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Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y Biotecnología

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Academic year: 2021

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Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y

Biotecnología

Universidad Nacional de San Martín (UNSAM)

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de

Chascomús (IIB-INTECH)

Nombre: Natalia M. Villarreal

Directores: Dres. Pedro M. Civello y Gustavo A. Martínez

“Caracterización de la expresión poligalacturonasa durante la

maduración de variedades de frutilla con diferente velocidad de

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Agradecimientos

· A mis directores, los doctores Marcos Civello y Gustavo Martínez por la

oportunidad de realizar mi tesis doctoral en la UB-4. Muchas gracias por el

trato amable de todos los días, por el apoyo, por conservar la curiosidad y las

ganas de seguir aprendiendo, y por la formación que recibí durante estos años.

· A la UNSAM, por el apoyo recibido. A la ANPCyT y al CONICET por

otorgarme una beca que permitió realizar mi doctorado.

· A todos los compañeros y amigos del INTECH, muchas gracias por compartir

sus conocimientos conmigo, y por los momentos que vivimos. Particularmente

agradezco a Mariela y Juan, Kari y Gustavo, Lis, Juli, Cori, Proli, Ana, Tini,

Lean y Emi. A los queridos amigos que estuvieron siempre aun a la distancia,

Naty y Pochy, y Maru y Diegui.

· A Marie Jean Watson y su hermosa familia (muchas gracias por todo amiga).

· A Claudia, muchísimas gracias por compartir conmigo la enorme cantidad de

cosas que sabés, tanto del laboratorio como de la vida (te admiro mucho

amiga).

· A Teresita y a Tora por su amor siempre alegre.

· A la gente de UB-1/UB-3 por ser tan generosos siempre.

· Al grupo de tenis, gracias a Vero, Anita, María, Caro, Naty, y por supuesto a

nuestro profe Guille, por todos los momentos de risas, distensión (muy

importante) y aprendizaje.

· A Cinty, Pablo, Vane, Ale, Vivi, Juan, Jackie, Manolo, y los nuevos integrantes

por su cariño y por la amistad de tantos, tantos años. A todos los amigos que

están en distintas partes del mundo.

· A mi queridísimo amigo Guille, te extraño siempre, me hacés mucha falta.

· A mis cuñados, cuñadas, sobrinos, tíos y primos, gracias por todo.

· A mi hermana, muchas gracias Marcelita por todo, por cuidarme,

comprenderme y apoyarme siempre, te quiero muchísimo. A Sofía, por ser tan

dulce y alegrar e iluminar nuestras vidas.

· A mi papá por transmitirme su cariño y respeto por el trabajo. A mi mamá por

ser tan dulce, atenta conmigo y con los demás, y un sol para mi vida. Gracias a

ambos por el enorme apoyo de siempre. Y gracias a Brisa por estar siempre a

mi lado.

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Publicaciones

Parte de los resultados presentados en esta tesis han sido publicados en revistas internacionales y presentados como comunicaciones a congresos.

Revistas científicas:

§ Villarreal, N.M., Rosli, H.G., Martínez, G.A., Civello, P.M. 2008. “Polygalacturonase activity and expression of related genes during ripening of strawberry cultivars with contrasting fruit firmness”. Postharvest Biology and Technology 47, 141-150.

§ Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M. 2009. “Influence of plant growth regulators on polygalacturonase expression in strawberry fruit”. Plant Science 176, 749-757.

§ Villarreal, N.M., Bustamante, C.A., Civello, P.M., Martínez, G.A. 2009. “Effect of ethylene and 1-MCP treatments on strawberry fruit ripening”. Journal of the Science of Food and Agriculture (Enviado, los dos primeros autores contribuyeron de igual manera a este trabajo).

Congresos:

§ Segundas Jornadas de Biología y Tecnología de Post-Cosecha. 26-27 de agosto de 2004. Chascomús. “Estudio comparativo del metabolismo

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de pectinas durante la maduración de variedades de frutilla con diferentes niveles de firmeza”. Rosli, H.G., Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 22-24 de septiembre de 2004. Santa Rosa. “Metabolismo de pectinas durante la maduración de frutillas”. Rosli, H., Villarreal, N., Martínez, G., Civello, M.

§ Congreso Internacional “Post Harvest Fruit: the path to success”. 7-11 de noviembre de 2004. Talca, Chile. “Differential expression of genes and enzymes involved in cell wall degradation during ripening of strawberry cultivars”. Martínez G.A., Rosli H.G., Villarreal N.M., Bustamante C., Dotto M.C., Civello P.M.

§ XLI reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). 3-6 de diciembre de 2005. Pinamar. “Cloning of two putative polygalacturonase genes and analysis of their expression during rimpening of strawberry cultivars with contrasting firmness fruits”. Villarreal, N.M.; Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXVI Reunión de la Asociación Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 4-6 de octubre de 2006. Chascomús. “Efecto de reguladores del crecimiento en la expresión de genes de poligalacturonasa de frutilla y caracterización de la actividad enzimática correspondiente”. Villarreal, N.M., Martínez G.A., Civello, P.M.

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§ IV Jornadas de Biología y Tecnología de Postcosecha y Primeras Jornadas de Postcosecha del Cono Sur. 5-6 de julio de 2007. Buenos Aires. “Análisis del efecto de diferentes reguladores del crecimiento sobre la expresión de genes de poligalacturonasa de frutilla”. Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXVII reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 21-24 de septiembre de 2008. Rosario. “Influencia del etileno el contenido de pigmentos, azúcares y compuestos fenólicos, y actividad de enzimas de degradación de pared celular de frutilla”. Bustamante, C.A., Villarreal, N.M., Civello, P.M., Martínez, G.A.

§ XLIV reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). 8-11 de noviembre de 2008. Córdoba. “Polygalacturonase on strawberry fruit ripening. Effects of plant growth regulators”. Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

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Índice

Índice

Índice 1

Abreviaturas 5

Neologismos y términos tomados del inglés 7

1. Resumen 9

2. Introducción general 12

2.1. El fruto de frutilla 13

2.1.1. Crecimiento 15

2.1.2. Desarrollo y maduración 15

2.1.3. Cambios en la estructura y composición durante la maduración 16

2.1.3.1. Azúcares 16

2.1.3.2. Ácidos 17

2.1.3.3. Fenoles y pigmentación 18

2.1.4. Actividad respiratoria y acción hormonal 20

2.2. Pared celular vegetal 22

2.2.1. Componentes principales de la pared celular vegetal 23

2.2.2. Metabolismo de la pared celular durante la maduración de frutos 27 2.2.2.1. Principales proteínas con o sin actividad enzimática que modifican

polímeros de la pared celular 29

2.2.2.1.1. Proteínas sin actividad enzimática conocida 29

2.2.2.1.2. Enzimas que actúan sobre hemicelulosas 30

2.2.2.1.3. Enzimas que actúan sobre cadenas laterales 31

2.2.2.1.4. Enzimas que actúan sobre pectinas 32

2.3. Características generales de las poligalacturonasas 33

2.3.1. Familias génicas 34

2.3.2. Poligalacturonasas y maduración de frutos 35

2.3.2.1. Poligalacturonasas y maduración de frutilla 39

3. Hipótesis de trabajo y objetivos 41

3.1. Hipótesis de trabajo 41

3.2. Objetivo general 41

3.3. Objetivos particulares 41

4. Materiales y Métodos 42

4.1. Material Vegetal 42

4.2. Determinación de la actividad poligalacturonasa (PG) 42

4.3. Extracción de ADN genómico 44

(8)

