FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA DEPARTAMENTO DE FARMACIA TRABAJO DE DIPLOMA

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FACULTAD DE QUIMICA Y FARMACIA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

TRABAJO DE DIPLOMA

TÍTULO: MODELACIÓN Y PREDICCION DE LA ACTIVIDAD

ANTINFLAMATORIA EN COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL Y

SINTETICO

AUTOR: VIUDEINYS CHAVIANO BORGES TUTORES: MSc. LUIS A TORRES GOMEZ

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Indice

INDICE

Página

Introducción

...13

Capitulo I

Fisiología de la inflamación...16

1.1 Procesos inflamatorios...16

1.2 Mediadores bioquímicos de la inflamación...17

1.2.1

Vía de la Lopooxigenasa...18

1.2.2

Vía de la Ciclooxigenasa...19

1.3 Mecanismo de acción de los antinflamatorios...22

1.4 Antinflamatorios novedosos...25

1.5 Saponinas...26

Capitulo II

Diseño de fármacos...28

2.1 Clasificación de los métodos de diseño de fármacos...28

2.1.1 Métodos varacionales...30

2.1.2 Métodos QSAR...30

2.2 ToSS MoDE...31

2.2.1 Momentos especterales...31

2.2.2 Momentos espectrales ponderados...32

2.2.3 Momentos espectrales locales...33

2.3 ToSS MoDE como método QSAR...33

Capitulo III

Materiales y métodos...35

Capitulo IV

Resultados y discusión...38

4.1 Análisis y contribución de enlace a la propiedad...41

4.2 Evaluación de metabolitos de plantas medicinales...47

Conclusiones

...49

Recomendaciones

...51

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RESUMEN

En el trabajo se aplica la aproximación ToSS-MoDE a la modelación subestructural de la actividad antiinflamatoria de compuestos tanto de origen natural como sintéticos, con vistas a ello se realizó el cálculo de los momentos espectrales de la matriz de adyacencia entre aristas del grafo molecular con hidrógenos suprimidos, ponderada en la diagonal principal con momentos dipolos estándar de enlace a 410 compuestos activos e inactivos. Los descriptores calculados fueron usados en el diseño de una serie de entrenamiento y otra de predicción Con la serie de entrenamiento se desarrolló una función discriminante para la actividad antiinflamatoria mediante el análisis Discriminante por Regresión Lineal Multivariada obteniéndose una buena clasificación total de 91.59 %. El modelo fue validado mediante el uso de la serie de predicción obteniéndose una buena clasificación de un 90.2 %. Adicionalmente se realizó el cálculo de la contribución de enlaces a la propiedad y se evaluaron en el modelo nuevos compuestos de origen natural, siendo corroborada la actividad de la Diosgenina, experimentalmente.

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13 INTRODUCCION

INTRODUCCION:

La inflamación es en proceso natural , producido por el Sistema Autoinmune del organismo ,la cual esta mediada por deferentes sustancias endógenas, tales como:

prostaglandinas (PGs), prostaciclina (PGI2), leucotrienos (LTs) y tromboxanos (TXs), moléculas de carácter lipídico con acciones fisiológicas diversas y en ocasiones contrapuestas que poseen la característica común de ser sintetizadas a partir de ácidos grasos poliinsaturados .

El proceso inflamatorio esta acompañado por signos como eritema, hipersensibilidad y dolor1, por esto, en nuestros días se han obtenido un sinnúmero de fármacos con actividad antinflamatoria, los cuales generalmente posen además acción analgésica y antipirética, tal es el caso de los AINES, pero estos aunque posen gran actividad, son altamente tóxicos para los sistemas digestivos y renal, por solo citar algunos, es por ello que se acude al empleo de los derivados de plantas medicinales potencialmente menos tóxicos, pero desconocido en un buen número de casos los metabolitos responsables de la actividad, siendo de vital importancia la obtención de nuevos fármacos más potentes y menos tóxicos , lo cual se ha hecho factible gracias a que en los primeros años de la década de los sesenta se desarrolló a través de los esfuerzos de Corwen Hansch y su computadora una metodología factible para cuantificar la actividad biológica.

Los primeros intentos dirigidos a incrementar la probabilidad de sintetizar un compuesto activo se basaron en encontrar correlaciones entre la estructura química de una serie de compuestos y su actividad biológica; surgiendo así el término QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) que hoy es una palabra de uso corriente tanto en el proceso de diseño de un fármaco como en el de racionalización de una serie de propiedades farmacológicas.

Actualmente se ha desarrollado una aproximación grafo-teórica que ha sido utilizada para expresar las propiedades físicas 2,3,4 y propiedades biológicas5 en función de términos subestructurales, este método está basado en el cálculo de los momentos espectrales (μ) de la matriz de adyacencia entre aristas del grafo molecular3.

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14 INTRODUCCION

En nuestro centro el grupo de diseño computacional de fármacos ha logrado aproximaciones al diseño racional de fármacos con el uso de métodos basados en la teoría de grafos moleculares según aproximaciones muy eficientes de la estructura molecular y las mismas han sido implementadas en varios paquetes computacionales, entre los que se destacan el MODEST (Molecular Design Tool) y el ToSS MoDe ( Topological Sub-Structural Molecular Design). En el presente, la aproximación I ToSS MoDe basada en el cálculo de los momentos espectrales de la matriz de adyacencia entre los enlaces, representa una alternativa al diseño racional de fármaco y en este sentido se ha desarrollado un modelo para la predicción de la actividad antinflamatoria de compuestos sintéticos. Sin embargo, resulta indispensable corroborar el efecto farmacológico predicho, a través de pruebas experimentales convencionales que establezcan definitivamente la validez de la predicción. Con estos propósitos nos trazamos los siguientes objetivos para nuestra investigación:

♦ Calcular los momentos espectrales para dos grandes series de compuestos una constituida por compuestos de probada acción antinflamatoria y otra por una gran variedad de estructuras de fármacos no antinflamatorios generando una serie de entrenamiento y otra de predicción .

♦ Aplicar la aproximación ToSS-MoDe a un problema de clasificación de fármacos con el uso de la técnica de análisis discriminante, encontrando un modelo matemático óptimo que lo describa.

♦ Validar el modelo encontrado mediante la evaluación de los compuestos de la serie de predicción.

♦ Interpretar el modelo en términos estructurales que permitan explicar desde el punto de vista químico-físico la acción antinflamatoria.

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Capitulo I 16

1.1 Procesos inflamatorios

La inflamación es una reacción fisiológica y su importancia para el organismo es trascendental. Su sentido biológico es intentar aislar y destruir un agente interno o externo que está produciendo una agresión hística. Se manifiesta por signos como eritema, hipersensibilidad y dolor1.

Tiene tres fases mediados por mecanismos diferentes. La fase aguda se caracteriza por vasodilatación local y aumento de la permeabilidad capilar, como resultado de la liberación por las células endoteliales de los vasos sanguíneos del Factor Relajante Derivado del Endotelio (EDRF) capaz de relajar la musculatura lisa de los mismos. Los mastocitos también contribuye porque al ser estimulados por anticuerpos IgE, traumatismos o estímulos químicos liberan histaminas y heparinas6. Los macrófagos tisulares constituyen la respuesta defensiva al proceso inflamatorio en esa etapa.

Durante la fase subaguda, los leucocitos polimorfonucleares así como los monocitos se adhieren a las células endoteliales y atraviesan la pared del vaso sanguíneo por el poder atractivo de las quimiotaxinas, una segunda línea de defensa. Como consecuencia de la inflamación el número de neutrófilos aumentan los cuales liberan enzimas hidrolíticas para eliminar material extraño; estos generan una cantidad considerable de radicales superóxido de tal manera que la superóxidodesmutasa encargado de eliminar estos radicales libres en condiciones normales no es capaz de hacerlo. Estos radicales son especies de extraordinaria reactividad química, que es capaz de destruir no solo a los agentes agresores sino también a las células normales del tejido inflamado, lo cual constituye uno de los riesgos de la inflamación.

Los eosinófilos que acuden al lugar detoxifican algunas de las sustancias liberadas por los mastocitos y los basófilos y fagocitan el complejo antígeno anticuerpo evitando la extensión del proceso inflamatorio local.

