FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
Departamento de Ingeniería Química y de Materiales
TESIS DOCTORAL
Aplicación de métodos computacionales a la monitorización y
el cosechado de cultivos de microalgas
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADA POR
Patricio Roberto López Expósito
Director
Carlos Negro Álvarez
Madrid
Ed. electrónica 2019
TESIS DOCTORAL
Aplicación de métodos computacionales a la
monitorización y el cosechado de cultivos de
microalgas
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN INGENIERÍA QUÍMICA PRESENTADA POR
Patricio Roberto López Expósito
DIRECTOR:Prof. Carlos Manuel Negro Álvarez
MADRID, 2019D./ ________________________________________________________________, estudiante en el Programa de Doctorado _____________________________________, de la Facultad de _____________________________ de la Universidad Complutense de
Madrid, como autor/a de la tesis y
titulada:
y dirigida por:
DECLARO QUE:
La tesis es una obra original que no infringe los derechos de propiedad intelectual ni vigente, en particular, la Ley de Propiedad Intelectual (R.D. legislativo 1/1996, de 12 de abril, por el que se aprueba el texto refundido de la Ley de Propiedad Intelectual, modificado por la Ley 2/2019, de 1 de marzo, regularizando, aclarando y armonizando las disposiciones legales vigentes sobre la materia), en particular, las disposiciones referidas al derecho de cita.
Del mismo modo, asumo frente a la Universidad cualquier responsabilidad que pudiera derivarse de falta de originalidad del contenido de la tesis presentada
En Madrid, a ____ de _________________________ de 20___
Fdo.: _______________________________
debe ser insertada en LOPEZ
EXPOSITO PATRICIO ROBERTO - 45580918R
Firmado digitalmente por LOPEZ EXPOSITO PATRICIO ROBERTO - 45580918R
Nombre de reconocimiento (DN): c=ES,
serialNumber=IDCES-45580918R, givenName=PATRICIO ROBERTO, sn=LOPEZ EXPOSITO, cn=LOPEZ EXPOSITO PATRICIO ROBERTO - 45580918R
CARLOS MANUEL NEGRO ÁLVAREZ CATEDRÁTICO DEL DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y DE MATERIALES DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
INFORMA
De que el trabajo de investigación titulado “APLICACIÓN DE MÉTODOS COMPUTACIONALES A LA MONITORIZACIÓN Y EL COSECHADO DE CULTIVOS DE MICROALGAS” ha sido realizado bajo su dirección dentro del Grupo de Investigación de Celulosa y Papel de la Universidad Complutense de Madrid, y constituye la memoria que presenta D. Patricio Roberto López Expósito para optar al Grado de Doctor. A su juicio esta tesis cumple con los requisitos de rigor científico y originalidad para que el alumno pueda optar al título de doctor.
Y para que conste a los efectos oportunos, firma el presente informe, en Madrid a 19 de marzo de 2019.
A mis padres agradezco todo. Su amor, apoyo y confianza, la educación que me dieron, siempre libre, siempre exenta de intervenciones. Quiero agradecer especialmente a mi madre que me enseñase a tratar y disfrutar el trato con los demás, y a mi padre, que despertase en mí el amor y la curiosidad por la naturaleza. Agradezco a mis hermanos, Paco y Moisés, y a Laura y a Loli su cariño y el aliento que me han prestado para continuar con la investigación doctoral en estos años.
Agradezco a Ángeles y Carlos, su confianza y la oportunidad que me han prestado para demostrar que era digno de ella. Esta tesis, sin embargo, no habría sido posible solo con confianza, puesto que encajar el trabajo de gestión en el grupo con el de investigación supone un esfuerzo ímprobo. Les agradezco pues, especialmente, su consideración y generosidad al ofrecerme espacio y tiempo para poder investigar dispensándome a menudo de tareas, viajes y otros desempeños que ellos han cargado sobre sus espaldas.
A Julio me gustaría agradecer su ingenio y su inquietud por el bienesatar de los demás. A Antonio su sentido del humor y sus anécdotas históricas. A Roberto, su teatralidad refrescante. A Jesús, gracias por su disposición a ayudar en todo siempre y por su buen humor y paciencia. A Pablo, gracias por obligarme a programar con objetos. A Emilio, gracias por sus ánimos. A Bárbara, gracias por su ayuda en el laboratorio.
Gracias a Esperanza por enseñarme a cultivar bichos y por su amistad. Gracias a Paloma por su amistad y sus sabios consejos. A Helen, Luis, Rocío e Isa por hacer los días más llevaderos y divertidos. Agradezco a Conchi su amabilidad y al resto de los miembros del grupo su apoyo y paciencia en los momentos duros.
A Antonio, Belén, Ester, Javi, Jhiret, Marcos, Marimar, Miguel, Noemí, Pepelu, Sandra, Silvia y Vicky, gracias por su amistad y los buenos momentos.
A Cristina tengo mucho que agradecerle. Por un lado, que haya compredido y valorado desde el primer momento el trabajo que he desarrollado en esta tesis y, por otro, que haya compartido conmigo su entusiasmo científico y su buen hacer investigador. Por supuesto, su amistad.
A Olly por tantos y tan entretenidos almuerzos y por su amable insistencia. A Nacho por su amistad y buenos consejos.
Mi agradecimiento al equipo del Centro de Citometría y Microscopía de Fluorescencia (CCMF) de la Universidad Complutense por su buen hacer y por sus consejos sobre procesamiento de imágenes.
Agradezco a las entidades financiadoras de los proyectos CENIT-VIDA (ref. CEN-20101026, Ministerio de Ciencia e Innovación), E4WATER (ref. 280756, Comisión Europea), RETOPROSOST-CM (ref. S2013/MAE-2907, Comunidad de Madrid), por el apoyo económico prestado a las investigaciones asociadas a esta tesis doctoral.
I. Patricio Lopez-Exposito, Angeles Blanco, Carlos Negro (2016). Estimation of Chlamydomonas reinhardtii biomass concentration from chord length distribution data. J. Appl Phyco, 28(4), 2315-2322. (JCR, Marine and Fresh Water Biology, 24 de 106, Q1)
II. Patricio López Expósito, Angeles Blanco, Carlos Negro. (2017). Laser reflectance measurement for the online monitoring of Chlorella sorokiniana biomass
concentration. Journal of Biotechnology, 243, 10-15. (JCR, Biotechnology & Applied Microbiology, 65 de 160, Q2)
III. López Expósito, P., Campano, C., Blanco, A., & Negro, C. (2019). Microalgae harvesting by the novel flocculant hairy cationic nanocrystalline cellulose. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 178, 329-336. (JCR, Biophysics, 13 de 72, Q1) IV. López Expósito, P., Blanco, A., & Negro, C. (2017). Estimating fractal dimension of
microalgal flocs through confocal laser scanning microscopy and computer
modelling. Algal Research, 28, 74-79. (JCR, Biotechnology & Applied Microbiology, 36 de 160, Q1)
V. Lopez-Exposito, P., Blanco, A., & Negro, C. (2019). Direct estimation of microalgal flocs fractal dimension through laser reflectance and machine learning. Algal Research, 37, 240-247. (JCR, Biotechnology & Applied Microbiology, 36 de 160, Q1)
R
ESUMEN EXTENDIDO
...1
E
XTENDED
S
UMMARY
... 5
1.
I
NTRODUCCIÓN
... 9
1.1. Las microalgas ... 9
1.1.1 Metabolitos de microalgas con potencial comercial ...11
1.1.2. Métodos de cultivo de microalgas ... 13
1.1.3. Cosechado de microalgas ... 14
1.1.4. Producción comercial de biomasa de microalgas ... 17
1.2. Floculación de suspensiones de microalgas ... 18
1.3. Morfología de los agregados de microalgas ... 20
1.3.1. Los objetos fractales y los agregados de partículas ... 20
1.3.2. La morfología de los agregados de partículas en la separación sólido líquido ... 22
1.3.3. Caracterización de las suspensiones de sólidos ... 23
2.
O
BJETIVOS
... 33
3.
