EFEITOS DA PRIVAÇÃO E DA RESTRIÇÃO DE
SONO NA INTEGRIDADE DA PELE
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador:
Profa. Dra. Monica Levy Andersen
Co-orientador:
Prof. Dr. Sergio Tufik Profa. Dra. Jane Tomimori
São Paulo 2011
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EFEITOS DA PRIVAÇÃO E DA RESTRIÇÃO DE
SONO NA INTEGRIDADE DA PELE
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Cyro Festa Neto
Profa. Dra. Miriam Oliveira Ribeiro Prof. Dr. Roberto Frussa Filho
SUPLENTE
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PROGRAMA
DE
PÓS-GRADUAÇÃO
EM
PSICOBIOLOGIA
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE PSICOBIOLOGIA
Profa. Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
v
Esta tese foi realizada no Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, com o apoio financeiro da Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) processos #09/04240-0 e #98/14303-3 (CEPID).
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Count your blessings
blessings
blessings instead of yours crosses
blessings
Count your gains
gains
gains
gains instead of your losses
Count your smiles
smiles
smiles
smiles instead of your tears
Count your courage
courage
courage instead of your fears
courage
Count your health
health
health
health instead of your wealth
De
De
De
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A minha mãe Márcia
Márcia
Márcia
Márcia Kahan¸
Kahan¸
Kahan¸ por ser o maior exemplo da minha
Kahan¸
vida, me guiando, apoiando, ensinando, muitas vezes
repreendendo, mas sempre, amando. Amor incondicional
Amor incondicional
Amor incondicional
Amor incondicional.
Ao meu pai, Jacob Kahan
Jacob Kahan
Jacob Kahan
Jacob Kahan, que mesmo longe sempre se fez
presente, preocupando-se e orgulhando-se de cada conquista.
Saudade.
Saudade.
Saudade.
Saudade.
A minha querida irmã Juliana Kahan
Juliana Kahan
Juliana Kahan, companheira da minha
Juliana Kahan
vida, sempre compreensiva e com palavras de força e amor.
Amizade.
Amizade.
Amizade.
Amizade.
Agradecimentos
Agradecimentos
Agradecimentos
Agradecimentos
x conquista.
A minha Orientadora, Monica Levy Andersen, que me guiou e ensinou muitas lições, indispensáveis para a minha formação pessoal e profissional.
Ao meu Co-Orientador Sergio Tufik, simplesmente por ser quem ele é, um exemplo de sabedoria, força e determinação, e principalmente, por acreditar em mim.
A minha Co-Orientadora Jane Tomimori, pela sua inteligência e disponibilidade para me ajudar sempre. Por seus comentários e sugestões de relevância fundamental para o trabalho.
Agradeço imensamente a Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), ao Departamento de Psicobiologia e a Associação de Fundo de Incentivo a Pesquisa (AFIP) pela grande oportunidade, apoio e estrutura cedida para a realização tanto do trabalho, como de minha formação pessoal e profissional. E a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro concedido.
A todos os professores do curso de Pós-Graduação do Departamento de Psicobiologia, por toda a experiência acadêmica transmitida em todos esses anos.
Aos membros do Grupo Expectativa: Camila Hirotsu, Francieli Ruiz, Gabriel Natan, Neuli Tenório e Paula Araujo, por todo o suporte e compreensão sempre.
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Molska, Gustavo Viana, Juliana Carlota Soares, Karin di Monteiro Moreira, Karina Possa Abrahão, Lyvia Freire e Ricardo Mazzeo, por todos os momentos juntos.
Em especial aos amigos Bruno Calegare, Juliana Cini Perry, Marina Marques, Nadine Pinho e Tathiana Alvarenga, por serem muito mais que amigos de Pós-Graduação.
A família que eu escolhi, minhas grandes amigas: Caroline di Grado, Christiane Togni, Mariana Poli Elias, Marcia Moraes, Monica Lilla, Roberta Alegretti e Talita Arantes. Amigas pra uma vida toda, em todos os momentos.
Aos funcionários do Departamento de Psicobiologia: Marilde Aires, Ricardo Marques e Waldemarks Leite, ajuda e cuidado fundamental para a execução do trabalho. Erika Damião, Ivan Xavier, Julio Nascimento, Manoel Novais, Maria Cristina Jorge, Natalia Mattos, Nelson da Silva, Nereide Garcia, Solange da Silva, Sandra e Valeria Acquilino, por desempenharem papel fundamental em distintas etapas deste trabalho.
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Lista de Abreviaturas ... xv
Lista de figuras ... xvi
Resumo ... xvii Abstract ... xix 1. Introdução ... 1 1.1. Pele ... 2 1.1.1. Epiderme ... 3 1.1.2. Derme ... 4
1.1.3. Hipoderme (tecido subcutâneo) ... 5
1.1.4. Colágeno ... 5
1.2. Fatores que influenciam o colágeno e a integridade da pele ... 9
1.2.1. Sistema imunológico ... 10
1.2.2. Estresse e glicocorticóides ... 11
1.3. Privação de sono ... 13
1.4. Interação entre privação de sono, estresse e integridade de pele ... 14
2. Justificativa ... 17 3. Objetivos ... 19 3.1. Objetivo geral ... 20 3.2. Objetivos específicos ... 20 4. Metodologia ... 21 4.1. Animais Hairless ... 22
4.2. Privação de sono paradoxal ... 22
xiii
4.5. Ensaio em gel de célula única (teste do cometa) ... 24
4.6. Análise de dados de genotoxicidade ... 26
4.7. Artigo 3: Sleep loss induces differential response related to genotoxicity in multiple organs of three different mice strains. ... 26
4.7.1. Animais ... 26
4.7.2. Delineamento experimental ... 27
4.7.3. Análise estatística ... 28
4.8. Artigo 4: Is lack of sleep capable of inducing damage in aged skin? (submetido) ... 28
4.8.1. Animais ... 28
4.8.2. Delineamento experimental ... 29
4.8.3. Análise estatística ... 29
5. Resultados ... 30
5.1. Artigo 1: Stress, immunity and skin collagen integrity: evidence from animal models and clinical conditions. ... 31
5.1.1. Resumo ... 31
5.2. Artigo 2: Can poor sleep affect skin integrity? ... 39
5.2.1. Resumo ... 39
5.3. Artigo 3: Sleep loss induces differential response related to genotoxicity in multiple organs of three different mice strains ... 43
5.3.1. Resumo ... 43
5.4. Artigo 4: Is lack of sleep capable of inducing damage in aged skin? (submetido) ... 50
xiv
7. Conclusões ... 76
8. Referências bibliográficas ... 78
9. Anexos ... 94
xv
ACTH Hormônio adrenocorticotrópico
CRF Do inglês corticotrophin-releasing factor
CTRL Grupo controle GC Glicocorticóides HPA Hipotálamo-pituitária-adrenal IgG Imunoglobulina G IL Interleucina MMP-1 Colagenase intersticial MMS Metilmetasulfonato
NF-kB Fator de transcrição nuclear kappa B
NK Células natural killer
PS Privação de sono
PSP Privação de sono paradoxal
ROS Espécies reativas de oxigênio
RS Restrição de sono
xvi
Figura 1: Representação esquemática das camadas da pele. ... 2
Figura 2: Corte histológico transversal de pele humana. Hematoxilina e Eosina; aumento 400X. ... 3
Figura 3: Representação esquemática da derme e seus anexos. ... 4
Figura 4: Representação da organização das fibras colágenas. ... 6
Figura 5: Composição molecular do tropocolágeno. ... 7
Figura 6: Animais Hairless no dia do nascimento (A), 10 dias de vida (B) e na vida adulta (C). ... 22
Figura 7: A: Camundongos Hairless privados de sono paradoxal pelo método modificado da plataforma múltipla. B: Animal do grupo controle em sua gaiola-moradia. ... 23
Figura 8: Delineamento experimental em relação aos protocolos de privação de sono. ... 28
Figura 9: Delineamento experimental em relação aos protocolos de restrição e privação de sono. ... 29
