Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada RegiónXalapa
Maestría en Ciencias en Biotecnología y Ecología
Tratamientos postenerales para mejorar la competitividad sexual de Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae)
Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biotecnología y Ecología
Presenta:
Ricardo Macías Díaz del Castillo Directora:
Diana Folger Pérez Staples Codirector:
José Salvador Meza Hernández Octubre de 2022
“Lis de Veracruz: Arte, Ciencia, Luz”
Universidad Veracruzana
Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada Región Xalapa
Maestría en Ciencias en Biotecnología y Ecología
Tratamientos postenerales para mejorar la competitividad sexual de Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae)
Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias en Biotecnología y Ecología Presenta:
Ricardo Macías Díaz del castillo Directora:
Diana Folger Pérez Staples Codirector:
José Salvador Meza Hernández Comité tutoral:
Juan Carlos Noa Carrazana Comité tutoral:
Maurilio López Ortega
Universidad Veracruzana Dirección General de Investigaciones Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada
Coordinación de Posgrado
Maestría en Ciencias en Ecología y Biotecnología
ECOBIOT-ACI
Agradecimientos y Créditos Institucionales
El presente trabajo se realizó bajo la dirección de la Dra. Diana F. Pérez Staples dentro de la Línea de Generación y Aplicación del Conocimiento: LGAC 2:
Ecología y Manejo de la Biodiversidad: de genes a ecosistemas, pertenecientes a el(los) Cuerpo(s) Académico(s): Clave “34194” Nombre Ecología y
comportamiento animal registrados en el Instituto de Biotecnología y Ecología aplicada de la Universidad Veracruzan a en Xalapa, Veracruz.
El trabajo de Maestría se desarrolló dentro del proyecto: IAEA Research Contract No: 23735, Sperm Traps: Assessment of Female Mating Status to Increase Monitoring Efficiency in the Sterile Insect Technique, Aprobado por el fondo OIEA mismo al que se le agradece su apoyo.
Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por su apoyo al estudiante con una beca académica bajo el No de becario 94544.
Se agradece al programa de posgrado Maestría en Ciencias en Ecología y
Biotecnología, siendo el Coordinador la Dra. Ana Dorantes Acosta y al Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada siendo director el Dr. Antonio Andrade Torres.
Xalapa de Enríquez, Veracruz, a 09 de octubre de 2022.
Dedicatoria y agradecimientos
Dedicada a mis padres Carlos Alberto Macías Cameth y María de Lourdes Díaz del Castillo Domínguez, a mi hermano Alejandro Macías Díaz del Castillo y también a mis demás familiares, le agradezco a ellos y también a mi directora de tesis Diana Pérez Staples, a los miembros de mi comité tutoral José Salvador Meza Hernández, Juan Carlos Noa Carrazana y Maurilio López Ortega. También le agradezco a mis maestros, compañeros y amigos por todo el apoyo que me brindaron durante la maestría.
Índice
Dedicatoria y agradecimientos ... 1
Índice ... 3
Resumen ... 3
Introducción ... 4
Estado del arte ... 7
Tratamientos postenerales ... 7
Metformina ... 8
Aceites esenciales ... 10
Capítulo I: Efecto de la metformina en el tamaño de los testículos y transferencia espermática de Anastrepa ludens cepa Tapachula-7 ... 15
Introducción ... 15
Materiales y métodos ... 15
Material biológico ... 15
Manejo del material biológico previo al establecimiento del experimento... 16
Establecimiento del experimento con metformina ... 16
Variables de respuesta ... 17
Transferencia espermática ... 17
Tamaño de los testículos ... 18
Análisis estadístico ... 18
Resultados ... 19
Discusión ... 21
Conclusiones ... 22
3. Capítulo II... 23
Discusión general ... 43
Conclusiones generales ... 44
Recomendaciones ... 45
Referencias ... 46
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Resumen
La Mosca Mexicana de la fruta Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae). es una de las plagas más importantes para los cultivos de Citrus spp, mango y en ocasiones durazno. Para su control se utiliza la Técnica del Insecto Estéril (TIE) que es un método que consiste en producir masivamente insectos estériles y liberarlos en el campo, para copular con insectos silvestres. La esterilización y la selección artificial no dirigida tiene un efecto negativo en el desempeño sexual de los insectos estériles por lo que se requiere de hacerlos más competitivos. En este trabajo se evaluó el efecto de la metformina y aceites de cítricos en el comportamiento sexual (órganos reproductivos) en machos adultos estériles de la cepa Tapachula-7 de A. ludens Esto con la finalidad de su posible uso como tratamientos postenerales de los insectos estériles para incrementar la eficiencia de la TIE. Para dilucidar la influencia de la metformina en la dieta se registró transferencia espermática y tamaño de los testículos. Los aceites comerciales de cítricos se aplicaron vía aromaterapia durante 4 horas en el quinto día después de la emergencia y en la dieta durante 1, 5 y 10 días, para evaluar su efecto en la probabilidad y latencia de cópula y en el tamaño de los testículos. La metformina no tuvo ningún efecto significativo en el tamaño de los testículos o la transferencia espermática de A. ludens. Los machos estériles Tapachula-7 tratados con aceites esenciales de naranja dulce (Citrus sinensis) y toronja (Citrus paradisi) con aromaterapia presentaron una probabilidad de cópula similar. En cambio, el aceite de naranja dulce (C.
sinensis) aplicado en la dieta durante 5 días los machos estériles Tapachula-7 se aparearon más rápido y tuvieron testículos más grandes. También, el aceite de toronja (C. paradisi) a concentraciones de 0.1% y 0.5% aplicado durante 1 día Tuvo una influencia negativa en la probabilidad de cópula. Los resultados sugieren estudios de aceite de naranja dulce (C.
sinensis) con adultos de la cepa Tapachula-7 para su uso con la TIE.
Palabras clave: Técnica del insecto estéril, Díptera, Tephritidae.
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Introducción
La mosca mexicana de la fruta Anastrepha ludens (Loew), es una de las plagas más importantes para algunos cultivos, principalmente para los cítricos y los mangos (Aluja, 1993). Esta especie de mosca pertenece a la familia Tephritidae que se caracteriza por su particular ciclo de vida donde las hembras depositan sus huevos dentro de algún fruto antes de su maduración. Así las larvas se alimentan de él. La presencia de larvas causa importantes pérdidas económicas para los agricultores ya que los frutos infestados no pueden comercializarse (Vilatuña et al. 2010).
Actualmente existen varios métodos efectivos para controlar esta plaga, entre los cuales se encuentran el control biológico y el control autocida la Técnica del Insecto Estéril (TIE), Esta técnica requiere un estudio especial de la biología reproductiva de los insectos.
La TIE consiste en criar al insecto plaga de forma masiva para luego esterilizar a los machos y liberarlos en el área donde se encuentra la plaga, estos competirán con los machos silvestres por aparear a las hembras reduciendo de esta forma la población (Knipling, 1955).