M
ATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES
... 35
3.1. Cepas de microalgas y su cultivo. ...35
3.2. Floculantes ... 37
3.2.1. Quitosano ... 37
3.2.2. Celulosa nanocristalina hairy cationizada (CNC-HC) ... 37
3.3. Determinación de la biomasa seca. ... 37
3.4. Ensayos de floculación ... 38
3.5. Obtención de datos de distribuciones de tamaños cuerda de las suspensiones ... 38
3.6. Adquisición de imágenes por microscopía óptica convencional. ... 40
3.7. Adquisición de imágenes por microscopía confocal láser de barrido ... 40
4.
M
ÉTODOS COMPUTACIONALES
... 41
4.1. Modelos de aprendizaje automático aplicados a la regresión. ... 41
4.2. Algoritmo de optimización de la arquitectura de los modelos de regresión ... 43
4.2.1. Algoritmo de recocido simulado ... 43
4.2.4. Combinación del algoritmo de recocido simulado con validación cruzada ... 47
4.3. Generación de agregados fractales virtuales. ... 48
4.3.1. Algoritmo para la combinación de pares de agregados ... 49
4.3.2. Algoritmo de crecimiento de agregados ... 50
4.4. Adquisición de datos de los agregados fractales virtuales ... 52
4.4.1. Algoritmo de sedimentación de los agregados virtuales ... 52
4.4.2. Estimación de la dimensión fractal en 2D de las proyecciones de agregados virtuales ... 52
4.4.3. Generación de espectros de tamaños de cuerda de los agregados virtuales ... 53
4.5. Métodos para la estimación de la dimensión fractal media de suspensiones reales de flóculos de microalgas ... 54
4.5.1. Método para la estimación de la dimensión fractal media de agregados de microalgas a partir del procesado de imágenes de microscopía láser confocal y modelado por ordenador ... 54
4.5.2. Metodología para el desarrollo del sistema de estimación de la dimensión fractal media de los agregados a través de un modelo de regresión por aprendizaje automático. ... 56
5.
R
ESULTADOS
... 59
5.1. Métodos para la estimación de la concentración de la biomasa de microalgas. ... 62
5.1.1. Estimación de la concentración de Chlamydomonas reinhardtii por medio de redes neuronales artificiales. ... 62
5.1.2. Estimación de la concentración de la biomasa de Chlorella sorokiniana floculada por medio de bosques aleatorios y máquinas de vectores de soporte. ... 63
5.2. Influencia de geometría de los agregados de microalgas en la filtrabilidad de las suspensiones de biomasa floculada ... 65
5.2.1. Floculación de suspensiones de Chlorella sorokiniana con CNC-HC ... 65
5.2.2. Efecto de la dosis de CNC-HC sobre el potencial Z de la muestra. ... 66
5.2.3 Efecto de la dosis de CNC-HC sobre la morfología de los agregados ... 67
5.2.4. Efecto de la morfología sobre la filtrabilidad de las suspensiones de microalgas floculadas. ... 71
5.3. Método de estimación de la dimensión fractal en 3D de flóculos de microalgas proyección mediante microscopía laser confocal y modelado por ordenador. ... 73
5.3.1. Adquisición de imágenes microscópicas de suspensiones de agregados de microalgas y su caracterización morfológica ... 73
5.3.2. Generación de flóculos virtuales con Df y máximo diámetro de Feret consignados .... 76
5.4. Desarrollo de un modelo de estimación de la Df a partir de datos de tamaño de
cuerda de suspensiones de microalgas ... 80
5.4.1. Obtención de tamaños de cuerda de flóculos virtuales ... 80
5.4.2. Entrenamiento y selección del modelo de estimación de la Df por medio de la DTC. .. 82
5.4.3. Validación del modelo con datos reales ... 82
6.
C
ONCLUSIONES
... 85
7.
R
EFERENCIAS
... 89
A
NEXO
I:
P
RINCIPALES BLOQUES DE CÓDIGO IMPLEMENTADOS
... 105
A
NEXO
II:
P
UBLICACIONES ORIGINALES
... 153
Tabla 1.1. Contenido en proteínas, carbohidratos y lípidos de biomasa de algunas cepas de microalgas
expresado como porcentaje de biomasa seca ... 10
Tabla 4.1. Hiperparámetros de la red neuronal de tipo perceptrón. ... 42
Tabla 4.2. Hiperparámetros de la regresión por máquina de vectores de soporte ... 42
Tabla 4.3. Hiperparámetros de la regresión por bosques aleatorios ... 42
Tabla 5.1. Hiperparámetros del perceptrón multicapa seleccionado ... 63
Tabla 5.2. Hiperparámetros del bosque aleatorio de regresión seleccionado ... 64
Tabla 5.3.- Hiperparámetros del modelo de regresión con máquinas de vectores de soporte. ... 65
Tabla 5.4. Dimensiones fractales proyectadas promedio (D2 ) obtenidas en las condiciones de agitación consideradas ... 75
Tabla 5.5. Dimensiones fractales proyectadas promedio (D2 ) obtenidas en cada familia de agregados para las dimensiones fractales de consigna consideradas. ... 80
Tabla 5.6. Hiperparámetros seleccionados para el modelo de bosque aleatorio para la estimación de la dimensión fractal. ... 82
Figura 1.1. Estructuras moleculares de quitina y quitosano ... 19
Figura 1.2. Producción de CNC-HC a partir de celulosa ... 20
Figura 3.1. a) Incubadora termostatizada con iluminación LED; b) fotobiorreactores de laboratorio empleados ... 36
Figura 3.2. Dispositivo experimental para el cultivo de microalgas en fotobiorreactores ... 36
Figura 3.3. Equipos de análisis del tamaño de cuerda, a) Sonda FBRM M500L y b) PT G400. ... 38
Figura 3.4. Esquema de funcionamiento de la sonda FBRM ... 39
Figura 3.5. Microscopio Axio Lab.A1 y portamuestras con pocillo ... 40
Figura 4.1. Algoritmo de recocido simulado para la optimización de la arquitectura del perceptrón .... 46
Figura 4.2. Algoritmo de optimización de la arquitectura de modelos de aprendizaje automático mediante la combinación de un algoritmo de optimización por recocido simulado y una validación cruzada ... 48
Figura 4.3. Algoritmo de crecimiento de agregados virtuales ... 51
Figura 4.4. Esquema conceptual de la estimación de la Df media de suspensiones de agregados por microscopía y modelado por ordenador ... 55
Figura 4.5. Procedimiento seguido para el desarrollo de un modelo de estimación de la Df media de suspensiones de flóculos con distribuciones de tamaño. ... 57
Figura 5.1. Resumen gráfico de las técnicas más relevantes empleadas en las publicaciones asociadas a la presente tesis ... 61
Figura 5.2. Concentración de biomasa estimada con el modelo de perceptrón frente a la medida en los datos de validación. ... 62
Figura 5.3. Concentración de biomasa estimada con el modelo de bosques aleatorios frente a la medida en los datos de validación ... 64
Figura 5.4. Concentración de biomasa estimada con el modelo de máquinas de soporte de vectores frente a la medida en los datos de validación ... 65
Figura 5.5. Potencial-Z y reducción de absorbancia en función de la dosis de CNC-HC. ... 66
Figura 5.6. Imágenes microscópicas de suspensiones de C. sorokiniana floculadas con 27,5 ppm de CNC –HC aplicando velocidades de agitación de a) 100 rpm; b) 200 rpm; y c) 300 rpm. Las imágenes de la izquierda corresponden a la fase de floculación y las de la derecha a la de refloculación. ... 67
Figura 5.7. D2 en función de la dosis para las velocidades de agitación consideradas ... 68
Figura 5.8. Posible unión mediada por CNC-HC intercelular en función de la concentración de nanopartículas: a) baja, b) media, c) alta concentración y d) estructura de un flóculo de microalga inducida con una dosis de CNCC cerca del PIE. ... 70
Figura 5.9. Volumen de filtrado frente al tiempo para las tres presiones de vacío consideradas: a) 0,5 bar, b) 0,65 bar y c) 0,8 bar; y d) reducción de absorbancia en función de la presión de vacío. ... 71
Figura 5.10. Eliminación de la absorbancia a distintas presiones de vacío en función de la velocidad de agitación en la floculación. ... 72
Figura 5.11. Imágenes de microalgas floculadas a distintas velocidades de agitación obtenidas por microscopía láser confocal ... 73 Figura 5.12. Imágenes binarizadas de agregados de C. sorokiniana floculados a 200, 350 y 500 rpm. 74
Figura 5.14. Agregados virtuales con MDF 307 μm y Df de consigna entre 1,2 y 2,1. ... 76
Figura 5.15. DFM de los agregados virtuales en función del DFM medidos. ... 77
Figura 5.16. Número de partículas en el agregado en función de su MDF de consigna. ... 77
Figura 5.17. Cuatro proyecciones aleatorias de un agregado virtual con Df = 2,1 y MDF 107. ... 78