Resumo
Resumo
Resumo
Resumo
xviii
A pele é o maior órgão do corpo humano, sendo composta principalmente por elastina, colágeno e glicosaminoglicanos. Toda a seqüência de eventos responsáveis pela manutenção da integridade da pele pode ser afetada por fatores endógenos e exógenos, como por exemplo, o estresse. Diversos trabalhos na literatura evidenciam que o sono desempenha uma função restauradora no funcionamento do organismo. Alterações nesses mecanismos podem afetar a produção de colágeno. Diversos efeitos da restrição de sono crônica em animais sugerem uma ruptura na função de barreira da pele e mucosas. Sendo assim, a redução do tempo de sono parece afetar de várias maneiras a composição e a integridade de diversos sistemas. Nesse sentido, a presente dissertação realizou um levantamento bibliográfico publicado no Artigo 1: Stress, immunity and skin collagen integrity: evidence from animal models and clinical conditions, em que foram coletadas evidências de que por ação dos glicocorticóides e de alterações no sistema imunológico o colágeno da pele pode ser prejudicado pela privação de sono em sua quantidade e qualidade. Com o objetivo de inserir na comunidade científica a possível relação entre o sono e a integridade de pele, o Artigo 2 (Can poor sleep affect skin integrity?) foi elaborado e publicado em uma revista especializada em hipóteses. Com a finalidade de validar a linhagem escolhida para o presente projeto (hairless) foi realizado um estudo preliminar, em que essa linhagem foi submetida à privação de sono por 72 horas, juntamente com outras duas linhagens muito utilizadas para estudos de privação de sono (C57BL/6J e Swiss) para uma comparação dos efeitos genotóxicos em diversos órgãos e sangue periférico (Artigo 3: Sleep loss induces differential response related to genotoxicity in multiple organs of three different mice strains). Nossos resultados mostram que a linhagem Swiss se mostra mais sensível aos danos ao DNA provocados pela privação de sono, no sangue periférico e no fígado, mostrando assim, que a linhagem Hairless estaria apta a ser submetida à privação de sono. No Artigo 4: Is lack of sleep capable of inducing damage in aged skin? (submetido) foi verificado se as conseqüências da privação de sono sobre a integridade do DNA da pele se somariam aos efeitos deletérios do envelhecimento em camundongos. Fêmeas da linhagem Hairless com 15 meses de idade foram submetidos 72 horas de privação de sono ou 15 dias de restrição de sono. O dano ao DNA da pele foi avaliado pela técnica do ensaio em gel de célula única, mostrando que a perda de sono não se sobrepõe ao dano genético já existente na pele desses animais idosos. Em conjunto, as evidências aqui expostas, indicam uma relação multidirecional entre o sono, sistema imunológico e a integridade da pele, porém, é necessário observar outros parâmetros além da fragmentação do DNA.
Abstrac
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Abstractttt
xx
The skin is the largest organ in the human body, being mainly composed by elastin, collagen and glycosaminoglycans. The sequence of events responsible for maintaining the skin integrity can be affected by endogenous and exogenous factors, such as stress. Several studies in the literature show that sleep plays a key role in restoring the organism functioning. Various effects of lack of sleep in animals suggest a break in the skin barrier function and mucous. Therefore, the reduction of sleep time in many ways seems to affect the composition and integrity of various systems. In this sense, this study conducted a literature review, published in Article 1: Stress, immunity and skin collagen integrity: evidence from animal models and clinical condition. In this article were collected evidences of lack of sleep can change the quality and quantity of collagen in the skin, mediated by the action of glucocorticoids and immune system changes. In order to clarify the scientific community about the possible relationship between sleep and skin integrity, Article 2: Can poor sleep affect skin integrity? was published in Medical Hypotheses. In order to validate the strain used for this dissertation (Hairless mice strain) we conducted a preliminary study, published in Article 3 (Sleep loss induces differential response related to genotoxicity in multiple organs of three different mice strains), in wich the animals was submitted to sleep deprivation protocol with two other strains (C57BL/6J) to a comparison of genotoxic effects in several organs e peripheral blood. Our results show that Swiss strain was more responsive to DNA damage caused by sleep deprivation, in blood and liver. thus, the hairless strain would be able to be subjected to sleep deprivation. In Article 4: Is lack of sleep capable of inducing damage in aged skin? (submitted), we verifyed wheter the consequences of sleep loss in the integrity of skin’s DNA were added to the deleterious effects of aging in mice. Females Hairless mice with 15 months of age were submitted to 72 hours of sleep deprivation or to 15 days of sleep restriction. The DNA damage was evaluated by single cell gel (comet) assay, and shows that lack of sleep do not overwrite the genetics damages already existing in the old skin. Taken together, the evidence presented here indicates a multidirectional relationship between sleep, immune system and skin integrity. However, it is necessary to observe other parameters in addition to DNA fragmentation with single cell gel (comet) assay.
Introdução
Introdução
Introdução
Introdução
2
1.1. Pele
A pele é o maior órgão do corpo humano, atingido até 16% do peso corporal. Apresenta diversas funções, como uma barreira eficiente contra agressores exógenos, de natureza química e biológica; proteção do organismo contra perda de água e atrito; comunicação constante com o ambiente externo graças a suas terminações nervosas; termorregulação do corpo por meio dos vasos sanguíneos, glândulas e tecido adiposo, além da excreção de diversas substâncias. Uma das propriedades mais importantes da pele é sua variedade no mesmo individuo. Cada parte da pele é unicamente construída e todas as suas propriedades são adequadas para sua localização (para revisão ver Sousa e Vargas, 2004).
A pele é composta por uma porção epitelial (epiderme) e uma porção conjuntiva (derme). Abaixo da epiderme, está a hipoderme, que, embora tenha a mesma origem embrionária que esta, não faz parte da pele, servindo apenas de suporte e união com os órgãos, porém é didaticamente incorporada ao tecido tegumentar, conforme ilustrado na Figura 1 (para revisão ver Sousa e Vargas, 2004).
3
1.1.1. Epiderme
A epiderme é a camada mais externa e com maior contato com o meio exterior. É constituída por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado e sua espessura e estruturas variam de acordo com sua localização. Está organizada em camadas e à medida que as mais superficiais são eliminadas por desgaste, as mais profundas são restauradas por divisão celular. Em regiões onde a pele é mais grossa, com a sola dos pés, a epiderme pode chegar a ter até 5 camadas: germinativa, espinhosa, granulosa, lúcida e córnea (Figura 2).
Figura 2: Corte histológico transversal de pele humana. Hematoxilina e Eosina; aumento 400X.