La transformación de los monocitos en macrófagos los hace ser considerado la tercera línea de defensa. La cuarta línea de defensa tisular depende de la producción acelerada de granulocitos y monocitos por la médula ósea. Durante los eventos inflamatorios se evidencia una fase crónica proliferativa, en la cual se produce degeneración tisular y fibrosis7.

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Capitulo I 17

1.2 Mediadores bioquímicos de la inflamación

Se han identificado numerosas sustancias endógenas implicadas en la respuesta inflamatoria y dentro de ellas se le concede especial importancia a los eicosanoides, que incluyen: prostaglandinas (PGs), prostaciclina (PGI2), leucotrienos (LTs) y tromboxanos (TXs), moléculas de carácter lipídico con acciones fisiológicas diversas y en ocasiones contrapuestas que poseen la característica común de ser sintetizadas a partir de ácidos grasos poliinsaturados esenciales de 20 átomos de carbono, siendo el ácido araquidónico el más abundante en el organismo humano. Este precursor deriva del metabolismo del ácido linoleico o se ingiere como componente de la carne, y se almacena formando parte de los fosfolípidos de la membrana celular. Su liberación se desencadena en respuesta a impulsos nerviosos, reacciones inmunitarias, daño celular, isquemias, y es el paso limitante que condiciona la velocidad de síntesis de los eicosanoides. En ella intervienen dos mecanismos diferentes, el primero catalizado por la fosfolipasa A2, la cual escinde la estructura de los glicerofosfolípidos liberando el ácido graso y un lisofosfolípido, y el segundo, mediado por la fosfolipasa C, separa el fosfolípido en la unión éster fosfato produciendo 1, 2 - diacilglicerol sobre el cual actúan diversas lipasas originando ácido araquidónico y glicerol.

El ácido araquidónico liberado puede tener tres finalidades diferentes: difundir fuera del entorno celular sin causar efecto alguno, ser reincorporado a los fosfolípidos de la membrana, mecanismo responsable de su baja concentración en circunstancias basales, o actuar como sustrato de tres sistemas enzimáticos fundamentales: la ciclooxigenasa que origina los prostanoides y TXs, las lipoxigenasas que median la producción de LTs y otros eicosanoides, y el citocromo P-450 que origina los denominados productos de la vía de la epoxigenasa.

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Capitulo I 18

1.2.1 Vía de la lipooxigenasa

Las lipooxigenasas constituyen una familia de enzimas citosólicas encargadas de oxidar los ácidos grasos poliénicos formando los correspondientes endoperóxidos lipídicos. El ácido araquidónico sufre diversas transformaciones, siendo la más importante la obtención de LTA4 por la 5-lipooxigenasa. Su semivida es corta y por acción de la leucotrieno A se hidroliza y se convierte en LTB4 o se conjuga con glutatión dando lugar al LTC4. A partir de este se origina el LTD4 por la separación del ácido glutámico, y el LTE4 por la posterior pérdida de glicina. La recuperación siguiente del ácido glutámico es el origen del LTF4.

La actuación de la 12 y la 15-lipooxigenasa sobre el ácido araquidónico producen otros eicosanoides que no están involucrados en la respuesta inflamatoria.

En cuanto a la caracterización de los receptores para LTs se admite la existencia de un receptor común LTD4/LTE4, cuya activación estimularía la fosfolipasa C, modulando tanto la producción de inositolfosfato como la movilización de Ca++ y la génesis de metabolitos del ácido araquidónico con funciones de segundos mensajeros intracelulares. Estudios con radioligandos sugieren la presencia de receptores LTB4 y LTC4 capaces de aumentar la producción de inositolfosfato. La actividad biológica del resto de los metabolitos de la vía de la lipooxigenasa no parece estar mediados por receptores convencionales.

Los productos obtenidos por la ruta metabólica que involucra la actividad de la 5-lipooxigenasa formados y liberados por neutrófilos, eosinófilos y macrófagos convenientemente estimulados, son los más involucrados en la respuesta inflamatoria. El LTB4 ejerce una poderosa acción quimiotáctica que favorece la concentración de neutrófilos, su desgranulación, agregación y adherencia a las paredes poscapilares, produciendo además hiperalgesia. El LTB4, LTC4 y LTE4 aumentan la permeabilidad vascular y la exudación plasmática (Tabla 1)

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Capitulo I 19 LTs PERMEABILIDA D VASCULAR TONO VASCULAR DOLOR QUIMIOTAXIS LTB4 Aumento en presencia de neutrófilos Reducción Hiperalgesia en presencia de neutrófilos

Muy intensa sobre neutrófilos y eosinófilos

LTC4 Aumento ligero Aumento _ _

LTD4 Aumento Reducción _ _

Tabla #1 Funciones de los principales LTs en la inflamación aguda8

Los LTs también actúan a otros niveles en el organismo, como el sistema cardiovascular, renal y digestivo, así como en el sistema nervioso central, donde la principal vía metabólica del ácido araquidónico es la 12-lipooxigenasa.

1.2.2 Vía de la ciclooxigenasa

Por la importancia que tienen las prostaglandinas en el proceso inflamatorio y el mecanismo de acción de los AINEs, a continuación describimos esta vía.

La síntesis de los prostanoides y TXs se inicia en una primera etapa catalizada por la prostaglandina endoperóxido sintetasa (PGH sintetasa) o ciclooxigenasa (COX), que convierte el ácido araquidónico en PGH2. La PGH-sintetasa es una glicoproteína de membrana que posee dos actividades catalíticas: una ciclooxigenasa, encargada de insertar dos moléculas de oxígeno en el ácido araquidónico, ciclándolo y produciendo un endoperóxido intermedio denominado PGG2, y una peroxidasa, que cataliza la reducción del grupo 15-hidroperóxido de la PGG2 al alcohol correspondiente para convertirla en PGH2 . Ambas actividades se encuentran en sitios distintos de la enzima pero

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Capitulo I 20

interactuantes entre sí. Estas dos PGs se denominan genéricamente endoperóxidos intermedios, y aunque son químicamente inestables poseen intensa actividad biológica. La mayoría de los tejidos son capaces de sintetizar estos endoperóxidos intermedios. A partir de la PGH2 las endoperóxido isomerasas sintetizan PGE2 y PGD2, mientras que por reducción se origina PGF2α. En algunos tejidos existe una interconversión de PGE2 en PGF2α catalizada por una 9- cetorreductasa. La PGH2 también es el origen de dos compuestos inestables y muy potentes: el TXA2 que se crea por la actuación de la tromboxano sintetasa y se metaboliza rápidamente y el TXB2 que se obtiene por vía no enzimática, mucho más estable químicamente pero biológicamente menos potente. La PGI2 se obtiene como consecuencia de la actuación de la prostaciclina sintetasa sobre la PGG2 y la PGH2, hidrolizándose con rapidez en un metabolito inactivo, la 6-ceto PGF1α y en otro activo, la 6- ceto PGE1

La acción de las PGs es consecuencia de su interacción con diversos receptores específicos localizados en las membranas celulares y asociados a proteínas G, denominándose de acuerdo con la PG natural por la que muestran mayor afinidad.

En la mayoría de los casos la estimulación de estos receptores activa el sistema adenilciclasa, con el consiguiente incremento en los niveles de monofosfato de adenosina cíclico (AMPc), o la fosfolipasa C aumentando la concentración de Ca++ intracelular y diacilgliceroles.

La PGE2 y la PGI2 son las más comprometidas en la respuesta inflamatoria y durante los procesos más inmediatos de la inflamación, los mastocitos liberan PGD2. Son potentes vasodilatadores, lo que provoca que las arteriolas precapilares aumenten su calibre, conduciendo al típico color rojo en la piel correspondiente a las áreas inflamadas. Potencian el efecto sobre la permeabilidad vascular de otros mediadores como bradicinina, histamina y 5-hidroxitriptamina, provocando la formación del típico edema y aumentando el efecto doloroso de las cininas, y favorecen la acción permeabilizadora del complemento. Frente a estas acciones claramente proinflamatorias, la PGE2 puede ejercer otras antagónicas, como la inhibición de la producción de interleucina-1 (IL-1) y la formación de LTs y radicales superóxido por parte de los neutrófilos, así como de la proliferación de linfocitos T. Este efecto regulador es muy limitado, predominando su acción inflamatoria.

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Capitulo I 21

Las prostaglandinas tienen otras funciones fisiológicas definidas en diversos sistemas del organismo.