Figura 5.18. Proyecciones de un agregado virtual con Df = 2,1 y MDF 107 tras la rotación alrededor de su eje máximo. ... 78
Figura 5.19. Área de la proyección del fóculo con Df= 2,1 y MDF 107 μm en función del ángulo de giro. ... 79
Figura 5.20. D2 de cada agregado virtual para las familias a) 200, b) 350 y c) 500 rpm. ... 79
Figura 5.21. Longitudes de cuerda sin procesar de 100 rotaciones de un flóculo virtual y la misma tras someterla a filtrado y promediado ... 80
Figura 5.22. Longitudes de cuerda de flóculos de MDF 307 μm y distintas dimensiones fractales ... 81
Figura 5.23. Df estimada frente a consignada ... 82
Figura 5.24. Df estimada a partir de datos de DTC de suspensiones reales y la estimada por comparación para las velocidades de agitación consideradas. ... 83
RFR Bosques aleatorios de regresión: (del inglés, random forest regression) CDAMC Celulosa modificada con dialdehído catiónica
DAMC Celulosa modificada con dialdehído CB Concentración de biomasa
CCA Crecimiento agregado-agregado (del inglés cluster-cluster aggregation) DQO Demanda química de oxígeno
D2 Dimensión fractal en dos dimensiones Df Dimensión fractal
DTC Distribución de tamaños de cuerda ECM Error cuadrático medio
FBR Fotobiorreactores LMC Longitud media de cuerda
SVR Máquinas de vectores de soporte para regresión (del inglés, support vector regression)
MDF Máximo diámetro de Feret
FBRM Medida por reflexión de haz de láser enfocado (del inglés, focused beam reflectance measurement)
MLCB Microscopía confocal láser de barrido CNC-HC Celulosa nanocristalina hairy cationizada
PIE Punto isoeléctrico
RECM Raíz del error cuadrático medio
TAP Tris-acetato-fosfato (del inglés, Tris-Acetate-Phosphate)
NTU Unidades nefelométricas de turbidez (del inglés, nephelometric turbidity unit)
RESUMEN
EXTENDIDO
El incremento de la población mundial junto a la mejora de los medios de vida de los países en vías de desarrollo está causando un aumento de la presión sobre los recursos naturales del planeta. Esta situación ha propiciado que los gobiernos, el mundo académico y la industria hagan una búsqueda activa de nuevas fuentes de suministro que permitan el sostenimiento de la población y el desarrollo de la calidad de vida de la sociedad. A esta tendencia hay que añadir el creciente compromiso social por la conservación del medioambiente y el desarrollo sostenible. Se plantea pues, una coyuntura en la que coexisten una realidad demográfica y unos intereses sociales que son, a primera vista, contrapuestos. En este escenario, la producción sostenible de biomasa de microalgas se ha valorado como una opción atractiva para contribuir a resolver estos retos. La biomasa de microalgas como fuente de productos de alimentación o de productos químicos de interés presenta una serie de ventajas respecto a otras opciones. Por un lado, su producción puede llevarse a cabo en terrenos no aptos para el cultivo o la ganadería o incluso en el mar. Por otro lado, la posibilidad de emplear residuos ricos en nutrientes de otros procesos productivos, especialmente cuando la biomasa se destina a la producción de sustancias no destinadas al consumo humano, permitirían a la sociedad avanzar hacia la economía circular. Además, dado que las microalgas son seres fotosintéticos, su producción permitiría el aprovechamiento del CO2 generado en procesos
de combustión, actuando la industria productora de biomasa de microalgas como sumidero de carbono.
Con todo, el cultivo masivo de microalgas para la obtención de los productos anteriormente mencionados no ha llegado a materializarse por varios factores. Aparte de los aspectos regulatorios, la causa principal de este hecho hay que buscarla en los elevados costes de producción de la biomasa de microalgas, principalmente asociados al cultivo, en particular, al medio de cultivo, y al proceso de concentración de la biomasa.
Las estrategias que se han planteado para la disminución de los costes vinculados al cultivo de microalgas pasan por la reutilización del medio de cultivo en las instalaciones de producción, el empleo de aguas residuales tratadas como medio y el uso de sistemas de cultivo abiertos en los que se favorece el crecimiento de varias especies de microalgas o incluso de consorcios de microalgas con bacterias u hongos. Al plantearse estos esquemas productivos surgen una serie de problemas, entre los que se encuentra la dificultad de determinar la concentración de microalgas en el medio de forma rápida y robusta, en parte debido a que estos medios presentan una turbidez significativa o porque dicha turbidez varía con la edad del cultivo o a lo largo de las etapas de reutilización del medio.
En lo relativo a la reducción de los costes de concentración de la biomasa de microalgas, la estrategia que está recibiendo un mayor interés conlleva la implementación de una etapa de pre-concentración que permita reducir los costes energéticos vinculados a las etapas convencionales de concentración, tales como la filtración convencional, la filtración a vacío o la centrifugación. Como etapa de pre-concentración, la coagulación/floculación seguida o no de sedimentación, está considerada, a día de hoy, como la alternativa más atractiva desde el punto de vista de los costes relativamente bajos de inversión y de operación que esta técnica implica. En la etapa de coagulación/floculación, la selección de los agentes promotores de
agregación está condicionada por el destino final que tiene la biomasa producida, si bien se tiende, cada día más, a emplear productos obtenidos de forma sostenible y cuya gestión posterior no presente una problemática ambiental ni ocasione costes adicionales de tratamiento.
La operación de coagulación/floculación se optimiza al objeto de garantizar la clarificación de la suspensión que se trata, de forma que las partículas en suspensión se agreguen en flóculos que puedan separarse del medio acuoso de forma efectiva aguas abajo. El sistema de control del proceso suele operar actuando sobre la dosis de los agentes coagulantes y/o floculantes en función de una medida de la turbidez del medio, y también sobre el pH y la conductividad a través de un sistema de corrección de los mismos. Sin embargo, dado que las microalgas son microorganismos sujetos a ritmos circadianos y muy sensibles a pequeñas variaciones en su medio de cultivo, las características de los flóculos inducidos en la operación de coagulación/floculación pueden variar sin que se produzcan cambios apreciables en los valores de los parámetros de control. Este aspecto, si bien no necesariamente compromete la capacidad de clarificación del medio que tiene el proceso, puede provocar la pérdida de efectividad de las operaciones de separación subsiguientes que son muy sensibles al tamaño y morfología de los agregados.
En la actualidad, la mayoría de los métodos de caracterización de la morfología de los agregados de microalgas se ciñen a la estimación de la dimensión fractal proyectada por análisis de imagen, y los sistemas de estimación de la dimensión fractal en tres dimensiones están limitados, entre otros factores, por la concentración de las suspensiones de microalgas. No existen, en la actualidad, métodos que permitan estimar la dimensión fractal media en tres dimensiones de suspensiones de microalgas de forma robusta.
El principal objetivo de la presente tesis doctoral es el desarrollo de nuevos métodos de caracterización de suspensiones de microalgas mediante la aplicación de sistemas computacionales a los datos de distribución de tamaños o a imágenes microscópicas de dichas suspensiones. Los sistemas desarrollados se enmarcan en dos categorías principales, una de métodos de estimación de la concentración de biomasa seca de microalgas y otra de métodos para la estimación de la dimensión fractal media de los agregados de suspensiones de microalgas. Como objetivo secundario, se estudió el empleo de un nuevo agente floculante, una nanocelulosa cristalina catiónica, en la floculación de biomasa de microalgas.
