GUÍA DE TRABAJOS
PRÁCTICOS
Departamento de Microbiología,
Parasitología e Inmunología
Facultad de Medicina
UBA
2008
Recordar que es condición indispensable concurrir a todos los
trabajos prácticos con guardapolvo, guantes y protección
ocular.
Es deseable que el alumno conozca las Normas de
Bioseguridad con las cuales debe trabajar en los
Laboratorios de Microbiología y Biomedicina. Dicha
información está disponible en una Guía a la que puede
acceder desde la página Web del Departamento de
Microbiología.
TRABAJO PRACTICO Nº 1: Inmunología
Hemoaglutinación
Se fundamenta en la detección de anticuerpos mediante la aglutinación de glóbulos rojos sensibilizados con el antígeno específico (GRS). En la reacción de aglutinación se forma una malla o red entre la inmunoglobulinas y los eritrocitos sensibilizados de tal manera que impide que los GRS sedimenten en un punto.
Para los antígenos de naturaleza proteica se requiere que los GR sean tratados previamente con ácido tánico antes de sensibilizarlos con el antígeno. El ácido tánico expone ciertos grupos químicos en la membrana del GR donde posteriormente se absorberá el antígeno proteico. Los antígenos de naturaleza polisacárida son absorbidos directamente a los GR sin previo tratamiento de los mismos. Es importante destacar que la IgM es mejor aglutinante que la IgG, debido a su polivalencia.
Aglutinación
A) Reacción de Hemaglutinación en microplaca.
Objetivo: Valoración semicuantitativa de anticuerpos séricos anti-Trypanosoma cruzi.
Reactivos y materiales:
– GR de carnero sensibilizados con Ags de T. cruzi. – GR de carnero sin sensibilizar.
_ Sueros problema – Diluyente.
– Controles positivo y negativo. – Microplaca de 96 pocillos.
Protocolo:
Realizar diluciones seriadas al 1/2 MUESTRAS CONTROLES Pocill o 1 Pocillo 2 Pocillo 3 Pocillo 4 Pocillo 5 Pocillo 6 Pocillo 7 Pocillo 8 Pocillo 9 Pocillo 10 Pocillo 11 Pocillo 12 50 µl. 50 µl. Dil 1/4 — — 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. — — — Suero Incognita (dil al ½) Diluyen-te GR sensib. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. 50 µl. — 50 µl. 50 µl. GR sin sensib. — — — — — — — — — 50 µl. — — Control Positivo — — — — — — — — — — 50 µl. — Control Negativo — — — — — — — — — — — 50 µl.1) Se coloca 50 µl del diluyente.
2) Luego se coloca el suero y se procede a las diluciones seriadas. 3) Finalmente se agregan los GR sensibilizados.
Homogeneizar, cubrir las placas e incubar a 37 °C durante 2 horas. A) Determinar el título de la muestra.
Tinción y observación
de Leucocitos
(May Grunwald: eosina/azul de metileno) (Giemsa: eosina/azul de metileno/azur)
Eosinófilos
Citoplasma acidófilo Gránulos acidófilos Núcleo segmentadoNeutrófilos
Citoplasma acidófilo Gránulos neutrófilos Núcleo trilobuladoMonocitos
Citoplasma basófilo o anfófilo Gránulos muy pequeño
Núcleo lobulado
Linfocitos
Citoplásma basófilo Gránulos ausentes o En baja concentración Núcleo redondo compacto
Basófilos
Citoplasma acidófilo o anfófilo Gránulos basófilos
Núcleo lobulado (puede ser bisegmentado)
Casos Clínicos:
A) Un niño de 8 meses es internado en el hospital debido a que sufre infecciones bacterianas recurrentes en piel, tractos y manifiesta, además, severas enfermedades periodontales; además, la madre comenta que hubo un retraso muy importante en la caída del cordón umbilical cuando nació.
1- Se solicita un frotis. ¿que formula leucocitaria se observa en el preparado Nº 1? 2- Se solicita una citometría de flujo a fin de evaluar la expresión de CD11b, y CD18.
R1 Dador Sano Paciente Control de isotipo CD11b CD18 Control de isotipo CD11b CD18 CD11b CD18 Paciente Dador Sano Paciente Dador Sano CI CI
B) Un niño de 12 meses es internado debido a que sufre infecciones bacterianas recurrentes en pulmón, piel, gingivitis; importante inflamación en fosas nasales y lesiones granulomatosas.
1- Se solicita un frotis. ¿qué fórmula leucocitaria se observa en el preparado Nº 2?
Junto con el frotis se solicitaron estudios radiológicos que determinaron formación de abscesos en pulmón, hígado, y granulomas en tractos urogenitales y gastrointestinales. Los microorganismos que produjeron estas infecciones recurrentes fueron principalmente catalasa positivos: S. aurius, B.cepacia, aspergillus sp, nocardia sp., entre otras.
El medico solicita un estudio de producción de intermediarios reactivos del oxígeno (IROs) por citometría de flujo.
