DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL INHIBIDOR DEL EXTRACTO Y FRACCIONES DE

DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL INHIBIDOR DEL EXTRACTO Y FRACCIONES DE Passiflora manicata SOBRE ENZIMAS DIGESTIVAS

(α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática)

ANGY TATIANA MORALES GÓMEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

NUTRICIONISTA DIETISTA

GEISON MODESTI COSTA -Director MILENA LIMA DE MORAES - Co-directora

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE NUTRICIÓN Y DIETETICA BOGOTÁ. D.C. Noviembre 20 de 2017

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL INHIBIDOR DEL EXTRACTO Y FRACCIONES DE Passiflora manicata SOBRE ENZIMAS DIGESTIVAS

(α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática)

ANGY TATIANA MORALES GÓMEZ

APROBADO

___________________________ ______________________________

CONCEPCIÓN PUERTA BULA MARTHA CONSTANZA LIÉVANO Bacterióloga. PhD Nutricionista Dietista. Msc.

Decana de Facultad Directora de Carrera

Dedicatoria

Primeramente, a mi Señor Jesucristo por brindarme salud, amor y hasta el momento su gracia infinita no ha me desamparado.

A mi padre Laureano, por ser mi ejemplo, mi gran mentor en los momentos de gran dificultad, por enseñarme a persistir y nunca desistir, a entregar todo con pasión para que siempre salga mejor.

A mi madre Blanca, por su incondicional amor, sabiduría, fortaleza y los infaltables consejos que han contribuido en mi crecimiento y formación diaria.

A ustedes padres amados y esforzados, les dedico este gran logro.

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar, agradezco a mi Señor Jesucristo por ser mi guiador, por su inexplicable amor que me ha guardado en cada momento y llenado de fortaleza en los momentos de gran dificultad, por enseñarme a ser perseverante y a confiar en tus palabras, que todo lo pedido se hará en el tiempo justo.

Infinitamente agradecida con mis padres por la maravillosa oportunidad que me regalaron de seguir luchando por un sueño, un legado que debe continuar para ser ejemplo como lo han sido ustedes. Gracias por tanto cariño, comprensión, amor, esfuerzo y pasión en lo que desarrollan todo para darnos lo mejor. Gracias por sus oraciones y enseñanzas.

A mis hermanos, que a pesar de la distancia siempre han estado conmigo en todo momento siendo mi apoyo incondicional.

Mi más sincero agradecimiento al Dr. Geison Modesti Costa, director quien fue mi guiador hacia una nueva experiencia en la carrera de Nutrición, compartiendo su conocimiento y experiencia en pro de mi formación y desarrollo del trabajo de grado. La Dra. Milena Lima de Moraes, codirectora quien me oriento y colaboro en cada paso a dar en el enfoque de Nutrición, siendo el principal eje. El grupo de investigación de fitoquímica de la Pontificia Universidad Javeriana (GIPUJ) y el grupo de investigación de sistemas para liberación controlada de moléculas biológicamente activas (SILICOMOBA) de la Universidad Nacional por complementar la ejecución de mis ensayos experimentales.