Los sistemas de estimación de la concentración de biomasa emplean datos de distribución de tamaño de cuerda adquiridos por medio de una sonda de reflexión de haz de láser enfocado. Este método puede aportar datos prácticamente en tiempo real de la concentración de biomasa, con lo que resultaría útil en la monitorización de cultivos de microalgas en los que la turbidez del medio es apreciable y/o variable. Este sería el caso, por ejemplo, de los cultivos que empleen como medio de crecimiento aguas residuales tratadas o aquellos en los que se reutiliza el medio.
El primero de los métodos de estimación de la concentración de biomasa de microalgas se desarrolló para la caracterización de suspensiones de Chlamydomonas reinhardtii. El método se concibió para que la estimación de la concentración se obtuviese por correlación con los datos de tamaño de cuerda de las suspensiones empleando una red neuronal artificial tipo
perceptrón, cuya arquitectura se optimizó por medio de un algoritmo de recocido simulado. Con este método se consiguió un error cuadrático medio de predicción de 0,031 (g L-1)2 con
la población de datos de validación.
El concepto aplicado para el desarrollo del sistema de estimación de la concentración de biomasa de C. reinhardtii se aplicó a otra cepa, Chlorella sorokiniana, y en la correlación se emplearon otros métodos de aprendizaje automático, en concreto modelos de regresión de bosques aleatorios y máquinas de vectores de soporte para la regresión. Estas condiciones se aplicaron al objeto de verificar el enfoque anterior con otra cepa de células más pequeñas (las células de C. sorokiniana son unas tres veces más pequeñas que las de C. reinhardtii). También se consideraron otros sistemas de aprendizaje automático especialmente apropiados para casos en los que el número de variables a emplear como predictores es elevado. En estos casos, los errores cuadráticos medios de predicción obtenidos fueron de 0,087 (g L-1)2 y 0,081
(g L-1)2 respectivamente, si bien en este caso, aplicando una validación cruzada en la que todos
los datos de la población se emplean como datos de validación.
Los sistemas de estimación de la dimensión fractal tridimensional que se desarrollaron se encuadran, a su vez, en dos tipos, uno de estimación del parámetro por comparación de dimensiones fractales proyectadas reales y simuladas, y otro por interpretación de datos de tamaño de cuerda. El segundo método, que se puede implementar en línea y en tiempo real, podría emplearse para desarrollar sistemas de control de la floculación que garanticen la agregación de las partículas del medio en flóculos de morfología óptima para la separación de los mismos en posteriores etapas de concentración.
El sistema de estimación de la dimensión fractal por comparación consistió en la generación de agregados virtuales de tamaño y dimensión fractal conocida y posterior comparación de su proyección en el plano con las imágenes de flóculos reales tomadas por microscopía láser confocal de barrido. Con este método se obtuvieron resultados de estimación de la dimensión fractal compatibles con los de la literatura.
El sistema de software para la generación, rotación y proyección de flóculos virtuales desarrollado para la implementación del método anterior, sirvió como plataforma para la creación del sistema de estimación de la dimensión fractal a partir de datos de tamaño de cuerda. En este desarrollo se emplearon datos de tamaños de cuerda de flóculos virtuales para el entrenamiento y optimización de un modelo de regresión de bosques aleatorios que, posteriormente, se validó con datos reales. Los datos reales de validación se obtuvieron mediante la sonda de medida por reflexión de haz enfocado aplicada a suspensiones de microalgas de distinta concentración floculadas en las condiciones experimentales aplicadas en la creación del sistema de estimación de la dimensión fractal por comparación de proyecciones. El método de estimación por tamaños de cuerda fue capaz de estimar la dimensión fractal media de suspensiones de microalgas con independencia de su concentración, proporcionando resultados muy similares a los aportados por el método de comparación, especialmente en condiciones de agitación medias, consiguiéndose una discrepancia media respecto a los valores de referencia de 0,15.
La tesis se presenta como compendio de artículos, que se relacionan con lo descrito en este resumen de la manera siguiente. Los artículos I y II describen el desarrollo de modelos de
aprendizaje automático concebidos para estimar la biomasa seca de microalgas en distintos estado de agregación a través de la interpretación de los datos de tamaños de cuerda de las suspensiones correspondientes, estos últimos adquiridos a través de una sonda de medida por reflexión de haz enfocado. En el artículo III se estudia la aplicación de una nanocelulosa cristalina catiónica como agente floculante en suspensiones de microalgas, se proponen modelos para describir el proceso de agregación y se evalúa el efecto de la geometría de los agregados en la filtrabilidad de las suspensiones. El artículo IV describe el desarrollo de una metodología para estimar la dimensión fractal media de suspensiones de C. sorokiniana por medio de la comparación entre imágenes de flóculos tomadas por microscopía láser confocal y las proyecciones de flóculos virtuales de dimensión fractal conocida generados por ordenador. El artículo V aborda el desarrollo de un modelo de regresión de aprendizaje automático para estimar la dimensión fractal media de suspensiones de flóculos de microalgas por medio de la interpretación de los datos de tamaño de cuerda de las mismas tomados a través de la sonda de medida por reflexión de haz enfocado.
Por último, los conocimientos generados en la presente tesis se han aplicado a campos de la investigación distintos del que se aborda en este trabajo. En concreto, la optimización de los hiperparámetros y aplicación de modelos de máquinas de vectores de soporte para la regresión se aplicaron en el artículo Morphological analysis of pulps from orange tree trimmings and its relation to mechanical properties (Aguado et al. 2016), y el sistema de estimación directa de la dimensión fractal en el artículo titulado Hairy cationic nanocrystalline cellulose as a novel flocculant of clay (Campano et al. 2019, publicado en Journal of Colloid and Interface Science). Asimismo, los conocimientos generales sobre aprendizaje automático se han aplicado en el artículo titulado Toward a description of the nanocrystalline cellulose aggregation state: correlating image analysis and Dynamic Light Scattering data (Campano et al., enviado a Langmuir).
EXTENDED
SUMMARY
The increase in the world population together with the improvement of the livelihoods of the developing countries is causing an increment in the pressure on the planet's natural resources. This situation has led governments, industry and academia to actively search for new resources to sustain the population and develop of the quality of life of society. To this trend we must add the growing social commitment toward the environmental preservation and sustainable development. Therefore, a situation arises in which a demographic reality coexists with social interests that are, at first sight, opposed. In this scenario, the sustainable production of microalgae biomass has been valued as an attractive option to contribute to address these challenges. The biomass of microalgae as a source of food or chemical products of interest has a series of advantages over other options. On the one hand, its production can be carried out on land not suitable for cultivation or livestock, and even at sea. Additionally, the possibility of using nutrient-rich waste from other production processes, especially when biomass is used for the production of substances not intended for human consumption, would allow society to progress towards the circular economy. Furthermore, given that microalgae are photosynthetic beings, their production would allow the use of CO2 generated
in combustion processes, acting the microalgal production industry as a carbon sink.
Nevertheless, the mass cultivation of microalgae to obtain the aforementioned products has not been materialized due to several factors. Apart from regulatory aspects, the main cause of this fact must be sought in the high production costs of microalgae biomass, mainly associated with the cultivation, in particular to the growing medium, and in the biomass concentration process.
The strategies proposed for the reduction of the costs related to the cultivation of microalgae go through the reuse of the culture medium in the production facilities, the use of treated wastewater as a medium and the use of open farming systems in which the growth of several species of microalgae or even consortia of microalgae with bacteria or fungi are promoted. When considering these production schemes a series of problems arise, among which is the difficulty to determine the microalgal concentration in the medium in a quick and robust manner, partly because such media present a significant turbidity or because said turbidity varies with the age of the culture or throughout the stages of medium reuse.
As for the reduction of the concentration costs of the microalgae biomass, the strategy drawing a greater interest involves the implementation of a pre-concentration stage that allows to reduce the energy costs linked to the conventional concentration stages, such as conventional filtration, vacuum filtration or centrifugation. As a pre-concentration stage, coagulation / flocculation, followed or not by sedimentation, is considered, today, as the most attractive alternative owing to the relatively low investment and operation costs involved in this operation. In the coagulation / flocculation stage, the selection of aggregation promoting agents is determined by the final use of the biomass produced, although the present trend is to use products obtained in a sustainable manner and whose subsequent management does not entail environmental problems or incur additional treatment costs.
