UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
Carrera de Ingeniería Agronómica
EVALUACIÓN DE INDUCTORES DE RESISTENCIA,
PARA EL CONTROL DE LEPIDÓPTEROS Y TOLERANCIA A ESTRÉS
HÍDRICO EN BRÓCOLI (
Brassica oleracea
L. var.
italica
) Y EN
Arabidopsis
thaliana
(L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA.
TESIS DE GRADO PREVIA A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO
AGRONÓMO
JHON JAIRO VENEGAS MOLINA
Quito – Ecuador
DEDICATORIA
A Manuel, Marlene, Irina y Jan Peter, por toda su motivación y apoyo.
AGRADECIMIENTO
A toda mi gran Familia y en especial a mi Padre, Madre y Hermanas por todo su apoyo.
Al Laboratorio de Biotecnología Agrícola de la Universidad San Francisco de Quito, por
financiar la presente investigación.
A Antonio León-Reyes, Ph.D. director del Laboratorio de Biotecnología Agrícola USFQ,
por proponer la presente investigación, por incluirme en su equipo de trabajo, por sus
consejos y asesoría en todo el proyecto, y sobre todo por su aliento y motivación a la
Ciencia.
A todos mis compañeras y compañeros del Laboratorio de Biotecnología Agrícola USFQ.
A la Universidad Central del Ecuador, por todo el conocimiento impartido, y en especial al
Ing. Hugo Orellana, por dirigir y corregir la presente tesis.
A mis compañeras y compañeros de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad
Central del Ecuador.
A Carlos Ruales (USFQ), Patricio Gallegos (INIAP), Michelle Noboa (INIAP), y Xavier
Chiriboga (Agrocalidad), por su asesoría en el área entomológica, en especial en la
identificación, recolección, crianza, fotos y manejo del insecto estudiado.
A todos quienes que de una u otra manera colaboraron en la realización de esta
investigación.
AUTORIZACÍON DE LA AUTORIA INTELECTUAL
Yo, Jhon Jairo Venegas Molina. En calidad de autor del trabajo de investigación o tesis realizada sobre “EVALUACIÓN DE INDUCTORES DE RESISTENCIA, PARA EL CONTROL DE LEPIDÓPTEROS Y TOLERANCIA A ESTRÉS HÍDRICO EN BRÓCOLI (Brassica oleracea L. var. italica) Y EN Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA” por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden con la excepción de la presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento,
Quito, 7 de Febrero del 2013.
FIRMA
CERTIFICACIÓN
En calidad de tutor del trabajo de graduación cuyo título es: “EVALUACIÓN DE INDUCTORES DE RESISTENCIA, PARA EL CONTROL DE LEPIDÓPTEROS Y TOLERANCIA A ESTRÉS HÍDRICO EN BRÓCOLI (Brassica oleracea L. var. italica) Y EN Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA”, presentado por el señor JHON JAIRO VENEGAS MOLINA, certifico haber revisado y corregido por lo que apruebo el mismo.
Tumbaco, 7 de Febrero del 2013.
Ing. Agr. Hugo Orellana Aguilar, M.Sc. TUTOR
Tumbaco, 7 de Febrero del 2013
Ingeniero
Juan León Fuentes
DIRECTOR DE CARRERA DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Presente.
Señor Director:
Luego de las revisiones técnicas realizadas por mi persona del trabajo de graduación “EVALUACIÓN DE INDUCTORES DE RESISTENCIA, PARA EL CONTROL DE LEPIDÓPTEROS Y TOLERANCIA A ESTRÉS HÍDRICO EN BRÓCOLI (Brassica oleracea L. var. italica) Y EN Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA”, llevado a cabo por parte del señor egresado JHON JAIRO VENEGAS MOLINA de la Carrera de Ingeniería Agronómica, ha concluido de manera exitosa, consecuentemente el indicado estudiante podrá continuar con los trámites de graduación correspondientes de acuerdo a lo que estipula las normativas y disposiciones legales.
Por la atención que se digne dar a la presente, reitero mi agradecimiento. Atentamente,
___________________________ Ing. Agr. Hugo Orellana Aguilar, M.Sc. TUTOR
EVALUACIÓN DE INDUCTORES DE RESISTENCIA,
PARA EL CONTROL DE LEPIDÓPTEROS Y TOLERANCIA A
ESTRÉS HÍDRICO EN BRÓCOLI (
Brassica oleracea
L. var.
italica
) Y
EN
Arabidopsis thaliana
(L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA.
APROBADO POR:
Ing. Agr. Hugo Orellana Aguilar, M.Sc.
TUTOR DE TESIS
____________________
Ing. Agr. Venancio Arahana Bonilla, Ph.D.
PRESIDENTE DEL TRIBUNAL (BIOM.)
____________________
Ing. Agr. Carlos Vallejo, M.Sc.
PRIMER VOCAL DEL TRIBUNAL
____________________
Ing. Agr. Carlos Ortega Ojeda, M.Sc.
SEGUNDO VOCAL DEL TRIBUNAL
____________________
CONTENIDO
CAPÍTULO
PÁGINA
1. INTRODUCCIÓN 1 1.1. Objetivo general 2 1.2. Objetivos específicos 2 2. REVISIÓN DE LITERATURA 3 2.1. Resistencia Inducida 32.2. Actores hormonales en la defensa vegetal 4
2.3. Defensa vegetal ante estrés hídrico 6
2.4. Defensa vegetal contra insectos 8
2.5. Perspectivas de la defensa inducida vegetal 13
2.6. Brócoli 15
2.7. Mariposa blanca de las crucíferas Ascia monuste L. (Lepidóptera: Pieridae) 18
2.8. Arabidopsis 20
3. MATERIALES Y MÉTODOS 23
3.1. Ubicación del ensayo 23
3.2. Materiales 24
3.3. Métodos 24
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35
4.1. Efecto de inductores de resistencia en la tolerancia a estrés hídrico en plántulas de brócoli
35 4.2. Permanencia de la inducción a través del tiempo en estrés hídrico en brócoli 40 4.3. Efecto de inductores de resistencia en el desarrollo de lepidópteros en brócoli 50 4.4. Efecto de inductores de resistencia en la expresión de genes de defensa 64
5. CONCLUSIONES 70
6. RECOMENDACIONES 71
7. RESUMEN Y SUMMARY 72
8. BIBLIOGRAFÍA 74
LISTA DE ANEXOS
ANEXO
PÁG.
1 Características agronómicas del genotipo híbrido Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
84
2 Plagas de Brasicáceas en Ecuador. Cumbayá, Pichincha. 2013. 85 3 Ciclo de Vida de Ascia monuste L. (Lepidóptera: Pieridae). Cumbayá,
Pichincha. 2013.
86
4 Composición de turba PROMIX 'PGX'. Cumbayá, Pichincha. 2013. 87 5 Protocolo para la estimación rápida del contenido relativo de agua (Rapid
Estimates of Relative Water Content RWC). Cumbayá, Pichincha. 2013.
88
6 Cálculo del contenido relativo de agua (RWC) en los ensayos de tolerancia a estrés hídrico en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
89
7 Ensayo de tolerancia a estrés hídrico en brócoli (Brassica oleracea L.var. italica). Cumbayá, Pichincha. 2013.
90
8 Ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli (Brassica oleracea L.var. italica). Cumbayá, Pichincha. 2013.
91
9 Solución modificada de Hoagland. Cumbayá, Pichincha. 2013. 92 10 Identificación del lepidóptero Ascia monuste L. Cumbayá, Pichincha. 2013. 93 11 Medio de cultivo vegetal Murashigue & Sckoog. Cumbayá, Pichincha. 2013. 94 12 Protocolo para la prueba histoquímica GUS (Histochemical GUS assay) en
Arabidopsis thaliana L. Cumbayá, Pichincha. 2013.
