Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de Orquídeas Silvestres de Tabasco

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Germinación in vitro de Semillas y

Desarrollo de Plántulas de Orquídeas

Silvestres de Tabasco

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Germinación in vitro de Semillas y

Desarrollo de Plántulas de Orquídeas

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Candita Victoria Gil Jiménez

Rectora

Alma Catalina Berumen Alatorre

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Germinación in vitro de Semillas y

Desarrollo de Plántulas de Orquídeas

Silvestres de Tabasco

Universidad Juárez Autónoma de Tabasco División Académica de Ciencias Agropecuarias

Alberto Mayo Mosqueda

Jaime G. Cázares Camero

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Primera edición, 2010

Zona de la Cultura, Col. Magisterial Villahermosa, Centro. Tab. C.P. 86040

Queda prohibida la reproducción parcial o total del contenido de la presente obra, sin contar previamente con la autorización expresa y por escrito del titular, en términos de la Ley Federal de Derechos de Autor.

ISBN: 978-607-7557-30-2

Impreso y hecho en Villahermosa, Tabasco. México

Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de Orquí-deas Silvestres de Tabasco / Alberto Mayo Mosqueda…[et al.] – Villa-hermosa, Tabasco: Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, 2010. 32 p.: IL. -- (Colección José N. Rovirosa, Biodiversidad, Desarrollo Sustentable y Trópico Húmedo)

Incluye Referencias Bibliográficas e Índice. ISBN: 978-607-7557-30-2

1. Semillas – Desarrollo \ 2. Germinación.

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Índice

Agradecimientos Introducción

I.Cultivo in vitro de orquídeas

Biología de la germinación de semillas de orquídeas

Propagación de orquídeas a partir de semillas

II. Medios de cultivo III. Siembra de semillas

Colecta y almacenamiento de las semillas

Consideraciones sobre la siembra de cápsulas verdes y cápsulas abiertas

Método de siembra de cápsulas verdes

Método de siembra a partir de cápsulas abiertas

IV. Inducción de germinación in vitro Crecimiento y emisión de raíces V. Transplante a condiciones ex vitro Bibliografía

Índice de Cuadros y Figuras

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Agradecimientos

Agradecemos a las personas que amable y desinteresadamente permitieron el acceso a sus terrenos para realizar las colectas de semillas y plantas de orquídeas. De igual forma a todos los estu-diantes que participaron en los recorridos de campo, como en la realización de experimentos en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de la División Académica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT.

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Introducción

Las orquídeas son plantas que pertenecen a la familia Orchida-ceae, con aproximadamente 700 a 800 géneros y 25,000 a 35,000 especies (Arditti, 1979). Taxonómicamente representan una de las familias más evolucionadas entre las monocotiledoneas, en su mayoría presentan flores atractivas y en algunos casos aunque no presenten flores cautivadoras ni de gran tamaño, tienen importan-cia desde el punto de vista ecológico. En general son consideradas como flores exóticas. Es por ello que la industria de flores de corte y macetas se ha convertido en un mercado creciente, tanto para mercados locales como de exportación. Adicionalmente, el desa-rrollo de nuevos híbridos y el cultivo comercial de orquídeas se ha convertido en una industria lucrativa en Europa, Hawaii, Australia, Tailandia, Japón, Singapur, Sri Lanka y Kenia (Luan, et al., 2006). Esta familia aunque es muy numerosa, algunas especies se encuen-tran amenazadas o en peligro de erradicación, debido al saqueo indiscriminado, destrucción de espacios, contaminación ambiental y deforestación, aunado a los problemas de lento crecimiento y baja tasa de germinación en condiciones naturales.

En Tabasco, existen algunas especies con potencial orna-mental; sin embargo, hay que diseñar estrategias de reproducción debido a que por métodos convencionales es un proceso lento. La propagación vegetativa a partir de rizomas, separación de brotes generados del tallo o seudobulbos, es muy lenta, además de obte-nerse pocos brotes después de dos a tres años de iniciado el proce-so.