TABLA DE CONTENIDO

ÍNDICE DE TABLAS ... i

ÍNDICE DE FIGURAS ... ii

RESUMEN ... iii

ABSTRACT ... iv

1. INTRODUCCIÓN ... 1

2. MARCO TEÓRICO ... 2

2.1. Alteraciones metabólicas ……... 2

2.1.1 Hiperglicemia………..………... 2

2.1.2 Hipertrigliceridemia…...…...4

2.2. Enzimas digestivas relacionadas con la digestión de los carbohidratos...5

2.2.1 α-amilasa………...7

2.2.2 α-glucosidasa………7

2.3. Enzimas digestivas relacionadas con la digestión de las grasas………9

2.3.1. Lipasa pancreática………...………9

2.3.2. El género Passiflora……….………... 10

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN ...11

4. OBJETIVOS ...13

4.1. Objetivo general ...13

4.2. Objetivos específicos ...13

5. HIPÓTESIS ...13

6. MATERIALES Y MÉTODOS ... 13

6.1. Material vegetal y extracción ……... 14

6.2. Fraccionamiento y caracterización química del extracto ... 14

6.3. Evaluación de la actividad inhibitoria de α-amilasa …...15

6.4. Evaluación de la actividad inhibitoria de α-glucosidasa …...15

6.5. Evaluación de la actividad inhibitoria de lipasa pancreática ...15

6.6 Análisis estadístico……….………...…15

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...16

7.1. Fraccionamiento del extracto………....16

7.2. Composición química de P. manicata ……….16

7.2.1 Perfil de fenoles y flavonoides…………...……...………...……..16

7.2.2 Cuantificación de fenoles totales………...…....…...……..18

7.3. Actividad inhibitoria del extracto y fracciones de las hojas de P. manicata sobre las enzimas digestivas α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática………....18

7.3.1 Inhibición de α-amilasa y α-glucosidasa…..………...…...……...……….18

7.3.2 Inhibición de lipasa pancreática……….………..……..23

7.3.3 Correlación por el coeficiente de Pearson con las enzimas lipasa pancreática y α-amilasa……….……….26

8. CONCLUSIONES ...27

9. RECOMENDACIONES ...28

10. BIBLIOGRAFÍA ...28

11. ANEXOS ...34

11.1 Anexo 1. Curva de calibración de mg Equivalentes de ácido gálico…………...34

11.2 Anexo 2. Fraccionamiento y caracterización química del extracto …………....34

11.3 Anexo 3. Evaluación de la actividad inhibitoria de α-amilasa……….…...36

11.4 Anexo 4. Evaluación de la actividad inhibitoria de α-glucosidasa……...……...37

11.5 Anexo 5. Evaluación de la actividad inhibitoria de lipasa pancreática ………..39

i ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Enzimas involucradas en la digestión de los carbohidratos, así como en el lugar de producción, acción y sustrato final. ………..…………..6 Tabla 2. Contenido fenólico total (mgEAG) …………...………..…………18 Tabla 3. Porcentajes de inhibición α-Amilasa con la concentración inhibitoria 50 (CI50) del extracto y fracciones .………..21 Tabla 4. Porcentajes de inhibición α-glucosidasa con la concentración inhibitoria 50 (CI50) del extracto y fracciones ………....…...22 Tabla 5. Porcentajes de inhibición lipasa pancreática con la concentración inhibitoria 50 (CI50) del extracto y fracciones ………..……25

ii ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Flujograma de la metodología realizada………14 Figura 2. Cromatografía de capa delgada en el extracto y las fracciones de P.

manicata………..17 Figura 3. Perfil de HPLC–DAD del extracto acuoso crudo de hoja de P. manicata a 340 nm. 1: Isoorientina; 2: Vitexina; y 3: Isovitexina ………..…………..17 Figura 4. Porcentaje de inhibición de α-amilasa con el extracto crudo y el residuo acuoso ………...21 Figura 5. Porcentaje de inhibición de lipasa pancreática con el extracto crudo y la fracción n-butanol ………..26 Figura 6. Coeficiente de correlación de Pearson con relación a lipasa pancreática y α- amilasa ………27

iii RESUMEN

Las alteraciones metabólicas como hiperglicemia e hipertrigliceridemia están directamente asociadas con el desarrollo de las enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT), por lo tanto, es de gran importancia en salud pública detener el desarrollo de estas. El uso de plantas medicinales para mejorar enfermedades o alteraciones es creciente en varias partes del mundo. Se conoce que Passiflora manicata es una planta con una alta actividad antioxidante que tiene como compuesto mayoritario el flavonoide isovitexina que podría inhibir enzimas digestivas y así influir en el metabolismo de la glucosa y lípidos. El objetivo del presente estudio fue analizar la potencial actividad inhibitoria del extracto y fracciones de las hojas de P. manicata sobre enzimas digestivas α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática. El análisis de la inhibición enzimática fue realizado a diversas concentraciones del extracto y fracciones como controles se encuentran la acarbosa para α-amilasa y α-glucosidasa, mientras que para lipasa pancreática fue orlistat con el fin de observar la presencia de actividad, además de realizar un perfil de fenoles y flavonoides junto con la cuantificación de fenoles totales por el reactivo de Folin-Ciocalteu. Los resultados obtenidos para el extracto y fracciones, se vio principalmente relacionado con el porcentaje de rendimiento, el perfil de fenoles y flavonoides, y el contenido de fenoles totales que presentaron una estrecha relación entre la presencia de actividad inhibitoria sobres las tres enzimas digestivas con diferente porcentaje de inhibición que estuvo entre el 60 y el 100% de actividad sobre α-amilasa y lipasa pancreática. Se concluye que la relación entre el contenido fenólico sobre la inhibición de estas enzimas está directamente asociada con el potencial antioxidante presente.