Índice

4.5. Cuantificación de ARN 47

4.6. Análisis de ARN total 47

4.7. Transcripción reversa 48

4.8. Reacciones de RT-PCR 49

4.9. Visualización de los productos de PCR 49

4.10. Purificación de los productos amplificados y cuantificación de ADN 50

4.11. Ligación de los productos de PCR 50

4.12. Obtención de células competentes 51

4.13. Transformación de células competentes 52

4.14. Extracción de ADN plasmídico 52

4.15. Reacciones empleando enzimas de restricción 54

4.16. Ensayos de Northern-blot 54

4.16.1. Transferencia de ARN a membranas de nailon 54

4.16.2. Preparación de las sondas a utilizar 55

4.16.2.1. Sonda para poligalacturonasas 55

4.16.2.2. Sonda para ARNr 18s 55

4.16.2.3. Marcado de sondas 56

4.16.3. Hibridación de membranas 57

4.17. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa 57

4.18. Obtención de las secuencias completas de FaPG1 y T-PG 59

4.19. Secuenciación y análisis bioinformático de los clones obtenidos 60

4.20. Construcción de un árbol filogenético 60

4.21. Números de acceso 61

4.22. Expresión heteróloga 62

4.22.1. Purificación de la proteína recombinante FaPG1 62

4.22.2. Producción del antisuero anti-FaPG1 y purificación del anticuerpo 63

4.22.3. Western-blot 64

4.22.4. Ensayo de deglicosilación 65

4.23. Cuantificación de proteínas 66

4.24. Tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal 66

4.25. Antocianinas 68

4.26. Clorofilas 69

4.27. Contenido de azúcares reductores y totales 69

4.28. Compuestos fenólicos totales 70

4.29. Actividad fenilalanina amonio liasa (PAL) 70

4.30. Análisis estadístico 71

(9)

Índice 5. Capítulo I. Análisis de la expresión y actividad poligalacturonasa durante la maduración de cultivares de frutilla con niveles de firmeza contrastantes 73

5.1. Introducción 73

5.2. Resultados 75

5.2.1. Actividad Poligalacturonasa 75

5.2.2. Análisis de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de

frutilla 77

5.2.2.1 Clonado de los ADNc completos de FaPG1 y T-PG 77

5.2.2.2. Obtención de sondas para poligalacturonasa 81

5.2.2.3. Ensayos de Northern-blot 82

5.2.2.4. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa 83

5.2.3. Acumulación de la proteína FaPG1 durante la maduración de frutilla 86

5.2.4. Análisis filogenético 90

5.3 Discusión 93

5.4. Conclusiones 100

6. Capítulo II. Análisis del posible fenómeno de splicing alternativo en el gen

FaPG1 101

6.1. Introducción 101

6.1.1. Corte y empalme del ARNm precursor (pre ARNm) 101

6.1.2. Propiedades de los intrones de plantas 103

6.2. Resultados 113

6.2.1. Comparación de las secuencias no traducidas 5´ y 3´ de FaPG1 y

T-PG 113

6.2.2. Acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG durante la maduración

de cultivares de frutilla con diferente velocidad de ablandamiento. 117 6.2.3. Análisis del intrón II de FaPG1 en cultivares con niveles de firmeza

contrastantes 119

6.3. Discusión 122

6.4. Conclusiones 127

7. Capítulo III. Influencia de reguladores del crecimiento vegetal en la

expresión poligalacturonasa de frutilla. 128

7.1. Introducción 128

7.2. Resultados 130

7.2.1. Tratamiento con auxinas y giberelinas 130

7.2.2. Tratamiento con ácido abscícico 134

(10)

Índice

7.2.4. Tratamiento con etileno 137

7.2.4.1. Efecto del etileno sobre la expresión PG 137

7.2.4.2. Efecto del etileno sobre parámetros de la calidad del fruto 140

7.2.4.2.1. Antocianinas, clorofilas y actividad PAL 141

7.3. Discusión 145

7.4. Conclusiones 152

8. Conclusión general 153

(11)

Abreviaturas

Abreviaturas

1-MCP: 1-metilciclopropeno

32P-dATP: desoxiadenosina trifosfato marcada con 32P

α-ara: α-arabinofuranosidasa β-xil: β-xilosidasa

ABA: ácido abscísico

AcH/NaAc: ácido acético/acetato de sodio ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario ARN: ácido ribonucleico

ARNm: ácido ribonucleico mensajero ASB: albúmina sérica bovina

ATP: adenosina trifosfato cps: cantidad suficiente para

CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio DEPC: dietil pirocarbonato

DMF: dimetilformamida DMSO: dimetilsulfóxido DO: densidad óptica DTT: ditiotreitol

EDTA: ácido etilendiaminotetracético ETEFÓN: ácido 2-cloroetilfosfónico GA3: ácido giberélico

IAA: ácido 3-indol acético

(12)

Abreviaturas LB: medio Luria Bertani

NAA: ácido naftalén acético PAL: fenilalanina amonio-liasa pb: pares de bases

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction) PEG: polietilenglicol

PG: poligalacturonasa PL: pectato liasa

PME: pectin metilesterasa

PMSF: fluoruro de fenilmetil sulfonilo ppm: parte por millón

PVP: polivinil pirrolidona PVPP: polivinil polipirrolidona

RT-PCR: transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (reverse transcription and polimerase chain reaction)

SDS: dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

(13)

Neologismos y términos tomados del inglés

Neologismos y términos tomados del inglés

Buffer: solución reguladora de pH, constituida por un par ácido-base

conjugados.

Contig: secuencia de ADN resultante del solapamiento de fragmentos

contiguos provenientes de un mismo gen.

Enhancer: potenciador.

ESTs (expressed sequences tag): secuencias de ADN expresadas.

Non-sense mediated decay (NMD): decaimiento sin sentido del ARNm.

Northern-blot: técnica para medir cantidad y tamaño aproximado de un

transcripto específico en una mezcla compleja mediante hibridación a una sonda complementaria de ADN o ARN marcada.

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends): amplificación rápida de los

extremos de ADNc.

Spliceosoma: complejo macromolecular responsable del corte y empalme del

pre ARNm.

(14)

Neologismos y términos tomados del inglés

Southern-blot: técnica para detectar uno o varios fragmentos específicos de

ADN en una población mediante hibridación a una sonda complementaria de ácido nucleico marcado.

UTR (untranslated region): region no traducida.

Western-blot: técnica para detectar proteínas específicas de una mezcla

(15)

Resumen

1. Resumen

La pared celular vegetal es una estructura dinámica que presenta cambios durante la diferenciación y el desarrollo de los diferentes órganos de las plantas. El ablandamiento que tiene lugar durante la maduración de los frutos carnosos se encuentra asociado con la degradación de los diferentes componentes de la pared.

Los frutos de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch) poseen una elevada

velocidad de ablandamiento, la cual contribuye a su rápido decaimiento post-cosecha. Las bases bioquímicas de la degradación de la pared celular de estos frutos no se encuentran claramente establecidas aun, y se han informado resultados contradictorios en diferentes cultivares. Es probable que la mayor contribución al proceso de ablandamiento, y a las diferencias de textura observadas entre variedades, provenga de la expresión y actividad diferencial de genes y proteínas asociados con la degradación de la pared, tales como poligalacturonasas (PGs), β-xilosidasas, expansinas, pectato liasas, etc.

Un mecanismo importante de regulación de la expresión génica, es el fenómeno de corte y empalme alternativo del pre-ARN mensajero (splicing alternativo). En plantas, dicho proceso se encuentra asociado a funciones biológicas, tales como crecimiento y desarrollo, respuestas a estrés biótico y abiótico, resistencia a enfermedades, tiempo de floración, etc. Con respecto al rol del splicing alternativo en el desarrollo y maduración de frutos, se reportó la presencia de variantes de splicing en manzana, durazno, y papaya.

En este trabajo de tesis se aislaron dos ADNc completos a partir de frutos de frutilla. Dichos clones, denominados FaPG1 y T-PG, son homólogos

(16)

Resumen a genes de poligalacturonasas de plantas. De acuerdo a nuestras observaciones, la expresión diferencial de ambos clones estaría asociada al ablandamiento de frutillas, y a las diferencias de textura observadas entre cultivares. Se determinó que el gen FaPG1 sufre un evento de splicing

alternativo que conduce a la formación de las variantes FaPG1 y T-PG

(números de acceso DQ458990 y DQ458991, respectivamente). La variante

FaPG1 codifica una proteína funcional (FaPG1), y tanto la acumulación del

mensajero como de la proteína fue mayor, y mas temprana, durante la maduración de un cultivar que produce frutos blandos con respecto a un cultivar que produce frutos más firmes. Asimismo, la variante T-PG codificaría

una proteína más corta que FaPG1, la cual carecería del sitio catalítico y los sitios de N-glicosilación predichos para PGs de plantas. Esta variante de splicing se acumula en mayor medida durante la maduración de cultivares que producen frutos mas firmes.