2- Interprete los siguientes gráficos de citometría y determine de qué patología se trata. IROs Dador Sano + PMA Paciente + PMA Control
C) Una mujer de 65 años consulta a su médico clínico por decaimiento general. Se solicita un hemograma de sangre periférica encontrándose los siguientes valores: leucocitos: 14 x 109/lt (60% de linfocitos maduros) (valor normal: 4-9 109/lt, 15-30% linfocitos). Se deriva a la paciente a un hematólogo que solicita una evaluación del inmunofenotipo de sangre periférica, encontrándose los siguientes resultados: población linfocitaria: 85% positiva para CD19, CD5, CD23 y cadena liviana kappa, 7% positiva para CD3 y 7% positiva para CD56. 1- Interprete los siguientes gráficos de citometría de flujo
2- ¿Presenta la paciente una patología monoclonal? 3- ¿Qué enfermedad podría padecer esta paciente?
Trabajo Práctico Nº 2
:
BACTERIOLOGIA
I Parte prácticaSe realizarán las siguientes actividades prácticas:
1. Tinción de Gram a partir de una suspensión bacteriana.
2. Siembra en placas de agar de una muestra por el método de las cuatro estrías. 3. Lectura e interpretación de un antibiograma por difusión.
II Parte mostrativa
Observación del desarrollo bacteriano en placas sembradas por el método de las cuatro estrías.
a) En agar Levine se podrán distinguir bacterias capaces de fermentar o no glucosa. b) En agar Chapman se podrán distinguir bacterias capaces de fermentar o no
manitol
Observación al microscopio de muestras clínicas. a) Se observarán micobacterias en esputo.
ACTIVIDAD PRACTICA Nº 1 1. Tinción de Gram.
Se realizará la tinción de Gram tal como se muestra en el esquema.
Materiales: 1 portaobjetos, 1 tubo con suspensión bacteriana, 1 equipo de tinción de Gram, 1 frasco de lugol, microscopio óptico y aceite de inmersión.
IMPORTANTE: Los tiempos de exposición a los reactivos pueden variar de acuerdo al producto comercial utilizado.
La observación se realizará al microscopio, primero a 40X y luego a 100X utilizando aceite de inmersión.
ACTIVIDAD PRACTICA Nº 2 2. Siembra en aislamiento
Se realizará el aislamiento por la técnica de las cuatro estrías tal como se muestra en el esquema a partir de una suspensión bacteriana (muestra).
Materiales: Muestra, placa de agar, ansa, mechero.
El desarrollo bacteriano se observa luego de la incubación por 18 hs a 37ºC.
ACTIVIDAD PRACTICA Nº 3
3. Lectura e interpretación de un antibiograma (Kirby-Bauer)
Materiales: 1 placa de agar Mueller-Hinton sembrada con un bacilo Gram negativo en presencia de multidiscos con antibióticos. Por ejemplo:
IMP 10 µg Imipenem GEN 10 µg Gentamicina CAZ 30 µg Ceftacidima AMS 10/10 µg Ampicilina/Sulbactama CTX 30 µg Cefotaxima TMS 1.25/23.75µg Trimetoprima/Sulfametoxazol
Actividad: Se evaluará el patrón de sensibilidad de la bacteria a los diferentes antibióticos. Para ello se realizará la medición del diámetro del halo de inhibición del crecimiento bacteriano, para cada disco de antibiótico, como muestra la figura.
Luego se interpretarán los resultados utilizando los criterios normatizados, (ver ANEXO).
_____________________________________________________________________ Bibliografía adicional:
En el sitio http://pathmicro.med.sc.edu/book/welcome.htm se pueden consultar textos de Microbiología en inglés y traducidos.
ANEXO
CRITERIOS DE INTERPRETACIÓN BASADOS EN EL MÉTODO DE KIRBY-BAUER DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD PARA MICROORGANISMOS DE FÁCIL CRECIMIENTO
Diámetro de la zona de inhibición en mm
Agente Antimicrobiano Contenido del disco
Resistente < ó = Intermedio Sensible > ó = BETALACTÁMICOS, PENICILINAS Ampicilina Enterobacteriaceae Estafilococos Enterococos Estreptococos β hemolíticos 10 µg 10 µg 10 µg 10 µg 13 28 16 18 14-16 ... ... 19–25 17 29 17 26 Oxacilina Estafilococos coagulasa negativo S.aureus
Neumococos para evaluar sensibilidad a penicilina 1 µg 1 µg 1 µg 17 10 ... ... 11-12 ... 18 13 20
Penicilina G Estafilococos Enterococos Estreptococos β hemolíticos 10 U 10 U 10 U 28 14 19 ... ... 20–27 29 15 28 Piperacilina Pseudomonas aeruginosa Enterobacteriaceae 100 µg 100 µg 17 17 ... 18–20 18 21
COMBINACION CON INHIBIDORES B-LACTAMASA
Amoxicilina / Acido Clavulánico
Estafilococos Enterobacteriaceae 20/10 µg 20/10 µg 19 13 ... 14–17 20 18 Ampicilina / Sulbactama 10/10 µg 11 12-14 15 Piperacilina / Tazobactama Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Esfafilococos meticilina S 100/10 µg 100/10 µg 100/10 µg 17 17 17 18-20 ... ... 21 18 18 CEFALOSPORINAS Cefaclor 30 µg 14 15-17 18 Cefazolina 30 µg 14 15-17 18 Cefepime 30 µg 14 15-17 18 Cefixima 5 µg 15 16-18 19 Cefoperazona 75 µg 15 16-20 21 Cefotaxima 30 µg 14 15-22 23 Cefoxitina 30 µg 14 15-17 18 Ceftacidima 30 µg 14 15-17 18 Ceftixozima 30 µg 14 15-19 20 Ceftriaxona 30 µg 13 14-20 21 Cefuroxima sódica parenteral 30 µg 14 15-17 18 Cefalotina 30 µg 14 15-17 18 CARBAPENEMS
