Las Columnas Empacadas (con partículas) La Clásica HPLC

(1)

(2)

Hoy en día, el análisis de muestras se ha

incrementado y las exigencias la productividad de los laboratorios son cada vez mayores; sin embargo

existen muchos factores que limitan el desarrollo:

Las Columnas Empacadas (con partículas)

La Clásica HPLC

(3)

Limitaciones de las Columnas Empacadas

Las Columnas corrientes de HPLC estan constituidas por

partículas muy pequeñas, (usualmente de Sílica) empacadas en un tubo de acero, provocando

• Alta presión del sistema cuando el flujo es incrementado

• Las limitaciones en el flujo provocan unas limitaciones en las longitudes de las columnas y por ende en el mismo desarrollo de los métodos.

• Los tiempos de equilibrio y lavado de las columnas altos

• Dentro de las columnas se pueden formar Volumenes Muertos los cuales pueden provocar reduccíones en la confiabilidad y reproducibilidad de los análisis

• La alta presión reduce la vida de las columnas y provoca además un gran

desgate de los sellos y el mismo equippo HPLC.

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Superando estas limitaciones Merck KGaA ha

desarrollado y patentado las Varillas Monolíticas de Sílica altamente porosas

Chromolith™

(5)

¿Porqué este nombre?

(6)

¿Cómo son?

Varillas de Sílica Monolitica Revestimiento conel polimero PEEK

(7)

Inicio Fase de Separación y Gelificación

Maduración Secado

Revestimiento AnálisisHPLC

Preparación

Si(OAlk)

₄

Polimero

H

⁺

(8)

Estructura porosa interna

Macroporos: 2 µµm Mesoporos: 13 nm

Totalmente porosa > 81% (65 - 70% para las columnas clasicas de particulas )

Vista de un corte de la varilla de silica

(9)

LiChrosorb

^®

LiChrospher

^®

Superspher

^®

Purospher

^®

Purospher

^®

STAR

Esféricas Irregular

Chromolith

^®

Monolitica

Las Edades de la Cromatografía

(10)

0 50 100 150 200 250

0 2 4 6 8

Rata de flujo (mL/ min)

Presión del sistema (bar)

^Chromolith

TM Performance

Column X: 3.5µµm Column S: 3.5µµm Column Z: 3.5µµm Column X: 5µµm Column S: 5µµm Column Z: 5µµm

p/u curva de Chromolith

^TM

Vs columnas HPLC particuladas

Análisis de la presión en las

Columnas

(11)

0,00 10,00 20,00 30,00

0 2 4 6 8

Flow rate (mL/ min)

Plate heigth H ( µ m)

Chromolith^TM Performance

Column X: 3.5µµm Column S: 3.5µµm Column Z: 3.5µµm Column X: 5µµm Column S: 5µµm Column Z: 5µµm

H/u curva de Chromolith

^TM

Vs columnas HPLC particuladas

Eficiencia en la separación

(12)

3 pasos en el desarrollo

1. Síntesis de las varillas de sílica monolitica

2. Modificación Superficial (C

₁₈

y capped)

3. Revestimiento

(13)

1. Síntesis de las Varillas de sílica monolitica

- Definición de la dimensión, 4.6mm i.d.

- Definición de la estructura de poros bimodal - Solidez estructural

3 pasos en el desarrollo

(14)

2. Modificación Superficial (C

₁₈

end capped)

- Suficiente recubrimiento superficial - En batches o in situ

3 pasos en el desarrollo

(15)

3. Revestimiento

- Libre de volúmenes muertos

- Resistente mecanica y químicamente

3 pasos en el desarrollo

(16)

0 7 14 min

1 2

3 4

5

6 7 8

9 Chromolith

^TM

Performance (100-4.6mm)

Batch 5 Batch 4 Batch 3 Batch 2 Batch 1

Selectividad de 5 columnas

Reproducibilidad

batch a batch

(17)

Alfa

1,800 1,850 1,900 1,950 2,000 2,050 2,100 2,150 2,200 2,250 2,300

UM0002 UM0006 UM0008 UM0010 UM0012 UM0014 UM0017 UM0020 UM0022 UM0024

Reproducibilidad

batch a batch

(18)

¿Qué significa esto para un cromatografista?