95
13 Prueba histoquímica GUS (b-glucuronidasa) en Arabidopsis thaliana L. Cumbayá, Pichincha. 2013.
LISTA DE CUADROS
CUADRO
PÁG.
1 Estadísticas del Desarrollo de A. monuste L. 19
2 Tratamientos que se aplicaron en el ensayo de inducción de tolerancia a estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
25
3 Esquema del análisis de la varianza para el ensayo de inducción de tolerancia a estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
27
4 Tratamientos que se aplicaron en el ensayo de permanencia de la inducción de la tolerancia a estrés hídrico a través del tiempo en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
28
5 Esquema del análisis de la varianza en los ensayos de permanencia de la inducción de tolerancia a estrés hídrico a través del tiempo en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
29
6 Tratamientos aplicados en el ensayo de resistencia vegetal a lepidópteros en brócolicv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
30
7 Esquema del análisis de la varianza para el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legay. Cumbayá, Pichincha. 2013.
31
8 Tratamientos aplicados en el análisis GUS en Arabidopsis thaliana. Cumbayá, Pichincha. 2013.
33
9 ANOVA para recuperación relativa en ensayo de estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
35
10 Prueba de Tukey al 5 % para recuperación relativa en ensayo de estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
37
11 Concentraciones de los inductores que se destacaron en la recuperación del estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá. Pichincha 2013.
40
12 ANOVA para estudiar la recuperación relativa producida por los inductores de resistencia utilizados en el ensayo de primera semana de permanencia ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
41
13 Prueba de Tukey al 5 % para estratificar los tratamientos empleados en la evaluación de la recuperación relativa en la primera semana de permanencia ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
41
14 ANOVA para recuperación relativa en ensayo de segunda semana de permanencia de inducción ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
15 Prueba de Tukey al 5 % para recuperación relativa en ensayo de segunda semana de permanencia de inducción ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
43
16 ANOVA para recuperación relativa en ensayo de tercera semana de permanencia de inducción ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
44
17 Prueba de Tukey al 5 % para recuperación relativa en ensayo de tercera semana de permanencia de inducción ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
45
18 ANOVA para recuperación relativa en ensayo de cuarta semana de permanencia de inducción ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
46
19 Prueba de Tukey al 5 % para recuperación relativa en ensayo de cuarta semana de permanencia de inducción ante estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
46
20 ANOVA para analizar los pesos de las larvas en el día 5 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
50
21 Promedios de los pesos de las larvas de A. monuste L. en el día 5 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
50
22 ANOVA para analizar los pesos de las larvas en el día 10 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
51
23 Prueba de Tukey al 5 % para analizar los pesos de las larvas de A. monuste L. en el día 10 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
51
24 ANOVA para analizar los pesos de las larvas en el día 15 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
52
25 Prueba de Tukey al 5 % para analizar los pesos de las larvas en el día 15 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
53
26 ANOVA para analizar los pesos de las larvas en el día 20 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
54
27 Prueba de Tukey al 5 % para analizar los pesos de las larvas en el día 20 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
54
28 ANOVA para analizar los pesos de las pupas en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
56
29 Prueba de Tukey al 5 % para estratificar los pesos de las pupas en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
57
30 ANOVA para analizar los días transcurridos hasta convertirse en pupa en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
58
31 Prueba de Tukey al 5 % para estratificar los tratamientos en la variable días hasta convertirse en pupa en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
58
32 ANOVA para estudiar los datos generados por los inductores de resistencia en la evaluación de daños ocasionados a las plantas por A. monuste L., en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
59
33 Prueba de Tukey al 5 % para estratificar a los tratamientos de acuerdo al daño producido por A. monuste L. a las plantas en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
60
34 Tendencia de expresión genética en análisis GUS en los 15 tratamientos en Arabidopsis thaliana. Cumbayá, Pichincha. 2013.
65
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO
PÁG.
1 Vías de transducción de señales que conducen a la inducción de ISR, SAR y respuesta inducida a heridas.
4
2 Vías metabólicas en la inducción de resistencia. 5
3 Diagrama esquemático de los componentes de la relación estrés-respuesta. 6
4 Interacciones bióticas de las plantas. 8
5 Modelo esquemático de reconocimiento, señalización y traducción de las señales de defensa en la interacción de un herbívoro con la célula de una planta.
10
6 Defensa vegetal inducida directa e indirecta contra insectos. 12
7 Prueba histoquímica GUS. 22
8 Promedios de recuperaciones relativas producidas por diversos inductores de resistencia ante estrés hídrico en brócoli (Brassica oleracea L. var. italica cv. Legacy) con tres concentraciones. Cumbayá, Pichincha. 2013.
38
9 Promedios de recuperaciones relativas obtenidos en el ensayo de primera semana de inducción ante estrés hídrico en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
42
10 Promedios de recuperación relativa en ensayo de segunda semana de inducción ante estrés hídrico en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
44
11 Promedios de recuperación relativa en ensayo de tercera semana de inducción ante estrés hídrico en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
45
12 Promedios de recuperación relativa registrados en el ensayo de cuarta semana de inducción ante estrés hídrico en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
47
13 Permanencia de la inducción en el tiempo en estrés hídrico en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
49
14 Promedios de los pesos de las larvas en el día 10 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli cv. Legacy. Cumbayá, Pichincha. 2013.
52
15 Promedios de los pesos de las larvas en el día 15 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
16 Promedios de los pesos de las larvas en el día 20 del ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
55
17 Pesos de larvas de Ascia monuste L. en los días 5, 10, 15 y 20 en ensayos de resistencia a lepidópteros en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
56
18 Promedios de los pesos de las pupas en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
57
19 Promedios de los períodos expresados en días que presentaron los tratamientos en la variable días hasta convertirse en pupa en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
59
20 Promedios de los daños ocasionados por A. monuste L. a las plantas en el ensayo de resistencia a lepidópteros en brócoli. Cumbayá, Pichincha. 2013.
60
21 Fotografías que demuestran los daños a las plantas en el ensayo para evaluar la inducción de resistencia a lepidópteros en brócoli al día 25. Cumbayá, Pichincha. 2013.
62
22 Análisis de expresión genética GUS en Arabidopsis thaliana en los 15 tratamientos. Cumbayá, Pichincha. 2013.
64
23 Modelo de la relación entre moléculas inductoras, vías de señalización de defensa y efectos biológicos en la resistencia ante diferentes tipos de estrés. Cumbayá, Pichincha. 2013.
68
EVALUACIÓN DE INDUCTORES DE RESISTENCIA, PARA EL
CONTROL DE LEPIDÓPTEROS Y TOLERANCIA A ESTRÉS
HÍDRICO EN BRÓCOLI (
Brassica oleracea
L. var.
italica
) Y EN
Arabidopsis thaliana
(L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA.
RESUMEN
En Cumbayá, Pichincha, se evaluó en brócoli (
Brassica oleracea
L. var.
italica
) el efecto
de varias moléculas inductoras de resistencia tanto a estrés hídrico como al ataque del
insecto
Ascia monuste
L. (Lepidóptera: Pieridae), y se visualizaron las rutas metabólicas de
defensa activadas por cada inductor. Las plantas pretratadas con los inductores mostraron
mejor recuperación ante el estrés hídrico que el testigo, habiendo sido la concentración de
las moléculas un factor clave. Las mejores respuestas se registraron con: quitosán (CHT)
0.88 mM, ácido salicílico (SA) 1.00 mM. En concomitancia, los resultados dieron a
entender que la defensa a estrés hídrico puede estar vinculada con la vía metabólica de
defensa del ácido salicílico (SA). Por otro lado, se determinó el efecto de los inductores en
el desarrollo y daño de
A. monuste
, en cuyo caso, se registró el mejor efecto con metil
jasmonato (MeJA) 0.10 mM. Adicionalmente, los inductores en
Arabidopsis thaliana
(L.)
Heynh evidenciaron la expresión de varios genes marcadores de señalización de defensa.