Coagulation / flocculation operations are normally optimized in order to ensure clarification of the suspension being treated, so that the particles in suspension are aggregated in flocs that can be effectively separated downstream from the aqueous medium. The process control system usually operates by acting on the dose of the coagulating or flocculating agents depending on a measure of the turbidity of the medium, and also on the pH and conductivity through a system for correcting them. Nonetheless, since microalgae are microorganisms subject to circadian rhythms and very sensitive to small variations in their culture medium, the characteristics of the flocs induced in the coagulation / flocculation operation can vary without appreciable changes in the values of the control parameters. This aspect, although not necessarily compromising the medium clarification capacity of the process, can cause a loss of effectiveness of the subsequent separation operations that are very sensitive to floc size and morphology.
At present, most of the morphological characterization methods of microalgae aggregates are restricted to estimating the projected fractal dimension of flocs by image analysis, being the three dimensions fractal dimension estimation systems limited, among other factors, by the concentration of microalgal suspensions. Currently, there are no methods to estimate the average fractal dimension in three dimensions of suspensions of microalgae in a robust manner.
The main objective of the present doctoral thesis is the development of new methods of characterization of microalgal suspensions through the application of computational systems to the size distribution data or to microscopic images of said suspensions. The systems developed fall into two main categories, one of methods for estimating the dry biomass concentration of microalgae and, the other, of methods to estimate the average fractal dimension of aggregates in microalgal suspensions. As a secondary objective, the use of a new flocculating agent, a cationic crystalline nanocellulose was studied for the flocculation of microalgae biomass.
The systems developed to estimate the biomass concentration of microalgae employ chord length distribution data acquired by means of a focused beam reflectance probe. This method can provide near real-time data on the concentration of biomass, which would be useful in the monitoring of microalgae cultures in which the turbidity of the medium is appreciable and / or variable. This would be the case, for example, of crops that use treated wastewater as a growth medium or those in which the medium is reused.
The first method to estimate the concentration of microalgae biomass was developed for the characterization of suspensions of Chlamydomonas reinhardtii. The method was conceived so that the estimation of the concentration was obtained by correlation with the chord length distribution data of the suspensions using a perceptron-type artificial neural network, whose architecture was optimized by means of a simulated annealing algorithm. With this method, a mean square error of prediction of 0.031 (g L-1) 2 was achieved with the population of validation data.
The concept applied to the development of the biomass concentration estimation system of C. reinhardtii was applied to another strain, Chlorella sorokiniana, and in the correlation, other machine learning methods were used, namely random forest regression models and of
support vectors machines for regression. These conditions were applied for the purpose of verifying the previous approach with another strain of smaller cells (C. sorokiniana cells are about three times smaller than those of C. reinhardtii) and with other machine learning systems especially appropriate for cases in the that the number of variables to be used as predictors is high. In these cases, the mean squared prediction errors obtained were 0.087 (g L-1)2 and 0.081 (g L-1)2 respectively, although in this case, applying a cross-validation in which
all the data of the population are used as validation data.
The systems to estimate the three dimensional fractal dimension that were developed according to two different approaches. In one, the estimation of the parameter is done by comparing the projected fractal dimension of real and simulated flocs and, in the other, by interpreting the chord length distribution data of microalgal suspensions. The second method, which could be implemented online and in real time, could be employed to develop flocculation control systems that guarantee the aggregation of particles in flocs of optimum morphology to achieve their separation in ensuing concentration stages.
The estimation system of the fractal dimension by comparison consisted in the generation of virtual aggregates of known size and fractal dimension and later comparison of its projection in the plane with the images of real flocs taken by confocal laser scanning microscopy. With this method, fractal dimension estimation results compatible with those of the literature were obtained.
The software system for the generation, rotation and projection of virtual flocs developed for the implementation of the previous method, served as a platform for the creation of the fractal dimension estimation system by interpreting chord length distribution data. In this development, chord length data of virtual were used for training and optimization of a random forest regression model that was subsequently validated with real data. The real validation data were obtained by means of the probe of measurement by focused beam reflectance applied to suspensions of microalgae of different concentrations flocculated in the experimental conditions applied in the creation of the system to estimate fractal dimension by comparison. The chord length distribution-based estimation method was able to estimate the average fractal dimension of microalgal suspensions regardless of their concentration, giving very similar results to those provided by the comparison method, especially under medium agitation conditions, achieving an average discrepancy with respect to the reference values of 0.15.
This doctoral thesis is presented as a compendium of articles, being these related to the contents of this summary as follows. Articles I and II describe the development of machine learning models designed to estimate the dry biomass of microalgae in different state of aggregation through the interpretation of the rope size data of the corresponding suspensions acquired through a measurement probe by focused beam reflection. In Article III the application of a cationic crystalline nanocellulose as a flocculating agent in suspensions of microalgae is studied, models to describe the aggregation process are proposed and the effect of the geometry of the aggregates on the filterability of the suspensions is evaluated. Article IV describes the development of a methodology to estimate the average fractal dimension of suspensions of C. sorokiniana by means of the comparison between images of flocs taken by confocal laser microscopy and the projections of computer generated virtual flocs of known
fractal dimension. Article V addresses the development of a machine learning regression model to estimate the average fractal dimension of suspensions of microalgae flocs by interpreting the chord length distribution data acquired through a focused beam reflectance measurement probe.
Finally, the knowledge generated in this thesis has been applied to research fields other than the one addressed in this paper. In particular, the optimization of the hyperparameters and the application of models of support vector machines for the regression were applied in the article Morphological analysis of pulp from orange tree trimmings and its relation to mechanical properties (Aguado et al., 2016), and direct estimation system of the fractal dimension in the article entitled Hairy cationic nanocrystalline cellulose as a novel flocculant of clay clay (Campano et al. 2019, published in Journal of Colloid and Interface Science). Likewise, the general knowledge on machine learning acquired has been applied in the article titled Toward a description of the nanocrystalline cellulose aggregation state: correlating image analysis and Dynamic Light Scattering data (Campano et al., submitted to Langmuir).
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INTRODUCCIÓN
1.1.LAS MICROALGAS
Las microalgas son seres unicelulares eucarióticos en su gran mayoría fotoautotróficos con alta eficiencia fotosintética. Las microalgas son consideradas un grupo distintivo de microorganismos (Pulz and Gross, 2004). En virtud a su capacidad para transformar la energía lumínica en energía química, las microalgas, junto con las algas, son los productores primarios más importantes en las cadenas tróficas acuáticas, tanto en ecosistemas de agua dulce como en los salinos en todas las áreas climáticas del planeta.
Si bien el mecanismo de fotosíntesis de las microalgas es similar al de las plantas superiores, en la mayoría de los casos, la eficiencia en la conversión a biomasa de la energía solar es superior en las microalgas (Abdullah et al., 2017). La entidad de las microalgas en el ecosistema global queda patente si se tiene en cuenta que estos microorganismos se estima que son responsables de aproximadamente el 50% de la fijación de carbono orgánico global (Ratha and Prasanna, 2012).
Se cree que la variedad de microalgas es enorme, estimándose que pueden existir entre 200.000 y varios millones de especies de microorganismos en este grupo (Norton et al., 1996). La magnitud de estas cifras se pone de relieve por comparación con el número de especies de plantas superiores que se estima que existen en la actualidad y que estaría comprendido entre las 250,000 (Rieseberg, 1997) y las 320.000 (Prance et al., 2000).
Las microalgas con usos industriales conforman una gran familia de microorganismos productores primarios de biomasa. En general, las especies explotadas comercialmente se han dedicado a la producción de alimento vivo para acuicultura, alimentos funcionales, aditivos para piensos, productos químicos de alto valor en nutracéuticos, cosméticos y reactivos químicos (Liu et al., 2016; Priyadarshani and Rath, 2012). En los últimos años, las microalgas
han cobrado, además, cierta relevancia como elemento vehicular en la producción industrial de biocombustibles (Maeda et al., 2018) y en el desarrollo de sistemas sostenibles de tratamiento de aguas (Udaiyappan et al., 2017). Las microalgas constituyen una fuente potencial de sustancias de utilidad industrial. La tabla 1.1 recoge la composición en proteínas, carbohidratos y lípidos de algunas cepas de microalgas (Guccione et al., 2014; Illman et al., 2000; Mobin and Alam, 2017; Priyadarshani and Rath, 2012).