Palabras claves: P. manicata, α-amilasa, α-glucosidasa, lipasa pancreática, hiperglucemia y hipertrigliceridemia.

iv ABSTRACT

Metabolic alterations such as hyperglycemia and hypertriglyceridemia are directly associated with the development of chronic noncommunicable diseases (CNCD), therefore, it is of great importance in public health to stop the development of these.

The use of medicinal plants to improve disease or alterations is increasing in several parts of the world. It is known that Passiflora manicata is a plant with a high antioxidant activity that has as a major compound the flavonoid isovitexin that could inhibit digestive enzymes and thus influence the metabolism of glucose and lipids. The objective of the present study was to analyze the potential inhibitory activity of the extract and fractions of P. manicata leaves on digestive enzymes α-amylase, α- glucosidase and pancreatic lipase. The analysis of enzymatic inhibition was performed at various concentrations of the extract and fractions as controls were acarbose for α- amylase and α-glucosidase, while for pancreatic lipase it was orlistat in order to observe the presence of activity, in addition to performing a profile of phenols and flavonoids together with the quantification of total phenols by the Folin-Ciocalteu reagent. The results obtained for the extract and fractions, was mainly related to the percentage of yield, the profile of phenols and flavonoids, and the content of total defenses that presented a close relationship between the presence of inhibitory activity on the three digestive enzymes with different percentage of inhibition that was between 60 and 100% of activity on α-amylase and pancreatic lipase. It is concluded that the relationship between the phenolic content on the inhibition of these enzymes is directly associated with the antioxidant potential present.

Key Words: P. manicata, α-amylase, α-glucosidase, pancreatic lipase, hyperglycemia, hypertriglyceridemia.

1 1. INTRODUCCIÓN

Dos de las alteraciones metabólicas más frecuentes en las enfermedades crónicas no transmisibles (ECNT) son la hiperglicemia y la hipertrigliceridemia. Una vez que actualmente las ECNT son las principales causas de defunciones en el mundo la importancia de monitorear y tratar estas alteraciones se hace aún más importantes.

Estas alteraciones están relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos y las grasas, por lo tanto, el presente estudio se enfocará en tres de las enzimas involucradas en la digestión y absorción de estos macronutrientes (α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática).

En la actualidad, una tendencia que ha tenido auge en los países subdesarrollados es el uso medicinal de plantas nativas de las regiones con el fin de mejorar enfermedades o alteraciones prevalentes en sus poblaciones. Partiendo de ahí, estudios realizados sobre el género Passiflora han demostrado que el potencial que tienen puede favorecer a la salud. En Colombia, Passiflora manicata es una planta de la región Andina que ha sido poco evaluada, pero los estudios que se han sido realizados la destacan por poseer un alto contenido de flavonoides que a su vez son considerados inhibidores de algunas enzimas digestivas.

Es por ello que el propósito del presente trabajo de grado es contribuir con un aporte al conocimiento acerca del potencial inhibitorio que puede tener las hojas de la planta sobre las enzimas digestivas (α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática) lo que podría contribuir futuramente al mejoramiento de alteraciones metabólicas como la hiperglicemia y hipertrigliceridemia. El desarrollo del proyecto se enfatiza en la experimentación de las concentraciones del extracto crudo de P. manicata y sus fracciones en ensayos in vitro que permiten relacionar la inhibición de las enzimas a través del resultado obtenido por la concentración inhibitoria 50 (CI50), adicionalmente de conocer parte de la composición química dominante, en este caso del contenido de fenólico total que se encuentra en las muestras evaluadas y así mismo correlacionarlo sobre la inhibición estas enzimas.