¾ La génesis de la fiebre en el SNC.

¾ La PGI2 es uno de los inhibidores más potentes de la agregación plaquetaria.

¾ La PGE2 impide la liberación de LTs y de radicales superóxido por parte de los polimorfonucleares e impide la activación de los linfocitos B y T.

¾ La PGI2 como sustancia vasodilatador y antiagregante, sería el contrapuesto de la PGH2, y sobre todo del TXA2 plaquetario, potente proagregante y constrictor vascular. La alteración del delicado equilibrio PGI2 / TXA2 determina el comienzo de la formación de trombo.

¾ En el riñón, la PGE2, la PGI2 y la PGD2 son vasodilatadoras, aumentan el flujo facilitando la diuresis y la eliminación de sodio y potasio, e inducen la producción de renina mediante acción directa sobre las células yuxtaglomerulares. Además, la PGE2 reduce la reabsorción de agua estimulada por la hormona antidiurética (ADH) en la porción ascendente del asa de Henle. Los endoperóxidos cíclicos, el TXA2 y la PGF2α son preferentemente constrictores, inhibiendo el flujo sanguíneo y la filtración glomerular.

¾ En el tracto gastrointestinal las PGE2 y PGI2 actúan como vasodilatadores de la mucosa, incrementan la producción de moco y bicarbonato y ejercen efectos protectores frente a las acciones lesivas de un elevado número de agentes ulcerógenos. Las PGs son sintetizadas de forma continua por la mucosa, y su producción aumenta en respuesta a la agresión. Este hecho, y el que la inhibición farmacológica de la COX sea una de las principales causas de erosiones gastrointestinales, sugiere un papel fisiológico de las PGE2 y la PGI2 en el mantenimiento de la integridad del epitelio digestivo8.

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Capitulo I 22

Las investigaciones sobre el papel de las prostaglandinas (PG) en la inflamación han sido divididas en dos preguntas fundamentales. Una supone que las PGs son pro- inflamatorias, explicando por qué los AINEs ejercen su efecto antinflamatorio previniendo la conversión del ácido araquidónico a PG estable a través de la inhibición del ciclooxigenasa. El otro supone que las PGs son antiflamatorio, explicando las reducciones en la inflamación producidas por estas sustancias en varios modelos experimentales de artritis.

Se han identificado varias acciones pro inflamatoria de las PG, incluso la vasodilatación e hiperalgesia. Sin embargo, estas actividades son relativamente modestas y no parecen ser considerados por los efectos antinflamatorios de los AINEs; de hecho, existen mecanismos para estos efectos que no dependen de la inhibición de ciclooxigenasa.

Se han identificado varios mecanismos potenciales para los efectos antinflamatorios de la PGE, incluyendo la inhibición de la activación de neutrófilos, liberación de superóxido y leucotrienos B4 y la producción de citoquinas. Es probable que la disponibilidad oral de análogos de la PGE activa permitirá el estudio que lleva a un íntegro entendimiento de la actividad de las PGs y una respuesta a la pregunta si tales agentes demostrarán un tratamiento útil de las enfermedades inflamatorias crónicas9.

1.3 Mecanismo de acción de los antinflamatorios

Los AINEs inhiben la COX, enzima responsable de la conversión del ácido araquidónico al intermediario endoperóxido inestable PGG2, primera etapa de la síntesis de PGs y TXs. El sitio activo de esta enzima es un largo canal hidrófobo del cual queda excluido el ácido araquidónico por acción de estos fármacos, impidiéndose la sustracción del H en el carbono 13 y la peroxidación posterior de los carbonos 11 y 15. La inhibición enzimática se logra por tres mecanismos diferentes.

1- La inactivación irreversible de la enzima, forma en que actúa el Ácido acetil salicílico y algunos derivados acetilados, provocando una reacción de acetilación covalente del sitio activo de la enzima, específicamente en el último aminoácido, la

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serina 530 N-terminal, alterando la conformación molecular con pérdida de la actividad COX.

2- La inactivación irreversible de la enzima, forma en que actúa el Ácido acetil salicílico y algunos derivados acetilados, provocando una reacción de acetilación covalente del sitio activo de la enzima, específicamente en el último aminoácido, la serina 530 N-

3- terminal, alterando la conformación molecular con pérdida de la actividad COX, como la formación precoz de radicales de oxígeno o la recuperación del estado oxidativo del hierro del grupo hemo. A esta variante, la menos conocida de las tres, se atribuye el efecto de los salicilatos, aminofenoles y pirazolonas.

4- La inhibición reversible competitiva, mediante el empleo de falsos sustratos que compitan con el ácido araquidónico por su unión con la COX formando complejos mucho más estables capaces de impedir el acceso del ácido araquidónico y su subsiguiente transformación en los correspondientes prostanoides. La mayoría de los AINEs se enmarcan en este grupo6.

Los AINEs se usan ampliamente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, pero los efectos colaterales significantes como corrosión gastrointestinal y daño renal limitan su uso. Los AINEs inhiben la enzima ciclooxigenasa (COX), que cataliza la conversión del ácido araquidónico a prostaglandinas (PGs) y tromboxano. Dos formas de la COX se han identificado--COX-1 que se expresan constitutivamente en la mayoría de los tejidos y órganos, y la enzima inducible, COX-2 que se ha localizado principalmente a las células inflamadas y tejidos10. Ambas son glicoproteínas codificadas por genes diferentes con un 60% de homología en la cadena de ADN, y como consecuencia tienen igual peso molecular, sitios activos similares para el sustrato natural y para el bloqueo por los AINEs, presentado actividad ciclooxigenasa y endoperoxidasa funcionalmente separadas.

En modelo animal de inflamación aguda (la inyección de carragenina en la planta de la pata), el edema producido fue asociado con marcada acumulación de COX-2 RNAm y tromboxano. Un inhibidor selectivo de COX-2 (SC-58125) inhibió el edema del sitio inflamado y era analgésico pero no tenía efecto en la producción de PG en el estómago

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Capitulo I 24

y no causó toxicidad gástrica. Estos datos sugieren que la inhibición selectiva de COX-2 pueda producir fármacos antinflamatorios superiores con ventajas de seguridad sustanciales comparados con los AINEs existentes11.

Los AINEs clásicos inhiben solo la actividad ciclooxigenasa, sin afectar la actividad endoperoxidasa. La COX-1 se localiza de forma permanente en el lado luminal de la membrana del retículo endoplasmático en la mayoría de las células y tejidos del organismo, mientras la COX-2 se encuentra en la membrana del retículo endoplasmático y la envoltura nuclear12. La COX-1 tiene funciones fisiológicas bien determinadas. Su activación conduce a la producción de prostaciclina, que liberada por el endotelio es antitrombogénica y cuando la secreta la mucosa gástrica tiene efecto citoprotector, mientras que la COX-2 es inducida por variados estímulos proinflamatorios, particularmente citocinas y factores de crecimiento en el lugar de la inflamación. Ello sugiere que la acción antinflamatoria de los AINEs se debe a la inhibición de la COX-2, mientras los efectos colaterales observados como irritación de la mucosa gastrointestinal, los efectos tóxicos sobre el riñón y la actividad antitrombótica se debe a la inhibición de la COX-113.

El descubrimiento de la COX-2 ha conducido a nuevas investigaciones en el desarrollo de fármacos capaces de inhibir selectivamente esta isoforma de la enzima, con potente actividad antinflamatoria y bajos efectos colaterales sobre el estómago y el riñón ejemplo, el Meloxicam que parece tener actividad inhibitoria mayor sobre la isoenzima inducible COX2. Este fármaco ha sido aprobado en Francia y otros países en el tratamiento de la artritis reumatoidea y la osteoartritis14. En la actualidad es incierto si los AINEs pueden inhibir la expresión del gen que codifica para la COX. En algunas células que expresan la COX-2, los AINEs pueden inhibir la actividad enzimática y expresión del gen. Se ha evaluado el efecto de varios AINEs sobre el RNAm de la COX-1 y COX-2 , expresión de la proteína y producción PGE THP-1 y U937 en macrófagos humanos estimulados con LPS. Los macrófago pre-tratados con Ácido Acetil Salicílico, Indometacina, Naproxeno o NS-398 y estimulados con LPS mostró una

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marcada inhibición en la producción de PGE2 pero no en el RNAm de COX1 o COX2 y la expresión de la proteína. Además, los niveles del RNAm de la COX-2 inducidos por LPS fueron transitorios (pico 3-4 h), sugiriendo que la PGE2 era incapaz de regular la expresión de la COX-2 de una manera autocrática. Estos resultados demuestran que la

acción de los AINEs en macrófagos humanos no se dirige hacia la transcripción o traducción de los genes de la COX pero sólo a la actividad enzimática de las proteínas15.