Imipenem 10 µg 13 14-15 16 Meropenem 10 µg 13 14-15 16
MONOBACTAMAS Aztreonam 30 µg 15 16-21 22 GLICOPÉPTIDOS Teicoplanina 30 µg 10 11-13 14 Vancomicina Enterococos Estafilococos 30 µg 30 µg 14 ... 15-16 ... 17 15 AMINOGLUCÓSIDOS Amicacina 30 µg 14 15-16 17 Gentamicina 10 µg 12 13-14 15 Kanamicina 30 µg 13 14-17 18 Netilmicina 30 µg 12 13-14 15 MACRÓLIDOS Azitromicina 15 µg 13 14-17 18 Claritromicina 15 µg 13 14-17 18 Eritromicina 15 µg 13 14-22 23 TETRACICLINAS Minociclina 30 µg 14 15-18 19 Tetraciclina 30 µg 14 15-18 19 QUINOLONAS Ciprofloxacina 5 µg 15 16-20 21 Levofloxacina 5 µg 13 14-16 17 Nalidixico Acido 30 µg 13 14-18 19 Norfloxacina 10 µg 12 13-16 17 Ofloxacina 5 µg 12 13-15 16 Trovafloxacina 10 µg 13 14-16 17 OTROS ANTIMICROBIANOS Cloranfenicol 30 µg 12 13-17 18 Clindamicina 2 µg 14 15-20 21 Fosfomicina Trometamol 200 µg 12 13-15 16 Nitrofurantoína 300 µg 14 15-16 17 Rifampicina 5 µg 16 17-19 20
Cefoperazona/Sulbactama 75/30 µg 15 16-20 21 Colistina 10 µg 8 9-10 11 Fosfomicina 50 µg 12 13-17 18 Fusídico Acido 10 µg 15 16-21 22 Neomicina 30 µg 12 13-16 17 Pipemídico Acido 20 µg 13 14-19 20 Polimixina B 300 U 8 9-11 12
Trabajo Práctico Nº 3: Parasitología
Objetivos:
1) Adquirir destrezas en relación con el manejo de materiales habitualmente empleados en un laboratorio de diagnóstico parasitológico.
2) Aprender a respetar prácticas de higiene y bioseguridad en el laboratorio. 3) Identificar los parásitos que más frecuentemente se diagnostican.
Contenidos: Realización de:
1) Métodos de concentración de materia fecal parasitada por sedimentación y flotación 2) Extendidos de sangre periférica y tinción con May-Grünwald-Giemsa.
Observación microscópica de:
1) Muestras de sangre concentradas mediante microhematocrito.
2) Montajes húmedos preparados a partir del procesamiento de la materia fecal conteniendo quistes de protozoarios y huevos de helmintos (Giardia lamblia, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Ascaris lumbricoides).
3) Preparados de materia fecal parasitada, fijados y coloreados (Entamoeba histolytica).
4) Hemoparásitos (Trypanosoma cruzi y Plasmodium spp) y parásitos titulares (Leishmania spp, Toxoplasma gondii).
Observación macroscópica de: 1) Quistes hidatídicos.
2) Adultos de Ascaris lumbricoides. 3) Adultos de Taenia spp.
4) Adultos de Fasciola hepatica en hígado.
5) Estadios de desarrollo de Triatoma infestans (vector biológico de Trypanosoma cruzi). Desarrollo de los contenidos.
Procesamiento de materia fecal - Métodos de concentración a) Charles Barthelemy
El objetivo general del método es concentrar mediante sedimentación los elementos de interés diagnóstico y eliminar mediante centrifugación y partición de fases, la mayor proporción de materia orgánica constituyente de la materia fecal. El uso de acetato de etilo (menos tóxico y volátil que el éter etílico) permite eliminar grasas (que contribuyen significativamente a la masa de materia fecal) y pigmentos biliares (que oscurecen el preparado) que dificultan la observación.
El uso de formalina (formol 10% en solución fisiológica) es convencional en este tipo de preparaciones. Dado que destruye los trofozoítos, se puede emplear alcohol polivinílico como alternativa.
El Lugol se emplea en tinciones semipermanentes, para resaltar vacuolas ricas en glucógeno, que muchas veces tienen carácter diagnóstico.
Embudos de plástico Pipetas Pasteur de plástico Portaobjetos y cubreobjetos Acetato de Etilo
Materia Fecal fijada con 10% Formol 10% Formol en solución fisiológica Gradillas
Guantes
Solución Lugol (Iodo 1% / Ioduro de Potasio 2% en agua destilada) Procedimiento:
1) Disgregar la materia fecal con varilla de vidrio o madera. 2) Filtrar a través de gasa (3 pliegues de gasa)
3) Centrifugar a 1300 rpm durante 3 minutos
4) Descartar el sobrenadante en frasco con hipoclorito de sodio al 0.5% (1/10 de lavandina comercial)
5) Resuspender con 10 ml de solución salina 6) Agregar 2 ml de acetato de etilo
7) Tapar y agitar por inversión (4-5 veces) 8) Centrifugar a 1300 rpm durante 3 minutos 9) Con una varilla de vidrio separar el tapón graso. 10) Descartar el sobrenadante por inversión
11) Resuspender el sedimento en el escaso líquido remanente
12) Colocar una gota entre porta y cubreobjetos y observar a 100X en el microscopio. Opcionalmente agregar una gota de Lugol
13) Si se observan elementos sospechosos pasar a 400X b) Método de Flotación de Sheather
El objetivo general del método es concentrar elementos de interés en diagnóstico parasitológico, basándose en su menor densidad con respecto al medio (solución de sacarosa). A diferencia del método de Charles-Barthelemy, los elementos parasitarios quedarán suspendidos en la solución, cerca de la interfase aire/líquido.