2 2. MARCO TEÓRICO

2.1. Alteraciones metabólicas

Las alteraciones metabólicas como la hiperglicemia y la hipertrigliceridemia están ampliamente presentes en ECNT que actualmente son las principales causas de defunciones en el mundo (Alegría et al., 2008). Es por esto que la preocupación con relación a estas alteraciones es una temática frecuente y cada vez más discutidas por su importancia en salud pública (ADA, 2017; AACE, 2017).

2.1.1 La hiperglicemia

La hiperglicemia es definida como el aumento de la glucosa en la sangre después de una comida por encima de los valores de referencia, a causa de una falta de secreción de insulina o acción de esta. Se pueden hacer mediciones de la glucosa plasmática en dos tiempos, como lo es en ayunas o 2 horas después de un ensayo de tolerancia a la glucosa oral de 75 g (ADA, 2017). La American Diabetes Association (ADA) recomienda una prueba de glucosa plasmática aleatoria, si el resultado es ≥200 mg/dL se requiere una segunda prueba para confirmar, dado que es considerado como el resultado del equilibrio neto entre la tasa de carbohidratos que se absorbe desde el tracto gastrointestinal y la velocidad a la que es metabolizada por el hígado y tejidos periféricos (ADA, 2017; Lebovitz, 1997).

Para elucidar este proceso, la hormona glucorreguladora dominante es la insulina, que tiene como función regular la concentración de glucosa en plasma en estados de ayuno, principalmente cuando a la glucosa hepática se le restringe la producción. Por lo tanto, es necesario tener concentraciones más altas, es decir que sean semejantes a las que se presentan después de la ingesta de alimentos para estimular la utilización de la glucosa.

Contraria a esta, se encuentra la hormona hiperglucémica por excelencia que es el glucagón, ya que actúa casi exclusivamente en el hígado y cuya función es aumentar la producción de glucosa hepática en pocos minutos. Un aumento rápido en la concentración de insulina y al mismo tiempo un descenso de la concentración de glucagón esta dado por el consumo de carbohidratos simples, de modo que, una manera

3 de prevenir la hiperglicemia es teniendo una temprana liberación de insulina lo que permite que haya una mayor disposición de glucosa durante la absorción (Giugliano, Ceriello & Esposito, 2008). Por lo cual es importante mencionar factores que están 1) la cantidad y cinética de las enzimas digestivas; 2) la velocidad de propulsión de los nutrientes a través del tracto gastrointestinal; 3) la velocidad y la cantidad de insulina secretada; y 4) la respuesta del hígado y tejidos periféricos a la insulina secretada.

Aunque la respuesta de secreción de insulina a los carbohidratos ingeridos está determinada por el aumento de la glucosa en sangre, está también se amplifica por la secreción de hormonas gastrointestinales estimuladas por nutrientes tales como el polipéptido inhibidor gástrico (GIP) y el péptido glucagonal 1 (GLP-1) (Lebovitz, 1997).

La principal razón por la cual se presentan un mayor riesgo de hiperglicemia es debido a una dieta alta en carbohidratos, dado a que se ha demostrado que estos contribuyen con el aumento de los niveles de insulina y triglicéridos en plasma que puede alterar el control de la glucosa en sangre en el período postprandial, debido a que incide directamente en los factores que mantienen el equilibrio (Riccardi & Rivellese, 1991).

Gran parte del tratamiento se basa en la dieta y la práctica de ejercicio en una condición inicial, mientras que, en un segundo momento en caso necesario, se encuentra la farmacoterapia. En la dieta influyen varias características que están relacionados con el metabolismo anteriormente mencionado, como los alimentos con bajo índice glicémico, alto contenido de fibra dietética y el vaciamiento gástrico. La fibra, inicialmente tiene relación con el enlentecimiento del vaciamiento gástrico lo que genera que haya distensión por un tiempo prolongado que conlleva a la presencia de sensación de plenitud, además de controlar los niveles de glicemia postprandiales junto con los efectos en la sensibilidad de la insulina (Gil, 2010), del mismo modo, se experimenta una degradación bacteriana ya que alcanza el colon sin digerir y la acción directa sobre el metabolismo intermedio disminuyendo la velocidad de absorción de glucosa y la grasa en el intestino delgado, así como en la fermentación en el intestino para producir ácidos grasos de cadena corta (AGCC) con el fin de contribuir con la

4 modulación del metabolismo de la glucosa y los lípidos en el hígado. La principales fuentes se encuentran en alimentos como las legumbres, los cereales integrales, las hortalizas y algunas frutas (Riccardi, Rivellese & Giacco, 2008).