1.4 Antinflamatorios novedosos

En la actualidad se continúa la búsqueda de nuevos fármacos y más seguros. El compuesto EGIS-5645 es un potente agente antipirético que posee propiedades analgésicas y antinflamatorias. El fármaco es activo en modelos de inflamación como el edema inducido por carragenina y artritis. El EGIS-5645 prácticamente no muestra ningún efecto gastroulcerogénico. La molécula no inhibe la biosíntesis de ninguna prostaglandina o la actividad enzimática de la lipoxigenasa de soya16.

La hidroxilamina y los derivados del ácido hidroxámico son AINEs conocidos de la serie de las dibenzoxapinas ambos son inhibidores de la ciclooxigenasa (CO) y la 5-lipoxigenasa (5-LO). Muchos de estos nuevos inhibidores duales de CO/5-LO también exhiben potente actividad antinflamatoria tópica sobre el ácido araquidónico en el modelo de edema inducido en la oreja murina. En la base al perfil prometedor que demuestra la actividad in vitro e in vivo, los ácidos hidroxámico, 24h, 3-(6,11 - Dihidro-11-oxodibenz[b,e]oxepin-2-il)-N-hidroxi-N-++ +metilpropanamida (HP 977), y 25, 3 -(6,11-dihidrodibenz[b,e]oxepin-2-il)-N-hidroxi-N - el metilpropanamida (P10294), se seleccionaron como candidatos en desarrollo para el tratamiento tópico de desórdenes superficiales inflamatorios17.

En los neutrófilos humanos estimulados con el péptido quimiotáctico FMLP, los agonistas de la adenosina inhiben la formación de superóxido y la degranulación. Por este motivo se estudian los efectos exudativos de varios compuestos agonistas de la

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Capitulo I 26

adenosina sobre los efectos exudativos y las fases celulares de la inflamación pleural inducida por la carragenina en ratas. Los resultados mostraron que todos los agonistas inhibieron los parámetros de la respuesta inflamatoria, sugiriendo que los agonistas pueden prevenir la migración de células por inhibición de la adhesión al endotelio o diapédesis. La inhibición es reversible por un antagonista del receptor de la adenosina, el 8-fenilteofilina de adenosina. En estudios mecanísticos el ( R-N-(1-metil-2-feniletil)adenosina, un agonista A1 selectivo, revirtió la caida de conteo de neutrófilo circulantes.

1.5 Saponinas

El desarrollo de la fotoquímica ha llevado al uso cada vez más creciente de fármacos derivados de los productos naturales, entre estos las saponinas, las cuales son un grupo de compuestos del tipo glicósido que podemos encontrar en algunas plantas de uso común como antinflamatorios según reportes bibliográficos 18,19 . Estos compuestos estructuralmente son estables ante un medio alcalino y son hidrolizados por la acción del medio ácido, estos compuestos se caracterizan por su elevada solubilidad en agua y capacidad de formar espumas, aspecto este útil en el desarrollo de los ensayos de caracterización de los mismos.

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Capitulo II

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2 Diseño de Fármacos

2.1Clasificación de los métodos de Diseño de Fármacos

Existen varias clasificaciones de los métodos de Diseño de Fármacos, ninguno de ellos lo suficientemente específico como para poder enmarcar sin ambigüedades todos los métodos que en esta rama se conocen en la actualidad.

En general los métodos usados en el diseño de fármaco se pueden enmarcar dentro de dos grandes grupos: Métodos QSAR asistidos por computadora y Métodos Experimentales. Dentro de los métodos experimentales más usados se encuentran los variacionales, los cuales serán abordados a continuación.

2.1.1 Métodos Variacionales

Se basa en la modificación de un compuesto líder o cabeza de serie de una manera racional con el objetivo de mejorar sus propiedades 20-22 ,aunque la búsqueda de un compuesto líder se puede realizar por un sinfín de métodos, dos son los más utilizados:

1.Estudio de los productos activos presentes usados en medicina tradicional. 2.Estudios de novo de compuestos obtenidos tanto por vía natural como sintética o biotecnológica.

Ambos métodos, sobre todo el segundo, requieren de la existencia previa de una amplia batería de ensayos biológicos cuidadosamente diseñados que permitan determinar con rapidez y de manera inequívoca la actividad biológica de los nuevos compuestos. Los ensayos deben ser fáciles, rápidos de realizar y económicos por la gran cantidad de compuestos a evaluar. En el segundo caso los costos asociados a este tipo de estudio hace que se vean limitados en número y espectro de acciones biológicas.

Posteriormente se pasa a la modulación de la estructura del compuesto líder con el objetivo de encontrar nuevos y mejores medicamentos. Esta técnica es conocida como Variación Molecular y tiene como finalidad:

1. Mejorar la potencia del líder.

2. Eliminar acciones secundarias no deseadas. 3. Potenciar acciones secundarias deseadas.

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Capitulo II

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5. Separación de actividades (Multiacción). 6. Combinación de actividades.

7. .Modificar la biodisponibilidad del fármaco. Ejemplos:

a) Protección de sistemas multienzimáticos: el antibiótico Cefalotina (I) por desplazamiento del grupo acetoxi por piridina se obtuvo la Cefaloridina (II) ( Ver Anexo. Figura1) con similares propiedades antibacterianas y resistentes a las estearasas de los mamíferos.

b) Aumento de la selectividad de la acción. A partir de compuestos con actividad anticancerosa se sintetizaron muchos derivados uniendo el resto del compuesto a moléculas como las que se muestran en la Figura 2 del anexo que fuera fácilmente identificable por los posibles substratos. Estas modificaciones además de lograr el efecto deseado, aumentaron la solubilidad del compuesto.

c) Modificación que conduce a alterar la distribución. Permite alterar la distribución entre distintos compartimentos consiguiéndose la exclusión de algunos o la localización selectiva en otros. Son clásicos los estudios con la Atropina (VI) y sus sales de amonio (VII). ( Ver Anexo. Figura 3)

La cuaternización del nitrógeno impide atravesar la barrera hematoencefálica sin alterarse las acciones anticolinérgicas periféricas.

d) Simplificación de la estructura de la molécula. Se eliminan aquellas partes de la molécula que no sean estrictamente necesarias.( Ver Anexo. Figura 4)

• Levorfanol (VII). Pertenece a la primera generación de analgésicos relacionados con la morfina, su relación estructural con la morfina es bastante evidente.

•Meperidina (VIII). Pertenece ya a la segunda generación, la molécula queda dramáticamente simplificada.

• Metadona (IX). Relación con la morfina bastante lejana.

Todas estas modificaciones con el objetivo de lograr compuestos más simples, que mantengan la actividad analgésica y que no presenten propiedades de adición.

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Desventajas: Como en esencia este método se basa en técnicas de prueba y error, consume

mucho tiempo y requiere grandes recursos económicos. Además el porcentaje de éxito como se dijo anteriormente es inferior al 0.1%.23,24

2.1.2 Métodos QSAR

Los denominados modelos QSAR han agrupado históricamente a todas las técnicas que han intentado establecer modelos de comportamiento de compuestos o familias de ellos en cuanto a actividad biológica se refiere, a partir de datos de un número limitado de productos.

Los métodos que relacionan la estructura química con la actividad biológica pueden dividirse en dos grandes categorías:

1. Topológico estadísticos: Sólo tienen en cuenta la estructura química plana de la molécula y se utilizan técnicas estadísticas o de reconocimiento de patrones para encontrar las QSAR.

2. Modelado Molecular: Se consideran las propiedades de las moléculas en tres dimensiones y son importantes:

• Análisis Conformacional

• Mecánica Cuántica

• Campos de Fuerza

• Termodinámica Estadística

• Gráficos Moleculares Interactivos.

Estos últimos permiten la representación y manipulación de las moléculas en tres dimensiones lo que brinda una información esencial para comparar moléculas y estudiar la interacción entre ligandos y receptores macromoleculares.