DESCRIPTORES:
INMUNIDAD, QUÍMICOS, SEQUÍA, PLAGAS, GENES.
EVALUATION OF RESISTANCE INDUCERS, ON THE CONTROL
OF LEPIDOPTERANS AND TOLERANCE TO WATER STRESS IN
BROCCOLI (
Brassica oleracea
L. var.
italica
) AND
Arabidopsis thaliana
(L.) Heynh. CUMBAYÁ, PICHINCHA.
SUMMARY
The effect of resistance inducers was evaluated upon water stress and lepidopterans
damage and also was visualized the metabolic defense pathways that activate each inductor
at Cumbayá, Pichincha. Plants of broccoli (
Brassica oleracea
L. var.
italica
) pretreated
with inducers molecules showed better water stress recovery, the concentration of the
molecules was a key factor. The better performances were found with chitosan (CHT) 0.88
mM, salicylic acid (SA) 1.00 mM, hexanoic acid (Hx) 6.00 mM. The results suggest that
defense to water stress can be linked with the SA pathway. Also the effect upon
development of herbivorous insect
Ascia monuste
L. (Lepidoptera: Pieridae) was
evaluated. Less larvae development and less damage on plants were found with methyl
jasmonate (MeJA) 0.10 mM. Also was found molecules with no effect on the development
and damage. Moreover susceptibility and greater damage were found with some inducers.
Also, it was found that application of inducer molecules on
Arabidopsis thaliana
(L.)
Heynh induced defense signaling marker genes expression.
1.
INTRODUCCIÓN
A medida que la población continúa creciendo, a más de los posibles efectos de un cambio climático global, el suministro de alimentos también debe crecer para satisfacer las necesidades nutricionales. Todos los años la producción agrícola mundial se reduce del veinte al cuarenta por ciento a causa de plagas y enfermedades (FAO, 2012). Una manera de garantizar la estabilidad y plenitud de las ofertas de comestibles es mitigar la pérdida de cultivos causada por patógenos, insectos herbívoros y condiciones ambientales desfavorables.
Estrategias para combatir estos factores adversos son las tecnologías tradicionales como fitomejoramiento y aplicación de pesticidas. La aplicación de pesticidas ha sido una práctica común para el control de muchos de estos problemas, pero la necesidad de mantener y mejorar la salud pública y del ambiente conlleva al desarrollo de estrategias alternativas.
Mayores esfuerzos están ahora siendo dedicados en la utilización del potencial genético de las plantas para resistir a patógenos, insectos herbívoros y factores ambientales adversos. Entre las nuevas estrategias, sin recurrir a la alteración genética, se incluye a la aplicación de inductores de resistencia que estimulan las defensas propias de las plantas (Pieterse et al., 2009).
Esta estrategia a pesar de sus limitaciones es muy prometedora y ofrece la oportunidad para desarrollar nuevas herramientas en la defensa vegetal. Además el desarrollo de la resistencia inducida puede ser una estrategia ambientalmente segura para controlar estos factores desfavorables (Anderson et al., 2006).
La resistencia de plantas puede incrementarse con el uso de sustancias químicas no tóxicas que inducen la activación de sus mecanismos de defensa natural, es entonces necesaria una mejor comprensión de las moléculas inductoras, relaciones planta-insecto, planta-patógeno, respuestas a estrés abiótico y dosis para maximizar la eficacia de su uso dentro del manejo integrado en aras de lograr una protección de amplio espectro, con efectos de larga duración y por supuesto con la reducción en el uso de pesticidas (Kuć, 2001).
Esta investigación pretende encontrar evidencia de la efectividad del uso de inductores de resistencia tanto a factores bióticos como abióticos desfavorables para la agricultura, con el propósito de fomentar la innovación tecnológica en el área de protección de plantas.
1.1.
Objetivo general
Evaluar el efecto de inductores de resistencia para controlar lepidópteros, tolerar el estrés hídrico en brócoli (Brassica oleracea L. var. italica) y conocer las rutas metabólicas que activa cada inductor en Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
1.2.
Objetivos específicos
1.Establecer el efecto de inductores de resistencia en la tolerancia al estrés hídrico en plántulas de brócoli (Brassica oleracea L. var. italica).
2.Delimitar la permanencia de la inducción de resistencia en el tiempo con cada inductor en estrés hídrico en plántulas de brócoli (Brassica oleracea L. var. italica).
3.Determinar el efecto de inductores de resistencia vegetal en el desarrollo larval del lepidóptero Ascia monuste L.
4.Visualizar los genes marcadores de expresión de cada ruta de defensa que se activan con la aplicación de cada inductor, empleando la prueba histoquímica GUS (β-glucoronidasa) en líneas reporteras de Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.
2.
REVISIÓN DE LITERATURA
2.1.
Resistencia Inducida
El desarrollo de las plantas está sumamente afectado por la combinación de estreses ambientales como temperaturas extremas, sequía o alta salinidad y bióticos como el ataque de patógenos e insectos (Walters et al., 2005). Desde el punto de vista de la agricultura cada estrés es un factor significante para una substancial pérdida en la producción de cultivos.
Los mecanismos fisiológicos que gobiernan las respuestas de la planta para hacer frente a factores adversos están gobernadas por hormonas, las mismas que permiten a las plantas defenderse a sí mismas tanto de estreses abióticos como bióticos, con una variedad de defensas físicas y químicas (Pieterse et al., 2012).
Sobre una infección o estrés ambiental, las plantas responden activando mecanismos de defensa en un intento por evitar la enfermedad o el daño. Este proceso es regulado por una compleja red de señales, moléculas y reguladores transcripcionales (Jones y Dangl, 2006; Pieterse et al., 2012). Los principales actores en la regulación de las vías de señalización de defensa de las plantas son las hormonas ácido salicílico (SA), ácido jasmónico (JA) y etileno (ET) (Pieterse et al., 2009).
Este estado aumentado de la capacidad defensiva desarrollado cuando la planta es estimulada, adicional a la resistencia física preexistente, se llama resistencia inducida (IR) (Van Loon et al., 1998). IR permite a la planta resistir futuros ataques de patógenos virulentos, insectos o condiciones ambientales adversas. IR puede ser activada por diferentes factores tanto bióticos como abióticos (Pieterse et al., 2012).
Una de las mejores IR caracterizada es la resistencia sistémica adquirida (SAR) (Durrant y Dong, 2004). SAR esta mediada por la acumulación de SA que conduce a la expresión de la reacción de hipersensibilidad (HR) y es principalmente efectiva contra patógenos biotróficos. Por otro lado, rizobacterias no patogénicas son capaces de activar IR que es efectiva contra patógenos necrotróficos e insectos y es llamada resistencia sistémica inducida (ISR), esta respuesta es mediada por las hormonas JA y ET (Pieterse et al., 2009; Walling, 2009) (Gráfico 1).
Aparte de la estimulación biológica, la IR también puede ser desencadenada por compuestos químicos. Algunos de los más caracterizados son benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbotionic acid S-methyl ester (BTH) (Mandal et al., 2008), β-aminobutyric acid (BABA) (Cohen et al., 2011), sacarina (Boyle y Walters, 2005), riboflavina (Zhang et al., 2009), ácido hexanoico (Vicedo et al., 2009), silicato de sodio (Reynolds et al., 2009), menadiona bisulfito de sodio (Borges et al., 2009), quitosan (Benhamou et al., 1994), ácido azelaico (Jung et al., 2009), fosfitos (Reuveni et al., 2003), tiamina (Ahn et al., 2005), entre otros, que actúan en diferentes puntos de las vías de transducción de señales específicas que median las respuestas de defensa (SA, JA y ET). Estos compuestos que actúan como inductores generalmente no presentan actividad antimicrobiana directa (Anderson et al., 2006).
Varios procesos de IR están asociados con un aumento de la capacidad para expresar respuestas de defensa específica sobre el ataque de un agresor, este estado es llamado “priming”. Plantas en estado de priming manifiestan una rápida y fuerte activación de varias respuestas celulares de defensa que son inducidas luego del ataque de patógenos, insectos o estrés abiótico (Conrath et al., 2006).