Por otra parte, se observó que la expresión y actividad poligalacturonasa podría encontrarse bajo la influencia de reguladores del crecimiento vegetal. El tratamiento con ácido naftalén acético (NAA) redujo la expresión de FaPG1 y T-PG, la acumulación de la proteína FaPG1, y

disminuyó la actividad PG. El tratamiento con ácido giberélico (GA3) produjo

efectos similares al NAA, si bien no fueron tan marcados. La aplicación de ácido abscísico (ABA) incrementó ligeramente la expresión de PG, pero no modificó significativamente la actividad enzimática. Por otra parte, la

acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG se incrementó

considerablemente en respuesta a los tratamientos con etileno y NO. Los datos de Western-blot confirmaron estas tendencias, si bien la actividad PG

(17)

Resumen total no se modificó significativamente por estos tratamientos. Sin embargo, la aplicación de 1-MCP (un inhibidor de la percepción del etileno) redujo la actividad y expresión PG, sugiriendo que el etileno podría desempeñar un rol en la regulación de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de frutilla.

(18)

Introducción general

2. Introducción general

Los frutos son de vital importancia para la mayoría de las plantas ya que protegen a las semillas durante su desarrollo, y posteriormente facilitan la dispersión de las mismas. Son importantes además para la alimentación de los animales en general, y constituyen un componente esencial de la dieta de los seres humanos.

Mientras que la relevancia de los frutos secos radica mayormente en las semillas que contienen, en el caso de los frutos carnosos son los frutos en sí mismos los que poseen un valor nutricional y económico intrínseco.

La maduración de los frutos puede definirse como un conjunto de procesos físico-químicos que ocurren entre la finalización del desarrollo y el principio de la senescencia, los cuales conducen a cambios en la textura, aroma, sabor y color de los mismos. Este es el caso de frutos como tomate, sin embargo en frutos como frutilla, la división entre desarrollo y maduración no se encuentra claramente definida. Por lo tanto, la maduración puede considerarse como un proceso de desarrollo continuo, en el cual varias etapas fisiológicas pueden estar solapadas (Manning, 1993).

Los frutos carnosos son susceptibles al deterioro postcosecha (ya sea por un ablandamiento excesivo o por el ataque de patógenos), lo que dificulta el almacenamiento de los mismos y conduce a importantes pérdidas económicas. Por esta razón, se realiza un gran esfuerzo para intentar comprender los mecanismos moleculares y bioquímicos que regulan la maduración de los frutos carnosos. Tal conocimiento se considera particularmente útil para retrasar o, posiblemente, controlar este importante

(19)

Introducción general

2.1. El fruto de frutilla

La frutilla (género Fragaria, familia Rosacea) es un fruto carnoso que

suele agruparse dentro de los denominados frutos blandos, junto con las moras, arándanos, frambuesas y grosellas. En general, dichos frutos son de tamaño pequeño, tienen una textura delicada y poseen un tiempo de vida post-cosecha corto. Desde el punto de vista botánico, la frutilla es un fruto agregado o fruto falso, originado a partir de la expansión y desarrollo del tejido denominado receptáculo (Coombe, 1976). Un número variable de aquenios o frutos verdaderos se encuentran ubicados en la capa epidermal del receptáculo y se conectan con el interior del mismo a través de fibras vasculares (Lis y Antoszewski, 1979). Los aquenios son considerados una combinación de tejido ovárico y semilla (Darrow, 1966). La parte comestible de la frutilla es el receptáculo, el cual se desarrolla a partir de la base de la flor (Perkins-Veazie, 1995) (Figura 1). Receptáculo Aquenio Haz vascular (A) (B) Receptáculo Aquenio Haz vascular Receptáculo Receptáculo Receptáculo Aquenio Haz vascular Aquenio Haz vascular Aquenio Aquenio Haz vascular Haz vascular (A) (B)

Figura 1: (A) fruto de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch) entero donde se señala el tejido

correspondiente al receptáculo y el aquenio; (B) corte longitudinal de un fruto en el que se indica el tejido vascular y el aquenio.

(20)

Introducción general En la actualidad se cree que existen en el mundo alrededor de 20 especies del género Fragaria, las cuales se agrupan de acuerdo a su ploidía

en: diploide (2n= 14), tetraploide (4n= 28), hexaploide (6n= 42) y octaploide (8n= 56) (Staudt, 1989). Entre las especies más importantes puede mencionarse:

- Fragaria vesca, especie diploide nativa de las regiones templadas de

Eurasia y Norteamérica. Posee frutos pequeños y aromáticos.

- Fragaria virginiana, especie octaploide nativa de Norteamérica. Por el

tamaño y sabor de sus frutos se hizo popular entre las tribus nativas y entre los colonos europeos. A partir del año 1620 comenzó a ser cultivada en Europa.

- Fragaria chiloensis, especie octaploide nativa de Alaska y California.

Posteriormente comenzó a colonizar ciertas áreas de Hawai, Chile y Argentina. Las tribus araucanas de Chile domesticaron esta especie antes de la llegada de los colonos españoles, seleccionando las variedades que presentaran frutos de mayor tamaño. Los españoles introdujeron esta especie en Europa en 1700.

- Fragaria x ananassa (o frutilla moderna), es una especie octaploide, y

un híbrido entre Fragaria virginiana (seleccionada por sus frutos

sabrosos) y Fragaria chiloensis (seleccionada por el gran tamaño de

sus frutos). Por la calidad y tamaño superior de sus frutos, es en la actualidad la principal especie cultivada y comercializada. Existe una gran cantidad de variedades de frutilla, entre las que podemos

(21)

Introducción general mencionar: Camarosa, Pájaro, Toyonoka, Aroma, Selva, Cal Giant 3, Cal Giant 4, Chandler, Elsanta, etc.

2.1.1. Crecimiento

Durante el desarrollo, los frutos presentan cinéticas de crecimiento variables entre distintos cultivares de frutilla. En algunos casos son sigmoideas simples, caracterizadas por un crecimiento inicial lento seguido por una fase exponencial y luego un periodo en el que la velocidad de crecimiento declina (Bollard, 1970; Woodward, 1972), y en otros casos son doble sigmoideas, caracterizadas por dos periodos de crecimiento rápido con una fase intermedia de crecimiento lento (Coombe, 1976; Perkins-Veazie y Huber, 1987). En ambos casos, el desarrollo del fruto ocurre rápidamente y llega al tamaño máximo aproximadamente 30 días después de la antesis (Manning, 1993).

2.1.2. Desarrollo y maduración

En frutilla, el crecimiento del receptáculo luego de la caída de los pétalos se produce inicialmente debido a una combinación de división y expansión celular. La proliferación de las células se completa aproximadamente a los 7 días y posteriormente el crecimiento se produce por un incremento en el volumen celular, el cual aumenta alrededor de 1000 veces durante el desarrollo (Knee y col., 1977).

Los diferentes estadios de desarrollo y maduración suelen clasificarse según el tamaño y color superficial del fruto. De esta forma, se denominan verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50%

(22)

Introducción general rojo (50% R), 75% rojo (75% R), 100% rojo (100% R) y sobremaduro. Estos últimos cinco estadios se refieren al porcentaje aproximado de superficie del fruto que presenta coloración roja (Figura 2).

2.1.3. Cambios en la estructura y composición durante la maduración

2.1.3.1. Azúcares

Al igual que otros frutos, las frutillas actúan como un sumidero para la acumulación de los productos fotosintéticos generados en las hojas (Lis y Antoszewski, 1979). Durante el desarrollo del fruto, una gran proporción de fotosintatos es exportada desde las hojas hacia el receptáculo y una proporción menor es dirigida hacia los aquenios (Nishizawa y Hori, 1988).