Existen otras clasificaciones en la literatura 25,26 no obstante, como se dijo anteriormente, es difícil encontrar una clasificación lo suficientemente amplia dado la dificultad de englobar todos los métodos que de esta materia se conocen en la actualidad.

(20)

Capitulo II

31

En esencia podemos decir que los métodos computacionales para le diseño de fármaco independientemente de su clasificación tienen en común el ahorro de tiempo y recursos lo cual es una ventaja con respecto a los métodos clásicos de prueba y error.

La metodología de los mismos sigue, independientemente del modelo a utilizar, pasos comunes que se expresan en la Figura 6 del anexo.

2.2 ToSS MoDe

El ToSSMoDe (siglas del inglés Topological SubStructural Molecular Design) es un método de diseño molecular con una base grafo-teórica. Por ser de corte fenomenológico necesita para llegar a relaciones cuantitativas el uso de datos muéstrales, que son procesados estadísticamente. Esto lo convierte en un método general, que no necesita del conocimiento de los mecanismos que intervienen en un proceso dado para describirlo. Aunque se debe reconocer que la dependencia de una muestra constituye su desventaja principal, ya que no siempre se dispone de ésta.

2.2.1 Momentos espectrales (μk)

El ToSS - MoDe opera con la matriz de adyacencia entre enlaces (E) en la molécula sin considerar los átomos de hidrógenos ( Ver Anexo. Figura 7). Los descriptores usados por el método son el conjunto de los momentos espectrales de dicha matriz. El momento espectral de orden k se define como la traza de la k-ésima potencia de la matriz E y su símbolo es μk

(34). A su vez la traza se define como la suma de los valores de la diagonal principal. Lo anterior se puede expresar matemáticamente de la siguiente manera:

= = = m i ii e k k E Tr k 1 ) ( μ [1]

Donde keii son los elementos de la diagonal principal de la matriz Ek. De la definición dada de E y μk se observa que los momentos espectrales son números enteros positivos.

Hay una pérdida de información a la hora de modelar con los μk la estructura molecular ya

que todas las aristas del grafo , que se usan para representar la molécula son iguales . Esto puede constituir una desventaja para resolver problemas, en que sea necesario considerar la presencia de heteroátomos.

(21)

Capitulo II

32

Una ventaja de los μk es que pueden expresarse como combinación lineal del número de

veces que aparecen determinados fragmentos (subgrafo). Al igual que los conceptos de grafo y molécula, los conceptos de subgrafo y fragmento molecular se usan indistintamente en este trabajo. No obstante no debemos confundirlos ya que la molécula o una parte de esta son objetos reales, mientras que el grafo o el subgrafo son objetos matemáticos usados para representarlos. La expresión matemática general de los μk en función de los

fragmentos puede ser escrita de la siguiente manera:

= = s i i F i c k k 1 μ [2]

Donde al número kC i se le llama contribución del fragmento i al momento espectral de orden k, ⏐Fl⏐ es el numero de veces que aparece el fragmento i en el grafo molecular y s es el número de clases de fragmentos que contiene la molécula 27 . Las expresiones para los primeros ocho μkson (Tabla 2):

Los fragmentos referidos en la Tabla 2 se muestran en la Figura 6 del Anexo. Como puede observarse a medida que aumenta el orden del μk aumenta el número de fragmentos que

contribuyen a él y se hace más compleja su interpretación en función de la estructura molecular. Puede observarse que los μk de ordenes superiores tienen mayor tendencia a ser

colineales. Vale aclarar que el hecho de que dos índices sean colineales no significa que registren exactamente la misma información estructural. Por otra parte los μk de mayor

orden son los que registran más información estructural.

2.2.2 Momentos espectrales ponderados

Un intento de resolver el problema de la incapacidad de los momentos espectrales sin ponderar para diferenciar moléculas con heteroátomos consiste en ponderar las aristas del grafo. Esto se hace ponderando con determinados pesos (dij) las aristas del grafo molecular. Entendemos por ponderar, “asignar a cada tipo de arista un valor o peso determinado”. Mediante los dij se pueden introducir de manera natural propiedades estándares de los enlaces como son: la distancia, la polarizabilidad o el momento dipolo estándar de enlace. Para calcular los μk la ponderación se tiene en cuenta sustituyendo los valores de la

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Capitulo II

33

diagonal principal por los dij correspondientes a cada tipo de arista en la matriz E. El uso de los dij aumenta notablemente las posibilidades y versatilidad del método. Se ha desarrollado por Estrada et al 28 las expresiones generales para momentos espectrales de la matriz de adyacencia entre aristas ponderada en la diagonal principal

2.2.3Momentos espectrales locales.

En determinados problemas como son:

• Estudio de fármacos, tóxicos o moléculas orgánicas con un esqueleto común, que es el responsable de la actividad en estudio, la cual puede ser químico física, biofarmacéutica, etc.

• Estudio de reactividad sobre sitios específicos de una serie de moléculas

• Análisis de datos espectroscópicos IR, UV-VIS o RMN de fragmentos de la molécula

• Predicción de la fragmentación en espectrometría de masas

• Propiedades geométricas locales

• Discriminación de biodisposición de determinados grupos de la molécula.

y en general cualquier caso en que sea necesario estudiar no la molécula en su conjunto, sino las propiedades de determinados fragmentos de esta; pudiera ser necesario la definición de descriptores locales.

En el caso de los momentos espectrales se ha definido por Estrada et al 27-29 unos análogos a los momentos espectrales totales que poseen análogas propiedades a las definidas

anteriormente y se llaman momentos espectrales locales de la matriz de adyacencia de aristas μk (G,Fi) ó dμk (G,Fi) los cuales pueden ser sobre la matriz de adyacencia de aristas del grafo molecular simple o ponderado y etiquetado

2.3 El TOSS MODE como método QSAR

Una vez descrito el basamento teórico del métododiremos que su desarrollo práctico a la hora de aplicarlo al diseño molecular es análogo al de todos los métodos QSAR y sigue el esquema de la Figura 7 del anexo.

(23)

Capitulo II 34

(24)

Capitulo III 35

MATERIALES Y MÉTODOS.

Para la búsqueda de modelos de clasificación se seleccionó una serie de entrenamiento, formada por dos componentes fundamentales: en primer lugar, un conjunto de compuestos químicos con una actividad farmacológica común a los cuales se les denomina compuestos activos, en segundo lugar un conjunto de compuestos con actividades farmacológicas diversas pero diferente a los compuestos activos, a este segundo grupo de compuestos se ha dado el nombre de compuestos inactivos, esto debido a que no poseen la actividad farmacológica del primer grupo al cual se ha hecho referencia aquí. Debe destacarse que los compuestos pertenecientes tanto al primer conjunto como al segundo, se ha tenido en cuenta que tengan la mayor variabilidad posible desde el punto de vista estructural.

Para esta serie de entrenamiento se le calculó los momentos espectrales a cada uno de los compuestos que la componen ponderando los grafos moleculares con los momento dipolo estándar de enlace, se obtuvo una matriz de datos que contiene los momentos espectrales desde μ0 hasta μ15 para cada uno de los compuestos.

Los momentos espectrales empleados en este trabajo fueron calculado con el programa ToSSMoDe 30 el cual genera los datos en ficheros de extensión .txt compatibles con el Microsoft Office.

El procesamiento de los datos para crear nuevas variables se realizó con el tabulador electrónico Microsoft Excel versión 7.0 para Window 2000 31

(25)

Capitulo III 36

Los ficheros generados por Excel fueron procesados con el software ESTATISTICA para Window 2000 .En la que se empleó el análisis discriminante lineal para buscar los modelos de clasificación

Todos los software fueron corridos sobre una computadora personal IBM Compatible Pentium a 1 GHz con 1 GB de memoria RAM .

(26)

Capitulo IV 38

RESULTADOS Y DISCUSION.

