medio hasta aproximadamente la mitad de la profundidad. (no debe usarse el agua para pruebas de motilidad). Con medios sólidos inclinados, inserte el asa hasta la base del declive y páselo a lo largo de la superficie del agar desde el fondo hasta la parte superior. Retire al asa y vuelva a colocar el tapón, teniendo cuidado de no golpear o sacudir el alambre contra el tubo. Flamee el asa para esterilizarla. 5. Ponga a incubar.
c. MEDIOS SEMISÓLIDOS: Utilice siempre la aguja recta de transferencia cuando se inocule para la determinación de la motilidad. Proceda al igual que con los medios inclinados normales mencionados anteriormente; quite el tapón del tubo que va a inocular y atraviese el medio aproximadamente hasta la mitad de su profundidad, con un movimiento recto vertical, teniendo cuidado de retirar la aguja a lo largo de la misma senda.
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