La tecnología de la Chromolith™

En la práctica

• “Sílica Monolítica”

• “Estructura porosa bimodal”

• “La mejor separación”

(19)

Rapidez y Calidad en sus análisis

1 mL/min - 17 bar

5 mL/min - 85 bar 5 1

2

4 3

9 mL/min - 153 bar

Chromolith™ Performance RP-18e 100 mm x 4.6 mm

ß-blockers

(20)

1 mL/min - 17 bar

5 mL/min - 85 bar

9 mL/min - 153 bar 5

1 2

4 3

1 2

3 4 5

9 mL/min - 153 bar 12

0.0

1.5

Rapidez y Calidad en sus

análisis

(21)

1 mL/min - 17 bar

5 mL/min - 85 bar 5 1

2

4 3

9 mL/min - 153 bar

12 Gran ahorro en el tiempo de

análisis 9 min

1 min

Rapidez y Calidad en sus

análisis

(22)

Mayor Productividad

Aumento en el número de analisis por día en cada sistema HPLC

Classical 20 Chromolith™ 180

Incremento en

Productividad

para

Laboratorios de Control y Desarrollo en:

Industrias Farmaceuticas, de alimentos,

de análisis ambiental, ...

(23)

Nuevos desafíos para la HPLC

0-2 min 2 mL/min

Gradiente de flujo

Chromolith™ Performance RP-18e 100 mm x 4.6 mm

Fenoles

2-3 min 2-5 mL/min

3-6 min 5 mL/min

(24)

Flow Gradient Nuevos desafíos para la

HPLC

Nuevos desafíos

para la HPLC

(25)

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

Particulate Competitor X (5 µm, 250 mm) Particulate Competitor Z (5 µm, 250 mm) Particulate Competitor L (5 µm, 250 mm)

Número de Platos N

Antraceno

Max. back pressure:

150 bar

Min. back pressure:

210 bar

Columna

16000 17500 18500

41000

Chromolith™ Performance 5x

(26)

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000

0 200 400 600 800 1000 1200

B e n z e n e T o l u e n e

E t h y l b e n z e n e P r o p y l b e n z e n e B u t y l b e n z e n e P e n t y l b e n z e n e

Longitud de la Columna (mm) Número de platos

N/

columna

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

(27)

3

2

4

5

6 7

2

1

0 4

3 2 4

5 6 7

20

1

0 40 min

1. tiourea, 2. benzeno, 3. tolueno, 4. etil-, 5. propil-, 6. butil-, 7. pentilbenzeno N: 11 000

p: 13 bar

N: 81 000 p: 85 bar

Chromolith

^TM

Performance, 100-4.6mm

1x 10 x = 1 meter

ACN/ Agua (80/ 20; v/v), 1mL/ min

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

(28)

Chromolith

^TM

Performance, 100-4.6mm

1 m

ACN/ water (80/ 20; v/v)

3 2 4

5 6 7

1 0 10 20

3 2 4

5 6 7

10

1 0 20 min

2 mL/ min 1 mL/ min

N: 41 000 p: 45 bar N: 76 000

p: 170 bar

0,5 m

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

1. tiourea, 2. benzeno, 3. tolueno, 4. etil-, 5. propil-, 6. butil-, 7. pentilbenzeno

(29)

1 metro Chromolith

^TM

Performance columnas

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

(30)

30 0 60 min

3

5

6

1 2

7

4

14 x Chromolith

^TM

Performance 100-4.6mm = 1.4 meter

108 000 N/column !!!

117 bar

ACN/ water (80/ 20; v/v)

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

1. tiourea, 2. benzeno, 3. tolueno, 4. etil-, 5. propil-, 6. butil-, 7. pentilbenzeno

(31)

Separaciones Desafiantes

10 000 N

41 000 N

100 mm

500 mm

Aumento en la

Eficiencia de las Columnas

(32)

1 2

4

3

5

6

7

8

9

Selectividad

1. Thiourea 2. Aniline 3. Phenol

4. 2,3 - Dihydroxynaphthalene 5. 4 - Ethylaniline

6. Diethylphthalate

7. N, N - Dimethylaniline 8. Toluene

9. Ethylbenzene

Chromatographic Conditions:

Column:

Chromolith Performance RP18e 4.6 mm x 100 mm

Mobile Phase:

Methanol/Water 55/45 (v/v)

Flow rate:

1.0 mL/min

Temperature:

ambient

Detection:

UV 254nm

Basic

Acidic

Metall chelating Neutral t₀

(33)

Chromolith Performance RP-18e

Purospher RP-18e, 5 µm

0 1

12 24 min

2 3

4

5

6

7 8

9 12

4

3

5 6

7 8

9

0 7 14 min

Selectividad

(34)

Certificado de Análisis

Equilibrio de la columna Validación de la Eficiencia Instalación de la columna

Dirección del flujo

Grupo de Muestras

Almacenada en fase móvil ACN/Agua

Column Cuidados

PEEK

pH: 2.0 - 7.5

No trabajar en 100% de fase movil de: tetrahidrofurano, dimetilsulfoxido, o diclorometano

presión: 200 bar

temperatura: 45°C, para la fase móvil

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