La sacarosa es el principal carbohidrato transportado al fruto (Forney y

50% R 75% R 100% R Sobremaduro VP VG B 25% R 50% R 75% R 100% R Sobremaduro VP VG B 25% R 50% R 75% R 100% R Sobremaduro VP VG B 25% R VP VG B 25% R

Figura 2: Clasificación de los estadios de desarrollo y maduración de frutos de frutilla de acuerdo al tamaño y color superficial de los mismos.

(23)

Introducción general Breen, 1985a) y, en general, las velocidades de crecimiento se correlacionan con las velocidades de captura de sacarosa (Forney y Breen, 1985b). En frutos maduros, sacarosa, glucosa y fructosa constituyen más del 99% de los azúcares totales solubles, mientras que sorbitol, xilitol y xilosa se encuentran en muy bajos niveles (Manning, 1993; Cordenunsi y col., 2002). Se reportó que el almidón se acumula durante las etapas muy tempranas del desarrollo del fruto (7 días después de la caída de los pétalos), y que la degradación de los gránulos de almidón predomina fuertemente durante el crecimiento del receptáculo y en la maduración del mismo (Knee y col., 1977; Souleyre y col., 2004). Se cree que el almidón es utilizado en las primeras etapas del crecimiento del fruto hasta que los aquenios estén desarrollados. Posteriormente, éstos inducen la rápida asimilación de nutrientes desde la planta (Perkins-Veazie, 1995). Se observó que los frutos no acumulan cantidades apreciables de azúcares después de la cosecha, ya que en frutos maduros la degradación de almidón solo aportaría alrededor del 3% del azúcar total (Cordenunsi y col., 2003; Souleyre y col., 2004). Por otra parte, si bien los frutos verdes poseen la capacidad de realizar fotosíntesis, aún no se determinó si este proceso contribuye a la acumulación de carbohidratos (Perkins-Veazie, 1995).

2.1.3.2. Ácidos

Los ácidos orgánicos determinan el pH del fruto y contribuyen a la estabilidad del color del mismo. Al igual que los azúcares, son componentes importantes del sabor, y la relación ácido/azúcar es usada frecuentemente

(24)

Introducción general como un índice de la calidad del fruto (Manning, 1993).

En frutilla, los ácidos principales son cítrico, málico y ascórbico, los cuales son secuestrados en vacuolas y pueden ser utilizados en el proceso de respiración o convertidos en azúcares (Perkins-Veazie, 1995). La acidez total se incrementa durante el desarrollo hasta el estadio verde grande y luego disminuye hasta un mínimo en el estadio sobremaduro, debido principalmente a una reducción en el contenido de ácido málico (Manning, 1993). El pH de los frutos maduros varía entre cultivares, en un rango de 3,6 a 4,1 (Cordenunsi y col., 2003).

2.1.3.3. Fenoles y pigmentación

En la actualidad se considera que una dieta rica en frutas y vegetales está asociada con un menor riesgo de sufrir enfermedades mediadas por un estrés oxidativo tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas (Lampe, 1999; Zern y Fernández, 2005; Yeh y col., 2009). Los efectos beneficiosos de las frutas y verduras para la salud son atribuidos, en gran medida, a los elevados niveles de compuestos fenólicos, los cuales comprenden un grupo diverso de sustancias, incluyendo entre otros a polifenoles (taninos), pro-antocianinas (taninos condensados) y ésteres de ácidos hidrobenzoico e hidroxicinámico (Manning, 1993). Frutos como frutilla, frambuesa y arándano, contienen en general niveles elevados de compuestos fenólicos (Kahkonen y col., 2001), y en el caso particular de frutilla, los principales compuestos fenólicos identificados son: ácido elágico, ácido gálico, flavonoides y ácido hidroxicinámico (Seeram y col., 2006). Se reportó que las

(25)

Introducción general frutillas poseen propiedades antioxidantes, anticancerígenas, antiinflamatorias y antineurodegenerativas (Hannum, 2004), si bien el contenido de antioxidantes y la calidad nutricional de los frutos (aporte de vitaminas y minerales) dependería de cada cultivar (da Silva Pinto y col., 2008; Tulipani y col., 2008). El contenido total de compuestos fenólicos decrece continuamente durante la maduración de frutilla, y la disminución más significativa se reportó desde el estadio verde pequeño al blanco (Spayd y Morris, 1981; Martínez y col., 2001).

Con respeto a los flavonoides, estos constituyen un grupo de metabolitos secundarios sintetizados a partir de una molécula de fenilalanina y tres moléculas de malonil-CoA, a través de lo que se conoce como "vía biosintética de los flavonoides". La unidad estructural de los flavonoides es una chalcona, y la acción de la enzima isomerasa la convierte en una flavanona. El esqueleto básico C6-C3-C6, puede sufrir posteriormente muchas modificaciones y adiciones de grupos funcionales, por lo que los flavonoides son una familia muy diversa de compuestos, aunque todos los productos finales se caracterizan por ser polifenólicos y solubles en agua (Winkel-Shirley, 2001).

Los principales flavonoides presentes en frutilla son las antocianinas, pigmentos hidrosolubles de localización vacuolar, responsables del color rojo de los frutos (Woodward, 1972). Las antocianinas actúan además como agentes antioxidantes, y la cuantificación de las mismas se utiliza habitualmente como un parámetro para evaluar el progreso de la maduración de los frutos. Las antocianinas son sintetizadas por la ruta de los fenilpropanoides, siendo la conversión de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico

(26)

Introducción general la etapa inicial y una de las etapas reguladoras en la vía de los fenilpropanoides. Esta reacción implica la eliminación de un grupo amino catalizada por L-fenilalanina-amonio-liasa (PAL), una enzima clave en la biosíntesis de compuestos fenólicos (Jones, 1984). La acumulación de antocianinas en frutos maduros de frutilla se correlaciona con una elevada actividad PAL (Given y col., 1988a). La síntesis de antocianinas comienza en el estadio blanco y alcanza su máximo aproximadamente 30 días después de la antesis (Cheng y Breen, 1991).

2.1.4. Actividad respiratoria y acción hormonal

Los frutos pueden ser clasificados como climatéricos y no-climatéricos de acuerdo a su actividad respiratoria y producción de etileno. Los frutos climatéricos (tomate, banana, manzana, etc.) presentan una gran actividad respiratoria y un pico en la producción de etileno durante su maduración (Fan y col., 1998; Liu y col., 1999; Alexander y Grierson, 2002). El etileno es una hormona que desempeña un papel esencial en la regulación de la maduración de los frutos climatéricos (Giovannoni, 2001). En tomate, la aplicación exógena de etileno acelera el inicio de la maduración, induciendo un aumento tanto en la síntesis de pigmentos como en la actividad de enzimas asociadas con la maduración (Grierson y Tucker, 1983), mientras que la aplicación de inhibidores de la percepción de dicha hormona (como el tiosulfato de plata o el 1-MCP), produce el efecto contrario (Hobson y col., 1984, Hobson y Grierson, 1993, Mostolfi y col., 2003).

(27)

Introducción general ejemplo, cítricos, uvas y pimientos) debido a que no presenta un incremento notorio en la producción de etileno y prácticamente no muestra cambios en la actividad respiratoria a medida que el fruto madura (Abeles y Takeda, 1990).