2.2.
2.2.Actores hormonales en la defensa vegetal
Es ampliamente conocido que las plantas responden a diferentes tipos de atacantes con unas señales hormonales exclusivas, que se traducen en cambios específicos en el transcriptoma (De Vos et al., 2005). Este potencial regulatorio permite a la planta adaptarse rápidamente a su ambiente hostil y utilizar sus recursos de una manera eficiente.
Niveles de SA aumentan cuando la planta es atacada por patógenos como bacterias, oomicetos, hongos y virus que en general tienen un estilo de vida (hemi-) biotrófico. SA es sintetizado en el cloroplasto y su aumento inducido por el patógeno es producido a partir del isocorismato a través de la isocorismato sintasa (ICS1), o también de la actividad de la fenilalanina amonio liasa (PAL) a partir del cinamato (Verhage et al., 2010).
SA ocasiona la alteración del estado redox del citosol, el cual conduce a la reducción de la forma inactiva oligomérica de la proteína nonexpressor of pathogenesis-related genes 1 (NPR1) a su forma monomérica activa. Subsecuentemente monómeros activos de NPR1 son traslocados al núcleo donde interactúan con factores de transcripción (TGA, WRKY) conduciendo a la expresión de los genes de defensa relacionados con el SA como PR1, PR2, entre otros (Verhage et al., 2010; Pieterse et al., 2012) (Gráfico 2).
Abreviaturas: JA, ácido jasmónico; ET, etileno; SA, ácido salicílico; ISR, resistencia sistémica inducida; SAR, resistencia sistémica adquirida.
Gráfico 1. Vías de transducción de señales que conducen a la inducción de ISR, SAR y respuesta inducida a heridas, adaptado de Pieterse y Van Loon (1999).
Rizobacteria Respuesta del JA Respuesta de genes de defensa de JA/ET (“Priming”) Patógeno SA
Proteínas relacionadas con la patogenicidad (PR) ISR SAR Respuesta del ET Insecto / Patógeno JA Compuestos de defensa
Por otro lado, JA es producido en plantas que son dañadas mecánicamente cuando los insectos comen sus tejidos (Howe, 2004), también se produce sobre la infección por patógenos necrotróficos (Pieterse et al., 2009).
JA se deriva de los lípidos de la membrana del cloroplasto, como el ácido linoleico que es rápidamente metabolizado a través de la vía de biosíntesis de la oxilipina a su forma precursora de JA, 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) y dinor (dn)-OPDA. Después se traslocan al peroxisoma donde experimentan tres pasos de beta-oxidación resultando en la formación de JA (Verhage et al., 2010; Pieterse et al., 2012).
JA es percibido por el receptor coronatine insensitive 1 (COI1), una proteína F-box que es parte de la ligasa ubiquitina E3 del complejo de degradación SCFCOl1, que degrada mediante ubiquitinación a la proteína jasmonate ZIM-domain (JAZ), que es parte del complejo receptor de JA que reprime los factores de trascripción de los genes sensibles al JA como MYC2, ERF1, ORA59 (Gráfico 2). MYC2 regula un conjunto grande de genes como VSP2 y LOX2; mientras que ERF1 y ORA59 integran la señalización entre JA y ET transcribiendo genes como el PDF1.2 (Verhage et al., 2010; Pieterse et al., 2012) (Gráfico 2). También se sabe que la respuesta genética inducida por SA suprime la respuesta genética inducida por JA (Leon-Reyes et al., 2010).
Como se analizó, después de la señalización se expresan genes que luego de los procesos de transcripción y traducción van a activar varios mecanismos de defensa. A continuación se revisan los mecanismos de defensa de las plantas ante estrés hídrico y contra insectos.
JA
JAZsubi
Genes de respuesta del JA Ej. VSP2, LOX2 Efectivo contra
insectos
Factores de transcripción MYC2
Genes de respuesta del JA/ET Ej. PDF1.2 Efectivo contra necrotróficos ET Factores de transcripción ERF1, ORA59 SA NPR1 111
Genes de respuesta del SA Ej. PR1
Efectivo contra (hemi) biotróficos Factores de transcripción
TGA, WRKY
Abreviaturas: SA, ácido salicílico; JA, ácido jasmónico; ET, etileno; NPR1, proteína nonexpressor of pathogenesis-related genes 1; JAZsubi, ubiquitinación de la proteína JAZ; TGA, WRKY, MYC2, ERF1, ORA59, factores de transcripción; PR1, VSP2, LOX2, PDF1.2, genes marcadores de defensa.
2.3.
Defensa vegetal ante estrés hídrico
Las plantas han desarrollado varios mecanismos bioquímicos y fisiológicos para responder y adaptarse ante un estrés determinado y así adquirir tolerancia a ese estrés. Para hacer frente a un estrés las plantas presentan defensas preexistentes e inducidas (Gatehouse, 2002).
Es así que las plantas en sus membranas celulares poseen receptores que perciben cambios en el ambiente próximo (físico, químico o metabolitos) y desencadenan una transducción de señales, las mismas que pueden producir, percibir y transmitir tanto mensajeros primarios como secundarios, que activan o reprimen factores de transcripción que a su vez activan genes con funciones que conforman la defensa (Pastori y Foyer, 2002) (Gráfico 3).
Algunas estrategias que tienen las plantas para soportar la deficiencia de agua son: inhibición de la expansión de las hojas, abscisión de las hojas, aumento del crecimiento de la raíz y cierre de estomas (Taiz y Zeiger, 2002).
La reducción en el área foliar es la primera línea de defensa ante una sequía, con una menor área foliar la planta transpira menos, conservando agua en el suelo. La deficiencia de agua en el desarrollo de las plantas genera un limitado crecimiento de las hojas, disminuyendo su área y por tanto reduciendo la fotosíntesis, el consumo de carbono y la energía. Al disminuir el agua en la planta el tamaño de las células se reduce y la pared celular se relaja, este decrecimiento en el volumen de la célula reduce la presión de turgencia y extensibilidad de la célula, con la subsecuente concentración de solutos (Taiz y Zeiger, 2002).
La extensibilidad de la pared celular es mayor cuando la solución de la pared celular es ligeramente ácida, en estrés disminuye la extensibilidad de la pared celular porque el pH aumenta, esta disminución en la extensibilidad de la célula junto con la disminución de turgencia, disminuyen el crecimiento (Matthews et al., 1984).
Gráfico 3. Diagrama de los componentes de la relación estrés-respuesta (Pastori y Foyer, 2002). ESTRÉS Muchos receptores/ Membrana Cambios físicos Transductores (genes de señalización/ moléculas de señalización) Factores de transcripción Genes objetivo
Además cambios en las tasas de crecimiento en respuesta a estrés, coordinadamente controlan otros procesos importantes como biosíntesis de membrana y pared celular, división celular y síntesis de proteínas (Burssens et al., 2000).
Asimismo, el estrés hídrico estimula la abscisión de las hojas. Las hojas desarrolladas de una planta en estrés hídrico presentarán senescencia y eventualmente caída, la abscisión en estrés hídrico resulta en gran parte por aumento en la síntesis de la hormona vegetal etileno (ET) (Taiz y Zeiger, 2002).
El estrés hídrico promueve la elongación de la raíz en búsqueda de humedad en zonas más profundas del suelo, debido a la producción de la hormona vegetal ácido abscísico (ABA), además inhibe el crecimiento de brotes, ya que los nutrientes son redistribuidos a la raíz para ayudar en su crecimiento, al mismo tiempo que los brotes pierden turgencia (Saab et al., 1990).