2.1.2 La hipertrigliceridemia

La hipertrigliceridemia se caracteriza por una concentración anormal de triglicéridos en la sangre, por lo cual, las directrices del National Cholesterol Education Program (NCEP ATP III), indican que el valor de referencia normal de triglicéridos debe ser de

<150 mg/dL. Actualmente existen dos etiologías de tipo primaria y secundaria. Las primarias se estiman que son los defectos genéticos que se presentan en el metabolismo de las grasas principalmente cuando hay una alteración en los triglicéridos, mientras que las secundarias son causas adquiridas como la alimentación alta en grasa, en carbohidratos y calorías, la baja actividad física, la presencia de la obesidad, diabetes, hipotiroidismo y el consumo de ciertos medicamentos (NCEP, 2002; Lars et al., 2012).

A nivel del metabolismo de las grasas, existen dos fuentes principales en la formación de triglicéridos que son las exógenas (dieta) que estas se transportan en quilomicrones y las endógenas (hígado) son movilizadas en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Por lo cual, a partir de la dieta los triglicéridos son absorbidos por el intestino delgado debido a la emulsificación de las sales biliares y la hidrólisis de la lipasa pancreática para ser secretados en el sistema linfático para luego entrar a circulación sistémica como quilomicrones a través del conducto torácico. En el torrente sanguíneo son transportados los quilomicrones a tejidos como el hígado, musculo y tejido adiposo. Aunque la mayor parte del triglicérido encontrado en la sangre haya sido absorbida por el intestino delgado, el hígado produce y secreta una pequeña cantidad de triglicéridos, por otra parte, son absorbidos los remanentes de quilomicrón y a su vez las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) son reempaquetados los triglicéridos (procedentes de quilomicrones) para ser transportados hacia el tejido adiposo y allí ser metabolizados y almacenados. El tejido adiposo por acción de la lipoproteína lipasa (LPL) hidroliza los ácidos grasos para ser almacenados o utilizados como energía, sin embargo, en el músculo esquelético y cardíaco (otros tejidos) son los

5 únicos que emplean ácidos grasos para oxidarlos. Las proteínas asociadas con los lípidos son las apolipoproteínas que colaboran con su ensamblaje, transporte y metabolismo, es de ahí que cualquier defecto en las proteínas estructurales o las enzimas que están interactuando en el metabolismo pueden conllevar a una dislipidemia clínica (Yuan et al., 2007; Mahan et al., 2013; Frayn et al., 2006; Pejic &

Lee, 2006). Se estima que un aumento en las concentraciones de triglicéridos son un marcador, en el momento de ingresar a la íntima pueden encaminar hacia la presencia de una inflamación de bajo grado, placas ateroscleróticas, la formación de células espumosas y finalmente, presentar enfermedad cardiovascular que está directamente asociado con el incremento en la mortalidad (Han et al., 2016).

Como primera línea del tratamiento para esta alteración metabólica se encuentra la composición de la dieta con respecto a la calidad y la cantidad del consumo de carbohidratos y las grasas, la reducción de azúcares (Consumo máximo de 5% del valor calórico total), sustitución de ácidos grasos saturados por mono y poliinsaturados, la reducción de las bebidas alcohólicas y un aumento de actividad física (SBC, 2017). Por otra parte, se encuentra la farmacoterapia que está indicada para pacientes que no lograron realizar los cambios en su estilo de vida o aquellos de etiología primaria (Lars et al., 2012).

2.2. Enzimas digestivas relacionadas con la digestión de los carbohidratos

La dieta está compuesta principalmente por los carbohidratos, las proteínas y grasas (Lieberman, Marks, & Peet, 2013). Los carbohidratos son polihidroxi aldehídos, cetonas, alcoholes, ácidos, sus derivados simples y sus polímeros que tienen enlaces del tipo acetal (Silva & Mura, 2011a). Estos pueden clasificarse según su grado de polimerización (es decir, el número de unidades monoméricas), estos se dividen en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. La gran mayoría abundan en la naturaleza, siendo superados por el agua. De tal manera, que son consumidos ampliamente por las personas, aproximadamente en un 50% de las necesidades energéticas de los individuos (Silva & Mura, 2011a).