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Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo

vitro. Esta técnica ofrece la oportunidad de conservar

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I. Cultivo in vitro de orquídeas

La propagación y cultivo de las orquídeas fue revolucionado des-pués del descubrimiento de Knudson (1922) en donde las semi-llas pudieron ser germinadas en un medio simple con azúcar. Este trabajo demostró que la germinación de semillas de orquídeas en condiciones in vitro fue posible sin la asociación con hongos. Pos-teriormente, el mismo autor propuso una nueva solución con la adición de nutrientes para la germinación de semillas de orquí-deas en 1946. A partir de este momento muchas orquíorquí-deas se han regenerado y propagado a partir de segmentos de hoja (Murthy Pyati, 2001), segmentos nodales de plántulas provenientes de se-millas germinadas in vitro (Chen et al., 2002) nudos florales (Chen

et al., 2002), ápices (Saiprasad y Polisetty, 2003), rizomas (Martin,

2003) y microsecciones apicales (Lakshmanan et al., 1995).

Biología de la germinación de semillas de orquídeas

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Aunque las semillas contenidas en una cápsula de orquídea pueden ser numerosas (2-3 millones), se considera que solo un 2-3% de semillas pueden germinar en condiciones naturales (Luan

et al., 2006).

Debido a las limitaciones anteriores, la germinación y el desarrollo en condiciones in vitro, se plantea como una alternativa que puede ser más eficiente en la regeneración de plantas, ya que se realiza en condiciones controladas y asépticas.

Propagación de orquídeas a partir de semillas

Desde el punto de conservación ex situ de los recursos genéticos vegetales, las semillas de orquídeas representan variabilidad gené-tica, lo que las convierte en un material apropiado para ser inclui-do en programas de conservación.

La primera propagación exitosa de orquídeas en condicio-nes in vitro a partir de la germinación de semillas fue lograda por Knudson (1922) con especies de Cattleya y más recientemente Lo et al. (2004) con Dendrobium tosaense y Damon et al. (2004) con

Cattleya aurantiaca, Encyclia chacoensis y Brassavola nodosa.

La germinación in vitro de semillas de orquídeas puede ser efectuada por dos vías:

a) Co-cultivo de las semillas con diversos hongos mico-rrízicos para establecer una relación simbiótica. Para ello es necesario el aislamiento y cultivo del hongo en un me-dio de cultivo específico.

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II. Medios de cultivo

Para la germinación de semillas de orquídeas se reportan en la literatura algunos medios de uso generalizado como Knudson C (Knudson, 1946), MS (Murashigue y Skoog, 1962), Hutner (1953), Dalla Rosa y Laneri (Dalla Rosa y Laneri, 1977), VW (Va-cin y Went, 1949) y Lindemann (1970). Sin embargo, los requeri-mientos pueden ser muy diversos, incluso en especies del mismo género. En el Cuadro 1 se muestra el contenido de elementos de cada medio de cultivo.

En resultados obtenidos con especies del estado de Tabas-co (Catasetum integerrimun Hook, Encyclia alata, Encyclia Tabas-cordigera,

Epidendrum flexuosum, Epidendrum chlocorymbos, Epidendrum stamfor-dianum, Myrmecophila sp., Trichocentrum ascendens, Trichocentrum car-thagenense, Oncidium sphacelatum, Prosthechea cochleata, Nidema boo-thii, Trichocentrum lindenii), se han obtenido resultados aceptables

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Cuadro 1. Formulación de medios de cultivo, empleados en el cultivo

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III. Siembra de semillas

Colecta y almacenamiento de las semillas

Las semillas pueden ser colectadas a partir de cápsulas verdes o cápsulas maduras. En una cápsula verde que está en proceso de maduración, debe estimarse la edad promedio para cosecharla (el tiempo requerido para madurar es diferente para cada especie), de lo contrario pudiera ser que se encuentre en un estadio inicial de maduración, lo que afectaría negativamente el proceso de germi-nación. Algunos de los indicadores para determinar si una cápsula presenta semillas maduras, son el cambio de coloración (general-mente inicia la presencia de tonalidades amarillas), la base de la cápsula en el lugar del relicto floral se encuentra seco y cuando se presiona no se deforma debido a que se encuentra llena de semillas (Seaton y Ramsay, 2005).

En la Figura 1, se muestran cápsulas maduras de diferen-tes especies, listas para germinar in vitro. Note la tonalidad parda en los bordes de la cápsula y la cicatriz de la flor completamente seca en la parte distal.