La TIE tiene varias ventajas para controlar poblaciones silvestres de insectos plaga, entre las cuales están; ser amigable para el ambiente, el ser específica para una especie, no transfiere agentes tóxicos a la zona y no daña organismos benéficos, aunque también tiene algunas desventajas. Por ejemplo, una de las principales desventajas es que la cría artificial induce selección artificial no dirigida y provoca, a través de las generaciones, que los individuos de laboratorio sean menos competitivos que los silvestres (Meza et al. 2014). Otro factor dentro de la TIE que afecta la competitividad sexual de los machos es el proceso de esterilización por medio de rayos gamma. Esta podría ser una desventaja mayor que la cría masiva dependiendo de la dosis de irradiación a la que se sometieron los insectos (Gallardo- Ortiz et al. 2018, Abraham et al. 2020). Los machos de la cepa genéticamente sexada Tapachula 7, una cepa mutante que permite la separación de machos y hembras durante la fase de pupa, presentaron desventaja frente a los machos silvestres en aspectos relacionados con la competencia sexual y la cantidad de esperma almacenado por la hembra después de la cópula (Contreras-Navarro et al. 2020). Esto nos indica que la desventaja de la cría masiva aunado a la irradiación persiste en diferentes cepas y especies criadas en la TIE.
Para intentar reducir esta desventaja se han propuesto y/o implementado múltiples métodos que pretenden incrementar el desempeño sexual de los machos de laboratorio,
5 aumentando la cantidad de cópulas. Estos métodos son conocidos como tratamientos postenerales. En estos, el uso de proteína hidrolizada en la dieta de los adultos, además de análogos de la hormona juvenil, como el metopreno para acelerar su madurez sexual (Pereira et al. 2011, Reyes-Hernández et al. 2021). Aunque varios de estos métodos, como el uso de estímulos basados en químicos derivados de plantas son efectivos en favorecer el desempeño sexual de los machos, aún no logran igualar y mucho menos superar, a los machos silvestres (Segura et al. 2018). Actualmente, a los machos Tapachula-7 se les administra solo levadura hidrolizada enzimática en una proporción de 1:24 antes de ser liberados (Liedo et al. 2013).
En este sentido, se sigue en la búsqueda de tratamiento postenerales. El uso de aceites esenciales o metformina puede ser un tratamiento interesante para incrementar la competitividad sexual. La metformina es un fármaco utilizado comúnmente en el tratamiento de la diabetes tipo 2. Durante muchos años, el blanco molecular de la metformina era desconocido, a pesar de que ya tenía décadas siendo recetado como el principal tratamiento para esta clase de diabetes. Sin embargo, se ha reportado que la activación de la proteincinasa activada por la Adenosin Monofosfato (AMPK) estaba asociada estrechamente con los múltiples efectos de la metformina (Zhou et al. 2001).
En los últimos años se han encontrado múltiples beneficios de la metformina en la salud reproductiva de hombres con síndrome metabólico y ratas con obesidad (Morgante et al. 2011, Yan et al. 2015). En ambos casos los tratamientos con metformina incrementaron el número y la motilidad espermática y redujeron las malformaciones en la cabeza de los espermatozoides, además en el caso de las ratas disminuyeron la apoptósis en los testículos causada por las dietas altas en grasas (Yan et al. 2015). En dípteros se utilizó a Drosophila como modelo para evaluar los efectos de la metformina a nivel genético en el tratamiento del síndrome de la x frágil, un trastorno neurológico del desarrollo que se caracteriza por una baja inteligencia, trastornos del sueño y autismo en humanos, demostrando que la metformina tiene un efecto benéfico en las células productoras de insulina en el cerebro de estos insectos (Monyak et al. 2016). Además de esto, la metformina también reduce la autofagia de las células madre intestinales provocada por la edad, lo que incrementa la esperanza de vida de estas moscas (Hyun-Jin et al. 2018).
En cuanto a los aceites esenciales se han reportado efectos positivos en el comportamiento sexual de otras especies como Ceratitis capitata, también se han reportado
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efectos positivos en el comportamiento sexual de A. ludens (Shelly et al. 2004, Kouloussis et al. 2013, Espinal-Pérez. 2021, Morató et al. 2015). Sin embargo, en los pocos estudios que existen hasta ahora no se han evaluado con una metodología compatible con la TIE, tampoco han sido evaluados aceites comerciales para poder determinar si existe una diferencia en el efecto de aceites extraídos directamente en el laboratorio y aceites comerciales extraídos de una forma más industrial.
Con base en lo anterior, podemos considerar a la metformina y los aceites de cítricos como posibles tratamientos postenerales potenciales para su aplicación en la TIE, ya que esta técnica busca apoyar a los machos irradiados para competir con los machos silvestres por las hembras. Si bien la evidencia documentada con ratas y humanos es prometedora, aún no se ha dilucidado el efecto de la metformina en la salud reproductiva de los dípteros. En la presente tesis de maestría en ciencias, se estudió la salud reproductiva de machos de A. ludens al evaluar parámetros clave del comportamiento sexual registrando el tamaño de testículos y cantidad de esperma eyaculado, latencia a la cópula y frecuencia de cópulas en machos estériles de la cepa Tapachula-7. Estos parámetros también podrían resultar ventajosas para la selección sexual poscopulatoria para la TIE.
7 Estado del arte
Anastrepha ludens es también conocida como la mosca mexicana de la fruta, es un díptero perteneciente a la familia Tephritidae. Muchas especies del género Anastrepha se consideran de las plagas importantes para la agricultura en México (SARH. 1991). Las hembras de esta especie depositan sus huevos en frutos inmaduros, afectando de manera considerable a la industria agrícola ya que daña los frutos antes de que estos puedan ser cosechados, provocando grandes pérdidas económicas para los productores (Birke et al. 2013) y genera la necesidad de controlar las poblaciones de estos insectos.
Existe todo un manejo integrado de plagas para controlar a las moscas de la fruta entre los cuales se encuentra la Técnica del Insecto Estéril (TIE), que entre todos ha demostrado ser a lo largo de los años la más efectiva (Pereira et al. 2011). Esta consiste en criar de forma masiva individuos de la misma especie que se busca controlar, para luego esterilizarlos y liberarlos en el campo, al copular con los individuos silvestres generan esterilidad en ellos y reducen las poblaciones (Knipling 1955). Las moscas estériles antes de ser liberadas en el campo pasan un tiempo breve en lugares especiales llamados centros de empaque donde las pupas emergen y las moscas son alimentadas y resguardadas hasta que puedan ser liberadas en el campo. En el caso de A. ludens estas permanecen 5 días en los centros de empaque (Zavala et al. 2020).
Tratamientos postenerales
Los tratamientos postenerales son tratamientos que se aplican durante los días que las moscas pasan en el centro de empaque. Tienen el propósito de beneficiar a los insectos estériles al ser liberados en el campo para que sean más efectivos en conseguir cópulas y transmitir un eyaculado a las hembras silvestres. Se buscan tratamientos que se puedan aplicar de forma simultánea a la mayor cantidad de adultos posibles, generalmente aplicando tratamientos por medio de la dieta o aromaterapias. El tratamiento posteneral más común es la dieta adicionada con proteína de levadura hidrolizadas enzimáticamente ya que las dietas altas en proteína benefician el desarrollo sexual de varias especies de moscas de la fruta (Liedo et al. 2013).
Específicamente para A. ludens, se utiliza una proporción de 24 partes de azúcar (sacarosa)
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por una parte de proteína porque esta es la concentración que demostró mejorar el desempeño sexual de las moscas afectando lo menos posible a la supervivencia de estas (Liedo et al.