6 Al abordar el proceso digestivo de los carbohidratos (Tabla 1), se suele enfatizar en la hidrólisis del almidón que es el tipo más abundante en los alimentos, sin embargo, se destacaran dos enzimas que son las que se evaluaran ( Silva & Mura, 2011a).

Tabla 1. Enzimas involucradas en la digestión de los carbohidratos, así como en el lugar de producción, acción y sustrato final.

ENZIMA LUGAR DE

PRODUCCIÓN

LUGAR DE ACCIÓN SUSTRATO

FINAL Amilasa

salival

Boca Boca y estomago Almidón

Amilasa pancreática

Páncreas Intestino delgado:

lumen del yeyuno y borde del cepillo

Almidón

α-glucosidasa Intestino delgado Intestino delgado:

lumen del yeyuno y borde del cepillo

Unidades de α-D- glucosa

Glucoamilasa Intestino delgado Intestino delgado:

lumen del yeyuno y borde del cepillo

Dextrinas

Maltasa Intestino delgado:

borde del cepillo

Intestino delgado: borde del cepillo

Maltosa

Isomaltosa Intestino delgado:

borde del cepillo

Intestino delgado: borde del cepillo

Isomaltosa

Sacarasa Intestino delgado:

borde del cepillo

Intestino delgado: borde del cepillo

Sacarosa

Lactasa Intestino delgado:

borde del cepillo

Intestino delgado: borde del cepillo

Lactosa

Adaptado de: (Silva & Mura, 2011a; Lebovitz, 1997)

La menor actividad de estas enzimas repercute en la menor absorción de glucosa. En el presente estudio se hará énfasis en las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa, que fueron enzimas trabajadas experimentalmente.

7 2.2.1. α-amilasa

La α-amilasa es una enzima amilolítica más ampliamente estudiada, cataliza la hidrólisis con retención de la configuración de los enlaces α-1,4-glucosídicos del almidón interno, poli y oligosacáridos relacionados (Janeček, Svensson, & MacGregor, 2014).

La digestión del almidón se continúa después del vaciamiento gástrico, con la llegada del quimo al duodeno, ocurre la liberación de secretina y colecistoquinina (CCK), que a su vez, estimulan la secreción exocrina del páncreas. En consecuencia, se liberan enzimas digestivas del páncreas hacia el duodeno, entre ellas la α-amilasa pancreática.

La α-amilasa pancreática tampoco es capaz de cortar ligaciones del tipo α-1  6, además de tener baja afinidad por ligas 1 a 4 adyacentes a las ramificaciones. De esta manera, la acción de la α-amilasa pancreática da como resultado final la liberación de grandes oligosacáridos (dextrinas, con al menos una ligación α-1  6 y con terminación α) conteniendo cerca de ocho unidades monoméricas de glucosa (Lieberman et al., 2013). Los oligosacáridos por acción de las enzimas glucoamilasa son hidrolizados, removiendo secuencialmente una única unidad de glucosa de la extremidad no reducida, y así mismo formando moléculas de maltosa e isomaltosa.

Finalmente, la maltosa e isomaltosa son digeridas por disacaridasas específicas presentes en la membrana del enterocito, conocidas como maltasa e isomaltasa, dando como resultado final moléculas de glucosa libre (Lieberman et al., 2013).

2.2.2. α-glucosidasa

Las enzimas que catalizan las reacciones de hidrólisis son las hidrolasas, en especial de compuestos como éteres, péptidos, ésteres, ésteres de ácido fosfórico, anhídridos de ácido y los carbohidratos. Unas de las subclases de esta enzima son las glicósidos hidrolasas cuya función es actuar sobre los enlaces glicosídicos (α y β) de los poli, oligo y disacáridos para obtener monosacáridos, por lo tanto la α-glucosidasa pertenece a esta subclase de enzima (Avellaneda, 2013).