Además existe cierre de estomas durante el estrés hídrico en respuesta al ABA, cuando el estrés hídrico comienza rápidamente una forma eficiente de evitar la desecación es el cierre de estomas, de esta manera se reduce la evaporación del área foliar existente. Cambios en la turgencia de las células guardas de los estomas modulan su apertura o cierre. Como las células guardas están en el epidermis de las hojas, estas pueden perder turgencia como resultado directo de la pérdida de agua por evaporación, este cierre de estomas es llamado cierre hidropasivo. Un segundo mecanismo llamado cierre hidroactivo se acciona cuando las hojas o las raíces están deshidratadas y dependen de procesos metabólicos en las células guardas (Taiz y Zeiger, 2002), que aumentan los niveles de ABA causando un incremento en la concentración de Ca+ en el citosol y subsecuentemente la activación de canales aniónicos localizados en la membrana (Pei et al., 2000), esto conduce a la despolarización de las células guardas, eflujo de potasio, pérdida de volumen y turgencia de las células guardas, y finalmente cierre de los estomas (Schroeder et al., 2001).
El ABA es sintetizado continuamente a un bajo ritmo en el mesófilo y tiende a acumularse en los cloroplastos, cuando el mesófilo se deshidrata ligeramente, el ABA acumulado en los cloroplastos es liberado al apoplasto del mesófilo, distribuyéndose a las células guardas, además en estrés el ABA se empieza a sintetizar a un alto ritmo y más ABA se acumula en el apoplasto, estos niveles de ABA aumentan y prolongan el cierre de estomas (Hartung et al., 1998); además otra señalización implicada presenta cambios en el pH y en la distribución de iones inorgánicos (Davies et al., 2002), además de expresar genes que regulan osmolitos, antioxidantes, entre otros (Zhang et al., 2000).
Recientes estudios con técnica de microarreglos (microarrays) han examinado la expresión de todo el genoma de algunas plantas en respuesta a estrés, algunos estudios han revelado que un gran número de genes muestran cambios en la expresión después de estrés, genes que median el estrés reflejan hasta el 10 % del total de genes examinados en arroz (Kawasaki et al., 2001).
Curiosamente varios genes inducidos transcripcionalmente por estrés abiótico también son parte de las respuestas de defensa de la planta al ataque de patógenos e insectos, como la expresión de la peroxidasa, PR-1, PR-10, y osmotina (PR-5) que se incrementan debido a estrés hídrico (Zhu et al., 1995), y genes de respuesta a heridas (Cheong et al., 2002), lo que sugiere que los mecanismos de tolerancia a estreses abióticos están relacionados con los de defensa a estreses bióticos.
2.4.
Defensa vegetal contra insectos
Plantas e insectos han coexistido por al menos 350 millones de años. En este periodo han desarrollado una variedad de interacciones diferentes (Gatehouse, 2002). En algunos casos estas interacciones han sido benéficas para las plantas como en la polinización y dispersión de semillas, pero en otros casos han sido perjudiciales cuando las plantas son atacadas por insectos herbívoros (Dicke y Van Poecke, 2002). Un esquema general de las interacciones bióticas de las plantas se muestra en el Gráfico 4.
Gráfico 4. Interacciones bióticas de las plantas: (1) Infección con patógenos; (2) ataque de herbívoros; (2a) insectos masticadores, ej. Larvas de lepidópteros, (2b) insectos que se alimentan del contenido celular, ej. Ácaros; (3) atracción de parasitoides o predadores por la inducción de volátiles; (3a) avispas parasitoides atraídas por orugas; (3b) ácaros predadores; (4) atracción de polinizadores por volátiles de las flores y néctar; (5) animales actuando como dispersores de semillas; (6) raíces de plantas colonizadas por hongos simbióticos micorrizas arbusculares; (7) leguminosas en simbiosis con rizobacterias, resultando en nodulación de las raíces; (8) herbívoros bajo el suelo, ej. Nemátodos; (9a) señalización aérea planta-planta con VOC’s (Compuestos orgánicos volátiles); (9b) señalización planta-planta con exudados de la raíz (Mithöfer et al., 2009). Una manera sencilla que la plantas utilizan para evitar ser comidas es ser tóxicas o menos palatables (Pasteels, 2007). Así, las plantas han desarrollado un gran conjunto de defensas químicas que provocan una efectiva y drástica reducción en sus atacantes insectiles, así como atacantes nemátodos. La activación de respuestas de defensa específicas requieren reconocimiento eficiente
del agresor, conversión de la señal percibida y transmisión de estas señales, para dar lugar al comienzo de reacciones apropiadas contra el enemigo (Maffei et al., 2007; Walling, 2009).
Las estrategias que las plantas han desarrollado para defenderse ellas mismas contra insectos fitófagos y nemátodos incluyen: las defensas que están constitutivamente presentes como barreras físicas, y por medio de mecanismos de defensa que son inducidos en el ataque como fitoquímicos (Dicke y Van Poecke, 2002).
La defensa inducida contra insectos herbívoros se activa al empezar el ataque y consta de dos componentes: la defensa directa, con la producción de químicos que actúan como toxinas o disuasorias para la alimentación (Kessler y Baldwin, 2002; Howe, 2004), y la defensa indirecta, con la producción de una mezcla de volátiles que atraen a los enemigos carnívoros de los herbívoros (Takabayashi y Dicke, 1996).
2.4.1.Reconocimiento, señalización y traducción
Las plantas están equipadas con un sofisticado sistema sensorial para percibir señales del ambiente y de ese modo detectan enemigos potenciales y traducen cada señal en una apropiada respuesta bioquímica o fisiológica. La señal de percepción en las células de la planta puede depender de la presencia de un receptor específico para señales químicas o el proceso de reconocimiento general que depende de una herida localizada en la planta (Walling, 2009). En principio los herbívoros combinan dos diferentes aspectos en el proceso de alimentación. Primero, con heridas mecánicas en el tejido infestado y segundo, con la introducción de secreciones orales en el tejido herido. Así, se encuentran ambos aspectos mecánico y químico (Mithöfer et al., 2009).
Se ha encontrado que en hojas de frejol (Phaseolus lunatus), la simulación mecánica de daños de larvas provocaron casi la misma mezcla de compuestos volátiles que fueron detectados en los daños provocados por los herbívoros, aunque se observaron diferencias cuantitativas, se demostró que el daño mecánico continuo fue suficiente para inducir emisión de volátiles tanto de forma local como sistémica (Mithöfer et al., 2005).
Las secreciones orales de los insectos contienen compuestos específicos que actúan como inductores, por ejemplo enzimas como glucosa oxidasa, β-gluosidasa, y fosfatasa alcalina, son compuestos que inducen respuestas de defensa (Mithöfer et al., 2009).
Un inductor encontrado en Spodoptera exigua es la volicitina, N-(17-hidroxylinolenoyl)-L-glutamine, este compuesto exhibe alta actividad inductora de volátiles cuando es aplicado en plantas (Alborn et al., 1997). Recientemente dos inductores fueron aislados de secreciones orales de Spodoptera frugiperda y sus estructuras fueron determinadas: inceptinas, péptidos con puente disulfuro con fragmentos proteolíticos de ATPsintasa subunidad γ. Las inceptinas desencadenan producción de etileno (ET), además incrementan el nivel de ácido jasmónico (JA) mediando la percepción de las plantas e induciendo varias defensas en Vigna unguiculata; claramente las inceptinas funcionan como iniciadores específicos de las señales de respuesta de la planta al ataque del insecto (Schmelz et al., 2006). Estos inductores actúan directamente sobre las membranas de la planta o interactúan con sitios específicos vinculantes o receptores en la planta que posteriormente traducen señales de defensa.
La defensa de las plantas contra herbívoros esta mediada por una compleja red de interacción de señales, sensores/receptores que reconocen el ataque del herbívoro (Walling, 2009). Cambios en la expresión de los genes mientras se induce la respuesta a los herbívoros y estudios de su efecto en la biología de los insectos, sugieren un patrón de múltiples vías de defensa independientes pero conectadas (Van Oosten et al., 2008).