2013).
Metformina
Otro posible tratamiento posteneral podría ser la metformina (dimetilbiguanida). Su historia está ligada a Galega officinalis L. (Fabaceae) (también conocida como ruda de cabra), una medicina herbal tradicional en Europa, rica en guanidina, que en 1918 fue demostrado que reduce la glucosa en la sangre (Watanabe 1918). La metformina fue redescubierta en la búsqueda de agentes antipalúdicos en la década de 1940 y, durante las pruebas clínicas, demostró ser útil para tratar la influenza. Esta propiedad fue investigada por el médico francés Jean Sterne, quien informó por primera vez sobre el uso de metformina para tratar diabetes en 1957. Sin embargo, la metformina recibió una atención limitada ya que era menos potente que otros hipoglucemiantes biguanidas (fenformina y buformina), que generalmente eran descontinuado a fines de la década de 1970 debido al alto riesgo de acidosis láctica (Sterne 1957).
Los efectos de la metformina se evaluaron en la salud reproductiva de pacientes con síndrome metabólico. Los pacientes utilizaron este fármaco durante 6 meses y al final del tratamiento se pudo observar un incremento en la cantidad de esperma por eyaculado, además de la cantidad de espermatozoides móviles, la disminución de malformaciones en la cabeza y un incremento en los andrógenos.
La metformina también demostró disminuir el peso corporal e incrementar el peso de los testículos en ratas con una dieta alta en grasas (high fat diet HFD) (Yan et al. 2015). El peso corporal y la ganancia de peso corporal fueron significativamente mayores en las ratas HFD, mientras que el peso y los coeficientes de los testículos fueron menores. En ratas con HFD, el tratamiento con metformina indujo la pérdida de peso y aumentó peso testicular. En ratas HFD, los cambios en el tejido testicular se caracterizaron por pequeños, túbulos seminíferos atróficos y distorsionados y membrana basal destruida. El tratamiento con metformina demostró tener un efecto protector contra la disminución inducida por HFD en el número de espermatogonias, células de Sertoli y células de Leydig, aumentos inducidos por HFD en glucosa sérica, insulina, leptina y estrógeno; y disminución de la testosterona
9 sérica y reducción de la tasa de apoptosis de células testiculares en ratas macho obesas.
Finalmente, la metformina mejoró significativamente los parámetros del semen (incluyendo concentración, viabilidad, motilidad y morfología normal) (Yan et al. 2015).
Otro estudio interesante ha demostrado que el medicamento biguanida, metformina, que se usa comúnmente para tratar la diabetes tipo 2, prolonga la vida útil y reduce fecundidad en el nemátodo Caenorhabditis elegans (Nematoda : Rhabditidae) a través de un mecanismo de restricción dietética a través de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) y la quinasa activadora de AMPK, LKB1 (Zhou et al., 2001). En Drosophila melanogaster se demostró que mientras se alimenta con metformina a los adultos se produce una activación robusta de AMPK y reservas de lípidos reducidas, sin embargo, no alarga la vida del adulto (Lauzon y Potter 2012). De hecho, cuando se administra en altas concentraciones, la metformina es tóxica para las moscas. Los análisis de la fisiología intestinal sugieren que estos efectos pueden resultar de alteraciones en la homeostasis del líquido intestinal. Por tanto, la metformina parece tener efectos conservados evolutivamente sobre el metabolismo, pero no sobre la esperanza de vida en esta especie de mosca (Lauzon y Potter 2012). En A.
ludens se ha demostrado que la metformina reduce el impacto negativo que tienen los tratamientos con metopreno en la supervivencia de machos y hembras, estos tratamientos con metopreno aceleran la madurez sexual de los machos de esta especie, pero con la desventaja de reducir la supervivencia de forma considerable (Aceves-Aparicio et al. 2021). La adición de metformina en una concentración de 0.19g por cada 10g de alimento detuvo los efectos negativos del metopreno en la supervivencia.
El uso reciente de la metformina en A. ludens, junto con los resultados de la metformina en la transferencia espermática y tamaño de los testículos, encontrados principalmente en ratas, nos llevan a estudiar si este fármaco pudiera mejorar el eyaculado, e incrementar el tamaño de los testículos de los machos de A. ludens. En varias especies de moscas de la fruta se ha demostrado que la esterilidad y la selección artificial reduce la cantidad de espermatozoides que los machos transfieren a las hembras, los machos silvestres transfieren más del triple de esperma que los machos de cría masiva, esta diferencia incrementa aún más con machos irradiados (Seo et al. 1990, Contreras-Navarro et al. 2020).
El esperma de los machos estériles debe tener mutaciones dominantes, pero no por eso se busca que los machos transfieran poco esperma ya que la receptividad sexual de la hembra
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depende de recibir un eyaculado completo, es decir con esperma y fluido seminal (sustancias de los órganos reproductivos) (Abraham et al. 2016). Además, el tamaño de los testículos en los machos de A. ludens está relacionado con el comportamiento de apareamiento (Dickens et al. 1982). Por lo tanto, es importante estudiar tratamientos postenerales que puedan mejorar tanto la fisiología reproductiva del macho, como su comportamiento sexual.
Aceites esenciales
Existen otros tratamientos que pueden ser administrados de forma simultánea a los tratamientos con proteína y que también han demostrado tener un beneficio para la TIE, como los tratamientos de aromaterapia (Segura et al 2018). Principalmente en C. capitata, los estudios demuestran que la exposición de las moscas al aceite de cítricos y de jengibre (α- copaeno) incrementan la competitividad sexual de los machos (Kouloussis et al. 2013).
Mientras que en especies de los géneros Bactrocera y Zeugodacus se ha observado que los machos se ven atraídos a los compuestos producidos por sus hospederos y son capaces de ingerirlos para incorporarlos en su feromona y de esta forma obtener una ventaja al atraer a las hembras (Segura et al. 2018). En A. ludens se han probado diversos tipos de aromaterapia como aceite de pomelo (Citrus paradisi) y aceite de naranja dulce (Citrus sinensis) con base en los resultados con otras especies y los hospederos comunes de esta, pero, solo el aceite de pomelo ha tenido un efecto positivo en el comportamiento sexual, incrementando la cantidad de apareamientos de los machos (Morató et al. 2015). Sin embargo, en dicho artículo se probó la aromaterapia con machos silvestres y administrándolo a los 11-18 días de emergencia por 4 horas solo 24 horas antes de la cópula, lo cual no se puede aplicar en la TIE. En la siguiente tabla se puede apreciar un resumen del efecto de los aceites esenciales en el comportamiento sexual de algunas especies de tefrítidos.
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Tabla 1: Diferentes efectos de la aromaterapia reportados en tefrítidos Cita Especie y
cepa
Aceite Concentración Administración Resultados
Shelly et al.
2004
Ceratitis capitata (Vienna- 7/Tol-99)
Jengibre 0.0625, 0.25, 0.5, 1.0, y 2.0 mL
Exposición durante 24 horas 3 días después de la emergencia
Incremento en el porcentaje de cópulas con concentración de 0.5 ml,
resultados similares para 0.1 y 0.25 Shelly et al.