A camada córnea é a mais superficial, constituída por células escamosas cheias de queratina, proporcionando assim, proteção contra traumas físicos e químicos. As várias camadas de queratinócitos unidos uns aos outros, fornecem a barreira contra a invasão de microorganismos. Além disso, é na epiderme que está presente a melanina, que protege os tecidos subjacentes da radiação ultravioleta (ver Junqueira e Carneiro, 2009).
4
1.1.2. Derme
A derme é uma camada espessa de tecido conjuntivo. Sua espessura é variável e sua superfície externa bastante irregular. Nesta camada estão presentes os anexos da pele, como pêlos, unhas e glândulas, além de muitos vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e receptores. Ela é formada principalmente por fibras elásticas, colágenas e glicosaminoglicanos, que conferem elasticidade e flexibilidade a pele (Figura 3). A porção papilar da derme contém um número maior de fibroblastos e as fibras de colágeno são na maioria do tipo III, mais finas e não se agrupam em feixes como na derme reticular, que tem uma maioria de colágeno tipo I, e os feixes de colágeno correm em todos os sentidos. Esses feixes de colágeno tipo I são permeados por colágeno do tipo III.
5 As fibras elásticas na derme são muito finas, e sua função é auxiliar no regresso das fibras colágenas quando há deformidades, retornando-as à sua forma original após a distensão. Esta complexa composição móvel requer um lubrificante, papel desempenhado pelo ácido hialurônico (ver Junqueira e Carneiro, 2009).
1.1.3. Hipoderme (tecido subcutâneo)
É composta por tecido conjuntivo frouxo, unindo de maneira pouco firme a derme aos órgãos subadjacentes. A hipoderme é a camada responsável pelo deslizamento da pele sobre as estruturas na qual ela se apóia. Dependendo da região e do grau de nutrição do organismo, o tamanho dessa camada pode variar. O tecido adiposo é um bom isolante térmico, essa camada proporciona proteção conta o frio, além de oferecer proteção mecânica (ver Junqueira e Carneiro, 2009).
1.1.4. Colágeno
O colágeno está presente em todos os vertebrados e invertebrados já estudados, desde a superfície de um pepino do mar (Cucumaria frondosa), nos ossos de um extinto réptil e na pele e ossos dos seres humanos (Solomon e Cheah, 1981), mostrando que a molécula de colágeno possui um papel fundamental na estrutura e integridade dos organismos. Responsável por dar força, suporte e integridade a vários tecidos e órgãos, é o maior componente estrutural da derme, tendo papel importante na proteção de agentes externos, como radiação ultravioleta e invasões bacterianas (Boelsma et al., 2001). Estudos sobre a estrutura molecular, biossíntese, agregação e quantidade do
6 colágeno são muito importantes para esclarecer desde o desenvolvimento embrionário até alguns processos patológico ligados com doenças humanas, cicatrização e regeneração de tecidos (Bateman et al., 1996; Von der Mark, 1999).
As fibras de colágeno da pele são estruturas extremamente longas quando comparadas com seu diâmetro. Em seu estado relaxado se apresentam torcidas, randomicamente entrelaçadas umas com as outras, porém, quando há um estiramento na pele, elas se alinham paralelamente, tornando-se mais resistentes. A rede formada por essas fibras é quem proporciona uma livre mobilidade da pele para a grande gama de movimentos corporais (Gibson, 1977).
As fibras colágenas são constituídas por diversas fibrilas, que são por sua vez compostas por inúmeras moléculas de colágeno (tropocolágeno) (Figura 4).
7 O tropocolágeno é alongado, composto por 3 cadeias polipeptídicas (cadeias alfa), com cerca de 3.000Å de comprimento e 15Å de diâmetro. Sua principal composição é de aminoácidos, como a glicina (33,5% do total), prolina (12%) e hidroxiprolina (10%) (ver Junqueira e Carneiro, 2009) (Figura 5). As fibrilas, por sua vez, não possuem resistência tênsil até que as moléculas estejam ligadas umas às outras por ligações covalentes específicas (ligações cruzadas) (Freedberg, 2005). Este processo de agregação, quando ocorre in
vitro é chamado de fibrilogênese e é dependente de temperatura, pH e força
iônica do meio (Nimni, 1988).
Figura 5: Composição molecular do tropocolágeno.
Há diversos tipos de cadeias alfa, cada uma codificada por um gene, o que dá origem a diversos tipos de colágeno. A estriação das fibrilas colágenas é conseqüência do arranjo das moléculas de tropocolágeno (Jimenez et al., 1979; Junqueira e Carneiro, 2009). Sua síntese pode ocorrer nos fibroblastos, odontoblastos, osteoblastos, células reticulares, células cartilaginosas e células
8 epiteliais, entre outras (Majno et al., 1971; Bensusan et al., 1978; Bentley, 1979; Simpson e DeLuca, 1980; Madden, 1991).
São conhecidos mais de 28 tipos de colágeno, que exercem as mais diversas funções no organismo, dentre estes, os mais abundantes na pele são:
• Tipo I constitui 90% do total existente no organismo. É muito resistente e se apresenta em fibras e feixes que formam uma rede entrelaçada. Encontra-se principalmente nos tendões, ligamentos, cápsulas dos órgãos, tecido conjuntivo frouxo, osso, dentina e na derme (Hoffmann et al., 1976);
• Tipo III normalmente é associado ao tipo I, formando as fibras reticulares. É encontrado freqüentemente na pele e nos pulmões (Kleinman e McGoodwin, 1976).
Já o colágeno dos tipos II, IV, V, VI e VII são encontrados freqüentemente nas cartilagens, lâmina basal, fibrilas e na junção da epiderme com a derme, respectivamente (Kleinman e McGoodwin, 1976; Minor, 1980; Hering et al., 1983; Kallioinen et al., 1984; Squier e Bausch, 1984; Smith et al., 1988; True e Rosai, 1990; Saika et al., 1995; Junqueira e Carneiro, 2009). Em 1988, Merkel e colaboradores mostraram que no embrião de ratos há um predomínio de colágeno tipo III. No entanto, no animal adulto há uma maior quantidade de fibras de colágeno tipo I, que atinge 80%, enquanto o colágeno tipo III está presente em torno de 20%.
A síntese de colágeno se inicia no retículo endoplasmático, onde polirribossomas sintetizam cadeias polipeptídicas (cadeias alfa) que crescem no interior do retículo. À medida que as cadeias se formam, ocorre a
9 hidroxilação da prolina e da lisina que são incorporadas às cadeias alfa (Bensusan et al., 1978; Gay et al., 1978; Minor, 1980; Benson e LuValle, 1981; Berman e Duncan, 1989).
1.2. Fatores que influenciam o colágeno e a integridade da
pele
As metaloproteinases (colagenases, gelatinases e estromelisina) são as únicas enzimas capazes de degradar as moléculas de colágeno, pois este é uma molécula estável. A colagenase intersticial (MMP-1), produzida pelos fibroblastos do interstício e células inflamatórias (macrófagos e leucócitos), é capaz de degradar o colágeno tipo I e tipo III. A MMP-1 quebra cada molécula da tripla hélice, desnaturando a molécula de colágeno (Gross e Lapiere, 1962). Após essa clivagem proteolítica inicial, o colágeno pode ser degradado por outras enzimas proteolíticas (McCroskery et al., 1975; Horwitz et al., 1977). Em geral, esse processo é semelhante em todos os tipos de colagenases, a diferença está na susceptibilidade dos diferentes tipos de colágeno às diversas colagenases.