Materiales:
Solución de Sheather (500 g de sacarosa en 320 ml de agua bidestilada) Centrifuga clínica
Tubos cónicos Varilla de vidrio Gasa
Embudos de plástico Pipetas Pasteur de plástico Portaobjetos y cubreobjetos
Materia Fecal fijada con 10% Formol 10% Formol en solución fisiológica Gradillas
Guantes
Solución Lugol (Iodo 1% / Ioduro de Potasio 2% en agua destilada)
5) Observar al microscopio
Preparación de extendidos de sangre periférica y Tinción con May-Grünwald-Giemsa Nota 1: Por razones de bioseguridad se empleará sangre de animales sanos de laboratorio y no sangre humana.
Nota 2: Los extendidos de sangre parasitada a disposición del alumno estarán previamente fijados por lo que no representan riesgo de infección.
Materiales: Portaobjetos
Sangre (anticoagulada) Procedimiento:
A) Realización del extendido
1) Colocar una gota (20-50 µl) de sangre en un extremo del portaobjetos
2) Sosteniendo firmemente un portaobjetos limpio a 45º, aproximar el canto del lado menor del mismo a la gota y permitir que se distribuya en el canto.
3) Deslizar el portaobjetos en sentido distal logrando una película uniforme y delgada 4) Descartar el portaobjetos empleado para realizar el extendido
5) Dejar secar el extendido (15-30 minutos). B) Técnica de Tinción con May-Grünwald-Giemsa
May-Grünwald-Giemsa es un método de tinción metacromático que se emplea habitualmente en hematología y en el estudio de hemoparasitosis. El objetivo del método es distinguir estructuras citoplásmicas (generalmente de aspecto granular, como vacuolas y lisosomas) que por sus características bioquímicas se tiñen diferencialmente con el colorante de May-Grünwald (eosinato de azul de metileno), de aquellas con alto contenido de ADN particularmente aquellas ricas en A-T (ADN nuclear y mitocondrial), que se tiñen con Giemsa (un sublimato de Azur II/Eosina). Esta técnica permite identificar tanto parásitos sanguíneos extracelulares (p.ej., Trypanosoma cruzi) como intracelulares (p.ej., diversas especies de Plasmodium).
Materiales:
-Colorante de May-Grünwald -Colorante de Giemsa
-Agua a pH neutro
-Extendidos de sangre periférica -Portaobjetos
-Aceite de Inmersión Procedimiento:
1) Agregar al extendido colorante de May-Grünwald puro, cubriendo toda la superficie del preparado. Nota: TÓXICO (contiene metanol como fijador). Teñir 3 minutos. Agregar agua corriente, homogeneizar e incubar 1 minuto más.
2) Volcar el colorante, lavar con agua corriente. Nota: la presencia de sales en el agua corriente, actúa en parte como mordiente y permite una mejor “diferenciación” que el agua destilada.
A MODO DE ATLAS DE (NO EXCLUYE LA CONSULTA DE TEXTOS Y ATLAS ESPECÍFICOS)
A continuación se indican las características morfológicas salientes de los estadios de los parásitos más frecuentemente hallados en exámenes coproparasitológicos de la población pediátrica del conurbano bonaerense.
Quiste de Giardia intestinalis. Método de Charles-Barthelemy. Se distingue la pared gruesa, birrefringente (flecha hueca) y la presencia de restos del citoesqueleto (flecha). Aumento original: 100x.
Huevo de Hymenolepis nana. Se distingue la cutícula refringente (flecha) rodeando el espacio hialino periembrionario, el embrióforo (flecha hueca), los filamentos polares (flechas punteadas) y el embrión hexacanto con ganchos (asterisco), dentro del embrióforo. Método de Charles-Barthelemy. Aumento original: 100x.
Huevo de Ascaris lumbricoides. Se distingue la cutícula mamelonada (flecha) y el embrión (flecha hueca). A la izquierda, un huevo decorticado de la misma especie. Método de Charles-Barthelemy. Aumento original: 100x.
Huevos de Enterobius vermicularis. Se distingue su aspecto hialino y morfología plano-convexa. En el interior se observa la larva desarrollada (flecha). Método de Graham. Aumento original: 100x.
A continuación se indican las características morfológicas salientes de los dos hemoparásitos endémicos de Argentina.
Tripomastigotes de Trypanosoma cruzi. Se observa el flagelo que emerge por el extremo anterior (flecha), el kinetoplasto (flecha punteada) y el núcleo en posición media (flecha hueca). La membrana ondulante se distingue particularmente en el ejemplar de la izquierda. May-Grünwald-Giemsa. Aumento original: 1000x.
Estadios sanguíneos de Plasmodium vivax. May-Grünwald-Giemsa. Aumento original: 1000x Gametocito (flecha) y trofozoíto joven (flecha hueca) en eritrocitos de sangre periférica de un paciente infectado con Plasmodium vivax. Aumento original: 1000x.