El primer paso para encontrar un modelo teórico que permita descubrir nuevos fármacos es diseñar una serie de entrenamiento representativa y aleatoria. En este trabajo se ha contado con una amplia data de 410 compuestos que comprenden compuestos activos e inactivos y estos últimos divididos en 7 grupos farmacológicos; entre los que se encuentran antiparasitarios, antihistamínicos, diuréticos, tranquilizantes, etc. Esta data fue dividida en dos subseries, una conteniendo 180 compuestos activos y otra de 212 inactivos, debemos destacar que del total de compuestos empleados en la serie de entrenamiento 18 compuestos no fueron clasificados por el modelo, se entiende por compuesto no clasificado aquellos que se su probabilidad de clasificación en un grupo u otro no excede el 5 %, una vez obtenidos los descriptores moleculares y procesados con el tabulador electrónico EXCEL se procesan estadísticamente y se obtiene la ecuación discriminante que denominamos modelo matemático y que se reporta a continuación.

14 . 15 ) 162 , 8 ( 33 . 6 38 . 0 410 N 824 . 17 10 6 . 7 01 . 0 042 . 0 075 . 0 10 6 . 6 038 . 0 263 . 0 489 . 0 949 . 0 2 15 0 11 3 0 2 0 1 0 14 9 5 4 3 0 = = = = − ⋅ ⋅ − ⋅ + ⋅ − ⋅ + ⋅ + − + − = − − F D Class λ μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ μ [3]

Donde N es el número total de compuestos y λ es la lamda de Wilks’, D2 es la distancia de Mahalanobis y la F es la razón de Fisher.

La λ de Wilks’ puede tomar valores entre 0 (discriminación perfecta) y 1 ( no discrimina). La

selección de los modelos se realizó en base a la calidad estadística de los mismos, los estadígrafos de

comparación multivariada tenidos en cuenta para este fin fueron, en primer lugar la lambda (λ) de

Wilks. De un conjunto elevado de modelos obtenidos se seleccionaron sólo aquellos cuyo valor de λ es

el más pequeño posible, ya que permite evaluar la hipótesis de que dos o más grupos provienen de poblaciones con medias significativamente diferentes para un conjunto de variables. Debido a que

valores pequeños de (λ) indican diferencias entre las medias de grupos, este se considera uno de los

(27)

Capitulo IV 39

qué modelo se debía seleccionar para realizar clasificaciones de calidad en el proceso de diseño de

fármacos fue el cuadrado de la distancia de Mahalanobis (D2 ), la cual es una especie de distancia entre

los centroides de cada uno de los supuestos grupos, por lo tanto su valor indicará, de una manera

proporcional, la diferencia entre ambos, para grupos idealmente separados entre si la D2 como

estimador insesgado de la F de Fisher debe ser mayor o igual a esta para demostrar significación estadística en la prueba de hipótesis, ninguno de los modelos encontrados cumplió este requisito lo cual indica que no hay una separación total entre los grupos sino que existe cierta superposición.32,33 en este

caso D2 es menor que F, indicando que existe un sobrelapamiento entre los grupos reales, este hecho

puede ser explicado por la existencia de moléculas con un comportamiento dual pero no reportado en el grupo de los inactivos en la serie de entrenamiento. Un ejemplo puede ser los analgésicos. En la práctica médica son muy conocidos casos de compuestos con dicho comportamiento, como es el acetaminofeno, es por esa razón que se emplea el porcentaje de buena clasificación para evaluar cuando un modelo posee un alto poder discriminatorio entre dos grupos diferentes. Se hizo una valoración de la efectividad del proceso de clasificación. Para ello se tuvo en cuenta los resultados de la matriz de clasificación, para asegurar la alta calidad del modelo sólo se tomaron aquéllos en los cuales el porcentaje de casos bien clasificados no fuera inferior al 78%, en este sentido se tuvo en cuenta que el porcentaje de casos bien clasificados para el grupo de sustancias inactivas fuera alto, para evitar la aparición de “falsos activos” a la hora de la predicción, lo cual muestra la calidad de los modelos ya que evita la mala selección de un compuesto en el momento de realizar un diseño racional de fármacos. Además de esto, se prestó especial atención como criterio final de selección, a la capacidad predictiva de los modelos, caracterizado por el porcentaje de buena clasificación en la serie de predicción.

Para la discriminación de compuestos activos/inactivos estudiados en este trabajo el modelo clasifica correctamente el 91.53 % de los activos y el 92.00 de los inactivos en la serie de entrenamiento para una buena clasificación global del 91.59 %. El porcentaje de falsos activos y falsos inactivos en la serie de entrenamiento es 8.00 y 8.47 % respectivamente. Los falsos activos son aquellos compuestos inactivos que el modelo clasifica como activos y los falsos inactivos son los positivos que el modelo clasifica como inactivos. En las Tablas 3, 4 y 5 se muestran los compuestos con la probabilidad posterior de clasificación y los porcentajes de buena clasificación calculados a partir de las distancias de Mahalanobis.

Uno de los criterios más importante para la aceptación o no de un modelo discriminante tal como se muestra en este trabajo está basado en los estadísticos de la serie de predicción externa, en nuestro

(28)

Capitulo IV 40

caso está constituida por un total de 62 compuestos de los cuales 11 resultaron no clasificados, de los 51 compuestos clasificados por el modelo están distribuidos en dos subseries, conformados por compuestos activos e inactivos, es de significar que los compuestos escogidos para formar esta serie de predicción nunca fueron empleados en la serie de entrenamiento y son compuestos que se le conoce a priori si son activos o no. El modelo clasifica el 89.89 y el 91.77 % de los activos e inactivos respectivamente, para una clasificación global del 90.2 %. En la Tabla # 4 y 5 se dan la probabilidad de clasificación posterior según los mismos criterios que para la serie de entrenamiento, así como los porcientos de buena clasificación. El porcentaje de falsos activos e inactivos en la serie de predicción es: 8.23 % y 11.11%, respectivamente.

La estadística indica que nuestro modelo es apropiado porque presenta un porcentaje de 91.59 % de buena clasificación en la serie de entrenamiento y 90.02 % en la serie de predicción.

El porcentaje de falsos activos e inactivos como se describió anteriormente es el % de compuestos mal clasificados en cada una de la respectivas series esto puede estar motivado por diversos factores; uno de los cuales puede estar asociado con la metodología de cálculo ToSSMODE, la cual opera con momentos espectrales los que codifican información subestructural, y como es bien conocido de los estudios de REA en la molécula de un fármaco se puede encontrar una parte farmacófora y otra correspondiente a los grupos transportes, los cuales no son esenciales para la actividad pero al estar presentes en la molécula se tiene en cuenta su influencia sobre el cálculo del momento espectral, entonces puede darse el caso que exista una mayor contribución de los grupos transportes al momento espectral que no del grupo farmacóforo; esto evidentemente puede llevar a clasificar un fármaco inactivo como activo y viceversa. También asociado con la presencia de grupos transportes en determinadas moléculas que pueden ser farmacofóricos en otros fármacos, surge una segunda problemática, tal puede ser el caso que se ilustran en la Figura 8( Ver Anexo) como es el del Ibuprofen y la bencilpenicilina , nótese que en la región seleccionada en la estructura de cada fármaco aparece el grupo fenilacetilo; en cada uno de estos compuestos dicho grupo cumple funciones diferentes, para el caso de la Bencilpenicilina este es un grupo transporte que cumple una función metabólica al estar destinado fundamentalmente a impedir la degradación por las Beta-lactamasas al ejercer impedimento estérico sobre la región vulnerable a dichas enzimas en el sistema beta- lactámico mientras que para el Ibuprofen forma parte del grupo farmacofórico, esencial para la actividad. De forma similar ocurre en el caso del anillo piridínico como sustituyente en el caso de algunas cefalosporinas (. Figura 8 )en las que actúa como grupo transporte con el fin de mejorar la unión a proteínas plasmáticas y en algunos

(29)

Capitulo IV 41

antinflamatorios forma parte del fragmento indispensable para la actividad en este caso se encuentran el ácido nilíxico y la cefaloridina, antinflamatorio el primero y potente antibacteriano de administración parenteral el segundo.

En otros casos los grupos transportes se emplean para mejorar propiedades organolépticas, de lo que es un ejemplo la función de los ésteres de los ácidos carboxílicos empleadas para enmascarar sabor amargo en el caso de algunos antibióticos y empleados como función principal en algunos antinflamatorios.

4.1 Análisis de contribución de enlace a la propiedad

.