Sin bien las auxinas son importantes para el crecimiento y la expansión del receptáculo, son también las hormonas claves que regulan la maduración de frutilla ejerciendo un efecto inhibitorio (Given y col., 1988b). Estas hormonas son producidas en los aquenios, y transportadas al receptáculo a través de la extensa red de haces vasculares. Se reportó que la expresión de muchos genes específicos de la maduración puede ser regulada negativamente mediante la aplicación exógena de auxinas (Manning, 1994; Aharoni, 2002). La auxina de mayor importancia biológica detectada en frutillas es el ácido 3-indol-acético (IAA), si bien existen derivados del mismo tanto en los aquenios como en el receptáculo. El contenido de la forma libre del IAA alcanza un máximo 14 días después de la antesis y luego disminuye marcadamente a partir del día 17 (Archbold y Dennis, 1984). Se comprobó que cuando los aquenios son removidos de la mitad de un fruto verde, se produce un aumento en la velocidad de maduración en la mitad deaquenada, que se manifiesta a través de un incremento en la velocidad de degradación de clorofilas, acumulación de antocianinas e inducción de PAL (Given y col., 1988b, Manning, 1994). Este efecto puede ser revertido mediante la aplicación de auxinas sintéticas, como el ácido 1-naftalen-acético (NAA), sobre la superficie sin aquenios del fruto (Given y col., 1988b).

La información respecto a la regulación de la maduración de frutos no climatéricos es escasa, pero los datos disponibles indicarían que no existe un único modelo de regulación hormonal para todos estos frutos. En el caso de

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Introducción general frutilla, no parece haber un único regulador que desempeñe un papel positivo análogo al desempeñado por el etileno en los frutos climatéricos. Inclusive, no se descarta la influencia del etileno en la maduración de este fruto, y se sugirió que una pequeña cantidad de etileno producida por los frutos de frutilla, podría ser suficiente para disparar respuestas fisiológicas relacionadas con la maduración (Tian y col., 1997; Trainotti y col., 2005).

Otros reguladores del crecimiento vegetal son el ácido giberélico y el ácido abscísico. Se ha reportado que el ácido giberélico tiene un efecto inhibitorio en la maduración de frutilla, evidenciado por un retraso en la síntesis de antocianinas y en la degradación de clorofilas (Martínez y col., 1994). Con respecto al ácido abscísico (ABA), se sugirió que el ABA endógeno podría jugar un papel en el desarrollo de color de frutilla a través de la regulación positiva de la síntesis de etileno y la actividad PAL (Jiang y Joyce, 2003). Por otro lado, la aplicación de óxido nítrico (NO), una molécula involucrada en diversos procesos fisiológicos (Leshem y Haramaty, 1996; Leshem y Pinchasov, 2000; Neill y col., 2002; Gniazdowska y col., 2007), podría extender la vida postcosecha de frutos de frutilla maduros (Wills y col., 2000; Zhu y Zhou, 2007).

2.2. Pared celular vegetal

La pared celular de las plantas es una estructura que determina la forma de las células y las mantiene unidas, provee fuerza mecánica y rigidez, y actúa como una barrera contra el ataque de patógenos. La pared celular primaria (característica de células en crecimiento) es una red de microfibrillas

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Introducción general de celulosa (donde regiones altamente cristalinas alternan con regiones menos organizadas) embebida en una matriz hidrofílica de hemicelulosas y pectinas (Cosgrove, 1998). En plantas dicotiledóneas, la composición general de la pared celular primaria es aproximadamente: 30% de celulosa, 30% de hemicelulosas, 35% de pectinas y 5% de proteínas estructurales, aunque en paredes celulares de frutos el contenido de pectinas puede ser sustancialmente mayor y el de proteínas menor (Knee y Bartley, 1981; Fry, 1988).

2.2.1. Componentes principales de la pared celular vegetal

Celulosa: es un polímero lineal formado por residuos de D-glucosa

unidos por enlaces glicosídicos b-(1®4). Estos glucanos lineales se asocian entre sí mediante enlaces por puente de hidrógeno para formar microfibrillas de al menos 36 cadenas de glucano. La celulosa otorga resistencia mecánica a la pared celular vegetal (Carpita, 1987).

Hemicelulosas: constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos

flexibles y fuertemente unidos a través de enlaces por puente de hidrógeno a la superficie de las microfibrillas de celulosa (Varner y Lin, 1989). Las hemicelulosas pueden unirse a dos microfibrillas de celulosa adyacentes de tal manera de formar una red y evitar, por otro lado, contactos directos entre las mismas.

Algunas hemicelulosas pueden quedar atrapadas dentro de las microfibrillas de celulosa, disminuyendo el ordenamiento cristalino de las

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Introducción general mismas (Hayashi, 1989).

En paredes celulares primarias de plantas dicotiledóneas, la principal hemicelulosa es el xiloglucano, un polímero formado por un esqueleto de residuos de D-glucosa en uniones b-(1®4), al igual que la celulosa, pero sustituido de forma regular por cadenas cortas de a-D-xilosa, b-D-galactosa y a-L-fucosa en el carbono 6 de los residuos de glucosa del esqueleto de glucano (Fry, 1988). En una proporción mucho menor se encuentran presentes otras hemicelulosas que incluyen: xilanos (formados por un esqueleto de D-xilosa en uniones b-(1®4), el cual puede contener ramificaciones de arabinosa u otros azúcares), glucomananos y galactomananos (Fischer y Bennet, 1991).

Pectinas: constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos que se

caracterizan por contener azúcares acídicos, tales como ácido galacturónico, y azúcares neutros, tales como ramnosa, galactosa y arabinosa. Las pectinas son los polisacáridos más solubles de la pared celular, y pueden ser extraídas con agua caliente, agentes quelantes o ácidos diluidos (Fischer y Bennett, 1991).

Las pectinas más importantes de la pared celular vegetal son:

- Homogalacturonanos: son polímeros lineales formados por residuos de

ácido D-galacturónico en uniones a-(1®4). El grupo carboxilo del C6 puede estar esterificado con un grupo metilo. El proceso de de-esterificación permite que las pectinas formen geles hidratados, en los cuales los grupos carboxilatos de moléculas de homogalacturonanos vecinas se unen iónicamente a través de puentes de Ca2+ en intervalos regulares (Fry, 1988).

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Introducción general constituidas por un largo esqueleto de subunidades repetidas de disacáridos (1®2)-a-L-ramnosil-(1®4)-a-D-galacturónico, con largas cadenas laterales de arabinanos y arabinogalactanos unidas a los residuos de ramnosa (Brummell y Harpster, 2001).

- Ramnogalacturonanos II (RG II): son heteropolímeros altamente

complejos formados por un esqueto de (1®4)-a-D-galacturónico, como los homogalacturonanos, pero con complejas cadenas laterales integradas por varios tipos de azúcares neutros. Los RG II son componentes minoritarios de la pared celular vegetal, pero la complejidad de los mismos sugiere que éstos podrían tener otras funciones además de la estructural, pudiendo actuar como moléculas de señalización celular (Brummell y Harpster, 2001; Cosgrove, 1998).

Proteínas estructurales: la pared celular vegetal contiene varios tipos de

proteínas estructurales, las cuales son clasificadas usualmente por su composición predominante de aminoácidos en, por ejemplo, glicoproteínas ricas en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, etc. Estas proteínas presentan grandes variaciones en su abundancia dependiendo del tipo celular, del estadio de desarrollo y de la estimulación previa que haya recibido la planta (heridas, ataque por patógenos, etc.) (Cosgrove, 1998).

El modelo de arreglo tridimensional de pared celular vegetal primaria actualmente más aceptado se representa en la figura 3. Este modelo postula que la pared está formada por microfibrillas de celulosa recubiertas y entrecruzadas por las hemicelulosas de la matriz, principalmente por

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Introducción general xiloglucano, el cual se une fuertemente a la celulosa a través de enlaces de hidrógeno. Las moléculas de hemicelulosas pueden unir distintas microfibrillas de celulosa adyacentes, actuando como puente y contribuyendo a que las mismas se mantengan unidas. Las otras hemicelulosas, como xilanos, glucomananos y galactomananos están presentes en cantidades menores y entrecruzan a las microfibrillas mediante puentes de hidrógeno, aunque de forma más débil que el xiloglucano. Los espacios en la red de celulosa/matriz de glicano están rellenos por pectinas altamente hidratadas, las cuales también forman una red que se mantiene unida por enlaces covalentes del tipo éster, por enlaces por puente de hidrógeno y por interacciones de tipo iónico. Las redes de celulosa/matriz de glicano y de pectinas podrían mantenerse unidas por enlaces covalentes entre algunas moléculas de xiloglucano y pectinas. Adicionalmente, las proteínas estructurales podrían formar otra red (Carpita y McCann, 2000).