2008
Ceratitis capitata
Jengibre Naranja
36 mL repartidos en 4 sitios de un trailer de 132 m3
Exposición durante 24 horas 3 días después de la emergencia
-Sin diferencia significativa entre ambos aceites -Ambos aceites aumentaron las cópulas en comparación con el control Espinal-
Pérez et al.
2021(tesis)
Anastrepha ludens
Citrus aurantium y citrus sinensis
Aromaterapia:
50 microlitros por 24 horas Dieta: 0.1 y 0.5% p/p en dieta
Aromaterapia:
expuestos por 24 horas a una edad de 9 días Dieta:1 g de comida al día desde la emergencia
-Sin diferencias significativas en número de cópulas -Diferencia significativa en número de cópulas para naranja agria madura al 0.1%
y naranja dulce
¾ a 0.5% en dieta Briceño et
al. 2014
Ceratitis capitata de cría masiva y hembras silvestres
Jengibre 20 microlitros en recipientes de 5 L
Exposición durante 7 horas a los 5 – 10 días de emergencia
-Las hembras aceptaban más a los machos tratados con aromaterapia que a los machos control (posible efecto de las feromonas) Paranhos et
al. 2010
Ceratitis capitata tsl- VIENNA-8 y hembras silvestres
Jengibre 0.1, 0.25, 0.5 y 0.75 ml/m3
Exposición durante 20 horas, de 4 a 5 días después de la emergencia
Mejores resultados con 0.1 ml/m3 en competitividad e índice de esterilidad Morató et
al. 2015
Anastrepha ludens de cría masiva y silvestres
-Citrus arantium -Citrus paradisi
25 microlitros en recipientes de 400 ml
Exposición durante 4 horas a los 11-18 días de emergencia
Mayor número de cópulas en machos silvestres expuestos a toronja (C.
paradisi) Kouloussis
et al. 2017
Ceratitis capitata vienna 8
Naranja y limoneno
25 microlitros en cajas de 15 x 15 x 15
Expuestos por 48 horas en el 4 y 5 días
Incremento en la señalización del macho
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Morelli et al. 2010
Ceratitis capitata silvestres irradiadas
Jengibre 0.1 ml/m3 Exposición durante 20 horas 4 días después de la emergencia
Reduce reapareamiento en las hembras
Bachmann et al. (2015)
Anastrepha fraterculus
Guayaba 50 gramos de fruta sin acceso a la pulpa
Expuestas desde la emergencia hasta 24 horas antes de los experimentos
Las moscas expuestas tuvieron un mayor éxito reproductivo que las moscas no expuestas Vera et al.
2013
Anastrepha fraterculus silvestres y de cría masiva
Guayaba, mango y limón
Fruta completa Expuestos por 1, 5, 10 y 15 días con la fruta a una distancia de 1- 3 cm
Incremento en el número de cópulas en machos silvestres a los 15 días de exposición a la guayaba Flores et al.
2011
Anastrepha ludens Anastrepha obliqua Anastrepha serpentina
Jengibre 2 microlitros Moscas de 6, 9 y 12 días de edad después de la emergencia, expuestas por 24 horas antes de la
evaluación
A. ludens: menos cópulas que el control a los 6 días
A. obliqua: sin efecto A. serpentina:
más cópulas que el control a los 12 días McInnis et
al. 2002
Ceratitis capitata silvestres y maui-93 irradiadas y no irradiadas
Jengibre 20 microlitros en un papel de 1 cm2 (0.4% a- copaeno)
Moscas sexualmente maduras expuestas por 5 horas 24 horas antes de la observación
Incremento en el número de cópulas de la cepa maui-93 con respecto a las moscas silvestres Shelly y
Epsky 2015
Ceratitis capitata silvestres y Vienna-7 / Tol-99
Aceite de árbol de té (Melaleuca alternifolia)
200 microlitros de aceite puro y disuelto con hexano al 50%
y al 5%
Expuestos por una hora un día antes del ensayo de 8 a 12 días después de la
emergencia
Incremento de cópulas en relación a los machos control (sin efecto después de 5 días, menos cópulas que los machos silvestres) Kouloussis
et al. 2013
Ceratitis capitata cepa VIENNA-8 tsl y hembras silvestres
Aceites esenciales comerciales de naranja amarga, toronja, mandarina y limón
12.5 y 25 microlitros
Moscas de 14 a 16 días expuestas durante 24 horas y evaluadas 12 horas después
Aumento en el éxito de apareamiento con respecto al control sin aceites.
13 En el caso de A. fraterculus se estudiaron los efectos de los frutos completos de guayaba y estos pudieron incrementar el éxito de apareamiento de los machos (Vera et al. 2013). Sin embargo, en otras especies se ha visto que no es necesario utilizar todo el fruto y basta con exponer a los machos a ciertos compuestos que este libera, como es el caso del limoneno, un compuesto presente en diversos cítricos y en la raíz de jengibre el cuál ha demostrado incrementar la señalización de los machos de C. capitata (Kouloussis et al. 2017).
Como se puede apreciar en la columna de “Administración” en la Tabla 1, la mayoría de estos estudios aplicaron los tratamientos con aromaterapia 24 horas antes de la cópula. En A.
ludens esto no es compatible con la TIE debido a que esta especie alcanza la madurez reproductiva aproximadamente a los 9 días después de la emergencia y dentro de la TIE los machos son liberados cuando cumplen apenas 5 días de emergencia (Orozco-Dávila et al.
2017). Por lo que se necesita conocer el efecto que estos aceites tienen en machos estériles cuando se aplican durante un máximo de 5 días.
En cuanto a los aceites esenciales aplicados en la dieta, se ha demostrado que los aceites de naranja dulce madura (C. sinensis) y de naranja agria (C. aurantium) incrementan el número de cópulas de machos estériles de A. ludens de la cepa Tapachula-7 cuando se les aplica directamente en el alimento desde la emergencia hasta el momento de evaluar las cópulas a los 10 días (Espinal-Pérez. 2021). Estos resultados tampoco son compatibles con la TIE debido al largo periodo en el que este tratamiento fue aplicado, se necesita también evaluar el efecto de estos aceites cuando son aplicados por un máximo de 5 días, tiempo en que las moscas permanecen dentro de los centros de empaque antes de ser liberadas (Orozco-Dávila et al. 2017). Es importante mencionar que algunos compuestos extraídos de los cítricos también podrían generar una desventaja en las moscas, como fue el caso de las hembras de C. capitata alimentadas con 5,7-dimetoxicumarina y linalool extraídos de cáscaras de limón (Citrus limon), en este caso el tratamiento resultó ser tóxico y afectó la capacidad de oviposición de las hembras (Salvatore et al. 2004)
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Pregunta de investigación
¿Los tratamientos postenerales a base de Metformina o aceites esenciales afectan la biología reproductiva de machos estériles de A. ludens?
Hipótesis
Si durante la etapa de maduración sexual se requieren nutrientes y estímulos específicos para mejorar el desarrollo de las gónadas de los machos, entonces, los tratamientos postenerales mejorarán la fisiología reproductiva y competitividad sexual en A. ludens.
Objetivo general
Evaluar el efecto de tratamientos postenerales con metformina y aceites de cítricos en el eyaculado y competitividad sexual precopulatoria de machos adultos estériles de la cepa Tapachula-7 de Anastrepha ludens.