JA protege a la planta de la infestación de insectos y patógenos necrotróficos que matan la célula hospedera después de su alimentación (Mithöfer et al., 2009).
SA, JA y ET funcionan como moléculas señalizadoras que median las respuestas de las plantas a patógenos y herbívoros resultando en la activación de distintos conjuntos de genes de defensa. SA activa el SAR que afecta negativamente a la resistencia contra determinados insectos, causado por el efecto antagónico de SA en la señalización de JA (Van Oosten et al., 2008).
En el Gráfico 5 se muestra un esquema del reconocimiento, señalización y traducción de las señales de defensa en la interacción de un herbívoro (nemátodo) con una célula vegetal.
Gráfico 5. Modelo esquemático de reconocimiento, señalización y traducción de las señales de defensa en la interacción de un herbívoro (nemátodo) con la célula de una planta (Williamson y Hussey, 1996).
2.4.2.Estrategias de defensa
Los mecanismos de defensa de las plantas pueden ser clasificados en constitutivos e inducidos. Los constitutivos incluyen características morfológicas y estructurales como también productos de defensa constitutivos. Es así que las barreras constitutivas físicas como espinas pueden disuadir a los herbívoros; mientras, las paredes celulares o cutícula sean espesas, altos niveles de lignificación o acumulación de resinas pueden impedir la penetración de bacterias, hongos y pequeños herbívoros. Los tricomas presentan una barrera mecánica, también son estructuras secretoras, produciendo y acumulando compuestos antimicrobianos, disuasivos de la alimentación y ovoposición, y además toxinas (Mithöfer et al., 2009).
Nemátodo
Secreciones de las glándulas Anfidia Secreciones anfidiales Estilete Pared celular Callosa Membrana plasmática Receptor Señal Transducción Núcleo Proteínas
Con frecuencia las defensas constitutivas permiten a plantas determinadas ser resistentes a herbívoros específicos, mientras que en la competencia por armarse algunos insectos han desarrollado adaptaciones que permiten alimentarse o defenderse químicamente de las plantas sin presentar efectos negativos en su desarrollo (Gatehouse, 2002).
La defensa inducida es por contraste activada después del ataque de patógenos o herbívoros y puede ser clasificada en modos de protección directos e indirectos (Gráfico 6).
En procesos de inducción, el reconocimiento de un ataque insecto y su consecuente alarma de señales, es un requisito para una defensa rápida y eficiente. Algunas formas de resistencia inducida no son restringidas a una respuesta local en el sitio de daño, sino que son detectadas sistemáticamente a través de la planta, así las defensas inducidas suponen la síntesis y acumulación de varios metabolitos secundarios que influencian en la atracción/disuasión de los insectos, así como la inhibición del crecimiento y desarrollo (Mithöfer et al., 2009).
La defensa directa actúa inmediatamente sobre la sobrevivencia o el ataque del herbívoro e incluye la acumulación inducida de toxinas o disuasivos de la alimentación, fortificación de las paredes celulares y la reacción de hipersensibilidad (Walling, 2009).
Entre algunos mecanismos directos que las plantas emplean para defenderse de los insectos, se encuentra la alteración de la digestión, que se regula disminuyendo el valor nutritivo de los tejidos vegetales que utilizan para alimentarse, por ejemplo produciendo taninos, resinas, sílice o polifenoloxidasas (PPOs), que son enzimas que catalizan la oxidación de fenoles a quininas, estas quininas se entrecruzan a la cadena lateral nucleofílica de las proteínas y aminoácidos libres reduciendo su digestibilidad (Kessler y Baldwin, 2002).
Un similar modo de acción es desplegado por aminoácidos deaminasas que son capaces de degradar aminoácidos en el intestino medio de los insectos disminuyendo la absorción de compuestos esenciales; también pueden producir inhibidores de la proteinasa (PIs) que actúan contra las enzimas implicadas en la asimilación del alimento. Además las plantas pueden producir toxinas que van dirigidas a matar o dañar seriamente al insecto, como los glucosinolatos, alcaloides e isotiocinatos, entre otros (Verhage et al., 2010), este tipo de defensa es conocida como defensa directa (Gráfico 6). Los compuestos producidos en la defensa directa pueden disminuir el desarrollo de los herbívoros por reducción de la eficiencia digestiva, mermando el desarrollo y limitando la fecundidad (De Vos y Jander, 2008; Verhage et al., 2011).
En tomate (Lycopersicum esculentum), PIs como tripsina fueron probados con Helicoverna armígera en diferentes órganos de la planta, observaciones en el campo revelaron que larvas de H. armígera infestaron hojas y frutos pero no flores, un hecho que fue correlacionado con los altos niveles de PIs que se acumularon en los tejidos de las flores (Damle et al., 2005).
Asimismo las plantas son capaces de liberar compuestos volátiles orgánicos (VOCs) que son percibidos por insectos parasitoides y predadores, y son usados como señales para rastrear a sus presas, después del rastreo, algunos herbívoros pueden ser consumidos directamente, otros pueden ser utilizados para la incubación de huevos o también como fuente de alimento para larvas parasitoides. Estos químicos volátiles pertenecen a un gran grupo de terpenoides (mono-, di-, sesqui- y homoterpenoides), ácidos grasos derivados, compuestos aromáticos, algunos alcanos,
alquenos y alcoholes (Holopainen, 2004), esta defensa se conoce como defensa indirecta (Gráfico 6).
Los compuestos orgánicos volátiles pueden transportar diferentes tipos de información: (a) a los herbívoros para localizar a su hospedante, (b) a la defensa indirecta empleando un tercer nivel trófico por atracción de enemigos naturales de los atacantes de la planta, y (c) a distintas partes de la misma planta o plantas vecinas para ajustar su fenotipo defensivo (Mithöfer et al., 2009).
En algunos sistemas, la cantidad de compuestos volátiles emitidos por las plantas está correlacionado con la densidad de insectos fitófagos sobre la planta (Schmelz et al., 2006). Estos volátiles afectan el comportamiento de los parasitoides que son atraídos hacia las plantas. Los animales usualmente requieren información acerca del estado actual de su hábitat para optimizar su comportamiento, para esto ellos usan un proceso de aprendizaje a través del cual se actualizan constantemente de acuerdo a lo que ellos perciben (Mithöfer et al., 2009).
En otras estrategias, las plantas incluso pueden redistribuir sus nutrientes a otros órganos de almacenamiento para utilizarlos en un recrecimiento luego de terminado el ciclo de vida del insecto (Stowe et al., 2000).
El aumento en la resistencia a herbívoros plaga como insectos o nemátodos, puede inducirse por la colonización de rizobacterias (ISR) o la aplicación de diversos compuestos naturales o sintéticos como el JA, BABA, sacarina, quitosan, riboflavina, ácido hexanoico, entre otros (Kuć, 2001). Estas moléculas inductoras de resistencia actúan en diversos puntos de las vías de señalización implicadas en la resistencia. Esta resistencia pretende ser una herramienta útil para emplearse dentro del Manejo Integrado de Plagas (Walters et al., 2005).
Gráfico 6. Defensa vegetal inducida directa e indirecta contra insectos, en las relaciones entre plantas, insectos herbívoros y sus enemigos naturales (Van Oosten, 2007).
Enemigo natural
Herbívoro
Planta
indirecta
2.5.
Perspectivas de la defensa inducida vegetal
Actualmente el desarrollo de nuevos químicos inductores de resistencia representa una alternativa atractiva para proteger a los cultivos contra patógenos, insectos o estreses ambientales, siendo esta una estrategia que incrementa la defensa natural sin recurrir a la alteración genética (Kuć, 2001). La aplicación de pesticidas ha sido una práctica común para el control de muchos de estos problemas, pero la necesidad de mantener y mejorar la salud pública y del ambiente conlleva al desarrollo de estrategias alternativas.