(33)

Introducción general

2.2.2. Metabolismo de la pared celular durante la maduración de frutos

Durante la maduración de los frutos carnosos, los polímeros que componen la pared celular sufren modificaciones progresivas, detectándose tanto solubilización como depolimerización de los diferentes componentes. La naturaleza y extensión de estos cambios varía entre las distintas especies y aún entre variedades de una misma especie. El ablandamiento que sufren los frutos durante la maduración está caracterizado por una disminución en la firmeza de los tejidos (Wakabayashi, 2000). El proceso de ablandamiento de la mayoría de los frutos es acompañado por la pérdida de adhesión celular, la cual es producida por la degradación de la lámina media. Los polisacáridos pécticos, y en particular los poliurónidos, son los constituyentes principales de

Proteínas estructurales

Microfibrilla de celulosa Hemicelulosas Pectinas

Microfibrilla de celulosa Hemicelulosas Pectinas

Figura 3: Diagrama de la pared celular vegetal primaria. Se señalan las microfibrillas de celulosa recubiertas y entrelazadas por las moléculas de hemicelulosa (principalmente por xiloglucano). Las pectinas forman una red altamente hidratada a través de los diferentes enlaces químicos mencionados en el texto. Se indican, además, las proteínas estructurales. Adaptado de Carpita y McCann (2000).

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Introducción general la lámina media (figura 4). Actualmente se propone que la degradación de xiloglucanos iniciaría el proceso de ablandamiento de los frutos, mientras que la degradación de las pectinas contribuiría principalmente al ablandamiento hacia el final de la maduración y en los estadios sobremaduros (Wakabayashi, 2000).

La velocidad de ablandamiento de los frutos es el principal factor que determina el deterioro post-cosecha, el cual influencia la susceptibilidad al ataque por patógenos, la frecuencia de cosecha y la vida útil de los frutos una vez cosechados. El proceso de ablandamiento limita, además, el transporte y almacenamiento de los frutos (Fischer y Bennett, 1991, Brummell y Harpster, 2001).

Lámina Media Zona rica en pectinas

Pared celular primaria Lámina Media

Zona rica en pectinas

Pared celular primaria

Figura 4: Vista de la pared celular mediante microscopía electrónica de transmisión. La lámina media se forma durante la división celular y crece coordinadamente a medida que la célula se expande. Las células se mantienen en contacto a través de la lámina media, y las zonas de confluencia de células de tejido jóvenes se encuentran ocupadas por polisacáridos ricos en pectinas. Adaptado de Carpita y McCann (2000).

(35)

Introducción general

2.2.2.1. Principales proteínas con o sin actividad enzimática que modifican polímeros de la pared celular

Durante la maduración de los frutos, los cambios producidos en la solubilidad y el tamaño molecular de los polímeros de la pared celular implican la acción coordinada de distintas proteínas y enzimas con la capacidad de degradar componentes específicos de la pared (Fischer y Bennett, 1991; Brummell y Harpster, 2001).

2.2.2.1.1. Proteínas sin actividad enzimática conocida

Expansinas: estas proteínas, de actividad enzimática desconocida,

provocarían la ruptura reversible de los enlaces por puente de hidrógeno que unen las microfibrillas de celulosa con las hemicelulosas de la pared celular vegetal (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994, Cosgrove, 2000). De esta manera, las expansinas serían importantes en los procesos que requieren desmantelamiento de la pared celular, tales como el crecimiento de la raíz y el tallo, la abscición de hojas, la germinación de las semillas y la maduración de los frutos (Rose y col., 1997; Cosgrove, 2000). Se sugirió que la acumulación de expansinas relacionadas con la maduración es un rasgo común de este proceso en la mayoría de los frutos (Civello y col., 1999; Rose y col., 2000).

(36)

Introducción general

2.2.2.1.2. Enzimas que actúan sobre hemicelulosas

Endo-(1®4)b-D-glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4): catalizan la hidrólisis

de los enlaces internos de cadenas de glucanos unidos por enlaces b-(1®4), adyacentes a residuos de D-glucosa no sustituidos. Es frecuente que se haga referencia a estas enzimas como celulasas, sin embargo la mayoría de las endoglucanasas de plantas superiores carecen del dominio de unión a celulosa encontrado en celulasas microbianas, y por lo tanto no pueden degradar microfibrillas cristalinas de celulosa (Brummell y col, 1994). De esta forma, se sugiere que los sustratos naturales de estas enzimas son el xiloglucano y las regiones no cristalinas de las microfibrillas de celulosa (Brummell y Harpster, 2001). La actividad endoglucanasa aumenta durante la maduración de frutilla y manzana (Abeles y Takeda, 1990). En el caso de frutilla, se detectó una elevada expresión de genes que codifican endo-(1®4)b-D-glucanasas putativas (Llop-Tous y col., 1999).

Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207): catalizan la

hidrólisis de los enlaces internos de los esqueletos b-(1®4)-D-glucano del xiloglucano, transfiriendo el extremo reductor recién formado a la posición C-4 del extremo no reductor de otra cadena de xiloglucano (Brummell y Harpster, 2001).

Endo-(1®4)b-mananasas (EC 3.2.1.78): catalizan la hidrólisis de los

enlaces glicosídicos b-(1®4) de glucomananos, galactoglucomananos y galactomananos. La actividad de estas enzimas aumenta durante la

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Introducción general maduración de diversos frutos, tales como tomate, durazno y mandarina (Bourgault y col., 2001). Se sugirió que las endo-b-mananasas desempeñan un papel importante en el proceso de ablandamiento del fruto en tomate (Bewley y col., 2000).

Endo-xilanasas (EC 3.2.1.8): catalizan la hidrólisis de los enlaces

b-(1®4) internos del esqueleto de los xilanos, generando xilo-oligosacáridos. En general, actúan en sitios donde la cadena principal no se encuentra sustituida (Cleemput y col., 1997).

b-D-Xilosidasas (EC 3.2.1.37): catalizan la liberación de xilosas a partir

de los extremos no reductores de los xilo-oligosacáridos generados por las endo-xilanasas (Cleemput y col., 1997). En frutilla, se reportó actividad b-D-xilosidasa y se sugirió que la misma tendría relación con las diferencias en la velocidad de ablandamiento observadas entre cultivares (Martínez y col., 2004; Bustamante y col., 2006).

2.2.2.1.3. Enzimas que actúan sobre cadenas laterales

b-D-galactosidasas (b-Gal, EC 3.2.1.23): en plantas superiores son del

tipo exo y remueven los residuos b-D-galactosilos a partir de los extremos no-reductores de las cadenas laterales de los RG I, los cuales poseen la mayor parte de los residuos de galactosa de la pared celular vegetal. Posiblemente actúan de la misma forma sobre las cadenas laterales de los xiloglucanos. Se ha sugerido que la actividad b-Gal produce un incremento en la solubilización

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Introducción general de las pectinas durante la maduración, la cual conduce a un mayor ablandamiento de los frutos. Dicho efecto es producido de forma directa, aumentando la solubilidad de los RG I, e indirecta, mediante el incremento de la porosidad de la pared celular, facilitando el acceso de PME y PG a sus sustratos (Brummell y Harpster, 2001).

α-L-arabinofuranosidasas (α-Ara, EC 3.2.1.55): actúan sobre diferentes

fracciones pécticas y hemicelulósicas liberando residuos de arabinosa a partir del extremo no reductor (Tateishi y col., 1996). En frutilla, se reportó que tanto la expresión como la actividad α-Ara, estarían asociadas a las diferencias de textura observadas entre cultivares de frutilla (Rosli y col., 2009).