Objetivos específicos
Determinar si la metformina tiene una influencia en el tamaño de los testículos y transferencia espermática de machos estériles de la cepa Tapachula-7 de Anastrepha ludens.
Evaluar si el aceite de naranja dulce (Citrus sinensis) y toronja (Citrus paradisi) aplicado vía aromaterapia y en la dieta incrementa la competitividad sexual de machos estériles de la cepa Tapachula-7 de Anastrepha ludens.
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Capítulo I: Efecto de la metformina en el tamaño de los testículos y transferencia espermática de Anastrepa ludens cepa Tapachula-7
Introducción
Los efectos de la metformina en los órganos reproductivos de los machos de otras especies sugieren que este fármaco podría reducir la desventaja sexual que los machos estériles de laboratorio tienen frente a los machos silvestres. Para evaluar estos efectos se administró un tratamiento con metformina (0.19g por cada 10g de alimento) y se comparó la transferencia espermática y el tamaño de los testículos de las moscas tratadas con moscas control sin ningún tratamiento (alimentadas únicamente con azúcar). Además del tratamiento con metformina también se comparó un tratamiento con proteína hidrolizada enzimática en una proporción con azúcar de 1:24 (tratamiento posteneral que se utiliza actualmente en la TIE) y una combinación de ambos tratamientos (metformina y proteína) de esta forma se pudo comparar el tratamiento de metformina con el tratamiento actualmente utilizado
Materiales y métodos
Material biológico de A. ludens de Moscafrut
Se utilizaron machos irradiados de A. ludens de la cepa Tapachula-7, cepa con sexado genético que se utiliza actualmente dentro de la TIE para el control de poblaciones silvestres. Su principal característica es la coloración oscura en las pupas de las hembras (Zepeda 2010). Esta característica permite diferenciar entre machos y hembras en estadío pupal para poder separarlas por medio de máquinas que detectan la diferencia de color.
Para las cópulas se utilizaron hembras estériles de la cepa bisexual (sin sexado genético), una cepa de cría masiva que ya tiene varias décadas siendo reproducida en cautiverio (Orozco-Dávila et al. 2007). Se utilizaron hembras de esta cepa en lugar de hembras silvestres debido a la falta de material silvestre suficiente para realizar todos los experimentos.
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Manejo del material biológico previo al establecimiento del experimento
Las pupas irradiadas fueron proporcionadas por la planta Moscafrut ubicada en Metapa de Dominguez, Chiapas, México. Las pupas fueron irradiadas 48 horas antes de la emergencia con Cobalto-60 para provocarles la esterilidad. Las pupas fueron enviadas por vía área al laboratorio del INBIOTECA de 2 o 3 días antes de la emergencia. Las pupas son enviadas en bolsas de plástico selladas y colocadas dentro de cajas de cartón para su transporte, cada bolsa tiene varios miles de pupas que son utilizadas para múltiples experimentos dentro de los laboratorios del INBIOTECA. En el laboratorio las pupas se colocaron en jaulas hechas con un armazón de madera de 30 x 30 x 30 cm y recubiertas con tela de tul y medias de nylon en la parte frontal para facilitar la manipulación del interior. Se les proporcionó agua con un bebedero con tapa y una mecha de algodón. El laboratorio se mantuvo con una temperatura entre 24 y 26 °C, 50% y 60% humedad relativa y con un fotoperiodo Luz : Obscuridad de 12-12 h.
Establecimiento del experimento con metformina
Los machos se dividieron en 4 jaulas y se les administró una dieta diferente dentro de cada jaula (Tabla 2). Dentro de cada jaula se colocaron 100 machos, de los cuales 15 fueron utilizados para medir el tamaño de los testículos y 50 fueron utilizados para los experimentos de transferencia espermática. Se realizaron 3 réplicas de este experimento utilizando diferentes envíos de moscas. Las hembras utilizadas para evaluar la transferencia espermática fueron alimentadas con proteína y azúcar en una proporción de 1:3.
Tabla 2: Dietas administradas a machos estériles de A. ludens, cepa Tapachula-7, desde la emergencia hasta 12 días. Los tratamientos fueron: proteína, metformina y azúcar, proteína y azúcar, metformina y azúcar y el control con solo azúcar, se utilizó la concentración de metformina utilizada por Aceves-Aparicio y colaboradores (2021).
Proteína, Metformina y Azúcar
Proteína y
Azúcar Metformina
y Azúcar Control 100 ml agua
purificada
100 ml agua purificada
100 ml agua purificada
100 ml agua purificada 9.6g de
azúcar refinada
9.6 g de azúcar refinada
10 g de azúcar refinada
10 g de azúcar refinada 0.4g de
levadura hidrolizada enzimática
0.4g de levadura hidrolizada enzimática 0.19g de
metformina 0.19g de
metformina
17 Variables de respuesta
Transferencia espermática
A los 12 días después de la emergencia (cuando alcanzaron la madurez sexual) se colocaron individualmente 50 machos de cada tratamiento en vasos de plástico transparentes de 300 ml. Se colocó una hembra por vaso aproximadamente a las 3 de la tarde (hora en la que los machos llaman a las hembras). El experimento terminó a las 8 de la noche. Se anotó la duración de la cópula y la latencia a la cópula (medida como el tiempo entre el inicio del experimento y el inicio de la cópula) y el porcentaje de cópulas obtenidas. Se consideró solo aquellas cópulas que duraron más de 20 minutos. Los machos fueron retirados del vaso para evitar un posible reapareamiento.
Al día siguiente, se seleccionaron de forma aleatoria 15 hembras copuladas de cada tratamiento (30 en total) y se sacrificaron, colocándolas una por una en un frasco con un algodón humedecido con 5 gotas de acetato de etilo, después se colocó a la hembra dorsalmente sobre un portaobjetos con una gota de solución salina. Se utilizó un microscopio estereoscópico y unas pinzas entomológicas con las puntas afiladas para realizar un corte en un costado del abdomen y separar el ovipositor junto con los ovarios y el resto del aparato reproductor de la hembra, se localizaron las 3 espermatécas y el receptáculo ventral, cada conjunto fue separado y colocado individualmente en un portaobjetos con 3 microlitros de solución salina. Se rompieron las estructuras en 4 partes, se agregaron otros 3 microlitros de solución salina y se realizó una mezcla por 30 segundos para homogeneizar la muestra. Por último se colocó un cubreobjetos sobre la muestra y se fijó con una gota de barniz de uñas transparente en cada esquina del cubreobjetos. Las muestras se guardaron en un estuche para ser analizadas posteriormente.
Para el conteo espermático se utilizó un microscopio de contraste de fases (Motic BA310, Canadá) con un aumento de 10x y se contó la totalidad del esperma observado en 36 campos visibles distribuidos de forma sistemática por todo el cubreobjetos. El área del cubreobjetos es de 484 mm2 y cada campo abarca un área de 3.1416 mm2 así que en total se observaron 113.976 mm2 que representan un 23.549% de la muestra. Para estimar la transferencia espermática total se multiplicó el esperma observado dentro de los 36 campos por el factor de conversión de 4.246 obtenido de dividir el 100% entre 23.549.