Trofozoíto maduro de Plasmodium vivax. Se observa acumulación de hemozoína (gránulos de Schüffner) en el citoplasma del eritrocito infectado. Aumento original: 1000x
Esquizonte de Plasmodium vivax (flecha). Se observan claramente los múltiples núcleos resultantes de la esquizogonia. Aumento original: 1000x.
ANEXO: RECOLECCION, TRANSPORTE Y CONSERVACION DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS PARASITOLOGICOS
A- MATERIA FECAL:
-Ficha Tipo: Nombre y apellido. Edad. Residencia actual. Lugar de nacimiento.
Residencias anteriores. Viajes recientes. Existencia de letrinas. Origen del agua de bebida. Costumbre de caminar descalzo sobre barro y tierra. Ingesta de vegetales crudos. Presencia de animales domésticos. Geofagia. Parasitados en la casa. Parasitosis padecidas anteriormente. Expulsión actual de parásitos. Motivo del estudio. Síntomas dominantes. Prurito anal.
-Preparación del enfermo: El paciente debe someterse a una preparación correcta,
mínima e indispensable para evitar Exámenes falsamente negativos o positivos. Por eso se recomienda evitar:
1) Medicamentos opacos no absorbibles. Su presencia en heces hace el examen difícil o imposible:
a-compuestos farmacéuticos: carbón vegetal, sales de bismuto o de magnesio, caolín, creta o benzonaftol.
b-productos opacos para radiología como compuestos baritados por vía rectal u oral, etc.
c-sustancias grasas, aceites laxantes, supositorios.
2) Alimentos que dejan demasiados residuos. Conviene descartarlos parcial o totalmente durante los tres días previos y durante el examen: legumbres secas, legumbres verdes, frutos de cutícula gruesa, granos de envolturas endurecidas, frutas de granos numerosos y de pequeño tamaño.
-Recolección de las muestras:
1-Método de uso habitual recomendado por la OMS: Se debe recolectar la materia fecal recién emitida en un frasco con fijador (PVA, PAF, SAF, MIF o Formol al 5%) en una proporción de 1 parte de heces por cada 3 partes de fijador (aproximadamente el volumen final no debe exceder la mitad del volumen del fijador). No debe estar mezclado con orina u otro líquido.
En casos de que las deposiciones sean formes o blandas se recomienda recolectar 3 muestras en días alternos en un lapso de 7 días, siempre de aquellas zonas más llamativas. En aquellos pacientes con diarrea aguda se recomiendan tomar 3 muestras seriadas, y aquellos con diarrea crónica 6 muestras alternas en un lapso de 12 días. Las materias fecales tienen que ser homogeneizadas por el paciente. En todos los casos la cantidad de muestra a recoger se hará en una cuchara tamaño de las de té.
Si se observan estructuras similares a parásitos adultos, se deben recoger en frascos con agua y remitirlas al laboratorio o en formol al 5%.
En caso de ser HECES MUCOSANGUINOLENTAS, se recomienda remitir inmediatamente de emitidas o conservar a 5°C y enviarlas dentro de las 24hs.
Las muestras fijadas pueden permanecer por meses a temperatura ambiente o refrigeradas a 5°C. Se recomienda dividir la muestra y recogerla por un lado en Formol 5% y por el otro en PVA y/o SAF debido a que estos fijadores presentan ventajas y desventajas complementarias (Formol preserva mejor morfología de huevos de helmintos y larvas; PVA y SAF son en general más adecuados para realizar coloraciones permanentes de trofozoítos y quistes de protozoarios).
1.1- Métodos de recolección especial para Taenia sp. y Enterobius vermicularis:
9Método de Graham-Garaguso: recomendado para niños. Se entregan 6 portaobjetos con cinta adhesivas pegadas a las mismas. Se debe tomar 6 muestras seriadas por las mañanas previa higiene, de la siguiente manera:
1-se despega la cinta adhesiva del portaobjetos y se enrolla en el dedo índice quedando la zona gomosa por fuera,
2-el paciente en decúbito ventral, se abre las nalgas y se pasa la zona engomada por la región perianal varias veces, y luego se vuelve a pegar sobre el portaobjetos. 9Método del escobillado anal: recomendado en los adultos. Se entregan al paciente 5 gasas dobladas de 5x5 cm. aproximadamente y un frasco de formol al 5%. Las muestras se toman durante 5 días seriados por las mañanas previa higiene. El paciente en decúbito ventral, se abre las nalgas y se pasa la gasa, previamente humedecida, por el ano y la región perianal varias veces y se colocan todas las gasas en el mismo frasco de formol.
2-Otros métodos: Examen de heces seriado de 6 muestras con técnica de Deschiens. En un frasco de boca ancha con solución de formol al 5% se recolecta una muestra (una cucharadita) de materia fecal por día, en las zonas que más llamen la atención (mucus, pus, sangre, etc.), hasta completar las 6 muestras no siendo necesario que sean en días consecutivos. Ventajas del método:
a- Desodoriza y fija el material. b- Puede enviarse a distancia.
c- Al ser seriado pone a cubierto las fases negativas de protozoarios (descargas cíclicas de quistes).
Desventajas: No se observan formas vegetativas de protozoarios, por acción del formol.
