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VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS DE SANGRE y ORINA

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VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR

PARA EL DIAGNOSTICO DE

LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS DE

SANGRE y ORINA

CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

2007

MANUEL J CÉSPEDES ZAMBRANO

RAFAEL TAPIA LIMONCHI

DANA GONZÁLEZ QUISPE

LOURDES BALDA JUÁREZ

CARLOS PERALTA

PATRICIA CONDORI

JORGE ALDAZABAL SOTO

FREDY MUNAYCO

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FORMATO PARA INFORME TÉCNICO FINAL INS

PRIMERA PÁGINA*

I. Título del estudio.

VALIDACIÓN DE LA PRUEBA DE PCR PARA EL DIAGNOSTICO DE LEPTOSPIROSIS EN MUESTRAS DE SANGRE y ORINA

II. Autores, indicando su filiación institucional.

Manuel J Céspedes Zambrano - CNSP Rafael Tapia Limonchi - CNSP

Dana González Quispe- CNSP Lourdes Balda Juárez - CNSP Carlos Peralta – LRR Madre de Dios Patricia Condori – Hospital Santa Rosa. Jorge Aldazabal Soto – DISA Madre de Dios. Fredy Munayco - Red Cañete-Yauyos

III. Autor corresponsal (Dirección, teléfono, correo electrónico).

Correspondencia: Manuel Céspedes Zambrano. Instituto Nacional de Salud. Av. Defensores del Morro 2268, Lima 09, Perú. Apartado Postal 471. Telf.51(1)251 6151, Fax51(1) 251 6151 Anexo : 429 ó 541

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IV. Resumen

Introducción: El “gold standar” para el diagnóstico de Leptospirosis es la prueba basada

en la respuesta serológica, el método utilizado es la aglutinación microscópica (MAT) que detecta títulos de anticuerpos de los pacientes infectados en un periodo de 6-10 días después de iniciada la enfermedad. En la prueba de MAT es necesario contar con una segunda muestra para poder evaluar la evolución de títulos de anticuerpos del paciente. Se han reportado el uso de la técnica de ELISA para casos tempranos de infección obteniendo resultados satisfactorios en el diagnóstico de esta enfermedad. El diagnóstico de Leptospiras también se podría realizar por observación microscópica en campo oscuro o por aislamiento en cultivo, sin embargo la viabilidad de las Leptospiras es mínima y el tiempo que demora en crecer la bacteria podría tardar entre 2-3 meses y su porcentaje de aislamiento es muy bajo de 1-10%. Objetivo: Estandarizar y validar una prueba de PCR para el diagnostico rápido de Leptospirosis humana a partir de muestras de sangre y orina.

Material y Métodos: Se optimizo la prueba tomando en cuenta los factores que afectan la

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1. INTRODUCCION

La Leptospirosis es una enfermedad zoonótica que puede ser causada por diversos serovares de Leptospira interrogans, es una enfermedad asociada con la actividad de las personas, sobre todo cuando el hombre está en contacto directo o indirecto con orina de animales infectados(1-3). La Leptospirosis es una enfermedad febril, aguda, sistémica de distribución universal cuya incidencia está relacionada con la localización geográfica y la ocupación de las personas. La Leptospira interrogans es una especie antigénicamente compleja que incluye diversos grupos genéticos, comprende más de 200 variedades antigénicas aisladas de unas 160 especies de mamíferos(1-3).

La Leptospirosis es una enfermedad ampliamente distribuida en el país, no conociéndose la proporción de casos febriles sin diagnóstico que pueden ser atribuidas a esta enfermedad, pues no es considerada usualmente como una enfermedad de notificación, el diagnóstico diferencial y las técnicas de diagnóstico no están ampliamente disponibles(4-8). Las pruebas de diagnostico para estas enfermedades zoonóticas están normalmente basadas en la respuesta inmunitaria y mucha de ellas no son muy sensibles dentro de los primeros 6 días de enfermedad y muchas veces no es muy oportuno para el inicio de tratamiento(7).

En la actualidad la biología molecular está permitiendo realizar investigaciones a nivel molecular de los patógenos infecciosos que están afectando la salud humana como la Leptospirosis. Las técnicas moleculares son altamente sensibles y específicas permitiendo un diagnóstico temprano y oportuno de la enfermedad. Una de estas técnicas es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que permite incrementar el número de amplificaciones de secuencias de ADN específicos de Leptospiras a partir de un ADN molde. Posterior al PCR se usa tambien la hibridación haciendo que la prueba sea más sensible y específica(9-19). En la actualidad el PCR está siendo usado para el diagnóstico de otras enfermedades infecciosas como Tuberculosis, Sífilis, Enfermedad de Lyme, entre otros.