18
Tamaño de los testículos
A los 14 días después de la emergencia, se sacrificaron 15 machos de cada tratamiento en una cámara con un algodón humedecido con 5 gotas de acetato de etilo durante 5 minutos.
Se colocó al macho dorsalmente sobre un portaobjetos junto con una gota de solución salina, se utilizó un microscopio estereoscópico y unas pinzas entomológicas para realizar un corte en el costado del abdomen y separar la mitad inferior del abdomen exponiendo los testículos de color amarillo fosforescente, se tomó una fotografía de ambos testículos con el microscopio a un aumento de 2x y se midió el área de cada uno utilizando el programa Image J. Este programa es capaz de contar los pixeles en una fotografía para tomar medidas del objeto que se muestra, para esto es necesario tener en consideración lo siguiente:
1.- Calibrar el programa tomando una fotografía a una regla graduada especial para microscopía.
2.- Las fotografías deben tener la misma resolución incluyendo la fotografía de referencia, incrementar la resolución incrementa los pixeles.
3.- Las fotografías tienen que tomarse con el mismo aumento para que los objetos no se vean de tamaños diferentes al tener aumentos diferentes.
Análisis estadístico
Para los datos de la transferencia espermática se analizó primero la probabilidad de transferencia espermática para las moscas que transfirieron o que no transfirieron esperma con una prueba de ji cuadrada, también se realizó una prueba de ji cuadrada para determinar la probabilidad de cópula. Después la cantidad de esperma transferida se transformó a logaritmos para eliminar los ceros, se analizó mediante una prueba ANOVA después de realizar las pruebas de normalidad y homocedasticidad. Para los datos del tamaño de los testículos se realizó un Modelo Lineal Generalizado con una distribución Gaussiana y una liga de función identity. Se utilizó el programa estadístico Jamovi 1.8.1
19 Resultados
Los análisis de variación no fueron significativos en la probabilidad de cópula (χ² = 4.45, gl = 3,716, p = 0.217), la latencia a la cópula (χ² = 2.17, gl = 3,223, p = 0.539) , yen la probabilidad de transferir esperma (χ² = 2.73, gl = 3,115, p = 0.435, Figura 1). No se encontró diferencias significativas en la cantidad de esperma transferido (F = 0.121, gl = 3, p = 0.948, Figura 2), entre machos alimentados con distintas dietas. Asímismo, no se encontraron diferencias significativas en el tamaño de los testículos de machos alimentados con metformina o proteína (χ² = 2.45, gl = 3, p = 0.484, Figura 3).
Figura 1. Probabilidad de transferir esperma de machos estériles de Anastrepha ludens tratados desde la emergencia y durante 5 días con una dieta de azúcar con Proteína, Metformina y una combinación de ambas.
El tratamiento de control fue una dieta con únicamente azúcar, todos los tratamientos fueron cambiados por el control a los 5 días de emergencia. Las letras en la parte superior de las tablas indican diferencias significativas.
A A
A A
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Proteína Metformina Proteína + Metformina
Control Porcentaje de machos que transfirieron esperma
Probabilidad de transferir esperma
20
Figura 2. Transferencia espermática.
Cantidad de esperma transferido a la hembra (en número total aproximado) durante la cópula por machos estériles de Anastrepha ludens (Tapachula-7) tratados desde la emergencia y durante 5 días con una dieta de azúcar con proteína (1:24), Metformina y azúcar, proteína y azúcar y metformina. El tratamiento de control fue una dieta con únicamente azúcar. Las líneas en el centro de la caja representan la mediana, las cajas representan el 50% de los datos y los puntos representan valores atípicos, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos (F = 0.121, gl = 3, p = 0.948)
A A A A
21 Figura 3. Promedio del área de los testículos de machos estériles de Anastrepha ludens tratados desde la emergencia y durante 5 días con una dieta de azúcar con Proteína, Metformina y una combinación de ambas.
El tratamiento de control fue una dieta con únicamente azúcar, (las barras verticales indican el error estándar).
Discusión
La metformina no tuvo un efecto significativo en el tamaño de los testículos de A. ludens y tampoco en la probabilidad de transferir esperma o en la cantidad de esperma transferido durante la cópula, algo diferente a lo observado en ratas (Yan et al. 2015). Estos resultados podrían estar relacionados con el tipo de daños a los testículos que en este caso fueron producidos por la irradiación, mientras que los daños a los testículos en los estudios previos fueron provocados por dietas altas en grasas o en enfermedades relacionadas con el sobrepeso, como la diabetes, en los estudios realizados con humanos (Faure et al. 2018). Los resultados observados con la metformina son diferentes a los obtenidos con otros tratamientos postenerales como el metopreno, con el cual se observó un incremento en el tamaño de los órganos reproductivos (específicamente las glándulas accesorias) en los machos de A. ludens (Reyes-Hernández et al. 2021). Aunque la metformina probablemente no podría utilizarse como tratamiento posteneral por si sola, se sabe que puede reducir los
0.2 0.205 0.21 0.215 0.22 0.225
Proteína Proteína + Metformina
Metformina Control Promedio del área de los testículos (mm2 )
Tamaño de los testículos (mm
2)
A A A A
22
efectos negativos en la longevidad causados por tratamientos con metopreno (Aceves- Aparicio et al. 2021) el metopreno es un análogo de la hormona juvenil de varias especies de dípteros incluyendo a A, ludens, aplicado en la dieta ha demostrado acelerar la madurez sexual de los machos y también incrementar el tamaño de órganos sexuales como las glándulas accesorias (Reyes-Hernández et al. 2021). La metformina por sí sola no tiene efectos negativos en el tamaño de los testículos o la transferencia espermática por lo que podría combinarse con el metopreno sin tener efectos negativos relacionados con estos parámetros
Conclusiones
La metformina no demostró tener un efecto significativo en el tamaño de los testículos o la transferencia de esperma, a diferencia de lo observado con otras especies (Morgante et al.
2011, Yan et al. 2015). Este fármaco no parece proteger a las moscas de los efectos perjudiciales que tiene la radiación y la selección artificial. Con esta información se puede concluir que la metformina por sí sola no podría utilizarse como un tratamiento posteneral.
Se propone estudiar los efectos de la metformina combinada con metopreno en la probabilidad de cópula, desarrollo sexual y competitividad contra machos silvestres para poder ser utilizadas en conjunto como un tratamiento posteneral que incremente la eficacia de la técnica del insecto estéril.
23
3. Capítulo II
For: Florida Entomologist
Aceites esenciales de cítricos ¿Estimuladores del apareamiento de Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae)?
Ricardo Macías-Díaz del Castillo1, José Salvador Meza-Hernández, Juan Carlos Noa- Carrazana, Maurilio López-Ortega, Diana Pérez-Staples1*
1INBIOTECA, Universidad Veracruzana, Av. de las Culturas Veracruzanas 101, Col. E.
Zapata, Xalapa, CP 91090 Veracruz, México.