Examen de heces frescas con técnicas de Neghme. Se recolecta una sola muestra de materia fecal en solución fisiológica; debe remitirse rápidamente al laboratorio. Ventajas: Se pueden reconocer las formas vegetativas de los protozoarios. Desventajas: No es seriado.
3-Métodos de recolección para detección de antígenos en materia fecal y/o para PCR (recomendaciones del CDC):
9Detección de antígenos de protozoarios en materia fecal: Consultar las instrucciones del kit diagnóstico para la selección de la toma de muestra más adecuada en cada caso (materia fecal fresca, congelada o fijada). Se desaconseja el uso de PVA. También se desaconseja el uso de métodos de enriquecimiento en el caso de detección de antígenos de Giardia por ELISA.
9Diagnóstico por métodos de biología molecular: Las muestras deben recogerse en ausencia de fijadores y enviadas refrigeradas o congeladas (hielo seco). Como alternativa, las muestras se pueden mezclar en proporción 1:1 con dicromato de potasio o etanol absoluto y enviarse refrigeradas. Para protozoarios intestinales, se recomienda previamente hacer tinciones y examinarlas microscópicamente; en caso de identificar al parásito por morfología, la PCR no se realiza. Es necesario realizar la extracción del ADN de la muestra de materia fecal previo a la realización de la PCR.
B- SANGRE:
alrededores. Fecha de comienzo de la enfermedad y diagnóstico clínico presuntivo. Recolección de la muestra:
-Por punción digital: Limpieza del pulpejo del dedo medio (mano izquierda si el paciente es diestro o viceversa), con alcohol 70%, dejar evaporar y punzar con lanceta o aguja estéril (de preferencia en la cara lateral del pulpejo). Con la sangre que se obtenga de esta pequeña herida se procederá a realizar:
9Gota fresca (si se sospecha una tripanosomosis o filariosis): Colocar una gota entre porta y cubre-objeto y revisar ordenadamente al microscopio recorriendo toda la preparación. Si la muestra no se observara de manera inmediata, conviene recoger sangre heparinizada (o con otro anticoagulante) en un tubo (ver más adelante), y preparar la gota fresca en el momento de realizar la observación. El reconocimiento de los parásitos se basan principalmente en sus movimientos. Esta técnica carece de coloración por lo que debe ser observada únicamente en 10X y 40X.
9Extendidos o Frotis (para tripanosomosis, filariosis, paludismo y babesiosis): Sobre un extremo de un portaobjeto seco, previamente desengrasado con una mezcla de alcohol-acetona, se coloca una pequeña gota de sangre. La misma se extiende ayudándose con un segundo portaobjeto que se colocará por delante, pero contactando la gota de sangre en un ángulo de 45° aproximadamente y que servirá para deslizarla formando una fina película. Dejar secar y transportar al laboratorio para su tinción. 9Gota gruesa (para tripanosomosis, filariosis y paludismo): Colocar sobre el centro del porta una gota de sangre bastante grande; sobre ella se agregarán 1 a 3 más, según el espesor de las gotas que se extraigan. Con el ángulo de otro porta efectuar sobre la gota un movimiento circular raspando la superficie del portaobjeto. Extender la superficie de las gotas con un movimiento en espiral durante uno a dos minutos. De esta manera se desfibrinará la sangre y se extenderá la gota con un diámetro de 2 a 2,5 cm. Dejar secar y enviar al laboratorio para su tinción.
9Microhematocrito: Tomar sangre del pulpejo del dedo (o del talón) y cargar varios capilares heparinizados. Sellar un extremo con plastilina y centrifugar a 1500-2500 rpm por 5 minutos. Si no se puede proceder a centrifugar inmediatamente, conviene tomar una muestra de sangre heparinizada en tubo y preparar con ella los microhematocritos en el momento de procesarlos. Luego de centrifugado se obtiene 3 capas (suero-GB-GR), se corta el capilar a la altura de los GB y se analiza entre porta y cubreobjetos. Es una técnica muy usada en la enfermedad de Chagas, y de elección en los neonatos, ya que los tripomastigotes circulantes sedimentan con los GB.
-Por punción venosa: Se recogen dos muestras, una sin anticoagulantes habitualmente
para estudios serológicos y otra con anticoagulante en condiciones estériles (se empleará para inocular animales y /o cultivos, realizar gota fresca y/o microhematocrito) y con este material se podrá también realizar el método de concentración de Strout. NOTA: Las muestras para la determinación directa de un parásito deberán ser remitidas al laboratorio lo más pronto posible. Materiales necesarios: Lanceta de Franke, agujas y jeringas descartables estériles, capilares heparinizados, tubos de ensayo, heparina, portas, plastilina, algodón, alcohol.
-Por xenodiagnóstico (se utiliza para T. cruzi): Se utilizan ninfas de T. infestans de
tercer estadio, con ayuno previo de 15 días, repartidas en 4 cajas (10 vinchucas por caja). Las cajas se cubren con una gasa bien fijada y se colocan durante 30 min sobre el
casos especiales, pues el método es engorroso y caro). Materiales necesarios: ninfas de tercer estadio de T. infestans, cajas para insectos, gasa, bandas elásticas.
C- MATERIAL DE BIOPSIAS:
-Por punción con agujas finas: Esta técnica se utiliza habitualmente para el
diagnóstico de leishmaniosis, en donde se obtiene muestras por punción-aspiración generalmente de médula ósea (esternón o cresta ilíaca) y excepcionalmente de bazo, ganglios o hígado. Una vez obtenido la muestra se puede colocar en medios de cultivo selectivo para Leishmania spp o realizar frotis y tinción de la muestra.