Como ya se ha referido con anterioridad en este trabajo en la molécula de un fármaco existen tanto grupos farmacofóricos como de transporte, también hemos discutido la contribución de grupos y la interacción entre ellos a la propiedad biológica, encontrando cual o cuales contribuyen ya sea de forma positiva o negativa a la misma; en el presente tópico discutiremos la contribución de enlaces a la actividad antinflamatoria, para lo cual tomaremos como ejemplos a discutir moléculas tanto activas como inactivas. La evaluación de las contribuciones presupone la necesidad de superponer las contribuciones de todos los fragmentos en la molécula, particionándolas de forma invariante; para garantizar esto es necesario hacer dos tipos de particiones, una para los términos lineales y otra para los de interacciones. Debido al carácter invariante necesario para la partición se escoge como mínima unidad estructural el enlace, teniendo en cuenta que este es la base de la matriz de adyacencia usada en el cálculo de los momentos espectrales. La partición de los términos lineales consiste simplemente en sumar todas las contribuciones de todos los fragmentos que pasan por un enlace premultiplicada por su

peso estadístico. Esto explica el primer término de la ecuación [4]. El segundo término está referido a

las contribuciones de las interacciones entre fragmentos de diferentes órdenes. Como la interacción es una relación simétrica (si el enlace a interacciona con el b, esto presupone una interacción idéntica de b con a que debe cuantificarse una sola vez). Una expresión matemática que es invariante y satisface la anterior condición de simetría es el producto cruzado de dos números reales. Por esta razón el segundo término de nuestra ecuación se escribe como un producto cruzado de los fragmentos locales de orden k de un enlace con todos los fragmentos de orden l en la molécula y el producto de todos los fragmentos de orden l en el enlace con todos los de orden k en la molécula, premultiplicado por el peso estadístico de la interacción en el modelo de clasificación y dividido entre dos para que no se

(30)

Capitulo IV 42

consideren duplicadas las interacciones. Por todo lo anterior la ecuación de partición de las contribuciones queda con el siguiente aspecto general:

(

)

(

) (

)

⎢⎣

⎟•

+

⎥⎦⎤ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ + • = l p p e l l l e p k p l k e l i C F C F C F C F a F C a e C 0 0 , 0 0 0 2 ) ( [4]

Donde C(e) es la contribución de enlaces a la propiedad, ai es el peso estadístico del i-ésimo

momento espectral en el modelo de clasificación, Coi es la contribución del fragmento de clase o al

i-ésimo momento espectral, ak,l son los pesos estadísticos en el modelo de calificación de la interacción entre el k-ésimo y el l-ésimo momento espectral, en los términos de tipo Coi la C se refiere a la palabra contribución del fragmento de la clase o al i-ésimo momento espectral, análogamente se interpreta los términos se Cpk y Col. En los términos del tipo │Foe│el módulo indica el número de veces que aparece el fragmento de clase o, Fo , en el enlace e. los términos del tipo │Fo│ expresan el número de veces que aparece el fragmento de clase o, en la molécula y m es el número de enlaces.

La expresión anterior puede ser reducida transformándola algebraicamente mediante la multiplicación de los términos y la extracción de factor común en el segundo miembro, llegándose a la siguiente expresión.

(

)

• +

• • • • + • = e p o o e p l o k p l k e l i C C F F F F m a F C a e C 2 ) ( 0 0 , [5]

De esta expresión se pueden extraer las siguientes interpretaciones estructurales. La contribución aditiva de los fragmentos a la propiedad es lineal y depende de la propiedad estudiada a través del

término ai así como del momento espectral que codifique la información de interés lo cual está

determinado por la complejidad de los fragmentos que influyan en la propiedad mediante el término Col, de lo anterior podemos extraer el término ai.Col que es igual a la contribución del fragmento o a la

propiedad y que denotaremos Cop . Del segundo término de la ecuación podemos extraer el término:

l o k p l k C C m a • • 2 , [6]

Que es la contribución de la interacción entre los fragmentos p y o a la propiedad en general.

La suma de todas las contribuciones de todos los fragmentos que pasan por un enlace no es más que el término correspondiente de ese enlace en la diagonal principal para los diferentes órdenes (k) o lo que es lo mismo el k-ésimo momento espectral local de enlace. Por otra parte la suma pesada de todos los fragmentos de un orden dado en la molécula no es más que la traza de la matriz de adyacencia lo cual es por definición el momento espectral total. Por esta razón y para mayor facilidad de cómputo se

(31)

Capitulo IV 43

pueden sustituir estos términos por los momentos espectrales locales de enlace obteniéndose la siguiente ecuación

(

)

+

+

+

=

m i m l k k L l l L k l k L i i

m

a

a

a

e

C

0 , ,

2

)

(

μ

μ

μ

μ

μ

[7]

Donde: C(e) es la contribución de enlace a la propiedad, aI es el coeficiente estadístico del i-ésimo

momento espectral total (μi) en el modelo de clasificación; ak,l es el coeficiente estadístico de la

interacción entre el k-ésimo y el l-ésimo momento espectrales totales ( μk, μl ); μkL yμl L son los

momentos espectrales locales de orden k y l para el enlace (e), a0 es el término independiente del

modelo y m es el número de enlaces totales en la molécula. La división de a0 por m obedece al hecho

de que por ser los momentos espectrales descriptores totales el aspecto aleatorio no controlado por el modelo influye por igual sobre todos los enlaces.

En la sustitución de las sumas por los momentos espectrales se considerarán además las interacciones de un fragmento con el mismo, lo cual no tienen sentido como interacción física sino que solo puede ser interpretado como una influencia cuadrática del número de veces que aparece dicho fragmento.

Así se evaluará los enlaces como positivos o negativos según su contribución a la actividad, donde la suma total de estas contribuciones será la contribución total de la molécula. Para ilustrar lo que será

discutido en detalle, en el anexo Figura10 – Figura 10d se muestran una serie de moléculas activas e

inactivas donde se ha representado en color sombreado las zonas isoactivas y en color blanco las isonegativas. Entiéndase como zona isoactiva aquella agrupación atómica cuyos enlaces tiene grado mayor o igual a uno y contribución positiva a la propiedad, esto garantiza que al tener los enlaces grado mayor o igual que uno en la zona isoactiva no existan elementos aislados y al ser todos positivos no quede encubierto un efecto por otro mayor y de signo contrario, de igual manera la zona isonegativa será aquella en la cual todos sus enlaces tengan grado mayor igual a uno y de contribución negativa. La partición en zonas de isoactividad permite sumar las contribuciones de enlaces para obtener contribuciones de grupos específico en una molécula que tenga un carácter invariante. Las zonas de isocontribución ( isoactivas o isonegativas) pueden ser subdividas en grupos atómicos más pequeños siguiendo diferentes criterios como pueden ser criterios sintéticos, farmacológicos electrónicamente,

(32)

Capitulo IV 44

farmacodinámica, u otros según los fines del investigador. La subdivisión de una zona de isocontribución en grupos sintéticos se realizará utilizando las reglas de desconección y permitirá diseñar una molécula activa siguiendo el criterio de accesibilidad sintética. Para ilustrar lo anterior analicemos el caso representado en la Figura 9 del anexo y que se trata de la molécula del Diclofenaco, un compuesto con actividad antinflamatoria, las zonas que aparecen sombreadas se corresponden con las zonas activas de la molécula aún sin especificar su valor de contribución. Nótese que las zonas negativas se han subdividido en otras zonas como por ejemplo los átomos de cloro como sustituyentes y el grupo amino secundario, esto está dirigido a seguir un criterio de interpretación lo más unificado posible, al diseñar la síntesis del compuesto estos sustituyentes que constituyen zonas isonegativas son introducidos en etapas del proceso diferentes a los sustituyentes de las zonas isopositivas, desde el punto de vista farmacológico también pueden tener una explicación independiente a la de los grupos que formen parte de las zonas isopositivas, es muy probable como se ha señalado con anterioridad que un mismo grupo aparezca como farmacofórico en una molécula y como transporte en otra, siguiendo este análisis puede darse el caso de que un mismo grupo aparezca como de isocontribución positiva en un caso o como negativa en otra, aspecto este a tener en consideración cuando se ha seguido un criterio farmacocinético. Es necesario destacar que no se ha expresado la contribución de cada enlace sino la de zonas en la molécula.

En nuestro caso tomaremos como ejemplo compuestos activos clasificados correctamente por el modelo que presentan un grupo carboxilo en la estructura y analizaremos como influye el resto molecular sobre el potencial de actividad de dicho grupo; para el caso de los compuestos inactivos se han escogido de forma similar moléculas clasificadas correctamente por el modelo obtenido.