8 La α-glucosidasa se encuentra en el yeyuno específicamente en el borde del cepillo del enterocito, desarrollando funciones de tipo anabólico en la digestión de la etapa final de la degradación de los carbohidratos y como función principal realizar la hidrólisis del enlace glucosídico catalizada por cada carbohidrato-hidrolasa es una reacción en la que el producto retiene (alfa  alfa o beta  beta) o invierte (alfa  beta o beta  alfa) la configuración anomérica del sustrato, es decir, que esta enzima se distingue esencialmente por la liberación de alfa-glucosa, fundamentalmente en los enlaces α 1,4 y 1,6 sobre los di y oligosacáridos obteniendo como producto final unidades de α- D-glucosa; además de hacer parte de la enzimas encargadas de la completa degradación del almidón (Avellaneda, 2013; Chiba, 1997).

Los principales beneficios obtenidos por el tratamiento con inhibidores de α- glucosidasa en pacientes diabéticos serían una reducción de la glucemia postprandial y una disminución en los extremos entre los niveles de glucosa postprandial máximo y mínimo. En pacientes con diabetes mellitus no insulino-dependiente (DMNID) una reducción de la glucemia postprandial seria conveniente (Lebovitz, 1997).

La unión de carbohidratos con los inhibidores de α-glucosidasa retrasara la digestión de estos. El carbohidrato que no se digiere, es lentamente digerido por las enzimas α- glucosidasa en el yeyuno distal y el íleon. Cuando la actividad enzimática es insuficiente en el intestino delgado distal, el carbohidrato pasa a intestino grueso donde las bacterias metabolizan el carbohidrato a ácidos grasos de cadena corta, hidrógeno, dióxido de carbono y metano. La magnitud y el curso del tiempo de la elevación glucémica postprandial dependen del contenido de carbohidratos de la dieta, el grado de inhibición de las enzimas α- glucosidasa en el yeyuno proximal y las actividades de la enzima α-glucosidasa en el yeyuno distal y el íleon (Lebovitz, 1997).

9 2.3. Enzimas digestivas relacionadas con la digestión de las grasas

Las grasas, aceites y los lípidos están formados por un gran número de compuestos orgánicos, entre los que se incluyen los ácidos grasos, monoacilgliceroles, diacilgliceroles, triacilgliceroles, fosfolípidos, eicosanoides, resolvinas, docosanoides, esteroles, ésteres de esteroles, carotenoides, vitaminas liposolubles, alcoholes grasos, hidrocarburos y ésteres de ceras (FAO & FINUT, 2010). Se encuentran clasificados en tres principales grupos de acuerdo con el grado de insaturación (presencia de dobles enlaces) como lo son los ácidos grasos saturados (AGS) no presentan, los ácidos grasos monoinsaturados (AGM) tienen uno solo y los ácidos grasos poliinsaturados (AGP) cuentan con dos o más. Estas se encuentran en los tejidos animales y vegetales que se consumen en la dieta (FAO & FINUT, 2010).

Los adultos ingieren cerca de 100 a 150 g por día de grasa, cerca de un 95 a 98%

corresponden en mayor parte a los triglicéridos. En el proceso de digestión se utilizan varias enzimas para la emulsificación, hidrólisis y formación de las micelas. Se hará énfasis en el proceso de la enzima lipasa pancreática (Silva & Mura, 2011b).

2.3.1. Lipasa pancreática

La lipasa pancreática es una carboxil esterasa con una fuerte preferencia por acilglicéridos sobre fosfolípidos, ésteres de colesterol y galactolípidos (Lowe, 2002).

En los seres humanos, la digestión de los triglicéridos en la dieta comienza en el estómago, donde la lipasa gástrica libera alrededor del 15% de los ácidos grasos (Lowe, 1997).

La lipasa pancreática es una enzima exocrina del jugo pancreático, esta es secretada por las células acinares para cumplir esencialmente la absorción en los enterocitos sobre las grasas provenientes de la dieta siendo responsable de un 50 a 70%

(Mukherjee, 2003). Inicialmente se da la digestión con la lipasa gástrica y se completa en el intestino delgado proximal, con la liberación de la colecistoquinina para estimular la secreción de las enzimas pancreáticas (lipasa pancreática junto con la colipasa (proteína pancreática)) y la contracción de la vesícula biliar para producir bilis que va

10 directo hacia el duodeno para así comenzar con la absorción de las grasas. La función principal que tiene es hidrolizar los ácidos grasos (cualquier longitud de cadena ) que se sitúen en las posiciones 1 y 3 de la porción glicerol del triacilglicerol, obteniendo como resultado ácidos grasos libres y 2-monoacilglicerol (un glicerol con un ácido graso en la posición 2) (Lieberman et al., 2013). Por lo tanto, la inhibición de esta enzima promovería una menor absorción de la grasa.