-Por biopsias de órganos: Se pueden obtener muestras de todo tipo de órganos
(pulmón, ganglios, hígado, bazo, piel, tejido celular subcutáneo, etc. dependiendo del parásito sospechado) y luego procesarlos básicamente por 3 vías: a) enviar material para cultivo; b) realizar improntas directamente del material sobre los portaobjetos, previamente secado la sangre por aposición sobre un papel filtro limpio, y luego teñir; c) realizar cortes histológicos para microscopia común o electrónica. Actualmente se realiza también técnicas de biología molecular sobre los tejidos biopsiados.
D- OTROS TIPOS DE MUESTRAS:
-Toma de muestras especiales. De acuerdo al cuadro clínico y al diagnóstico presuntivo
las formas evolutivas de los parásitos pueden ser investigadas en líquido duodenal, biopsia de intestino delgado y biopsias de lesiones ulcerosas colónicas por colonoscopia.
-Recolección y envío de parásitos para el diagnóstico macroscópico. Identificación de
parásitos completos o partes de parásitos expulsados por vía rectal o por vómitos. Deben ser llevados al consultorio médico o al laboratorio en frascos transparentes con formol al 5%. Si el paciente no tiene la posibilidad de conseguir el formol, indicarle que lo lleve en agua de la canilla. Advertir que no debe hacerlo con alcohol (lo que se hace frecuentemente), porque deshidrata y retrae los elementos dificultando su
Trabajo Práctico Nº 4: Micología
•
Observación de exámenes directos de levaduras con la Tinción
de Giemsa.
Procedimiento:
•
Fijar la muestra con metanol 100% 1 minuto
•Inundar el extendido con Giemsa 20 minutos
•
Lavar el preparado con agua y dejar secar al aire. No secar al calor.
•
Observación de escamas con micelios y levaduras. Digestión con
KOH 40%.
Procedimiento:
•
Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos
•Agregar la muestra y cubrir con un cubreobjetos.
•
Digerir calentando la preparación suavemente a la llama hasta
el desprendimiento de burbujas
•
Preparación de LCR con tinta china y observación de levaduras
capsuladas.
Procedimiento:
•
Centrifugar previamente la muestra (10min a 3000rpm).
•Colocar una gota del sedimento en un portaobjetos
•
Agregar una gota de TCH sobre la muestra, mezclar y cubrir
con un cubreobjetos.
.
•
Cultivo de escamas observadas en la clase 1 en tubos conteniendo
los medios Saboureaud/Cloranfenicol y Lactrimel/Cloranfenicol
en pico de flauta.
Procedimiento:
•
Destapar el tubo cerca del mechero y flamear la boca del
mismo.
•
Utilizar un gancho previamente flameado al rojo y enfriado.
•Humedecerlo en medio estéril y tomar las escamas.
•
Realizar tres puntos de siembra desde el fondo hacia el pico
sobre la superficie del medio.
•
Volver a tapar el tubo previamente flameado.
•Incubar en estufa a 28º C.
Tener la precaución de trabajar siempre cerca del mechero.
•
Descripción de las características de las colonias gigantes de :
•
Histoplasma capsulatum fases levaduriforme BHI.
•
Alternaria en medio Saboureaud.
•
Aspergillus fumigatus en medio Saboureaud.
•
Rhizopus sp en medio Saboureaud
•
Candida spp. en medio Saboureaud y Chrom Agar.
•
Microsporum canis y Trichophyton rubrum en medios de
Saboureaud
.
•
Realizar preparaciones con azul de lactofenol para la
observación microscópica. Describir las estructuras observadas.
•
Observación de microcultivos
Procedimiento:
•
Tomar un portaobjeto previamente flameado, colocar en el centro
una gota de azul de lactofenol.
•
Con un gancho estéril tomar parte del micelio y disociarlo con ayuda
Trichophyton rubrum.
Hongo antropófílo. Características
macroscópicas: Colonias de lento crecimiento,
blanca aterciopelada, algodonosa con un pigmento
rojo vinoso por el reverso. Características
microscópicas: Microconidios en forma de
lágrima o pera (2-3
µ
x 3-5
µ
), unidos en forma
alterna al la hifa. En general los macroconidios
son raros. En cepas muy esporuladas se pueden
encontrar en forma de lápiz
Microsporum canis
Hongo zoófílo. Características macroscópicas:
Colonias de crecimiento rápido, mostrando hacia los
10-15 días de incubación colonias con anverso
lanoso o algodonoso blanco o de color gamuza.;
puede existir algún surco radiado. Reverso con
pigmento amarillo ocre. Característias
microscópicas: Macroconidios fusiformes de pared
externa gruesa y rugosa, con extremos afilados
ligeramente curvados, con 6-12 septas internas.
Escasos microconidios claviformes o piriformes,
sesiles.
Alternaria alternata
Caracteristicas macromorfológicas: colonias afelpadas o
pulvurulentas de color gris-oliva. Caracteristicas
microcromorfológicas: hifas septadas y pigmentadas.
Conidióforos septados de longitud variable del que emerge
un conidio elipsoidal grande septado en forma transversal y
longitudinal (moriforme) formando cadenas.