Mudanças na síntese e degradação do colágeno podem ser influenciadas por vários fatores e levar a diversas doenças, como a síndrome de Cushing (Crapo, 1979). Nesse contexto, a quantidade e a qualidade do colágeno na pele são afetadas tanto por fatores exógenos quanto endógenos, incluindo doenças, hormônios, estresse, envelhecimento e tratamento com glicocorticóides (GC) tópicos ou sistêmicos (Cohen et al., 1979; Minor, 1980; Oikarinen et al., 1992; Autio et al., 1994a). Esses fatores podem interferir nas fibras de colágeno. Um exemplo é a vitamina A, que modula a atividade da
10 MMP-1, influenciando na cicatrização (Levenson et al., 1984). Deficiência no nível de ácido ascórbico resulta em um déficit do sistema imunológico, hemorragias gengivais, sangramentos freqüentes, além retardar a cicatrização e a calcificação de fraturas (Fauci et al., 1998; Gross, 2000; Porto da Rocha et al., 2002), o que é justificado pelo fato de que o ácido ascórbico ser essencial para a hidroxilação da prolina e da lisina durante a formação das moléculas de colágeno (Gross, 2000).
Outro fator que interfere na formação do colágeno é a idade. A proporção relativa dos tipos de colágeno presente na pele (I e III) também muda com a idade. A pele jovem é composta por aproximadamente 80% de colágeno tipo I e 15% de colágeno tipo III. Na pele envelhecida, essa proporção muda. As fibras de colágeno se tornam mais finas e há uma perda significativa de colágeno tipo I, alterando essa proporção (Oikarinen, 1990). Além disso, fibroblastos envelhecidos sintetizam menos colágeno, tanto in vivo como in
vitro, quando comparados com fibroblastos jovens (Varani et al., 2006),
produzindo também mais MMP-1 (Fisher et al., 2009). Após os 50 anos, a perda anual de colágeno chega a aproximadamente 1% (para revisão ver Uitto, 2008). Esse fato é devido há uma supressão na produção de colágeno e uma maior expressão de metaloproteinases (Shelton et al., 1999).
1.2.1. Sistema imunológico
Na literatura já é bem descrito que a resposta imunológica pode ser modulada pelo estresse. O estresse induz mudanças no sistema imunológico principalmente através da desregulação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) que, em situações de estresse, aumenta a secreção de cortisol em
11 humanos, e de corticosterona em roedores, levando a um estado de imunossupressão (Dhabhar et al., 2000). O estresse agudo pode desencadear uma resposta positiva para o funcionamento do sistema imunológico, aumentando o trafico de leucócitos, fazendo-os migrar do sangue para outros órgãos, como os linfonodos e a pele, melhorando a resposta imunológica (Dhabhar, 2003). Porém, quando o estresse se torna crônico esta resposta torna-se prejudicada (Godbout e Glaser, 2006).
Matsushima e colaboradores (1985) mostraram que a liberação de uma citocina específica, a interleucina 1 (IL-1), aumenta a produção de colágeno tipo IV pelas células epiteliais de camundongos. A IL-1 também estimula a produção de fibroblastos, aumentando assim a produção de MMP-1, alterando a produção de colágeno I e III. Um aumento da IL-1β pode causar uma rápida redistribuição da rede de fibras colágenas, atuando como um possível modulador da adesão dos fibroblastos. Ainda, outro componente do sistema imunológico, o interferon (β e γ) pode inibir a produção de colágeno, mas não inibe a proliferação dos fibroblastos (Qwarnstrom et al., 1991). A IL-1 e o fator de necrose tumoral α (TNF-α) são capazes de estimular a expressão do gene da colagenase (Burrage et al., 2006). Também é sabido que a expressão desses mediadores imunológicos também é afetada pelo estresse (Heijnen et al., 1991).
1.2.2. Estresse e glicocorticóides
Há diversas evidências da relação entre o estresse e alterações na pele. Em resposta ao estresse crônico há uma desregulação do ritmo circadiano de cortisol/corticosterona (Dhabhar e McEwen, 1997; Sephton et al., 2000). Em
12 resposta ao estresse, o fator liberador de corticotrofinas (CRF, do inglês
corticotrophin-releasing factor) inicia uma cascata de eventos que culminam na
liberação de GC pelo córtex da adrenal. O eixo HPA é sensível a esses níveis de GC, apresentando um feedback negativo, inibindo assim futuras respostas a estresse. Assim, em condições crônicas de estresse o eixo HPA apresenta uma resposta inadequada ao estresse. Estes níveis elevados de GC têm um grande poder imunomodulador mediado por receptores citosólicos (Stahn e Buttgereit, 2008). Diversos estudos têm relacionado à liberação de hormônios do estresse a mudanças do colágeno da pele (Autio et al., 1994a; Oikarinen et al., 1998; Josse et al., 2009).
O excesso de GC causa diversos efeitos negativos, inclusive na pele. O aumento de GC gerado pelo estresse pode levar a uma diminuição na espessura da pele (Josse et al., 2009), podendo também levar ao envelhecimento precoce (Oikarinen e Autio, 1991; Boscaro et al., 2001). Como maior componente da pele, o colágeno também é afetado pelos GC. Esses efeitos deletérios são primariamente mediatos por uma função inadequada dos fibroblastos e pelo estado de imunossupressão. Estudos in vitro mostraram que os GC modificam diversos parâmetros da homeostase, causando mudanças na matriz extracelular e no próprio colágeno (Autio et al., 1994a; Oikarinen et al., 1998). Durante tratamento sistêmico com GC as concentrações dos peptídeos precursores do colágeno diminuem consideravelmente, resultando numa diminuição da espessura da pele (Autio et al., 1994b) Esse efeito é similar ao observado durante o tratamento tópico com GC, quando as concentrações de colágeno tipo I e III diminuem até 80% (Oikarinen et al., 1998).
13
1.3. Privação de sono
Os hábitos da sociedade moderna têm exercido impactos negativos na qualidade de vida do homem. As longas jornadas de trabalho e o aumento das atividades cotidianas são apenas alguns dos motivos que fazem com que as horas de sono cada vez mais sejam reduzidas. O estresse é um fator inerente à falta de sono e sabe-se que situações estressantes podem desencadear alterações em diversos sistemas, decorrentes principalmente da ativação do eixo HPA (Heijnen et al., 1991).
Na literatura encontra-se documentada uma ampla variedade de efeitos negativos da falta de sono por diferentes períodos sobre o sistema imunológico, desempenho psicomotor e cognitivo, variações de humor, alterações metabólicas, comportamentais e cerebrais (Adrien, 2002; Alvarenga et al., 2008; Andersen et al., 2009; Ruiz et al., 2007, 2011; Zager et al., 2011), Em animais, a privação de sono paradoxal (PSP) é muito utilizada para se investigar estes efeitos. Neste procedimento, os animais são colocados em tanques contendo água e plataformas circulares. Uma vez que os animais entrem em sono paradoxal, a presença da atonia muscular característica dessa fase, faz com que os animais encostem na água e conseqüentemente, acordem. Os efeitos dessa privação seletiva sugerem uma supressão do sistema imunológico (Everson, 2005; Ruiz et al., 2007; Zager et al., 2007), degradação da barreira epidérmica e das mucosas (Kushida et al., 1989), porém, não é possível determinar se essas alterações fisiológicas são conseqüências da perda de sono em si ou do estresse provocado pelo método utilizado (Vogel, 1975; Velazquez-Moctezuma et al., 1984; Tufik et al., 1995),
14 uma vez que há alterações nas funções do eixo HPA, aumentando a produção de corticosterona e hormônio adrenocorticotrópico (ACTH) (Andersen et al., 2003, 2004, 2005).