Tabla 1.1. Contenido en proteínas, carbohidratos y lípidos de biomasa de algunas cepas de microalgas expresado como porcentaje de biomasa seca.
Cepa Proteínas Carbohidratos Lípidos
Anabaena cylindrica 43–56 25–30 4–7 Botryococcus braunii 40 2 33 Chlamydomonas rheinhardii 48 17 21 Chlorella pyrenoidosa 57 26 2 Chlorella vulgaris 41–58 12–17 10–22 Chlorella sorokiniana 40‐45 25‐38 20‐24 Dunaliella bioculata 49 4 8 Dunaliella salina 57 32 6 Dunaliella tertiolecta 29 14 11 Euglena gracilis 39–61 14–18 14–20 Haematococcus pluvialis 17–25 32–37 36–40 Porphyridium cruentum 28–39 40–57 9–14 Prymnesium parvum 28–45 25–33 22–39 Scenedesmus dimorphus 8–18 21–52 16–40 Scenedesmus obliquus 50–56 10–17 12–14 Scenedesmus quadricauda 47 – 1.9 Spirogyra sp. 6–20 33–64 11–21 Spirulina maxima 60–71 13–16 6–7 Spirulina platensis 42–63 8–14 4–11 Synechoccus sp. 63 15 11 Tetraselmis maculata 52 15 3
Como puede colegirse de la tabla 1.1, la composición de las microalgas es diferente en función de la especie, y también presenta diferencias dentro de una misma cepa, estas últimas atribuibles a las condiciones en las que se realiza su cultivo (Chiranjeevi and Mohan, 2016). En esta tesis doctoral se han considerado dos especies de microalgas, Chlamydomonas reinhardtii y Chlorella sorokiniana. La selección de estas especies está condicionada por la actividad investigadora del Grupo de Investigación de Celulosa y Papel, que ha realizado estudios de floculación de cultivos de ambas especies en el marco de dos proyectos de investigación, en concreto el proyecto nacional CENIT VIDA, Valorización Integral De Algas (C. reinhardtii) y el proyecto con ref. 280756 del VII Programa Marco de la Comisión Europea titulado E4WATER, Economically and Ecologically Efficient Water Management in the European Chemical Industry. Las investigaciones desarrolladas dentro de la presente tesis, extienden y complementan los trabajos desarrollados en ambos proyectos en lo referente a la monitorización de las suspensiones floculadas de cepas cultivadas de las mencionadas especies.
La C. reinhardtii es una microalga clorófita de agua dulce de unos 10 μm de diámetro que cuenta con dos flagelo para desplazarse. Esta microalga se ha estudiado de forma intensiva
como modelo de organismo y en la actualidad está despertando mucha atención académica por su capacidad para la producción de hidrógeno (Noone et al., 2017), por su habilidad para nutrirse de fuentes de carbono orgánico en ausencia de luz y como plataforma para la producción de productos de alto valor recombinantes (Ramos‐Martinez et al., 2017), siendo tal vez la microalga cuyo metabolismo se conoce más en profundidad (Fields et al., 2018). La C. sorokiniana es un alga unicelular también clorófita y de agua dulce de unos 3 μm de diámetro. Esta microalga también puede crecer heterotróficamente y se caracteriza por exhibir unas tasas de crecimiento significativamente altas (Sorokin and Krauss, 1959) y por su capacidad para tolerar temperaturas elevadas (Cazzaniga et al., 2014), aspectos que la convierten en una buena candidata para el cultivo a gran escala (Cazzaniga et al., 2014) y el tratamiento de aguas residuales (Álvarez-Díaz et al., 2017), si bien el pequeño tamaño de sus células dificulta su separación.
1.1.1. Metabolitos de microalgas con potencial comercial
A diferencia de la biomasa procedente de las plantas, la biomasa de microalgas es pobre en lignina y muy rica en sustancias con valor comercial, tales como proteínas (40-70%), hidratos de carbono (12-30%), lípidos (4-20%), carotenos (8-14%) y vitaminas. Por su composición, las microalgas constituyen una alternativa muy atractiva para la producción de productos alimenticios destinados al consumo humano y animal, suplementos nutricionales, pigmentos, cosméticos, productos farmacéuticos y biocombustibles. Para dar una idea del potencial de estos microorganismos, en las últimas décadas se han identificado más de 15.000 nuevos compuestos en las microalgas (Cardozo et al., 2007). Entre los compuestos de mayor interés comercial que se pueden extraer de las microalgas cabe destacar los siguientes.
Ácidos grasos poliinsaturados
Los ácidos grasos poliinsaturados (AGP), conocidos por su acrónimo PUFA (en inglés poly-unsaturated fatty acids) se denominan así por contar en su cadena hidrocarbonada con más de un enlace doble carbono-carbono. En esta familia de compuestos se encuentran los ácidos omega-3, en concreto el ácido eicosapentaenóico (EPA) y el ácido docosahexaenóico (DHA). Ambos compuestos son ácidos grasos esenciales, o lo que es lo mismo, no sintetizables por el ser humano y son de crucial importancia para el sistema nervioso y en la regulación de la respuesta inflamatoria. Las microalgas son los productores primarios de ácidos grasos poliinsaturados en la cadenas tróficas marinas (Devos et al., 2006). Existe una gran variedad de especies de microalgas con capacidad para producir cantidades significativas de AGP, si bien posiblemente las especies con mayor proyección comercial en esta línea serían los géneros Nannochloropsis and Phaeodactylum como fuentes de EPA y el género Isochrysis como fuente de DHA (Ryckebosch et al., 2012).
Esteroles
Los esteroles son moléculas lipídicas policíclicas con unas funciones muy importantes en la fisiología de las células eucarióticas siendo componentes esenciales de la membrana celular e interviniendo, entre otros, en los procesos de reproducción celular y transducción de señales y en la modulación de la actividad de las enzimas unidas a la membrana. Ciertos esteroles presentes en las microalgas son capaces de inducir una disminución en los niveles de
colesterol en sangre (Devaraj et al., 2004), un efecto antiinflamatorio, y son precursores esenciales en la síntesis de vitaminas (Hamed et al., 2015).
Carotenoides
Los carotenoides, en su gran mayoría, son compuestos de la familia de los tetraterpenos, caracterizados pues por estar constituidos por 8 unidades de isopreno. Los carotenoides son compuestos con una actividad vital en las microalgas, pues están asociados a la captura y transmisión de la radiación lumínica y a la protección del centro de reacción fotosintético de la oxidación. En los animales, los carotenoides tienen actividad antioxidante, antiinflamatoria, antitumoral y son precursores de vitaminas como el retinol (Guedes et al., 2011). En acuicultura, los carotenoides se emplean para aportar pigmentación a crustáceos, como el camarón o la langosta, y a pescados de cultivo, como la trucha y el salmón.
Entre los carotenoides más relevantes producidos por las microalgas están el β-caroteno producido por la microalga halotolerante Dunaliella salina (Zhang et al., 2014) o la astaxantina, identificada como uno de los compuestos más potentes contra el estrés oxidativo que se conocen (Pashkow et al., 2008), que es producida principalmente por la microalga Haematococcus pluvialis.