En la Figura 10 de este anexo se representa la estructura del Orpanoxin, compuesto este con actividad antinflamatoria en el cual está presente un grupo carboxilo, como podemos apreciar en el diagrama las zonas isoactivas en los anillos bencénico y furánicos contribuyen en un 3.72 y 2.37 respectivamente , desde el punto de vista subestructural esto puede ser atribuido a hecho de su

contribución al momento espectral μ4 el cual lo hace de forma positiva a la actividad según el modelo

y electrónicamente esto encuentra su explicación en que como ya se señaló en la hipótesis inicial la actividad biológica está en dependencia de la presencia de un centro deficitario de electrones en la molécula, para estas zonas señaladas como de contribución positiva se puede apreciar que la presencia en el anillo bencénico de un cloro como sustituyente conlleva a un incremento de la deficiencia electrónica en la molécula favoreciendo la interacción con sitios de alta densidad electrónica en el

(33)

Capitulo IV 45

receptor, esto está en plena concordancia con lo citado con anterioridad con relación a que la presencia de halógeno contribuye al incremento de la actividad antinflamatoria según los estudios de REA,

reportados en la literatura34 aparentemente contradictorio con lo reportado en este trabajo sobre la

contribución negativa de los halógenos a la actividad medida y que como se puede apreciar en el propio diagrama el enlace con el cloro lo hace negativamente, por lo tanto la influencia positiva del cloro es indirectamente, a través del incremento de la deficiencia electrónica en la molécula provocada por su efecto electroaceptor. En el mismo diagrama puede observarse la existencia de dos zonas que también contribuyen de forma negativa. La primera formada por los enlaces adyacentes al átomo de oxígeno del sistema heterocíclico, este tipo de fragmento puede contribuir al momento espectral de orden 2 el cual entra en el modelo como parte de una interacción que lo hace de forma negativa. La segunda zona que contribuye negativa es la correspondiente a la cadena hidrocarbonada ubicada entre el anillo furánico y el grupo carboxilo la cual contiene el grupo hidroxilo la cual desde el punto de vista subestructural posee fragmentos que contribuyen a los momentos espectrales de orden 3 y orden 5 que lo hacen de forma negativa en el modelo, desde el punto de vista electrónico esto puede ser justificado debido a la presencia del grupo hidroxilo en la misma que provoca un desplazamiento electrónico hacia él, dado por su efecto electroaceptor predominante.

Un segundo ejemplo de compuesto con actividad antinflamatoria que se sometió a estudio lo constituye el Brofezil (Figura 10 a) ; en el cual podemos encontrar un anillo bencénico y un sistema heterocíclico, donde el primer fragmento mencionado constituye una región isoactiva en la molécula,

subestructuralmente este anillo tiene 6 fragmentos que contribuyen al momento espectral μ4 y este a su

vez lo hace positivamente en el modelo, mientras que en el sistema heterocíclico se encuentra también una zona isoactiva donde el fragmento que forma parte de ella lo hace de manera positiva momentos espectrales de orden 1 y 4 lo que repercute favorablemente en la propiedad. Por otra parte, existen en la molécula fragmentos que constituyen regiones isonegativas, este comportamiento encuentra su explicación subestructural en el hecho de su contribución a los momentos espectrales de orden 3, 2 y 5 y estos lo hacen negativamente en la ecuación del modelo, estas regiones isoactivas se encuentran ubicadas en el sistema del anillo heterocíclico y la cadena lateral adyacente al grupo carboxilo, así como sobre el enlace con el bromo en el anillo bencénico. Electrónicamente este comportamiento puede ser explicado si tenemos en cuenta la electronegatividad por una parte del bromo el que manifiesta un efecto electroaceptor, aumentando la densidad electrónica sobre su enlace con el sistema aromático y por otra parte la presencia del grupo carboxilo provoca una polarización electrónica en la

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Capitulo IV 46

cadena hidrocarbonada y en parte del sistema aromático que conlleva a un incremento de la densidad electrónica en la región señalada. El tercer ejemplo de estos compuestos con actividad biológica lo constituye la Mefeclocine (Figura 10 b), el cual es un derivado de ácidos carboxílicos y en cuya estructura se destacan dos zonas isoactivas, estas se encuentran en los anillos aromáticos, que como ya

se ha discutido anteriormente poseen 6 fragmentos que contribuyen al término μ4,el cual es positivo en

la ecuación que predice la actividad antiinflamatoria. Estos anillos se caracterizan por presentar sustituyentes electroaceptores los que provocaran la consecuente disminución de la densidad electrónica sobre dichos anillos favoreciendo la interacción la interacción electrostática con el receptor; en el diagrama correspondiente a esta molécula también se puede apreciar que los enlaces nitrógeno-carbono entre el grupo amino y los anillos aromáticos contribuyen positivamente, cuando debía esperarse que debido al efecto de conjugación positivo del grupo amino existiera un incremento de la densidad electrónica en estos enlaces, pero esta contribución positiva puede estar asociada al impedimento estérico que ejerce la cadena hidrocarbonada sustituyente del nitrógeno sobre los anillos aromáticos lo cual impide la coplanaridad de los mismos limitando la conjugación electrónica. En este diagrama se aprecian tres zonas isonegativas correspondiente a los enlaces con el cloro, grupo metoxi y la cadena lateral que contiene el grupo carboxilo, estos grupos desde el punto de vista subestructural contribuyen a los momentos espectrales de orden dos, tres y cinco los que influyen negativamente en la propiedad, mientras que desde el punto de vista electrónico tanto el cloro como el grupo metoxi son electroaceptores que dan lugar a una deficiencia electrónica sobre ambos anillos, en tanto que el enlace nitrógeno carbono entre el grupo amino y el metileno de la cadena alifática contribuye negativo por la naturaleza electroaceptora del amino con relación a un carbono tetraédrico.

Para las sustancias consideradas como inactivas también se realizó el análisis similar, en este anexo aparece la estructura de la Bromazina (Figura 10 c), compuesto con actividad antihistamínica en la cual aparecen dos regiones isoactivas correspondientes a los dos sistemas aromáticos y dos isonegativas, subestructuralmente ya se ha discutido con anterioridad

Un segundo ejemplo de compuestos inactivos lo constituye el Clorprotixeno (Figura 10 d), el cual es un neuroléptico, en el mismo se aprecian varias zonas isonegatvas, las que contribuyen a los momentos espectrales de orden 5 y 3 los que como ya se ha referido al estar precedidos de un signo negativo en la ecuación del modelo influyen de manera negativa en la actividad, estas zonas de contribución negativa se encuentran fundamentalmente sobre los anillos aromáticos y la cadena lateral. Se puede apreciar una pequeña zona de contribución positiva en torno al átomo de azufre del sistema

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Capitulo IV 47

heterocíclico y los enlaces en el anillo aromático que presenta al cloro como sustituyente, el cual puede provocar una deficiencia electrónica en dicho sistema favoreciendo una interacción de forma similar a lo que ocurre con las moléculas activas.

4.2 Evaluación de metabolitos de plantas medicinales.

Dentro de los objetivos de nuestro trabajo está aplicar el modelo obtenido a la predicción de metabolitos de plantas medicinales (Tabla 5), en nuestro caso hemos evaluados dos compuestos con este fin resultando evaluados como antinflamatorios, en el primer caso se trata del éster glucósido del ácido 24-hidroxytorméntico y que además se realizó el cálculo de la contribución de enlace y que aparece reflejado en la figura 11, en la que se puede apreciar que aunque la mayor parte de la estructura química contribuye negativa, la región isoactiva lo hace en una alta magnitud, destacándose que el grupo éster de la molécula lo hace significativamente mayor que el resto. Por otra parte fue evaluada la diosgenina (Figura 12), compuesto este que también se encuentra en la planta en forma de glicósido, pero que en este caso solo hemos evaluado la parte de la aglicona, ya que su extracto etanólico sería evaluado como antinflamatorio por otros autores, dando positivo dicha evaluación, esto no nos permite afirmar que este compuesto tenga actividad antinflamatoria pues en el extracto no solo existe este metabolito, pero si constituye una prueba a favor de continuar los estudios de aislamiento, caracterización y evaluación farmacológica del mismo.

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