Em 2004, Velazquez-Montezuma e colaboradores compararam os efeitos do estresse de imobilização com a PSP por 24 e 240 horas. Os resultados demonstram que, apesar de possuir fatores estressantes intrínsecos, a ausência do sono desencadeia uma reação imunológica particular, aumentando significativamente o número de células natural killer (NK), sendo que o estresse de imobilização causou apenas um dano mínimo na produção de células T e B, efeito rapidamente reversível. Um estudo mais recente realizado pelo nosso grupo mostrou que a restrição de sono (RS) em ratos por 21 dias é mais prejudicial que a PSP por 96 horas, uma vez que há uma diminuição significativa do número total de linfócitos e leucócitos e aumento da quantidade de imunoglobulina G (IgG) (Zager et al., 2007), indicando que a perda crônica de sono é mais prejudicial ao sistema imunológico do que a PSP por 96 horas, causando um dano maior ao organismo.
1.4. Interação entre privação de sono, estresse e integridade
de pele
Há evidências que a falta de sono possa prejudicar a barreira epidérmica. Estudos investigando a relação entre o estresse e o sistema imunológico mostraram que o estresse psicológico aumentou diversas dermatoses cutâneas associadas com uma função anormal da barreira epidérmica, como a psoríase e dermatites (Rostenberg, 1960; Ghadially et al., 1996; Gupta e Gupta, 1996; Tausk e Nousari, 2001; Proksch et al., 2003; Sugarman et al., 2003). Estudos
15 em seres humanos vêm demonstrando que diferentes tipos de estresse prejudicam a função de barreira epidérmica (Altemus et al., 2001; Garg et al., 2001). Em 2000, Denda e colaboradores demonstraram que esse prejuízo era devido ao aumento de GC. Essa produção aumentada de GC inibe a síntese de lipídeos, resultando assim em uma produção e secreção menor dos corpos lamelares, impedindo a produção da membrana lamelar no estrato córneo da epiderme, prejudicando assim sua integridade (Kao et al., 2003).
Em modelos animais, ratos submetidos a prolongados períodos de privação de sono (PS) desenvolveram espontaneamente lesões ulcerativas nas patas e cauda, além de apresentarem uma maior suscetibilidade à invasão bacteriana (Kushida et al., 1989; Everson e Toth, 2000). Animais submetidos a PS (total ou de sono paradoxal/REM) pelo método do disco apresentaram lesões ulcerativas e hiperqueratóticas nas patas e na cauda. Kushida e colaboradores (1989) submeteram ratos a esse protocolo de PS por um período prolongado. Os animais apresentaram espontaneamente lesões ulcerativas nas patas e cauda, essas lesões não podem ser explicadas pelo contato com a água, infecções ou necrose. No mesmo sentido, Everson e Toth (2000) submeteram os animais a PS utilizando esse mesmo protocolo e observaram essas mesmas lesões, além de uma maior invasão bacteriana nos linfonodos periféricos, resultado da imunossupressão. Os autores acreditam que esses achados sejam devidos a uma maior invasão bacteriana, resultante da quebra da barreira epidérmica.
Há outros dados que corroboram com a hipótese de que o estresse, em suas diferentes formas, possa interferir com a integridade da pele. Altemus e colaboradores (2001) compararam os efeitos de 3 tipos de estresse em vários
16 aspectos da fisiologia da pele e alguns parâmetros imunológicos em mulheres jovens e sadias. Os autores compararam os efeitos do estresse de entrevista (método descrito por Kirschbaum (1993)), PS total por 42 horas e 3 sessões diárias de exercício. O estresse causado pela entrevista diminuiu significativamente a recuperação da pele após o teste do tape stripping, aumentou a perda de água transepidermal e aumentou significativamente os níveis de cortisol, norepinefrina, TNF-α, IL-1β, IL-10 e o número de células NK. Já a PS reduziu significativamente a recuperação da pele, mas não causou nenhum efeito marcante na perda de água transepidermal. Assim como no estresse de entrevista, a PS foi capaz de aumentar os níveis de TNFα, IL-1β, porém a IL-10 não foi alterada. O número de células NK também foi alterado. Por fim, depois das 3 sessões de exercício físico, nenhuma alteração significativa foi encontrada na fisiologia da pele, apesar de haver um aumento das células NK e uma diminuição das células T (Altemus et al., 2001).
Apesar das diversas conseqüências comportamentais e hormonais da PSP serem bem estabelecidas, a influência deste déficit de sono sobre a integridade da pele permanece como uma área desconhecida. Nesse sentido, torna-se relevante o estudo dos efeitos da falta de sono nos parâmetros de quantidade e qualidade do colágeno da pele.
Justificativa
Justificativa
Justificativa
Justificativa
18 A falta de sono é uma das várias conseqüências da vida moderna, gerando um estresse significante para o organismo. Existem estudos mostrando que o estresse retarda a cicatrização, promove a invasão bacteriana, prejudica a qualidade e a quantidade de colágeno na pele, além de desencadear ou exacerbar doenças de pele como psoríase e dermatites. Diante dessas evidências, nossa hipótese é que a perda de sono possa alterar a estrutura da pele. Sendo assim, será de grande interesse verificar os efeitos da restrição de sono aguda e crônica na integridade da pele.
Objetivo
Objetivo
Objetivo
Objetivossss
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3.1. Objetivo geral
O presente estudo avaliou as conseqüências do modelo de PS aguda e crônica na integridade da pele de camundongos.
3.2. Objetivos específicos
• Realizar um levantamento bibliográfico abordando os processos que modulam as alterações do colágeno e dos efeitos do estresse no colágeno da pele (Artigo 1): “Stress, immunity and skin collagen integrity:
Evidence from animal models and clinical conditions”;
• Introduzir na comunidade cientifica a possível relação entre o sono e a integridade de pele (Artigo 2): “Can poor sleep affect skin integrity”; • Avaliar se a linhagem Hairless estaria apta a ser submetida à privação
de sono paradoxal pelo método modificado das plataformas múltiplas (Artigo 3): “Sleep loss induces differential response related to
genotoxicity in multiple organs of three different mice strains”;
• Avaliar os danos da privação e da restrição de sono ao DNA da pele de animais idosos (Artigo 4): “Is lack of sleep capable of inducing damage in
Metodologia
Metodologia
Metodologia
Metodologia
22
4.1. Animais Hairless
A escolha da linhagem Hairless (SKH1-hr) se deve ao fato desses animais apresentarem um gene recessivo autossômico no cromossomo 14, responsável pela ausência de pêlos. A presença de pêlos dificulta as análises histológicas da pele destes animais, pois somente o fato de realizar qualquer tipo de tricotomia já pode desencadear uma reação imunológica que interferiria nos resultados. Os camundongos Hairless desenvolvem pelagem normal, mas o pêlo começa a cair aos 10 dias de idade, podendo voltar a crescer em pequenos tufos que caem ao atingir a superfície da pele. Logo, os animais permanecem sem pêlo por toda a vida (Green, 1966), conforme a Figura 6 mostra. Ainda, esses animais Hairless não apresentam deficiência imunológica como a linhagem HFH11NU (nude).