Anderson et al. (2006), cita algunas ventajas de la activación de la defensa inducida sistémica:
Compatibilidad ecológica, muchas moléculas cumplen los requerimientos para obtener la etiqueta de insumo orgánico para la agricultura.
Protección sistémica en toda la planta, incluyendo efectos post cosecha.
Protección contra patógenos y plagas que han desarrollado resistencia a pesticidas químicos. Funciona a través de mecanismos propios de la planta, no con un ataque directo sobre el
patógeno o plaga, evitando efectos no deseados sobre organismos benéficos o no patogénicos. Debido a la serie de genes que se activan, puede ser beneficioso en otros tipos de estrés,
proveyendo protección a un amplio rango de amenazas como patógenos, insectos y estreses ambientales.
Las aplicaciones requieren poco tiempo de reingreso a la plantación, así como para la cosecha. Compatible con otros tipos de estrategias de control, logrando un mayor alcance en la
protección.
Algunos compuestos químicos que se han encontrado con efecto de inducción de resistencia son: Ácido salicílico (SA): recibe su nombre de Salix, la denominación latina del sauce de cuya corteza fue aislado por primera vez. Se trata de un sólido incoloro que suele cristalizar en forma de agujas, tiene una buena solubilidad en etanol y éter. Este producto sirve como materia prima para la obtención del ácido acetilsalicílico, comercialmente conocido como Aspirina. Se conoce que SA activa resistencia sistémica adquirida (SAR) (Hayat y Ahmad, 2007); además SA conduce a la expresión de los genes de defensa relacionados con el SAR como PR1, PR2, entre otros (Pieterse et al., 2009; Pieterse et al., 2012).
Metil jasmonato (MeJA): es un compuesto orgánico volátil, las plantas producen ácido jasmónico y metil jasmonato en respuesta a muchos estreses bióticos y abióticos (en particular herbívoros y heridas) y lo acumulan en las partes dañadas de la planta. En un ataque de herbívoros una planta produce MeJA tanto para la defensa interna como para la señalización a otras plantas (Truman et al., 2007). El metil jasmonato activa la ruta metabólica del JA, que después del proceso de transducción de señales activa factores de trascripción de los genes sensibles al JA (MYC2, ERF1, ORA59). El factor de transcripción MYC2 regula un conjunto grande de genes como VSP2 y LOX2 efectivos contra insectos; mientras que ERF1 y ORA59 integran la señalización entre JA y ET
transcribiendo genes como el PDF1.2 (Gráfico 2) efectivos contra patógenos necrotróficos (Verhage et al., 2010; Pieterse et al., 2012).
BABA (ácido DL-beta-amino butírico): es un compuesto no proteico que ha mostrado capacidad de aumentar las defensas en varios especies vegetales(Cohen et al., 2011), además se conoce que en la defensa vegetal aumenta la formación de papila rica en callosa, asimismo es capaz de inducir priming, esta respuesta depende de una vía de defensa desconocida, que implica al ácido abscísico (ABA) y la señalización de los fosfoinosítidos (Ton et al., 2009).
Sacarina (Sacch): La sacarina es uno de los edulcorantes sintéticos más antiguos. Químicamente es una imida o-sulfobenzoica. En la industria alimentaria se conoce con las siglas E954. Se ha reportado a la sacarina como desencadenante de la señalización SAR (Srivastava et al., 2011), asimismo suple la energía que necesita la planta para la defensa sin disminuir el crecimiento y desarrollo (Boyle y Walters, 2005).
Riboflavina (Rib): también conocida como vitamina B2, la riboflavina pertenece al grupo de pigmentos amarillos fluorescentes llamados flavinas. La vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble de color amarillo, constituida por un anillo de isoaloxazina dimetilado al que se une el ribitol, un alcohol derivado de la ribosa. Los tres anillos forman la isoaloxacina y el ribitol es la cadena de cinco carbonos en la parte superior. Esta vitamina es sensible a la luz solar y a ciertos tratamientos, como la pasteurización. En la resistencia de plantas participa en algunos procesos redox, posiblemente en la señalización de NPR1, asimismo está relacionada con el estallido de H2O2,
muerte celular hipersensitiva y deposición de callosa en respuesta a un patógeno (Zhang et al., 2009).
Ácido hexanoico (Hx): también llamado ácido caproico, es un ácido carboxílico derivado del hexano con seis carbonos. Es un aceite incoloro, viscoso. Forman sales llamadas hexanoatos o caproatos. Es un ácido graso encontrado naturalmente en las grasas y aceites animales, y es uno de los compuestos químicos que le da a la semilla del ginkgo el característico brillo y mal olor al descomponerse. Está reportado en la señalización del JA, además presenta propiedades antimicrobiales (Vicedo et al., 2009).
Silicato de sodio (Si): (nombre común del compuesto metasilicato de sodio), también conocido como vidrio soluble, es una sustancia inorgánica, se encuentra en soluciones acuosas y también en forma sólida en muchos compuestos, entre ellos el cemento, impermeabilizadores, refractores, y procesos textiles. En la resistencia vegetal está asociado con la acumulación de compuestos antimicrobiales como fitoalexinas pero aún no se revelan los mecanismos (Fauteux et al., 2005). Bisulfito de sodio Menadione (MSB): es un derivado de la vitamina K3, soluble en agua, ha sido demostrado como activador de las defensas de las plantas, además regula algunos genes como glutathione S-transferases, factores de transcripción (incluyendo reguladores de G-box) y citocromo P450s (Borges et al., 2009).
Quitosán (CHT): también llamado chitosán, es un polisacárido lineal compuesto de cadenas distribuidas aleatoriamente de β-(1-4) D-glucosamina (unidades deacetiladas) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilatada). Esta sustancia tiene gran cantidad de aplicaciones comerciales y biomédicas. Su principio activo se ha encontrado en los caparazones de los crustáceos, tales como langostas, cangrejos y gambas, así como en otros organismos con exoesqueleto. Se ha encontrado
que actúa en la activación de MAP-kinasas, deposición de callosa, estallido oxidativo, respuesta hipersensible (HR), síntesis de ácido abscísico y proteínas PR, además esta reportado como PAMPs/MAMPs (receptores celulares de la señal de defensa) (Iriti y Faoro, 2009).
Ácido azelaico (AzA): o ácido nonanodioico es un ácido dicarboxílico saturado de cadena lineal. Se encuentra en la naturaleza en el trigo, el centeno y la cebada. Se lo ha encontrado formando parte de la ruta metabólica del SAR antes de la acumulación de SA (Jung et al., 2009)
Acibenzolar-Smethyl (BTH): thiadiazol-7-carbothioic acid-Smethyl ester, o acibenzolar-S-methyl, es una molécula análoga del SA, activa SAR, pero no requiere la acumulación de SA (Oostendorp et al., 2001; Mandal et al., 2008).
Fosfito de Calcio (CaPhi): El fósforo (P) es un elemento muy reactivo y se combina rápidamente con el oxígeno (O) e hidrógeno (H), cuando se oxida completamente el P se une con cuatro átomos de O para formar fosfato (ácido fosfórico), sin embargo cuando no se oxida completamente un átomo de H ocupa el lugar del O y la molécula resultante se denomina fosfito (ácido fosforoso) (Lovatt y Mikkelsen, 2006), plantas tratadas con fosfito (PO3
3-) muestran alta actividad de phenylalanine ammonia-lyase (PAL) (Saindrenan et al., 1988); vinculada con la activación de SAR.
Fosfito de Potasio (KPhi): Además del efecto del fosfito, la aplicación de ion K+ incrementa los niveles de transcripción de las enzimas de la biosíntesis de JA lipoxigenasa (Armengaud et al., 2004).