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Posteriormente para aumentar la sensibilidad de esta prueba se uso secuencias dentro del genoma de esta bacteria como el gen ribosomal (16S, 23S) para detectar DNA de esta bacteria en muestras para poder aumentar la sensibilidad de la prueba se han utilizado sondas marcadas que permitieron dar una mayor sensibilidad a la prueba.(16, 17, 20)

En nuestro país también se han desarrollado trabajos desde 1953, en el Instituto Nacional de Salud se iniciaron estudios epidemiológicos de Leptospirosis en ratas de desagües, gatos, perros y cerdos sacrificados en el camal del Callao, así como al personal del Mercado Central. A partir de 1962, se intensificaron estos trabajos, principalmente fuera de Lima, efectuándose estudios en Tumbes, Ancash, Cajamarca, Arequipa, Amazonas, San Martín, Huánuco, Ayacucho, Loreto y Madre de Dios y se concluyó que era una enfermedad ocupacional presentándose esporádicamente y que es producida principalmente por Leptospiras del serogrupo Icterohaemorrhagiae, aislándose numerosas cepas de Leptospiras, tanto del hombre como de los animales domésticos y silvestres, algunos de los cuales resultaron ser serovares nuevos(21-26). Los estudios que se realizaron anteriormente en nuestro país nos permitieron conocer las variedades de serovares en las distintas regiones. Estos estudios se realizaron en diferentes zonas del país.

Durante el año de 1997, el Instituto Nacional de Salud reportó 11 casos positivos, en el año 1998, debido a problemas climáticos como el fenómeno del Niño, el laboratorio de Leptospiras reportó 98 casos positivos, en 1999 reportó 93 positivos, en el 2000 reportó 105 positivos. Con el objetivo de conocer la incidencia de la enfermedad en febriles en un brote en Madre de Dios, personal del Instituto Nacional de Salud y la Dirección de Salud de Madre de Dios intervinieron para hacer el estudio en los poblados que se encuentran a lo largo del río Madre de Dios, encontrando un 36.6% de positividad para Leptospirosis en humanos. Asimismo se hizo un muestreo al animal doméstico más cercano al hombre, el perro, encontrando en estos animales una positividad de 66.6% para Leptospirosis. (6)

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DISA Ucayali realizó un estudio en humanos y animales encontrado una positividad de la enfermedad en 31%.(4)

Con estos datos obtenidos en los diferentes departamentos del país, se vio que la Leptospirosis es una de las causas más frecuentes de fiebre en las diferentes regiones del país(27)

Asimismo en el INS se han estandarizado diferentes metodologías para él diagnóstico serológico de la Leptospirosis en especial por el método de ELISA para lo cual se uso diferentes preparaciones antigénicas, encontrando valores de sensibilidad y especificidad, que varia entre 85 a 95%(7)

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V. Objetivos.

Validación de la prueba de PCR para el diagnóstico temprano de Leptospirosis.

Objetivos Específicos:

 Estandarización de la prueba de PCR en el laboratorio.

 Validación de la prueba de PCR a partir de muestras de sangre y orina

provenientes de zonas endémicas de Leptospirosis

VI. Materiales y métodos.

Población de estudio: El estudio tuvo dos etapas la primera de estandarización de la

prueba en laboratorio y la otra de validación en el campo.

Estandarización in vitro:

A. Selección de cepa de Leptospira interrogans

Las cepas usadas para la estandarización in vitro fueron de la especies de leptospiras patógenas y no patógenas. Las cepas fueron reactivadas mediante su cultivo en medio EMJH, por 5 días a 30ºC. Posteriormente se realizará pruebas para evaluar la pureza de los cultivos con técnicas establecidas.

B. Extracción de ADN genómico

Las cepas de Leptospira después de incubadas fueron centrifugadas a 2000g durante 10 minutos. El sedimento fue resuspendido en buffer TE/sodio (50mM Tris, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, pH 8,0). Luego se adicionará 30 ul de SDS al 10% y 3ul de proteinasa K, dejando incubar a temperatura de 37ºC durante una hora. La suspensión de las células lisadas se trataron con fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (25:24:1) y los ácidos nucleicos serán precipitados con dos volúmenes de etanol frío y luego resuspendidos en agua tridestilada estéril.

C. Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR):

Se realizo la optimización de todos los parámetros del PCR como Primer, Cloruro de Magnesio, DNTPS, Taq polimerasa, buffer y ADN.

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Para los estudios de especificidad de la prueba de PCR se probaron con 3 muestras de ADN de los siguientes patógenos (Brucella, Salmonella, Treponema, Borrelia, Rickettsias y Plasmodium).

Validación en el campo:

Para la validación en campo se trabajo con aquellos pacientes sospechosos con Leptospirosis que acudan a los establecimientos de salud de las Dirección de Salud de Madre de Dios (Hospital Santa Rosa, Iberia y C.S. Jorge Chávez, Nuevo Milenio, Laberinto) y adicionalmente se capto muestras de pacientes febriles con sospecha de leptospirosis los cuales fueron posterior a un brote al sur de Lima en San Vicente de Cañete.