Figura 6: Animais Hairless no dia do nascimento (A), 10 dias de vida (B) e na vida adulta (C).
4.2. Privação de sono paradoxal
Os animais foram submetidos à PSP pelo método da plataforma múltipla modificada durante 72 horas ou mantidos em suas gaiolas de moradia. Este método de PS consiste em colocar aproximadamente 5 animais em um caixa de policarbonato (38x31x17 cm) contendo 13 plataformas circulares de 3,5 cm de diâmetro, com o nível da água 1 cm abaixo da sua superfície. O número de
23 plataformas foi maior que o de animais para permitir que eles se movimentem de uma para outra, minimizando a imobilização observada no método de plataforma única. A atonia muscular presente no sono paradoxal faz com que o animal acorde ao encostar o focinho ou, ainda, o corpo inteiro na água (Figura 7).
Um estudo realizado recentemente em nosso laboratório demonstrou que durante o período de PSP de 72 horas, o método de plataforma múltipla foi capaz de suprimir o sono paradoxal nos camundongos (Zager et al., 2009). Portanto, optamos por denominar a técnica de “privação de sono paradoxal”. Durante todo o período de PSP, a sala foi mantida em condições de temperatura constante (22 ± 1°C) e sob um ciclo cla ro-escuro de 12 horas, iniciando-se a fase clara às 7 horas da manhã. A água da caixa foi trocada diariamente.
Figura 7: A: Camundongos Hairless privados de sono paradoxal pelo método modificado da
plataforma múltipla. B: Animal do grupo controle em sua gaiola-moradia.
4.3. Restrição de sono
Os animais foram submetidos à RS por 15 dias pelo método modificado da plataforma múltipla, como descrito no item 4.2. Diariamente, às 10:00 horas, os animais (n=5) foram alojados em gaiolas de polipropileno (38x31x17 cm),
24 onde permaneceram até às 13:00 horas, permitindo assim 3 horas de sono diariamente. Após esse período, os animais foram novamente submetidos ao protocolo de privação de sono até as 10:00 do dia seguinte.
4.4. Coleta das amostras
Após o período experimental os animais foram eutanasiados pelo método de decapitação em uma sala adjacente ao laboratório de sono. Ressaltamos que esse procedimento requer muita experiência e destreza para imobilizar o animal corretamente. O sangue foi coletado em tubos estéreis contendo EDTA e posteriormente congelado a -80ºC, assim como fragmentos centrais do coração, fígado, rim. Também foram retirados 4 fragmentos de pele do dorso do animal com o auxílio de um punch de biópsia cutânea (6 mm de diâmetro, Richter, São Paulo) para padronização do tamanho dos fragmentos extraídos. Três dos fragmentos foram congelados a -80ºC para posteriores dosagens. Outro fragmento foi retirado e imerso em solução de formol tamponado para fixação do tecido.
4.5. Ensaio em gel de célula única (teste do cometa)
Com a finalidade de avaliar os danos genéticos induzidos pela privação de sono utilizamos o ensaio em gel de célula única (teste do cometa). Os fragmentos de fígado, rim, coração e pele foram descongelados em banho-maria e macerados em 0,9% NaCl. O sobrenadante foi removido e as suspensões celulares foram utilizadas para o ensaio em gel de célula única (teste do cometa).
25 O protocolo usado para as células do sangue periférico, fígado, coração e rim seguiram guias pré-definidas por Sasaki e colaboradores (2002) com algumas modificações. Um volume de 5µl de sangue periférico foi adicionado a 120µl de agarose com baixo ponto de fusão (0,5%) a 37ºC, colocado em uma lâmina pré-gelatinizada (1,5% de agarose convencional), e coberta com uma lamínula. Similarmente, o sobrenadante das amostras (suspensão celular, 10µl) do fígado, coração, rim e pele foi adicionado a 120µl de agarose com baixo ponto de fusão (0,5%) a 37ºC, colocados em uma lâmina pré-gelatinizada (1,5% de agarose convencional), e coberta com uma lamínula. Após a rápida solidificação da agarose em um refrigerador, a lamínula é removida e as lâminas imersas em uma solução de lise (2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris-HCl solução, pH 10, 1% sarcosinato de sódio com 1% Triton X-100 e 10% DMSO), por aproximadamente 1 hora. Antes da eletroforese, as lâminas são deixadas em uma solução alcalina (pH>13) por 20 minutos e depois sofrem eletroforese por mais 20 minutos, a 0,7V/cm, 300mA. Após eletroforese, as lâminas são neutralizadas em 0.4M Tris-HCl (pH 7,5), fixadas em etanol absoluto e armazenadas até análise em um microscópio de fluorescência a 400X de aumento.
Foi efetuado um controle positivo independente usando células do sangue periférico, fígado, rim e coração que foram tratados in vitro com 10µg/mL de metilmetasulfonato (MMS) por 30 minutos a 37°C para garantir replicabilidade e sensibilidade do ensaio.
26
4.6. Análise de dados de genotoxicidade
Um total de 50 cometas aleatoriamente selecionados por animal (25 células de cada lâmina) (Hartmann et al., 2003) foram examinadas cegamente por um observador experiente a um aumento de 400X usando um microscópio de fluorescência (Olympus) conectado através de uma câmera em preto e branco para um sistema de análise de imagem (Comet Assay II, Perceptive Instruments, Suffolk, Haverhill, RU) calibrado previamente segundo as instruções do fabricante. O sistema de análise da imagem computadorizada adquire imagens, calcula a intensidade integrada dos perfis de cada célula, estima os componentes celulares da célula cometa, e então avalia a faixa dos parâmetros derivados. Células que não sofreram danos têm o núcleo intacto sem a cauda, e células lesionadas apresentam o aspecto de um cometa. Para medir a danificação do DNA, 2 parâmetros de sistemas de análise de imagens foram considerados: intensidade da cauda (% migrada de DNA) e o momento da cauda (o produto do comprimento da cauda e a fração de DNA na cauda do cometa) (Hartmann et al., 2003).
4.7. Artigo 3: Sleep loss induces differential response related
to genotoxicity in multiple organs of three different mice strains.
4.7.1. Animais
Foram utilizados 10 camundongos de 3 linhagens distintas (Hairless, Swiss e C57BL/6J) machos e adultos (8 a 10 semanas de vida), provenientes do Biotério do Departamento de Psicobiologia da Universidade Federal de São Paulo. Os animais foram mantidos em gaiolas de policarbonato,
27 acondicionadas em estante ventilada que proporciona um baixo índice de infecções, elimina odores provenientes das excreções, e minimiza ruídos que possam estressar os animais. Água e ração foram fornecidos ad libitum. As condições de luz (ciclo claro-escuro: 7 às 19 horas) e temperatura (22 ± 1ºC) foram controladas automaticamente. Os experimentos foram conduzidos segundo princípios éticos (Andersen et al., 2004b) e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo (CEP Nº 1711/08). Ao final dos protocolos propostos os camundongos foram eutanasiados utilizando o método da decapitação em uma sala adjacente por um técnico experiente, com o mínimo de desconforto.
4.7.2. Delineamento experimental
Para este experimento foram considerados 2 grupos (Figura 8). Foram utilizados 5 animais por grupo.