Tiamina (Thiam): también conocida como vitamina B1, es una molécula que consta de dos estructuras cíclicas orgánicas interconectadas: un anillo pirimidina con un grupo amino y un anillo tiazol azufrado unido a la pirimidina por un puente metileno. Es soluble en agua e insoluble en alcohol. Se ha detectado en la expresión de genes PR, e inducción de SAR (Ahn et al., 2005). El presente estudio pretende encontrar evidencia de que el empleo de inductores de resistencia es efectivo ante estrés hídrico y contra el ataque de insectos. Para el efecto se utilizaron dos especies vegetales: brócoli (híbrido Legacy) y Arabidopsis thaliana, las mismas que se describen a continuación.
2.6.
Brócoli
El brócoli (Brassica oleracea L.var. italica) es una hortaliza de alto consumo a nivel mundial, además es cultivada en casi todo el mundo; en Ecuador su producción ha mostrado un fuerte dinamismo en los últimos años, constituyéndose como un producto estrella dentro de los no tradicionales de exportación (SICA, 2008; CORPEI, 2009).
El cultivo de brócoli probablemente se desarrolló en la época del imperio Romano, desde formas silvestres y primitivas de Brassica oleracea provenientes de la región mediterránea oriental, es así que actualmente existe una notable diversidad de brócolis, coliflores y vegetales parecidos al brócoli en Italia (Gray, 1982).
2.6.1.Clasificación Taxonómica:
A continuación se presenta la clasificación taxonómica según USDA (2012a):
Reino Plantae – Plantas
Subreino Tracheobionta – Plantas vasculares
Superdivisión Spermatophyta – Plantas con semillas
División Magnoliophyta – Plantas con flores
Clase Magnoliopsida – Dicotiledóneas
Subclase Dilleniidae
Orden Capparales
Familia Brassicaceae – o Cruciferae
Género Brassica L.
Especie Brassica oleracea L.
Variedad Brassica oleracea L. var. italica Plenck
2.6.2.Descripción:
Planta erguida, glabra, con tallo de hasta 80 cm en la etapa vegetativa y hasta 150 cm en la floración. Las hojas tienen 40 - 50 cm, son alternas lobuladas y largamente pecioladas, de limbo color verde oscuro con un nervio central de color blanco, forman una roseta que rodea la inflorescencia. Sistema radicular muy ramificado. Los tallos florales son carnosos y gruesos; emergen de las axilas foliares formando inflorescencias, el primordio floral consiste en yemas normales unidas en racimos no cubiertos con hojas. A diferencia de las coliflores, en el brócoli se forma una cabeza principal y otras laterales de un color verde oscuro, sobre un tallo floral menos corto y en un estado de desarrollo más avanzado. La parte comestible está formada por las yemas florales, el tallo y alguna porción de las hojas. Flores bisexuales regulares, con 6 estambres, ovario súpero. Fruto es una silicua dehiscente con más de 30 semillas. Semillas esféricas. Germinación epigea, hipocótilo presente con 3-5 cm, cotiledones con peciolo de 1- 2 cm de largo (Tjeertes, 2004).
Según Tjeertes (2004) el desarrollo del brócoli se puede considerar en las siguientes fases:
De crecimiento: semillas germinan entre 3-6 días, luego la planta desarrolla solamente hojas, entre 30-40 días la planta tiene 7-9 hojas verdaderas.
De inducción floral: después de haber pasado un número determinado de días con temperaturas bajas la planta inicia la formación de la flor.
De formación de pellas: la planta en la yema terminal desarrolla una pella y, al mismo tiempo, en las yemas axilares de las hojas está ocurriendo la fase de inducción floral con la formación de nuevas pellas, la cosecha está lista 75-150 días después de la siembra, dependiendo del cultivar y el clima.
De floración: los tallos que sustentan las partes de la pella inician un crecimiento en longitud, con apertura de las flores.
-De fructificación: se forman los frutos (silicuas), y en su interior se forman las semillas 45-50 días después de la antesis.
2.6.3.Exigencias ecológicas
El brócoli es una hortaliza de clima fresco o templado, requiere bastante humedad, bajo ciertas condiciones se cultiva en climas cálidos. Las zonas adecuadas para el cultivo de brócoli son aquellas caracterizadas por bosques secos y zonas húmedas montanas bajas con clima templado y frío, lo que convierte a la sierra ecuatoriana en la región productiva por excelencia (SICA, 2008). El cultivo de brócoli se adapta a altitudes que van desde 2200 – 3000 msnm (PROEXANT, 1992). Para un desarrollo normal de la planta, es necesario que las temperaturas durante la fase de crecimiento oscilen entre 20 °C y 24 °C, para poder iniciar la fase de inducción floral se necesita entre 10 °C y 15 °C durante varias horas del día. La calidad de la inflorescencia es mejor cuando madura en temporadas de frío. El rango de temperatura óptimo es de 15 °C a 18 °C (Theodoracopoulos y Lardizábal, 2008).
El brócoli durante su ciclo de cultivo requiere entre 400 – 500 m³/ ha de agua, la fase fenológica de mayor demanda es desde el trasplante hasta los 38 días, y luego desde el inicio del botoneo hasta terminar la cosecha (Toledo, 1995). El brócoli se desarrolla adecuadamente en lugares templados y fríos, cuya humedad relativa óptima sea del 80 % y mínima del 70 % (PROEXANT, 1992).
El brócoli se desarrolla mejor en suelos franco arenosos con buen contenido de materia orgánica con un pH entre 6.5 y 7.0, de textura media; no soporta la salinidad excesiva (Theodoracopoulos y Lardizábal, 2008).
2.6.4.Híbrido Legacy
SICA (2008) indica que los genotipos cultivados de brócoli en el Ecuador son híbridos. En general se clasifican según su ciclo (entre 50 y 150 días) en tempranas, medias y tardías. Las diferencias radican en el color, tamaño de la planta y de la inflorescencia, en el grado de desarrollo de los brotes laterales, en su adaptabilidad a diversos climas y suelos y sus características genéticas. El híbrido Legacy, se caracteriza por tener una pella bien formada que permite cortes de tallo relativamente cortos, con floretes (cabezas) de consistencia firme, de grano pequeño (lo que le hace más compacta), forma adecuada y un color verde grisáceo (Theodoracopoulos y Lardizábal, 2008), las características agronómicas se presentan en el Anexo 1.
2.6.5.Plagas del Brócoli
Según el inventario de plagas, enfermedades y malezas en los principales cultivos del Ecuador del MAG (1986), Anexo 2, y del Manual de Entomología Agrícola del Ecuador (Rogg, 2000), se reportan tanto en brócoli como en otras brasicáceas las siguientes plagas insectiles:
Agrotis deprivata Walker (Lepidóptera: Noctuidae) Agrotis ipsilon (Hufnagel) (Lepidóptera: Noctuidae) Ascia monuste L. (Lepidóptera: Pieridae)
Brevicoryne brassicae (L.) (Hemíptera: Aphididae) Colias lesbia Fabicius (Lepidóptera: Pieridae)
Lepthophobia aripa Boisduval (Lepidóptera: Pieridae) Peridroma saucia Hubner (Lepidóptera: Noctuidae) Pieris rapae L. (Lepidóptera: Pieridae)
Plutella xylostella (L.) (Lepidóptera: Plutellidae) Tatochila autodice Butler (Lepidóptera: Pieridae)
En el presente estudio se utilizó el piérido Ascia monuste L., debido a su relativo fácil manejo y sus altas poblaciones en cultivos de brasicáceas, con el propósito de evidenciar el efecto de los inductores de resistencia en su desarrollo. A continuación se detalla con más profundidad el lepidóptero estudiado.
2.7.
Mariposa blanca de las crucíferas
Ascia monuste
L. (Lepidóptera: Pieridae)
La mariposa blanca de las crucíferas (Ascia monuste L.) es una especie tropical y subtropical con varias subespecies y formas, a continuación se detalla su taxonomía (Hauser et al., 2012):
Reino Animalia
Filo Arthropoda
Clase Insecta
Orden Lepidóptera
Super Familia Papilionoidea Familia Pieridae Género Ascia