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Una vez abierta la cápsula, se desprenden con facilidad las semillas de las paredes con solo agitar al momento de la inocu-lación en el medio de cultivo. Las cápsulas pueden ser almacena-das por algunas semanas si se envuelven en papel periódico y se colocan en refrigeración a 4°C. Es importante no utilizar bolsas plásticas para almacenar cápsulas o semillas ya que se presentará condensación y consecuentemente pudriciones.

En la medida de lo posible, es mejor colectar cápsulas que han estado expuestas a un día seco. Cuando se dispone de suficien-te masuficien-terial y no es posible sembrar la totalidad, se sugiere extraer las semillas en un área estéril y deshidratarlas con sílica gel en un desecador por dos días. Posteriormente, se colectan las semillas en tubos de vidrio con tapa hermética (Figura 2) y se pueden almace-nar en un refrigerador a 4°C por varios meses, siempre y cuando no se abra el contenedor.

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de Plántulas de Orquídeas Silvestres de Tabasco

Consideraciones sobre la siembra de cápsulas verdes y cápsulas abier-tas

Siembra a partir de cápsulas verdes. De forma general se

considera que el interior de una cápsula de orquídea conserva las condiciones de asepsia si está intacta. Sin embargo, en la práctica se sugiere que al momento de realizar la disección, se ponga aten-ción en el color y textura del interior, en algunas ocasiones al abrir la cápsula, las semillas pueden estar necróticas o contaminadas de-bido a daños mecánicos que no son visibles a simple vista.

Se considera que al esterilizar la parte externa y abrirla en condiciones asépticas, las semillas están estériles listas para inocu-larse en el medio de cultivo, por lo que ya no se requiere esterilizar las semillas. Una consideración a esta opción es que las semillas sembradas a partir de cápsulas que no han madurado lo suficiente podrían germinar lentamente o simplemente no germinar.

Siembra a partir de cápsulas abiertas. Las cápsulas abiertas,

contienen en su interior semillas secas, pero como han estado expuestas al ambiente, este material presenta contaminación por hongos y bacterias. Para este material es necesario realizar este-rilización, por lo que con frecuencia se tienen problemas con los protocolos, dado que no existe alguno de forma general, sino que hay que establecer para cada especie las condiciones específicas.

La elección de alguna de las opciones anteriores, estará en función de la disponibilidad de material vegetal.

Método de siembra para cápsulas verdes

El método general para sembrar semillas a partir de cápsulas ver-des es el siguiente:

1. Con un bisturí o tijera, cortar cuidadosamente los restos de la flor muerta de la cápsula.

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3.Esterilizar la cápsula por 5 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 2.5 %, adicionando una gota de detergente Tween 20® por 100 ml.

4. Retirar de la solución de cloro. En condiciones asép-ticas, sumergir en alcohol al 70 % por 30 segundos, y a continuación flamear hasta que el alcohol se queme. Esta operación se puede realizar de una a tres veces depen-diendo del tamaño de la cápsula. En caso de realizar un mayor número se corre el riesgo de dañar las semillas. 5. Realizar uno o dos cortes en forma longitudinal y abrir la cápsula con un bisturí, cuidando de no introdu-cirlo demasiado para no tocar el interior.

6. Tomar la mitad de la cápsula y con una espátula o bis-turí golpearla para esparcir las semillas sobre el medio de cultivo. Normalmente, cuando las semillas se en-cuentran maduras se desprenden con facilidad (Figura 3). De no ser así, con un bisturí se deben raspar, cuidan-do de no incluir tejicuidan-do de las paredes de la cápsula.

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Método de siembra a partir de cápsulas abiertas

Se dispone de diferentes métodos para la siembra a partir de se-millas secas. Por destacar, existe el método de la jeringuilla (más empleado), de la funda de papel, dentro de una pipeta o filtración a través de un embudo. Cada técnica varía de acuerdo a la especie, tiempo de esterilización y la concentración de los esterilizantes.

En el laboratorio de cultivo de tejidos de la División Aca-démica de Ciencias Agropecuarias de la UJAT, se ha utilizado con buenos resultados la técnica de Dixon (1987). Consiste en la utili-zación de una solución de 5 ml de hipoclorito de sodio al 6%, 5 ml de etanol al 95% y 90 ml de agua destilada. Las semillas se colocan en esta solución por un minuto (agitando vigorosamente) y poste-riormente se enjuagan 2 veces en agua destilada estéril, dando un minuto por cada enjuague. Después del segundo lavado, se dejan sedimentar ligeramente las semillas y con una pipeta estéril se to-man de 0.1 a 0.2 cc, depositando sobre el medio de cultivo con esta técnica una cantidad de 50 a 300 semillas por cada contenedor de cultivo (Figura 4).