*To whom correspondence should be addressed
24 Resumen
La técnica del insecto estéril (TIE) es un método de control de plagas que consiste en producir insectos masivamente para luego esterilizarlos y liberarlos en el campo, estos copulan con los insectos silvestres evitando su reproducción. Los procesos de esterilización junto con la reproducción en laboratorio tienen un efecto negativo en el desempeño sexual, por lo que se buscan formas de hacerlos más competitivos. Los aceites esenciales han demostrado incrementar el desempeño sexual en ciertos tefrítidos. Sin embargo, aún faltan estudios para poder emplearlos dentro de la TIE en la mosca mexicana de la fruta Anastrepha ludens. Es decir, evaluar estos efectos dentro del tiempo en que los insectos estériles se encuentran en los centros de empaque previos a la liberación. Aquí se evaluaron 2 aceites de cítricos diferentes (Citrus sinensis y Citrus paradisi) de marcas comerciales aplicados por medio de aromaterapia y 4 aceites diferentes (Citrus aurantium, Citrus sinensis y Citrus paradisi) de marcas comerciales aplicados dentro de la dieta de los adultos. Se les aplicó el tratamiento a machos estériles de la cepa Tapachula-7 de Anastrepha ludens en la dieta durante 1, 5 y 10 días posteriores a la emergencia para poder evaluar la probabilidad de cópula y latencia a la cópula. Los machos tratados con aceites esenciales por medio de aromaterapia no presentaron diferencias significativas en la probabilidad de cópula. Ningún aceite empleado en la dieta mejoró la cantidad de cópulas comparadas con el control. Sin embargo, los machos tratados con aceite C. sinensis aplicado en la dieta por 5 días demostraron aparearse más rápido que los machos de otros tratamientos. Estos resultados pueden apoyar en hacer más competitivos a los machos estériles de A. ludens cepa Tapachula 7. Asimismo, encontramos que los machos estériles tuvieron menos cópulas cuando fueron tratados con aceite de toronja al 0.1% y 0.5% durante 24 horas.
Palabras clave: Técnica del insecto estéril, Diptera, Tephritidae
25 1. Introducción
La mosca mexicana de la fruta Anastrepha ludens, es una de las plagas más importantes para algunos cultivos, principalmente cítricos y mangos (Aluja, 1993). Esta especie de mosca pertenece a la familia Tephritidae caracterizados por su particular ciclo de vida en el que las hembras depositan sus huevos dentro de algún fruto antes de que este madure, para que así las larvas se alimenten de él, lo que causa importantes pérdidas económicas para los
agricultores ya que los frutos infestados no pueden comercializarse. Actualmente se controla esta especie mediante técnicas de control de plagas, como los trampeos o control biológico con parasitoides y control autocida con la técnica del insecto estéril (TIE).
La Técnica del Insecto Estéril (TIE) es un método de control autocida de plagas que consiste en reproducir de forma masiva la plaga que se busca controlar para luego esterilizarla y liberarlas en el campo con el objetivo de que copulen con los individuos silvestres y de esa forma evitar su reproducción (Knipling 1955). Esta técnica ha demostrado ser efectiva para controlar poblaciones silvestres de A. ludens, aunque tiene algunas desventajas; una de las principales es que la selección artificial que implica la cría masiva provoca, a través de las generaciones, que los individuos de laboratorio sean menos competitivos que los silvestres (Meza et al. 2014). La reducción en competitividad sexual también se debe al proceso de esterilización por medio de rayos gamma (Gallardo-Ortiz et al. 2018, Abraham et al. 2020).
En la cepa genéticamente sexada Tapachula 7, una cepa mutante que permite la separación de machos y hembras durante la fase de pupa, se observó también esta ventaja de los machos silvestres frente a los de cría masiva en aspectos relacionados con la competencia sexual entre machos, como la cantidad de esperma almacenado por la hembra después de la cópula (Contreras-Navarro et al. 2020). Esto nos indica que la desventaja de la cría masiva persiste en diferentes cepas y especies criadas en la TIE.
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Para intentar reducir esta desventaja se han propuesto y/o implementado múltiples métodos que pretenden incrementar el desempeño sexual de los machos de laboratorio, incrementando la cantidad de cópulas. En este sentido, el uso de aceites esenciales puede ser un tratamiento interesante para incrementar la competitividad sexual. Actualmente los aceites esenciales ya han sido utilizados en otras especies principalmente en forma de aromaterapia (Segura et al.
2018). En Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera Tephritidae). los tratamientos con aceites esenciales de marcas comerciales de Citrus aurantium, Citrus paradisi, Citrus reticulata y Citrus aurantifolia les confirieron a los machos un mayor éxito de apareamiento en relación con el control sin aceites (Shelly et al. 2004, Kouloussis et al. 2013). En A. ludens se han evaluado anteriormente los efectos de aceites de Zingiber officinale y a diferencia de lo observado con C. capitata en esta especie no se observó ningún efecto de este aceite aplicado en forma de aromaterapia (Flores et al. 2011), también en A. ludens se evaluaron los efectos de diferentes aceites de cítricos (C. sinensis, C. aurantium, C. paradisi) aplicados en dieta y en aromaterapia (Morató et al. 2015, Espinal-Pérez 2021). En ambos casos los tratamientos demostraron incrementar la probabilidad de cópula, sin embargo, la metodología utilizada no es compatible con la TIE, debido a que dentro de ambos experimentos se les aplicó
tratamientos a las moscas a los 11-18 días de edad por 4 horas en el caso de la aromaterapia y durante 10 días desde la emergencia en el caso de los aceites aplicados en dieta. Dado que A.
ludens es liberada a los 5 días (Zavala et al. 2020), esta metodología no es compatible con la TIE. También es necesario evaluar los efectos de los aceites utilizando las mismas dietas que actualmente se utilizan dentro de la TIE. Actualmente para A. ludens se utiliza una dieta de azúcar refinada (sacarosa) y levadura hidrolizada enzimática en una proporción de 24 partes de azúcar por una parte de levadura (Liedo et al. 2013).
27 En este trabajo de laboratorio se evaluaron los efectos de tres aceites esenciales de cítricos (C. sinensis, C. aurantium, C. paradisi) comerciales en la probabilidad de cópula, la latencia a la cópula y el tamaño de los testículos de machos estériles de A. ludens de la cepa
Tapachula-7, utilizando la misma dieta ofrecida en los centros de empaque (Liedo et al.
2013) y se comparó la aplicación durante 10 días con una aplicación durante 5 días y 24 horas, retirando el tratamiento al quinto día para que de esta forma sea compatible con lo realizado dentro de la TIE.
2. Materiales y métodos
2.1. Material biológico
Se utilizaron pupas de las cepas bisexual y Tapachula-7 de A. ludens, proporcionadas por la planta Moscafrut ubicada en Metapa de Dominguez, Chiapas, México. Las pupas fueron irradiadas 48 horas antes de la emergencia con Cobalto-60 para provocarles la esterilidad.
Las pupas fueron enviadas por vía área al laboratorio del INBIOTECA de 2 o 3 días antes de la emergencia.
2.2. Manejo de material biológico
Los adultos fueron separados por sexos en jaulas de 30 x 30 x 30 centímetros y se les proporcionó agua y una mezcla de levadura hidrolizada (BioWorld Dublin Ohio, USA) con azúcar en una proporción de 1:3 para las hembras y 1:24 para los machos.