2.2.2.1.4. Enzimas que actúan sobre pectinas

Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2): catalizan la ruptura de pectinas

de-esterificadas a través de un mecanismo de eliminación beta. Las PLs requieren la presencia de Ca2+ para ejercer su acción, y producen oligosacáridos con

residuos de ácido galacturónico no-saturados en el extremo no-reductor de los mismos (Charnock y col., 2002). Se hallaron secuencias nucleotídicas correspondientes a pectato liasas, tanto en frutos de banana como de frutilla (Medina-Suarez y col., 1997; Medina-Escobar y col., 1997). En el caso de frutilla se observó un aumento de la expresión del gen correspondiente durante la maduración de los frutos (Medina-Escobar y col., 1997). La supresión de la expresión de este gen en frutillas transgénicas resultó en una

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Introducción general menor degradación de pectinas y un mayor mantenimiento de la firmeza respecto a los frutos control (Jiménez-Bermúdez y col., 2002).

Poligalacturonasas (PGs): catalizan la hidrólisis de las uniones a-(1®4)

que mantienen unidos a los residuos de ácido galacturónico. Estas enzimas pueden ser de acción exo o endo. Las exo-poligalacturonasas (EC 3.2.1.67) remueven unidades simples de ácido galacturónico a partir del extremo no-reductor del ácido poligalacturónico. En cambio, las endo-poligalacturonasas

(EC 3.2.1.15) rompen dicho polímero en posiciones internas al azar (Brummell

y Harpster, 2001). Se ha determinado que las PGs muestran una mayor afinidad por la forma de-esterificada de las pectinas, por lo tanto se postula que estas últimas serían primeramente de-metiladas de modo de convertirse en un sustrato adecuado para la acción de las PGs (Brummell y Harpster, 2001).

Pectin metil esterasas (PME, EC 3.1.1.11): catalizan la de-metilación del

grupo carboxilo en la posición C-6 de los residuos de ácido galacturónico de las pectinas de alta masa molecular. Esta de-metilación cambia el pH y la carga de la pared celular, permitiendo la agregación de los poliurónidos a través de puentes de Ca2+ y tornándolos más susceptibles a la degradación

por poligalacturonasas (Brummell y Harpster, 2001).

2.3. Características generales de las poligalacturonasas

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Introducción general de las pectinas de la pared celular que caracteriza distintos procesos del desarrollo de las plantas. La actividad poligalacturonasa fue asociada a procesos tales como la abscisión de órganos (Bonghi y col., 1992), dehiscencia de vainas y anteras (Meakin y Roberts, 1991), maduración del grano de polen y crecimiento del tubo polínico (Pressey y Reger, 1989, Pressey, 1991), y especialmente con la maduración de los frutos (DellaPenna y col., 1987; Hadfield y col., 1998; Brummell y Harpster, 2001; Asif y Nath, 2005).

2.3.1. Familias génicas

Si bien muchas de las secuencias aminoacídicas de PG muestran un nivel relativamente elevado de divergencia, existen regiones que están altamente conservadas entre todos los genes clonados de plantas y fuentes microbianas. Estas similitudes se observan particularmente en la porción carboxilo terminal de la enzima, dentro de la cual se encuentra un conjunto de residuos de aminoácidos altamente conservados, los cuales determinan las funciones catalíticas (Scott-Craig y col., 1990; Caprari y col., 1996).

Todas las PGs clonadas hasta el momento poseen una secuencia señal N-terminal hidrofóbica (péptido señal) la cual dirige la proteína hacia el lumen del retículo endoplasmático y probablemente hacia la pared celular. Sin embargo, aparentemente sólo un subgrupo de PGs presenta una secuencia N-terminal a continuación del péptido señal. La función de la pre-secuencia no es conocida, pero podría mantener a la proteína en un estado inactivo hasta que ésta sea transportada hacia su destino final, o podría dirigir

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Introducción general a la misma hacia una posición específica dentro de la pared celular (Della Penna y Bennett, 1988).

Las poligalacturonasas de plantas son agrupadas en tres clados, A, B y C, de acuerdo a la comparación de sus secuencias de aminoácidos (Hadfield y col., 1998). Sin embargo, esta clasificación no es absoluta, y podría no ser suficiente, considerando el número creciente de secuencias de PGs en las bases de datos. El clado A comprende genes que se expresan en frutos y zonas de abscisión y dehiscencia, y los mismos codifican endo-PGs sin pre-secuencia predicha. El clado B está formado por genes que codifican endo- y exo-PGs con pre-secuencia y que actúan en los mismos tejidos y zonas de la plantas que las proteínas del clado A. Finalmente, el clado C, comprende genes que se sólo se expresarían en polen y aparentemente codifican para exo-poligalacturonasas sin pre-secuencia predicha (Hadfield y col., 1998). Sin embargo, es de destacar que existen reportes donde se detectó actividad exo-poligalacturonasa asociada con la maduración de frutos (Pressey y Avants, 1978; Nogata y col., 1993; Brummell y col., 2004).

2.3.2. Poligalacturonasas y maduración de frutos

Las pectinas de la pared celular de frutos sufren un desensamblaje particularmente extensivo durante los últimos estadios de maduración. Esta importante depolimerización y degradación de pectinas está asociada con el deterioro que sufren los frutos en los estadios sobremaduros (Huber y O’Donoghue, 1993). Por otra parte, el desensamblaje de pectinas puede incrementar la porosidad de la red de polisacáridos, dando lugar al

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Introducción general hinchamiento de la pared celular, fenómeno observado en numerosos frutos durante el ablandamiento (Redgwell y col., 1997). Cabe destacar que, si bien los cambios en la composición de los polisacáridos de pared son importantes para las variaciones de textura observadas durante la maduración, no son los únicos factores determinantes de la firmeza del fruto. Otros factores contribuyentes deben ser tenidos en cuenta, particularmente la integridad de la cutícula (Saladié y col., 2007) y la turgencia del fruto (Shackel y col., 1991, Shiota y col., 2006).

El desensamblaje de pectinas dependiente de PG se estudió principalmente durante la maduración de tomate, estableciéndose la contribución de la actividad poligalacturonasa al ablandamiento asociado con la maduración de este fruto. Si bien las PGs de plantas pueden ser parte de grandes familias génicas (Hadfield y Bennett, 1998), en fruto de tomate el ARNm de un solo miembro de la familia génica (PG2, número de acceso

P05117) se acumula durante la maduración. El aumento de la expresión de dicho gen es paralelo al incremento de los niveles y actividad de la enzima (Della Penna y col., 1986).

La poligalacturonasa de tomate fue la primera hidrolasa de pared celular en ser examinada utilizando métodos transgénicos. En frutos en los cuales la actividad PG fue suprimida mediante la expresión de un transgen anti-sentido a niveles por debajo del 1% del valor presente en frutos salvajes, la solubilidad de las pectinas no resultó afectada, pero no se observó depolimerización de las pectinas solubilizadas (Smith y col., 1988). Estos frutos transgénicos maduran normalmente, lo cual demuestra que no es necesaria una actividad PG elevada para que se produzca la maduración del fruto. Por

(43)

Introducción general otra parte, solo se observó una ligera disminución del ablandamiento de los frutos transgénicos con respecto a los de tipo salvaje. A pesar de estos resultados, se obtuvieron mejoras significativas en frutos transgénicos procesados, y se observó un aumento en la viscosidad del jugo o de la pasta preparada a partir de los mismos (Brummell y Labavitch, 1997).

En otros estudios orientados a determinar el papel de PG en el metabolismo de la pared celular durante la maduración, se utilizaron tomates

rin (ripening inhibitor). Estas plantas presentan una mutación en un gen

MADS-box (LeMADS-RIN), el cual se encuentra corriente arriba del control de

la maduración por etileno. Dicha mutación es responsable de que los frutos fallen en la producción autocatalítica de etileno, tanto en la maduración como en respuesta a la aplicación de etileno exógeno (Vrebalov y col., 2002). En

rin, el ARNm del gen endógeno de PG se acumula en niveles muy reducidos.