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IV. Inducción de germinación in vitro

Al disponer de semillas (independientemente del origen) se deben cultivar a una temperatura de 27 °C ± 2, con iluminación difusa, y se debe eliminar aquellos cultivos contaminados o que presenten problemas de fenolización. En las especies de Tabasco que se hace referencia anteriormente se observan las semillas germinando des-pués de 2 a 3 meses de iniciado el cultivo.

Crecimiento y emisión de raíces

Una vez que se ha presentado la germinación, se sugiere realizar una transferencia de las plántulas a un medio de cultivo renovado. En caso de no presentar problemas, puede ser en el mismo medio que el primero; o bien, realizar un cambio a un medio Knudson C. En esta etapa algunos autores recomiendan la utilización de sustan-cias indefinidas como pulpa de banano (Lo et al., 2004) o agua de coco (Arias et al., 2006).

Dependiendo del desarrollo del cultivo, se deben utilizar contenedores de cultivo de acuerdo al tamaño de las plántulas, para permitir un adecuado desarrollo. De igual forma debe consi-derarse la utilización de una mayor intensidad lumínica o luz natu-ral, para permitir que se adapten con mayor facilidad a condiciones naturales.

V. Transplante a condiciones ex vitro

Para esta etapa, deben separarse aquellas plantas con presencia de crecimiento radicular, hojas y rizoma (Figura 5).

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cuidados durante la transferencia a condiciones ex vitro, para asegu-rar el máximo porcentaje de sobrevivencia.

Al extraer las plantas del contenedor de cultivo, deberán lavarse con agua corriente en forma abundante hasta eliminar los restos del medio de cultivo, de igual forma deben eliminarse hojas y raíces dañadas o necrosadas. Tratar las plantas con una solución de fungicida con Mancozeb (Manzate®) a una concentración de 1gl l-1 durante 10 minutos, para tratar de evitar problemas causa-dos por hongos durante el proceso.

Figura 5. Plántulas con presencia de hojas y raíces suficientes para iniciar el proceso de aclimatización.

Respecto al sustrato a utilizar existe a nivel comercial una amplia gama a utilizar, entre los que incluyen corteza de pino, musgo, perlita, tezontle, poliestireno, carbón vegetal, arcilla, etc.

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Figura 6. Charola plástica con perforaciones.

Figura 7. Tepetzil. Después de cribarlo se separa por tamaños. 1) menor de 0.5 cm; 2) de 0.5 a 1 y 3) mayor de 1 cm.

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Posteriormente de sembrar las plántulas deben cubrirse con un domo plástico (Figura 8) para evitar la desecación y colo-carlas bajo sombra al 50 % con un nivel de luz promedio de 100 a 200 µmol m-2_s-1_{. Cuando estas condiciones no sean posibles,} se debe escoger una temporada donde la temperatura no sea muy elevada (no más de 30 ºC) y con media sombra.

Figura 8. Cobertura de charolas con domos plás-ticos para evitar la desecación.

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Bibliografía

Arditti J, Ernst R (1984) Physiology of germinating orchid seeds. En: Arditti J (ed) Orchid biology: reviews and perspectives III. New York: Cornell University Press; 177-222 pp.

Arias HL, Santibañes SR, Dendooven L, Ayora TT, Gutierrez MFA (2006) Efecto de agua de coco y homogenizados de jitomate y plátano

sobre el crecimiento de la orquídea Guarianthe skinneri cultivada in vitro.

El cromosoma: 76-79.

Chen LR, Chen JT, Chang WC (2002) Efficient production of

proto-corm-like bodies and plant regeneration from flower stalk explants of the sympodial orchid Epidendrum radicans. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant.

38: 441- 445.

Chen TY, Chen JT, Chang WC (2002) Multiple shoot formation and

plant regeneration from stem nodal explants of Paphiopedilum orchids. In

Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 38:595-597.