Histoplasma capsulatum var. capsulatum
Examen directo en materiales biológicos con tinción de
Giemsa: levaduras pequeñas redondas u ovales con un
brote, rodeado de una pared que no toma los colorantes,
con una masa cromática en un polo en forma de media
luna de color azul oscuro y el resto del citoplasma presenta
color celeste. Se lo puede observar en el interior y/o afuera
de macrófagos o células gigantes.
Cultivos a 28° C en Sabouraud: Características
macroscópicas: Colonias de lento crecimiento (3 a 4
semanas), de aspecto granuloso a algodonoso, blancas y
luego parduzcas (color canela). Reverso inicialmente de
color crema y luego pardusco
Características microscópicas: Microconidios hialinos
sésiles de pared lisa y delgada que salen de conidióforos
cortos o a los lados de las hifas hialinas y tabicadas.
Macroconidios esféricos de pared rugosa, con expansiones
digitiformes, que salen de conidióforos cortos. Ambos
conidios muy abundantes.
Cultivos
a 37°C en BHI:
Características
macroscópicas: colonias cerebriformes de aspecto
cremoso. (7días)
Características microscópicas: levaduras monogemantes
Aspergillus fumigatus.
Características macroscópicas:. Las colonias
sobre agar Czapek son blancas al principio y luego
se tornan verde azulado a gris oscuro. Consiste en
una densa felpa de conidióforos. Características
microscópicas:. Conidióforo corto de pared lisa, a
menudo verde en la parte superior. Cabezas
conidiales columnar, uniseriada, usualmente fértil
sobre los dos tercios de la superficie de la vesícula.
Conidios verrucosos, subesféricos de 2.5 a 3 µm de
diámetro.
Rhizopus.
Características macroscópicas. Colonia de
crecimiento rápido y vellosa. Características
microscópicas: micelio cenocítico con estolones y
rizoides. Esporangióforos partiendo de los rizoides.
Esporangio terminal con multiesporos, con apófisisy
columella, lamisma es esférica a ligeramente
elipsoide. Esporangiosporos subesféricos,
ornamentados.
Trabajo Práctico Nº 5: Virología
Objetivos Generales: Conocer la metodología aplicada en el diagnóstico de laboratorio
de infecciones virales humanas y la interpretación médica de sus resultados.
Objetivo específicos: introducir al alumno en conocimientos prácticos sobre técnicas de
cultivo y biología molecular y en la obtención de la muestra y procesamiento a partir de una extracción de sangre:
- Observación microscópica de monocapas normales e infectadas. Caracterización del efecto citopático viral
- Obtención de muestras clínicas, envío al laboratorio, métodos de diagnóstico rápidos.
- Utilidad de los técnicas moleculares en el diagnóstico y monitoreo de las infecciones virales.
Parte 1: MOSTRACIÓN CULTIVOS CELULARES NORMALES E INFECTADOS
Observar por microscopía óptica:
1) Efectos citopáticos virales sobre monocapas celulares infectadas comparándolas frente a un control sin infectar.
2) Detección de antígenos virales por inmunoperoxidasa.
3) Resultado final de una reacción de cuantificación viral por método de plaqueo
Conceptos a discutir: Cultivo celular primario, línea diploide, línea continua. Cultivo en monocapa y en suspensión. Caracterización del efecto citopático (redondeamiento, lisis, sincicios, etc.). Unidades formadoras de placas (UFP).
Resulta conveniente que el alumno dibuje cada observación que realice al microscopio óptico.
Parte 2: DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
El alumno podrá observar:
1) Producto final de la extracción de un ácido nucleico (ADN).
2) Corrida electroforética en geles de agarosa de productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con posterior visualización por transiluminación con luz UV.
3) Corrida electroforética de productos de digestión enzimática de un producto de PCR para observar el “Polimorfismo en el Largo de los Fragmentos de Restricción” (RFLP). Visualización por transiluminación UV.
4) Demostración de procedimientos de separación electroforética de proteínas por SDS-PAGE (gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes).
5) Mostración de placas auto-radiográficas obtenidas por secuenciación nucleotídica manual. Comparación con los métodos automatizados.
ATENCIÓN: recordar el potencial carcinogénico del Bromuro de Etidio que se utiliza para la visualización de los geles de agarosa. USAR GUANTES DE LATEX y Protección Ocular.
Parte 3: TOMA DE MUESTRAS, TRASLADO AL LABORATORIO Y PROCESAMIENTO.
Objetivo: Lograr que los estudiantes adquieran destrezas reales que les permitan conocer cómo tomar muestras en Virología.
Trabajo Práctico:
1. Reconocer una sonda K30 y prepararla con una jeringa de 10 cm3 en su extremo, simulando una aspiración nasofaríngea. Colocarla nuevamente en su envoltorio y rotularlo con los datos del paciente. Simular el depósito del material en un tubo cónico y un lavado con PBS. Reconocer los portaobjetos en los que se colocan las muestras y repasar la técnica de inmunofluorescencia indirecta. 2. Reconocer el recipiente para tomar muestras de gargarismos o de materia fecal y
conocer los métodos que se usan de recolección y traslado.
3. Discutir la forma en que se toma una biopsia cutánea (anestesia local toma de muestra con “sacabocados”, colocación del tejido en el líquido fijador. Rotulación y envío al laboratorio.
4. Discutir cómo se toma una muestra de sangre periférica por punción venosa para preparar suero.