28
2.3. Establecimiento de los ensayos de aromaterapia y dieta
2.3.1 Aromaterapia
Los machos estériles de la cepa Tapachula-7 fueron separados al momento de emerger en 3 jaulas distintas con 150 machos, cada una en un cuarto diferente. Cinco días después de que los adultos emergieran de la pupa se colocó en cada jaula un papel filtro con 25 microlitros de: 1) aceite de naranja dulce (C. sinensis) (Nice and Bella, Dallas, Téxas, EU), o 2) aceite de toronja (C. paradisi) (Nice and Bella, Dallas, Téxas, EU) o 3) agua destilada como control, estos tratamientos se aplicaron durante 4 horas, estos tratamientos se aplicaron una sola vez durante el quinto día después de la emergencia de los adultos. Al día 10 se
colocaron 100 machos de cada tratamiento de forma individual en vasos de plástico de 127 ml junto con una hembra por vaso de la cepa bisexual de 10 días de edad para inducir la cópula.
Variables de respuesta
Se registró la probabilidad de cópula y la latencia a la cópula (el tiempo que demora en iniciar la cópula a partir del inicio del experimento), solo se consideraron las cópulas que superaran los 20 minutos de duración. Se realizaron 3 réplicas con 100 individuos por tratamiento.
2.3.2 Aceites de cítricos en la dieta
Aceites de cítricos evaluados
Se utilizaron aceites de naranja dulce C. sinensis (Nice and Bella, Dallas Téxas, EU), naranja agria C. aurantium (Soregano, Mérida México) y toronja C. paradisi (Nice and Bella, Dallas, Téxas, EU) y C. sinensis (Citrus and allied essences LTD, Lake Success,
29 Nueva York, EU) esta última marca de C. sinensis se utilizó ya que es la que actualmente se usa para el tratamiento de C. capitata en la planta Moscamed (PM), Metapa de
Domínguez, Chiapas (SAGARPA-SENASICA 2016), a este aceite lo denominamos PM.
Ensayo de laboratorio
Los aceites fueron aplicados por 3 periodos diferentes (1 día, 5 días y 10 días) teniendo un control sin aplicación para cada ensayo de duración. Las moscas se separaron por
tratamiento colocando 200 machos por jaula y se les proporcionó agua en un bebedero de plástico con una mecha de algodón y alimento a base de proteína hidrolizada y azúcar en una proporción de 1:24. Los aceites esenciales fueron agregados a la dieta de los machos Tapachula-7 en las siguientes proporciones: Aceite de C. sinensis al 0.5%, aceite de C.
aurantium al 0.1%, aceite de C. sinensis (PM) al 0.5%, aceite de C. paradisi al 0.1% y 0.5%. Para los tratamientos con C. paradisi se evaluaron dos concentraciones distintas ya que no hay antecedentes de su uso en la dieta de A. ludens (total de 15 tratamientos y 3 controles). Las concentraciones se determinaron siguiendo resultados de Espinal-Pérez (2021). Los tratamientos fueron aplicados por 1 día (en el cuarto día después de la
emergencia del adulto), por 5 días o por 10 días aplicado desde la emergencia. Las hembras utilizadas en el experimento fueron de la cepa bisexual (irradiadas) y se alimentaron con una dieta de azúcar y proteína en una proporción de 3:1 sin aceites esenciales. Se realizaron 8 réplicas con aproximadamente 140 moscas por tratamiento (dependiendo de la
disponibilidad del aceite y las moscas) teniendo un total de 1020 individuos de C. sinensis, 855 de C. aurantium, 600 de C. sinensis (PM), 1020 de C. paradisi al 1%, 1016 de C.
paradisi al 5% y 1020 de control.
30
Las moscas se colocaron en parejas en vasos desechables con tapa de 127 ml a las 3 pm (de acuerdo con el periodo sexual de esta especie) (Aluja et al. 1983). Las variables de respuesta observadas fueron la latencia a la cópula (registrado como el tiempo entre el inicio del experimento y el inicio de la cópula), la duración de la cópula y la probabilidad de cópula. Se consideraron como cópula solo aquellas que sobrepasaran los 20 minutos de duración. Se realizaron 8 réplicas de aproximadamente 140 individuos por tratamiento.
Experimento en jaula de campo
Se utilizaron 40 machos tratados con aceite C. sinensis PM al 0.5% aplicado en la dieta durante 5 días y 40 machos control alimentados con azúcar, ambos estériles y de la cepa Tapachula-7, marcados en el tórax un día antes del experimento con pintura acrílica (Politec, Ciudad de México, México) para poder distinguirlos dentro de la jaula de campo.
También se utilizaron 40 hembras silvestres (séptima y octava generación) colectadas de fruta infestada en Coatepec, Cocoxatla Mpio. de Xico y en la Estanzuela Mpio de Emiliano Zapata, Veracruz, México. Al cumplir los machos 10 días después de la emergencia se colocaron en una proporción sexual 2:1 (machos:hembras) en una jaula de campo de 2 metros de alto hecha con un pabellón de plástico, previamente se colocaron dentro 3 macetas con árboles de mango y naranja de 1.0 - 1.5 m de altura. Los machos fueron colocados en la jaula a las 2 de la tarde y las hembras se colocaron a las 3 de la tarde, la hora que se tomó como inicio del experimento fue a partir del momento que se colocaron las hembras dentro de la jaula. Se registró el número de cópulas y la latencia a la cópula.
2.3.4 Tamaño de los testículos
Se utilizaron 15 machos tratados con C. sinensis PM al 0.5% aplicado en la dieta durante 5 días y 15 machos control alimentados con azúcar, ambos estériles y de la cepa Tapachula-7.
31 Al cumplir 10 días de emergencia se sacrificaron colocándolos en un congelador durante 20 minutos y se colocó a cada macho dorsalmente sobre un porta objetos junto con una gota de solución salina, se utilizó un microscopio estereoscópico (Olympus modelo LG-PS2) y unas pinzas entomológicas para realizar un corte en el costado del abdomen y separar la mitad inferior del abdomen sacando los testículos de color amarillo fosforescente, se tomó una fotografía de ambos testículos con el microscopio a un aumento de 2x y se midió el área de cada uno utilizando el programa Image J.
2.4. Análisis estadístico
Para los datos de aromaterapia se realizó una prueba de Ji cuadrada con la probabilidad de copular en relación con el tratamiento. Para analizar los datos de la probabilidad de cópula con los aceites esenciales en la dieta se realizó un Modelo Lineal Generalizado con una distribución Binomial y una función Logit. Para el modelo se utilizó el tratamiento, la duración del tratamiento y la interacción entre el tratamiento y la duración como variables independientes. Por último, se realizó una prueba post hoc con una corrección de
Bonferroni. La latencia a la cópula se analizó por medio de un Modelo Lineal Generalizado con una distribución Gaussiana y una línea de función Identity. Los análisis se realizaron en el programa estadístico Jamovi versión 1.8.1.
3. Resultados
3.1. Efecto de los aceites en aromaterapia
No se encontraron diferencias significativas en la latencia a la cópula para los tratamientos de aceites esenciales aplicados por medio de aromaterapia (F = 1.27, gl = 2,48, p = 0.291).
Tampoco se encontraron diferencias significativas en la probabilidad de cópula de los machos expuestos a diferentes aceites (χ² = 0.175, gl = 2,57, p = 0.916).