Vitaminas
La biomasa de microalgas constituye una fuente de vitaminas, como por ejemplo, A, B1, B2, B6, B12, C, E, biotina, ácido fólico o ácido pantoténico (Gouveia et al., 2010). Ciertas especies de la Chlorella y de algas rojas (Rhodophyta) son conocidas por presentar altas concentraciones de cobalamina (vitamina B12) (de Jesus Raposo and de Morais, 2015). La presencia y contenido de estos compuestos depende de la especie, de las condiciones de crecimiento de la biomasa y de la fase del ciclo de crecimiento en que se encuentre la misma. Proteínas
Varias especies de microalgas son ricas en proteínas con un patrón de aminoácidos cuya biodisponibilidad es comparable a la de otras fuentes de proteínas, lo que apunta, a que estas especies podrían emplearse como fuente de proteína alimentaria (Hamed et al., 2015). Algunas especies presentan un contenido significativamente alto de proteínas, como el caso de especies de Spirulina, Chlorella e Isochrysis. Varias especies de Spirulina se han empleado desde antiguo como fuentes de proteínas por parte de civilizaciones como la azteca (Santley and Rose, 1979) o la maya y las comunidades de África Central que rodean al lago Chad siguen cosechando Spirulina platensis con fines alimentarios (Chen et al., 2016). Esta especie presenta un contenido proteico de entre el 60 y el 70%.
Polisacáridos
Dadas la relativamente alta velocidad de crecimiento de las microalgas cuando se controlan las condiciones de crecimiento, se considera que la mayor parte de polisacáridos producidos por microalgas podría tener aplicaciones industriales y comerciales.
Polisacáridos aislados de microalgas producidas comercialmente como la Spirulina platensis (LI et al., 2007a), la Dunaliella salina (Murthy et al., 2005) o la Isochrysis galbana (Sun et al., 2014) han mostrado propiedades antioxidantes muy notables.
De especial interés son los polisacáridos de la pared celular de ciertas microalgas rojas (Porphyridium sp.), un exopolisacárido de galactano sulfatado (EPS) que presenta una alta viscosidad en soluciones de baja concentración, comparable a los alginatos y a la goma guar (Bernaerts et al., 2018). Los polisacáridos de este tipo, presentan, además, propiedades antiinflamatorias (Wijesekara et al., 2011), antivíricas (Arad et al., 2006) y antitumorales (Sakamoto et al., 2003).
1.1.2. Métodos de cultivo de microalgas
El sistema de cultivo de microalgas a emplear de cara a la explotación comercial de la biomasa, depende principalmente del destino que se va a dar a esta última (Acién et al., 2018). Los sistemas de cultivo comercial de microalgas se suelen clasificar en dos categorías principales, los sistemas abiertos y los sistemas cerrados.
Los sistemas abiertos son estanques artificiales que pueden contar con un sistema de mezcla o carecer de él (balsas). Los primeros pueden ser de forma circular y mezclado a través de un agitador de eje central, de canales con agitación por paletas (raceways) o inclinados (Borowitzka and Moheimani, 2013). Los sistemas abiertos requieren inversiones relativamente bajas, son fáciles de manejar y baratos de mantener. Por otro lado, presentan baja productividad y, al estar el cultivo en contacto directo con la atmósfera, son susceptibles de contaminación y no permiten un buen control de las condiciones de proceso.
Los sistemas cerrados de aplicación comercial son los fotobiorreactores (FBR), en los que el cultivo no está en contacto directo con la atmósfera del entorno. El aislamiento del cultivo permite, por un lado, controlar las condiciones de operación de forma que se maximice la productividad del sistema, y por otro, evitar contaminaciones de otros microorganismos. Los fotobiorreactores se diseñan en base a dos configuraciones básicas, la tubular y la plana. A partir de estas dos tipologías, existe un gran número de configuraciones derivadas con geometrías, orientaciones y sistemas de circulación muy variadas (Liao et al., 2018).
Además de la geometría del reactor, en los sistemas cerrados es de suma importancia la forma en que se consigue la impulsión o agitación del cultivo y la manera en la que se favorece el intercambio de gases necesario para permitir un crecimiento y mantenimiento de la biomasa óptimos (Wang et al., 2012).
Los principales tipos de fotobiorreactores son los siguientes: Columnas verticales
Fotobiorreactores tubulares orientados verticalmente en los que la agitación y el mezclado se consiguen por inyección de aire enriquecido en CO2 por la base de la columna. Suelen tener
hasta 0,2 m de diámetro y hasta 4 m de altura. Presentan altos coeficientes volumétricos de transferencia de gases, permitiendo un buen suministro de CO2 y eliminación de O2 (que
puede inhibir la fotosíntesis), con lo que el crecimiento de las microalgas suele estar limitado por otros parámetros como la temperatura o la intensidad de luz (Wang et al., 2012).
Fotobiorreactores de placas planas
Son reactores en los que el cultivo se mantiene en una lámina relativamente fina por medio de dos superficies paralelas de material transparente o translúcido, lo que se traduce en una elevada relación de superficie a volumen. Tal configuración facilita enormemente la iluminación del cultivo. La orientación de los paneles en estos reactores puede ser vertical o inclinada al objeto de favorecer la captación de luz solar. Estos sistemas presentan ciertas limitaciones asociadas a la deposición de células sobre la superficie del material contenedor del medio. Los paneles de captación de este tipo de reactores se suelen fabricar de plástico rígido o flexible (bolsas). En general los paneles de plástico rígido suelen tener unas dimensiones que eviten el empleo de materiales de alta resistencia mecánica (Acién Fernández et al., 2013).
Fotobiorreactores tubulares.
Este tipo de reactor es el sistema de cultivo cerrado más popular. Los FBR tubulares están constituidos por tubos transparentes dentro de los cuales se hace circular el cultivo. Los tubos suelen tener un diámetro menor que 0,1 m para asegurar la trasferencia de luz al medio de cultivo (Wang et al., 2012). Los reactores se construyen de acuerdo a una amplia variedad de diseños, pudiendo ser rectos, curvados, en espiral o mixtos. Como en el caso anterior, pueden encontrarse en orientaciones vertical, horizontal e inclinada. La circulación del cultivo en los tubos se consigue por bombeo directo o a través de un sistema airlift. Al objeto de eliminar el oxígeno producido en la fotosíntesis, se pasa el cultivo a través de una columna de burbujeo, donde se suministra aire y CO2 y se controla la temperatura del medio (Acién Fernández et
al., 2013). Este tipo de FBR permite un alto grado de control del proceso y una buena productividad. Las desventajas que presenta este tipo de sistemas están asociadas a la necesidad de aportar la necesaria turbulencia en el interior de los tubos que garantice la iluminación adecuada del cultivo y a la necesidad de evitar la acumulación de oxígeno disuelto, que a su vez impone limitaciones a la longitud máxima de los tubos. La mayor parte de la producción comercial a gran escala de microalgas se lleva a cabo en reactores tubulares (Borowitzka, 2018).
1.1.3. Cosechado de microalgas
El cosechado de microalgas es el proceso o procesos conducentes a la obtención de una pasta de microalgas con un contenido de agua reducido. El cosechado de microalgas, no comportando grandes dificultades a nivel técnico, constituye un reto de ingeniería a la hora de abordar una producción comercialmente viable de esta biomasa (Christenson and Sims, 2011) dada la baja concentración de biomasa que se alcanza en los FBR, el pequeño tamaño de las células de microalgas, entre 2 y 30 μm (Li et al., 2008; Zhang et al., 2010b), y su densidad, similar a la del agua.
El cosechado se suele llevar a cabo en una o dos etapas (Brennan and Owende, 2010). La aplicación de un enfoque u otro va a depender de los requisitos del producto final y del precio de la biomasa. En términos generales, el cosechado en dos etapas es de aplicación más común. En este caso se contempla una etapa de pre-concentración o cosechado primario (thickening empleando la terminología anglosajona) y otra de cosechado secundario (dewatering).
Cuando el cosechado se realiza en dos etapas, en la primera se parte de una suspensión diluida de microalgas, típicamente con una concentración entre 0.02 y 0.06 % de sólidos totales en suspensión, y se llega a una suspensión con una concentración de entre el 2 y el 7 % de sólidos totales. De esta suspensión intermedia se llega a una pasta con una concentración de entre el 5 y el 25 % de sólidos (Uduman et al., 2010a). Una revisión bastante exhaustiva de las técnicas de concentración de microalgas puede encontrarse en Barros et al. (2015). Las principales técnicas de cosechado primario de microalgas se resumen a continuación.