1. Grupo controle (CTRL): Este grupo permaneceu em suas respectivas gaiolas-moradias por todo o período no mesmo ambiente do grupo experimental.
2. Grupo privação de sono paradoxal (PSP): Os animais foram submetidos a PS por 72 horas consecutivas (3 dias).
28 Figura 8: Delineamento experimental em relação aos protocolos de privação de sono.
4.7.3. Análise estatística
Os resultados obtidos no ensaio em gel de célula única (teste do cometa) foram avaliados estatisticamente com o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste post-hoc de Dunn usando o programa Sigma Stat para Windows (Jadel Scientific, EUA). O nível de significância foi estabelecido a 5%.
4.8. Artigo 4: Is lack of sleep capable of inducing damage in
aged skin? (submetido)
4.8.1. Animais
Foram utilizados 12 camundongos Hairless fêmeas com 15 semanas de vida, provenientes do Biotério da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto (Universidade de São Paulo). Os animais foram mantidos em gaiolas de policarbonato, acondicionadas em estante ventilada que proporciona um baixo índice de infecções, elimina odores provenientes das excreções, e minimiza ruídos que possam estressar os animais. Água e ração foram fornecidos ad libitum. As condições de luz (ciclo claro-escuro: 7 às 19 horas) e temperatura (22 ± 1ºC) foram controladas automaticamente. Os experimentos foram
29 conduzidos segundo princípios éticos (Andersen et al., 2004b) e aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo (CEP Nº 1711/08). Ao final dos protocolos propostos os camundongos foram eutanasiados utilizando o método da decapitação em uma sala adjacente por um técnico experiente, com o mínimo de desconforto.
4.8.2. Delineamento experimental
Para este experimento foram considerados 3 grupos (Figura 9). Foram utilizados 4 animais por grupo.
Figura 9: Delineamento experimental em relação aos protocolos de restrição e privação de
sono.
4.8.3. Análise estatística
Os resultados obtidos no ensaio em gel de célula única (teste do cometa) foram avaliados estatisticamente com o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste post-hoc de Dunn usando o programa Sigma Stat para Windows (Jadel Scientific, EUA). O nível de significância será estabelecido a 5%.
Resultados
Resultados
Resultados
Resultados
31
5.1. Artigo 1: Stress, immunity and skin collagen integrity:
evidence from animal models and clinical conditions.
Com a finalidade de realizar um levantamento bibliográfico sobre integridade de pele, colágeno e fatores que pudessem interferir nesses dois parâmetros, elaboramos um artigo de revisão, intitulado em português: “Estresse, imunidade e integridade do colágeno da pele: evidências em modelos animais e condições clínicas”.
5.1.1. Resumo
A pele é o maior órgão do corpo humano e tem um papel muito importante na homeostase e proteção contra agentes externos. O colágeno, maior componente da pele, tem um papel fundamental, fornecendo coesão e elasticidade a esse órgão. Diversos fatores, como doenças autoimunes, envelhecimento e estresse podem mudar a qualidade e integridade do colágeno, prejudicando, conseqüentemente suas principais funções. O estresse parece afetar a integridade da pele através da produção de glicocorticóides que alteram a síntese e a degradação do colágeno. Os glicocorticóides também podem prejudicar a qualidade da pele através do sistema imunológico. Esta revisão apresentou brevemente os processos que podem modular as alterações no colágeno, tanto em animais como em humanos, além de descrever as conseqüências do estresse no colágeno da pele.
38
39
Artigo 2: Can poor sleep affect skin integrity?
Com o objetivo de introduzir na comunidade cientifica a possível relação entre o sono e a integridade de pele publicamos este artigo na revista Medical
Hypothesis. Esta é uma revista que publica hipóteses bem fundamentadas,
com lógica claramente indicada e avaliada.
5.2.1. Resumo
A sociedade moderna tem relatado nas últimas décadas um declínio no tempo total de sono. Essa redução pode aumentar a morbidade e a mortalidade de diversas doenças e levar a um estado imunossupressivo. A pele é o maior órgão do corpo humano e o colágeno, como seu maior componente, têm um papel fundamental na estrutura e integridade dos organismos. Toda a seqüência de eventos da formação do colágeno pode ser afetada por fatores endógenos e exógenos. Uma grande variedade de estudos na literatura mostra que o sono tem um papel importante em restaurar o sistema imunológico e que alterações na resposta imunológica pode afetar a produção de colágeno. Estudos detalhando as conseqüências da privação de sono por períodos prolongados sugerem uma quebra na barreira da pele, prejudicando sua função. Assim, nós elaboramos a hipótese que a falta de sono, assim como outros tipos de estresse podem prejudicar a integridade da pele.
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Artigo 3: Sleep loss induces differential response related to
genotoxicity in multiple organs of three different mice strains
Para este projeto optamos por utilizar a linhagem Hairless, que não possui pêlos, mas é imunocompetente. Essa linhagem é muito pouco utilizada no Brasil e nunca foi antes utilizada em experimentos com PS. Com o objetivo de avaliar se essa linhagem seria apta para o procedimento de PS pelo método modificado das plataformas múltiplas, realizamos um experimento comparando os animais Hairless com 2 linhagens muito utilizadas para este procedimento, camundongos Swiss e C57BL/6J. Foram avaliados parâmetros de fragmentação do material genético em diversos órgãos, como fígado, rim e coração, além do sangue periférico.
5.3.1. Resumo
O objetivo do presente artigo foi determinar o dano genético induzido pela privação de sono paradoxal no sangue periférico, coração, rim e fígado, em três diferentes linhagens de camundongos machos. Camundongos Swiss, C57BL/6J e Hairless foram submetidos à privação de sono paradoxal pelo método modificado das plataformas múltiplas por 72 horas e o dano ao DNA foi avaliado pelo método do ensaio em gel de célula única (teste do cometa). Diferenças estatísticamente significativas foram encontradas somente nas células do sangue dos animais Swiss quando comparados com os controles negativos. Em contraste, não houve diferenças significativas nas linhagens C57BL/6J e Hairless. Com relação ao fígado, um elevado dano genotóxico foi encontrado na linhagem Swiss. As linhagens C57BL/6J e Hairless não mostraram nenhum sinal de genotoxicidade nesse órgão. O mesmo efeito
44 também não foi notado nos rins ou coração de todas as linhagens avaliadas. Assim, nossos resultados mostram que a privação de sono exerceu um dano genético na forma de quebra do DNA somente no sangue periférico e no fígado da linhagem Swiss. Sendo assim, devemos considerar o tipo de linhagem usada quando se estuda as atividades nocivas ao material genético induzidas pela privação de sono, e a linhagem Swiss parece ser mais adequada para esse fim.
46
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Artigo 4: Is lack of sleep capable of inducing damage in aged
skin? (submetido)
5.4.1. Resumo
A pele muda naturalmente com a idade, se tornando mais frágil. Diversos estímulos, como o estresse, podem alterar a integridade da pele. No presente estudo nós avaliamos se as conseqüências da privação de sono sobre a integridade do DNA da pele se somariam aos efeitos deletérios do envelhecimento em camundongos. Camundongos fêmeas da linhagem
Hairless com 15 meses de idade foram submetidos a 72 horas de PSP ou 15
dias de RS. Imediatamente após esse período, foram retiradas amostras de pele e o dano ao DNA foi avaliado pela técnica do ensaio em gél de célula única (teste do cometa). A PSP e a RS não exacerbaram os efeitos adversos causados pela idade no dano ao DNA, levando em consideração o momento e a intensidade da cauda da análise do cometa. Tomados em conjunto, esses achados mostram que a perda de sono não se sobrepõe ao dano genético já presente na pele de camundongos Hairless idosos, utilizando a técnica do ensaio em gel de célula única (cometa)
51
Is lack of sleep capable of inducing damage in
aged skin?