El tratamiento de frutos rin con etileno, no incrementa la acumulación de los

ARNm de PG, como ocurre normalmente en frutos de tomate del tipo salvaje (Della Penna y col., 1987). Por otro lado, estos mismos frutos se transformaron con una construcción génica formada por el gen de PG fusionado al promotor del gen E8, el cual responde a etileno y propileno (Giovannoni y col., 1989). En los frutos rin-transgénicos, tanto la expresión

génica de PG, como la actividad enzimática y la solubilización y depolimerización de pectinas fueron restauradas hasta alcanzar valores cercanos a los de frutos salvajes. Sin embargo, estos frutos no se ablandaron ni presentaron alteraciones en otros parámetros de maduración, tales como la acumulación de pigmentos o la producción de etileno.

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Introducción general de las mismas en frutos transgénicos con PG antisentido, indica que estos dos procesos poseen determinantes enzimáticos diferentes, siendo la depolimerización, pero no la solubilización, debida principalmente a la acción de PG. En contraste, en mutantes rin complementados con PG, las pectinas

fueron tanto solubilizadas como depolimerizadas. Estos datos sugieren que en tomate, la actividad PG es necesaria y suficiente para la depolimerización de pectinas, pero que puede ser solo una de múltiples y redundantes actividades enzimáticas que solubilizan pectinas, y que el resto de ellas podría estar ausente en los mutantes rin (Hadfield y Bennett, 1998). En un trabajo reciente,

se demostró que la supresión simultánea de PG y expansina en tomate, redujo el desensamblaje de la pared celular, retrasó el ablandamiento, y disminuyó la susceptibilidad de los frutos transgénicos al hongo patógeno

Botrytis cinerea (Cantu y col., 2008).

En frutos de banana, se detectó un incremento en la actividad y expresión poligalacturonasa durante la maduración y la senescencia de los frutos (Asif y Nath, 2005). En el caso de melón, se sugirió que la expresión poligalacturonasa podría estar asociada con el desensamblaje de pectinas asociado con la maduración (Hadfield y col., 1998). Por otra parte, en duraznos se observó una actividad poligalacturonasa diferencial entre frutos de textura denominada “no-melting” (de textura firme, utilizados para conserva) y frutos de textura “melting” (de textura suave o blanda, destinados al consumo en fresco) (Pressey y Avants, 1978). En un trabajo posterior, Callahan y col. (2004) observaron que deleciones en un grupo de genes de poligalacturonasa se correlacionan con la textura característica de los duraznos tipo “no-melting”.

(45)

Introducción general maduración de frutos señala que el desensamblaje de pectinas mediado por PG no contribuye al ablandamiento temprano del fruto, pero cumple un rol importante en la degradación de los tejidos durante los últimos estadios de maduración y en los estadios sobremaduros.

2.3.2.1. Poligalacturonasas y maduración de frutilla

En frutilla, los primeros estudios para detectar actividad poligalacturonasa arrojaron resultados negativos (Barnes y Patchett, 1976; Huber, 1984). Sin embargo, en un trabajo posterior se logró detectar actividad PG en frutos rojos del cultivar Toyonoka (Nogata y col, 1993). Los autores de este trabajo señalaron que la actividad PG se debía a tres enzimas que pudieron distinguirse mediante cromatografía de intercambio catiónico. Una de las enzimas (PG1) tendría una baja actividad endo-poligalacturonasa, mientras PG2 y PG3 presentaron actividad exo-poligalacturonasa. Nogata y col. (1993) señalaron además que la actividad exo-PG disminuye durante el desarrollo y maduración de los frutos, resultado que contradice al papel sugerido para PG en la maduración y ablandamiento de los frutos.

Posteriormente, se clonaron tres genes putativos de PG: spG

(Redondo-Nevado y col., 2001), D15 y B4 (Salentijn y col., 2003). Dos de estos clones, spG y D15, corresponden al mismo gen (Salentijn y col., 2003), si bien se

reportaron datos contradictorios acerca de su expresión. Redondo-Nevado y col. (2001) detectaron expresión poligalacturonasa sólo al comienzo de la maduración de frutos del cultivar Chandler, y reportaron que la expresión de

(46)

Introducción general enzima sPG tendría un papel en la liberación de oligosacarinas al comienzo de la maduración del fruto, y que no desempeñaría un papel importante en el ablandamiento del fruto durante la maduración. Sin embargo, en un trabajo posterior, Salentijn y col. (2003) detectaron expresión de sPG (D15) en frutos

rojos pertenecientes a cultivares con diferentes niveles de firmeza. Mediante ensayos de Northern-blot, observaron una elevada expresión de spG en frutos

pertenecientes a la variedad Gorella (firmeza baja); frutos pertenecientes al cultivar Holliday (firmeza elevada) presentaron la menor expresión de sPG,

mientras que frutos de la variedad Elsanta (firmeza intermedia), presentaron un nivel de expresión intermedio. Estos resultados, opuestos a los obtenidos por Redondo-Nevado y col. (2001), sugieren un rol de sPG en las diferencias de textura observadas entre cultivares. Por otro lado, Salentijn y col. (2003) observaron un patrón de expresión similar para el gen B4 en los tres

cultivares analizados. Sin embargo, a diferencia de la proteína codificada por

sPG, en la proteína deducida a partir de B4 el sitio activo difiere del presente

en las proteínas PGs conocidas, por lo cual existen dudas acerca de si realmente se trata de una poligalacturonasa.

Como se mencionó anteriormente, las PGs de plantas son agrupadas en tres clados. En el caso de frutilla, Redondo-Nevado y col. (2001) ubican a spG dentro del Clado A, sugiriendo que spG codificaría una

endo-poligalacturonasa (Redondo-Nevado y col., 2001), mientras Salejtijn y col. (2003) clasifican a sPG como una exo-poligalacturonasa perteneciente al Clado C.

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Hipótesis de trabajo y objetivos

3. Hipótesis de trabajo y objetivos 3.1. Hipótesis de trabajo

“Existe una correlación entre la expresión y actividad poligalacturonasa y el ablandamiento del fruto durante la maduración de frutilla”.

3.2. Objetivo general

Contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares y bioquímicos que determinan el ablandamiento de frutilla.

3.3. Objetivos particulares

· Analizar la actividad PG total durante la maduración de variedades de frutilla con diferente velocidad de ablandamiento.

· Caracterizar la expresión de genes de PGs durante la maduración de variedades de frutilla con niveles de firmeza contrastantes.

· Obtener y clonar las secuencias completas de genes de PG de frutilla. · Estudiar la acumulación de proteínas PGs durante la maduración de

variedades de frutilla con firmezas contrastantes.

· Evaluar el efecto de diferentes reguladores del crecimiento vegetal sobre la expresión de genes de PGs de frutilla.

· Analizar la existencia del fenómeno de splicing alternativo en genes de PGs de frutilla.

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Materiales y Métodos

4. Materiales y Métodos 4.1. Material Vegetal

Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch.) de distintas

variedades cuyos frutos presentan diferentes niveles de firmeza. Se emplearon los cultivares Camarosa (firmeza elevada), Pájaro (firmeza intermedia) y Toyonoka (firmeza baja). Los datos de firmeza de las tres variedades se tomaron de estudios previos a la realización de este trabajo de Tesis (Rosli y col., 2004). Los frutos se obtuvieron de productores locales (La Plata, Provincia de Buenos Aires) a partir de plantas cultivadas de acuerdo a prácticas convencionales. Los frutos se recolectaron en distintos estadios de desarrollo y maduración. Los estadios empleados fueron: verde grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R) y 100% rojo (100% R) para Camarosa, Pájaro y Toyonoka. Las muestras se lavaron, secaron, cortaron, congelaron en N2(l) y se almacenaron a -80 °C hasta su utilización.

Para los ensayos con reguladores del crecimiento vegetal, se utilizaron frutos de Camarosa y Toyonoka en el estadio blanco.

4.2. Determinación de la actividad poligalacturonasa (PG)

La metodología que se utilizó para la obtención de extractos proteicos y la medición de actividad PG se adaptó de Nogata y col. (1993). Para la preparación de los extractos, se utilizaron frutos de frutilla de las variedades Camarosa, Pájaro y Toyonoka de los estadios VG, B, 50% R y 100% R, y

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