Los criterios de inclusión usados fueron: Criterios de inclusión:

 Todo paciente febril con tiempo de enfermedad menor de 10 días, con temperatura

oral mayor o igual a 38oC con malestar general, cefalea repentina y asociado a uno o mas signos y síntomas como escalofrío, mareo, mialgia, artralgia, tos, disnea, diarrea, náuseas o vómitos, hemorragia conjuntival, fenómenos hemorrágicos, ictericia y oliguria

 Residente en el área un mínimo de 2 meses.  Edad mayor de 5 y  65 años de edad.

Criterios de exclusión:

 Pacientes con sintomatología sugerente de leptospirosis que antes de empezar

con el estudio se le confirma otra patología.  Personas que no deseen participar en el estudio

Procedimientos:

Muestra biológicas para las pruebas:

Paciente: Se tomo a aquellos pacientes sospechosos con Leptospirosis y que cumpla

la definición de caso.

A. Obtención de Sangre para el cultivo y PCR: Se tomo una cantidad de 5ml con

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B. Obtención de Suero para serologia: La toma de la muestra sangre total se realizo

simultáneamente con la toma de sangre anticoagulada entre 1-10 días de iniciado los síntomas y otra muestra se tomo a los 7-21 días posterior a tomado la primera muestra.

C. Obtención de muestra de orina para PCR:

La toma de la muestra de orina se realizo simultáneamente de tomado la muestra de sangre, esta se centrifugo y el sedimento se guardo en congelación hasta la realización del PCR.

VII. Resultados y Discusión (incluye tablas y gráficos). Métodos para la Estandarización del PCR en laboratorio: Estandarización del PCR:

Para el PCR se usaron al final un primer ribosomal correspondiente al gene rrs Lep A: 5´GGCGGCGCGTCTTAAACATG3´ and Lep B: 5´TTCCCCCCATTGAGCAAGATT 3´. Las condiciones del mix se estandarizaron en 100 pmol de cada primer, 1.5mM MgCl2

(Perkin Elmer) 1X PCR Buffer II (Perkin Elmer) 200uM dNTPs and 1 U of AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin Elmer) in a final volumen of 50uL. Las condiciones se ciclaje fueron: Denaturación inicial de 95°C for 5 min, 95°C por 30 segundos, 59°C por 1 minuto, 72°C por 30 segundos, este ciclo se repitió 30 veces terminado se hizo una extensión final 72°C for 7 minutos en un thermocycler Amplitron II (Thermolyne)

Sensibilidad y especificidad in vitro:

Los primers usado durante la estandarización del PCR amplificaron los 25 serovares de leptospiras que están agrupado en 6 especies, estos serovares son usados en el MAT. Tabla 1: Numero de Serovares usados por especie en la estandarización del PCR.

Especie Numero de serovares Resultados de PCR.

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De las muestras de ADN de otras bacterias ninguno amplifico usando estos primers. Para este numero de cepas y con estas bacteria podemos se afirma que la sensibilidad del método es 100% y con una especificidad de 100%.

Evaluación de la Extracción de ADN con muestras de sangre:

Asimismo 8 serovares de Leptospira fueron extraído por 7 métodos para ver cual era el mejor método de extracción: M1: DNAzol (GIBCO), M2: DNAzol y extracción orgánica,

M3: DNAzol modificado, M4: Esferas de CHELEX 100 (SIGMA), M5: Método

convencional, M6: Método convencional modificado, M7: Boiling (Corney 1993). Solo amplificaron adecuadamente y se observo una banda con los métodos M3, M4, M5, M6 y M7.

Validación de la prueba en campo

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Tabla 2 Resultados de las muestras obtenidas por las diferentes pruebas.

Pacientes (180)

MAT ELISA Cultivo Elisa y

mat PCR-sangre PCR orina PCR suero PCR total (sangre y orina) Positivo 57 56 5 74 41 20 8 47 Negativo 123 124 66 106 139 121 19 133 No realizado 0 0 109 0 0 39 153 0

Asimismo comparando el PCR con respecto al MAT en la primera muestra de 41 PCR que resultaron positivos en sangre, en el MAT tuvo positividad en solo en 19 y 22 habían salido negativos. Esto evidencia que en la fase temprana es mucho más sensible que el MAT en el PCR muestras que resultaron se obtuvo que el PCR detectaba positividad.

Haciendo la comparación con la positividad obtenida en PCR en muestras de sangre y orina de 47 PCR positivos en la primera muestra solo el MAT detecto 20 y 27 salieron negativos, los cuales evidencia que el PCR es mas sensible que las pruebas serológicas ya que la respuesta inmune es mas tardía como es mencionado por diversos autores en revisiones previas.

Con respecto a la negatividad obtenida en el PCR se explica porque en la mayoría de casos se han tomado en pacientes entre 8 y 10 días de enfermedad donde las leptospiras ya en sangre están en menor proporción que en los primeros seis días y recién comienzan a circular en orina.

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VIII.Referencias Bibliográficas (Estilo Vancouver).

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