Kahan V1, Ribeiro DA2, Tomimori J3, Tufik S1, Andersen ML1
1
Departamento de Psicobiologia, 2Biociências and 3Dermatologia - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) - São Paulo-SP, Brazil
Running title: Sleep deprivation and skin DNA integrity
Corresponding author: Monica Levy Andersen
Rua Napoleão de Barros, 925 Vila Clementino - SP- 04024-002 São Paulo, Brazil
Phone # (55-11) 21490155 Fax # (55-11) 55725092
E-mail address: mandersen@psicobio.epm.br
Abbreviations used: Paradoxical sleep deprivation (PSD); sleep restriction (SR); glucocorticoids (GC); sleep deprivation (SD); reactive oxygen species (ROS).
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Abstract
Skin naturally changes with age becoming more fragile. Various stimuli, such as stress, can alter skin integrity. The aim of this study was to evaluate if the consequences of sleep deprivation on skin’s DNA integrity augment to the deleterious effect of aging in mice. Female hairless mice with 15 months of age were submitted to 72 hours of paradoxical sleep deprivation (PSD) or to 15 days of chronic sleep restriction (SR). Immediately after, punch biopsies of the skin were taken and processed to evaluate DNA damage by single cell gel (comet) assay. PSD or SR did not potentiate the adverse effect caused by aging on genetic damage, depicted by tail movement and tail intensity values from the comet assay. Taken together, the findings are consistent with the notion that sleep loss does not override the genetic damage in elderly hairless mice as detected by single cell gel (comet) assay.
Key-words: Skin, elderly, sleep deprivation, mice, single cell gel (comet) assay,
53
Introduction
Aging of the skin is a complex process and is associated with morphological and chemical changes that can be altered due to genetic, environmental and endocrine factors (Farage et al., 2008), which implies random cell damage as a result of mutations during metabolic processes due to the production of free radicals (Baumann, 2002; Yar e Gilchrest, 2003).
The aged skin is overall thinner, by about 10-50% between the ages of 30 and 80, an effect that is especially marked in women, and it is directly related to decreased sex hormone levels (Baumann, 2002; Lock-Andersen et al., 1997; Vitellaro-Zuccarello et al., 1994). This phenomenon, known as skin atrophy, is noted after the fifth decade of life and shows many histomorphologic changes, including loss of melanocytes and immunocompetent Langerhans cells, epidermal thinning and flattening of the dermal-epidermal junction. There are also dermal changes, such as reduced fibroblast population (Wulf et al., 2004).
Over the past 60 years, there has been an important increase in the lifespan for most populations. This may be attributed to the epidemiological control of infectious diseases and advances in modern medicine. Consequently, skin from older people becomes more susceptible to many diseases. Moreover, in the next 50 years, one-third of women will be in menopause. Thus, anti-aging medicine is of great importance, and further studies are necessary to understand the aging process and how the overall health can be improved. Another important factor is the changing dynamics of society, which generates a high level of stress in the population. It is well documented that the skin aging process can be accelerated by stressful events. In response to stress,
54 corticotrophin-releasing factor, which regulates the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, initiates a cascade of events that culminate in the release of glucocorticoids (GC). This excess of GC has negative effects on all tissues and accelerates skin aging (Boscaro et al., 2001; Roupe, 2001).
One of the most common stressors of modern society is sleep deprivation (SD). Sleep deprivation can exert negative effects in many systems, like decrease in cognitive performance, changes in hormonal levels, mood and behavior and deleterious effects on the immune system (Alvarenga et al., 2008; Andersen et al., 2006, 2005; Benedetti et al., 2008; Ruiz et al., 2010, 2007; Zager et al., 2009, 2007). In animal models, the protocol of paradoxical sleep deprivation (PSD) for 72 hours and sleep restriction (SR) for 15 days have been proposed in order to mimic short-term sleep loss and a gradual long-term loss of sleep, respectively. Indeed, these two protocols are very important to elucidate the potential health risks associated with SD.
In particular, PSD can affect the homeostasis of the skin barrier in humans and animals. For instance, Altemus and colleagues (2001) showed that healthy women submitted to 72 hours of SD had a significant reduction in the recovery of skin barrier function after tape stripping. This effect was not observed when the volunteers’ practiced physical exercises. In animals, Kushida et al. (1989) demonstrated that extended SD (11 to 54 days) resulted in ulcerative and hyperkeratotic lesions on the feet and tails of rats. The authors proposed that these lesions could not be explained by water immersion, infection or necrosis. Moreover, these changes could also be attributed to increased levels of GC that occur after SD in rats (Andersen et al., 2005, 2003).
55 Our group has demonstrated that selective SD promoted genetic damage to the blood, brain and liver in rodents (Andersen et al., 2010, 2009; Kahan et al., 2010). Moreover, when three different mouse strains (Hairless, Swiss and C57BL/6J) were submitted to PSD, we observed DNA damage only in the peripheral blood and liver of Swiss mice, an outbred strain. It is important to note that these animals were young adults. However, the consequences of sleep loss, acute or chronic in elderly and on skin integrity remain unknown in animal models. Thus, the purpose of this study was to verify whether the lack of sleep can induce DNA damage in the skin of female hairless mice at advanced age.
Material and Methods
Animals
Female hairless mice were provided by the animal facility of the Dentistry College of Ribeirão Preto (University of São Paulo) with 12 months. The animals were maintained in ventilated cages (Techniplast, Italy) until complete 15 months, with free access to food and water under a 12:12h light-dark cycle (lights on at 0700 h). This system allowed for a controlled temperature (22±2ºC), provided low rates of infection, eliminated odors from excreta and reduced noise that could stress the animals, thus providing better welfare and living conditions. Mice used in this study were maintained and treated in accordance with the guidelines established by the Ethical and Practical Principles of the Use of Laboratory Animals (Andersen et al., 2004), and the experimental protocol
56 was approved by the Federal University of São Paulo Ethical Committee (CEP 1711/08).
Experimental Design
Elderly female hairless mice were distributed into 3 groups: home-cage control group (CTRL), paradoxically sleep deprived (PSD) for 72 h and chronically sleep restricted (SR) for 15 days. After being housed in the water cages (experimental groups) or home-cages (CTRL), mice were transported to an adjacent room and decapitated at 9:0 AM. The dorsum skin fragments were removed with a 7-mm punch biopsy and were immediately frozen at -80ºC until the analysis.
Paradoxical Sleep Deprivation and Sleep Restriction Protocols
The first experimental group was submitted to PSD for 72 hours using the modified multiple platform method, which consisted of placing 5 mice in a cage (41x34x16 cm) containing 20 circular platforms (3.5 cm in diameter) with water 1 cm below the upper surface. This method is based on the loss of muscle tone presented at each paradoxical sleep episode (Silva et al., 2004; Zager et al., 2009).
The SR consisted of submitting the animals to PSD using the modified platform method for 21 hours consecutively with a sleep opportunity of 3 hours for 15 days (Araujo et al., 2010). Food and water were available.