Dalla RM, Laneri U (1977) Modification of nutrient solutions for

ger-mination and growth “in vitro” of some cultivated orchids and for the vege-tative propagation of Cymbidium cultivars. American Orchids Society

Bulletin 46: 813- 820

Damon A, Aguilar-Guerrero E, Rivera L, Nikolaeva V (2004)

Ger-minación in vitro de semillas inmaduras de tres especies de orquídeas de la región del Soconusco, Chiapas, México. Revista Chapingo Serie

Horti-cultura. 10 (2): 195-203.

(29)

28

Hadley G (1997) Orchid mycorrhiza. En:Orchid Biology: Reviews and perspective Vol. II. Cornell University Press. Arditti J, Prid-geon AM. (eds). Ithaca, New York. USA. 424 pp.

Hutner SH (1953) Comparative physiology of heterotrophic growth in

plants. En: Growth and differentiation in plants. LOOMIS WE.

(ed). Iowa State College Press. Ames, USA.458 pp.

Knudson C (1922) Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Botanical Gazette 73: 1- 25.

Knudson C (1946) A new nutrient solution for the germination of orchid

seed. American Orchid Society Bulletin 15: 214-217.

Lakshmanan P, Loh CS, Goh CJ (1995) An in vitro method for rapid

regeneration of a monopodial orchid hybrid Aranda Deborah using thin section culture. Plant Cell Reports. 14: 510- 514.

Lindemann EGP, Guncke JE, Davidson WO (1970) Meristem culture

of Cattleya. Amer. Orch. Bull., 39, 1002- 1004.

Lo SF, Nalawade SM, Kuo CL, Chen CL, Tsay HS (2004) Asymbiotic

germination of immature seeds, plantlet development and ex vitro establis-hment of plants of Dendrobium Tosaense Makino - A medicinal important orchid. In Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant 40: 528-535.

Luan VQ, Thien NQ, Khiem DV, Nhut DT (2006) In vitro

germina-tion capacity and plant recovery of some native and rare orchids. Procee-dings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture. Nong

Lam University Ho Chi Minh City, October 20-21. 175 – 177 pp. Martin KP (2003) Clonal propagation, encapsulation and

(30)

or-de Plántulas or-de Orquíor-deas Silvestres or-de Tabasco

chid. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 39: 322-326.

Mayo MA, Cázares CJG, De la Cruz LE, Flores HA (2008) Informe

final. Proyecto: Conservación y propagación de orquídeas de Tabasco.

Fon-do Sectorial SAGARPA-CONACYT.

Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473 - 497.

Murthy HN, Pyati AN (2001) Micropropagation of Aerides maculosum

Lindl. (Orchidaceae). In vitro Cell. Dev. Biol.- Plant 37:223-226,

Marzo-Abril.

Saiprasad GBS, Polisetty R (2003) Propagation of three orchid

gene-ra using encapsulated protocorm-like bodies. In Vitro Cell. Dev. Biol.

Plant. 39: 42-48.

Savina GI (1974) Fertilization in orchids. In: Linskens HF (ed)

Fertiliza-tion in higher plants. New York: American Elsevier Co. 197-204 pp.

Seaton P, Ramsay M (2005) Growing orchids from seed. Royal Botanic Gardens, Kew. U.K. 83 pp.

Singh F (1981) Differential staining of orchid seeds for viability testing. Am. Orchid Soc. Bull. 50: 416-418.

Vacin F, Went FW (1949) Some pH changes in nutrient solutions. Bot. Gaz. 110: 605-613.

Weber WS, Webster J (2001) Teaching techniques for mycology: 14.

Mycorrhizal infection of orchid seedlings in the laboratory.

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Yoder JA, Zettler LW, Stewart SL (2000) Water requirements of

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Cuadro 1. Formulación de medios de cultivo,

empleados en el cultivo in vitro de orquídeas Figura 1. Cápsulas maduras

Figura 2. Extracción de semillas y deshidratación en sílica gel

Figura 3. Siembra a partir de cápsulas verdes Figura 4. Esterilización de semillas secas

Figura 5. Plántulas con presencia de hojas y raíces suficien-tes para iniciar el proceso de aclimatización

Figura 6. Charola plástica con perforaciones

Figura 7. Tepetzil después de cribarlo se separa por tama-ños

Figura 8. Cobertura de charolas con domos plásticos para evitar la desecación

Figura 9. Plántulas establecidas sobre diferentes sustratos

Índice de Cuadros y Figuras

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Germinación in vitro de Semillas y Desarrollo de Plántulas de Orquídeas Silvestres de Tabasco se

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