Floculación/coagulación
La floculación/coagulación es el proceso por el cual se consigue desestabilizar una suspensión por medio de la adición de compuestos químicos que promueven la agregación de las partículas desestabilizadas, que posteriormente se separan del medio clarificado obteniéndose una suspensión más concentrada que la de partida. La coagulación implica la neutralización de las cargas superficiales de las partículas en suspensión que formarían micro-flóculos, y la floculación consiste en la agregación de dichos agregados en otros de mayor tamaño. El proceso de agregación se puede llevar a cabo con sistemas dobles, es decir, aplicando coagulantes y floculantes, o en una sola etapa, normalmente empleando solo floculantes. Como sustancias coagulantes suelen emplearse sales metálicas, p. ej., de hierro o aluminio, si bien, en muchos casos estos coagulantes no son compatibles con el uso final de las microalgas y pueden impedir la reutilización del medio clarificado en el cultivo. En cuanto a los floculantes, se suelen emplear polímeros naturales o sintéticos, normalmente catiónicos en virtud a su capacidad de reducir o neutralizar la carga superficial negativa de las microalgas. El empleo de polímeros catiónicos como la poliacrilamida de alto peso molecular, el quitosano o el almidón cationizado se han empleado satisfactoriamente en la floculación de microalgas (Show and Lee, 2014), especialmente en especies de agua dulce. Como en el caso de los coagulantes, la elección del floculante a aplicar ha de tener en cuenta el destino final de la biomasa producida.
La floculación/coagulación es, a día de hoy, la técnica que más interés está suscitando como medio para mejorar la viabilidad económica de la producción de microalgas (Wan et al., 2015) por su versatilidad y bajo coste. La floculación/coagulación suele asociarse a una operación posterior de sedimentación.
Autofloculación
Consiste en inducir la floculación natural de las microalgas a través de un incremento del pH del medio, normalmente mediante la adición de hidróxidos de calcio, magnesio o sodio. Si bien se considera un proceso barato, su aplicación a nivel industrial no está extendida por la falta de control sobre el proceso de agregación, que depende de un elevado número de factores (Sirin, 2013). Además, el incremento de pH del medio limita la reutilización del medio de cultivo.
Biofloculación
La biofloculación es la agregación de las microalgas a través de los polisacáridos externos segregados por bacterias u hongos con las que se cultivan. La biofloculación se ha conseguido también cultivando conjuntamente cepas de microalgas auto-floculantes con otras que no
presentan esta capacidad (Salim et al., 2011). Si bien la biofloculación evita el empleo de floculantes que pueden resultar contaminantes para el cultivo, la biomasa agregada resultante presenta una contaminación biológica que puede ser incompatible con numerosas aplicaciones. Por otro lado, en ocasiones, el cultivo conjunto de microalgas y otros microorganismos puede requerir un sustrato suplementario como fuente de carbono para estos últimos, con el consiguiente encarecimiento del cultivo.
Sedimentación
La sedimentación es un proceso de concentración de bajo coste, aunque su aplicación directa para concentrar los cultivos de microalgas no se considera una opción viable a nivel industrial, principalmente por las bajas velocidades de sedimentación, entre 0.1 y 2.6 cm h-1 debidas al
pequeño tamaño de las partículas en suspensión del medio, y la posibilidad de que la biomasa sufra deterioros en el proceso (Eldridge et al., 2012). La sedimentación se suele aplicar, por lo tanto, en combinación con procesos de floculación/coagulación (Grima et al., 2003).
Flotación por aire disuelto
En la flotación se consigue la adhesión de las células del cultivo a un caudal de burbujas de aire, que las arrastra formando una espuma rica en la biomasa en la parte superior del equipo. La flotación se considera más eficiente que la sedimentación (Hanotu et al., 2012) cuando se aplica directamente al cultivo de microalgas, si bien, como en el caso anterior suele aplicarse en combinación con una etapa de floculación/coagulación. La flotación presenta una serie de ventajas interesantes, entre ellas, que se ha demostrado la viabilidad de su empleo a escala industrial para suspensiones de partículas minerales o en tratamientos de agua (Rubio et al., 2002) y que requiere de un espacio reducido para su instalación.
Técnicas alternativas
Existen otras técnicas para conseguir la preconcentración de la biomasa de microalgas, como son la electro-flotación y la electro-coagulación seguida de flotación. La electro-flotación es similar a la flotación por aire disuelto, si bien en la primera técnica las burbujas se generan a través de la electrolisis del agua. La electro-flotación puede considerarse una alternativa a la flotación en el caso de producciones a pequeña escala (Kyzas and Matis, 2016). La electro-coagulación seguida de flotación se basa en la producción de cationes metálicos in-situ a partir de la oxidación electrolítica de un ánodo metálico (Vandamme et al., 2011). Al igual que en el caso de la coagulación con sales metálicas, la biomasa floculada presenta contaminación por iones metálicos, si bien en este caso en un grado notablemente menor (Vandamme et al., 2013). La implantación de estos métodos es a día de hoy minoritaria debido a los costes de operación asociados que presentan (Christenson and Sims, 2011). Procesos de cosechado secundario
Estos procesos suelen ser de tipo mecánico, siendo los más importantes la centrifugación y la filtración.
Centrifugación
La centrifugación es efectiva en la separación de la biomasa preconcentrada de microalgas, y en algún caso también del cultivo sin preconcentrar. La aplicación de esta técnica tiene
asociada unos altos costes energéticos, que convierten a la centrifugación en la alternativa más cara para conseguir la concentración de la biomasa de microalgas (Barros et al., 2015). La centrifugación puede ser, por lo tanto, una alternativa viable cuando el destino final de la biomasa es la producción de sustancias de alto valor añadido, siendo su aplicación demasiado costosa para la producción de sustancias de bajo valor (Dassey and Theegala, 2013). En cualquier caso, la eficiencia económica de la centrifugación puede mejorarse si se combina con otras técnicas de cosechado primario, como la floculación-sedimentación (Fasaei et al., 2018; Milledge and Heaven, 2013).
Filtración
Un buen número de estudios han demostrado la efectividad de la filtración en diferentes variantes como técnica de concentración de la biomasa de microalgas (Mathimani and Mallick, 2018; Singh and Patidar, 2018). Además, los consumos energéticos asociados a los procesos de filtración son relativamente bajos. El principal inconveniente que presenta esta alternativa de concentración estriba en la ocurrencia frecuente de fenómenos de ensuciamiento del medio filtrante (Milledge and Heaven, 2013). Al igual que en el caso de la centrifugación, se ha demostrado que la combinación de la filtración con otros procesos de preconcentracion, especialmente, floculación y sedimentación, puede mejorar la eficiencia económica del proceso (Fasaei et al., 2018; Singh and Patidar, 2018).
1.1.4. Producción comercial de biomasa de microalgas
El cultivo a nivel comercial de biomasa de microalgas está orientado a la producción de sustancias de alto valor añadido, dado el elevado coste asociado a la producción de estos microorganismos (Suganya et al., 2016). Los costes de producción más bajos referidos por suministradores están en torno a los 5 € kg −1 de biomasa seca de D. salina (cultivo en balsas),
mientras que para algunas especies los costes pueden ser superiores a los 30 € kg−1, como por
ejemplo en el caso de la biomasa de H. pluvialis cultivada en fotobiorreactores tubulares (Borowitzka, 2018).
En la actualidad, la producción de biomasa de microalgas destinadas al consumo humano o animal se concentra principalmente en Asia, destinándose la mayor parte de la producción al mercado de los suplementos nutricionales y, de forma minoritaria, a la producción de productos alimenticios (Vigani et al., 2015). Si bien el uso de microalgas para la producción masiva de proteínas o carbohidratos dista de ser una realidad a día de hoy, la Unión Europea está orientando parte de sus recursos de investigación y desarrollo para que la producción industrial de microalgas llegue a materializarse (Enzing et al., 2014).
A día de hoy es posible encontrar empresas dedicadas a la producción de biomasa de microalgas destinada a la fabricación de biocombustibles (Maeda et al., 2018). La producción de estos últimos en términos absolutos es anecdótica en comparación con la de combustibles fósiles o la procedente de otros combustibles basados en la biomasa.
Sin tener en cuenta las barreras no tecnológicas, la viabilidad de la producción industrial de microalgas pasa por reducir los costes totales asociados a la obtención de este tipo de biomasa. En el caso de la producción de biocombustibles, se estima que los costes de producción