2.4. El género Passiflora

La familia Passifloraceae incluye acerca de 18 géneros y 630 especies, que están distribuidos en la región tropical, mayormente en el Sur de América. Más de 58 especies endémicas en Colombia son halladas entre las altitudes de 1500 y 2500 metros y pertenecen principalmente, a las secciones de Tacsonia y Decaloba, y el género Passiflora (Casierra-Posada & Jarma-Orozco, 2016). Entre las especies más conocidas están, curuba (P. tripartita var. mollissima), el maracuyá (Passiflora edulis var.

flavicarpa), cholupa (P. maliformis), gulupa (P. edulis var. edulis), badea (P.

quadrangularis), curuba de india (P. tarminiana) (Carvajal et al., 2014). P. manicata, especie de interés en este trabajo, también conocida como ‘curuba de monte’, se identifica por presentar frutos pequeños, poco jugosos, poco agradable, no comestible debido a la bajo contenido de pulpa, de tal manera que no puede favorecer el ámbito comercial y alimenticio (Bernal & Diaz, 2005).

El principal uso de las especies de Passiflora se da no solo en la industria alimentaria con el consumo de la fruta ya sea fresca o procesada, sino también, en el área farmacéutica como ingredientes activos en cosméticos y/o productos fitoterapéuticos (Casierra-Posada & Jarma-Orozco, 2016). Gran parte de los estudios realizados recientemente, están enfocados en P. edulis, P. incarnata, P. alata, P. ligularis tanto químicamente como farmacológicamente, en especial como potenciales sedantes, anti- inflamatorios, antioxidantes e hipoglicemiantes (Colomeu et al., 2014; Gupta et al., 2012; Da Silva et al., 2013; Deng et al., 2010), mientras que para la especie P.

manicata, hay pocos estudios científicos.

11 Algunas de las actividades biológicas previamente reportadas para esta planta, está el potencial citotoxicidad in vitro contra células de linaje tumoral del extracto metanolico de las hojas y su capacidad para interactuar con enzimas (Morrone et al., 2013).

Adicionalmente, el extracto metanolico de las hojas proporcionó protección contra el estrés radical, es decir, que actúa como depurador de radicales libres como especies reactivas de oxígeno (ROS) en modelos in vivo (Morrone et al., 2013).

En relación con los aspectos químicos, en la mayoría de las especies de Passiflora se ha destacado la gran cantidad de flavonoides C-glicósidos, además de poseer saponinas y alcaloides del tipo harmano (Casierra-Posada & Jarma-Orozco, 2016). Especialmente en P. manicata, se reportan flavonoides C-glicosidico, siendo compuesto mayoritario el flavonoide isovitexina que está presente en las hojas (Bonilla, 2016; Morrone et al., 2013). Estudios realizados han evaluado la asociación directa entre el contenido de flavonoides, el tipo de mecanismo inhibitorio con respecto a la actividad biológica sobre las enzimas digestivas α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática (Costa et al., 2015; Kim et al., 2000; Teixeira et al., 2014; Yang et al., 2014; Piparo et al., 2008).

3. FORMULACIÓN DE PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

La tendencia mundial sobre el uso de las plantas medicinales con la finalidad de mejorar la salud de las personas se ha demostrado por medio de estudios etnobotánicos en diferentes países, géneros y especies (Sofowora, Ogunbodede, & Onayade, 2013).

Algunos estudios realizados demuestran que el mayor uso de plantas medicinales se da en países subdesarrollados, en donde el nivel de atención médica es escaso o nulo y el costo de los medicamentos es elevado, de manera que concluyen que el uso de la medicina tradicional es una solución adecuada para los problemas de salud en estas poblaciones (Abe & Ohtani, 2013; Maroyi, 2013). Alteraciones metabólicas como la hiperglicemia e hipertrigliceridemia son problemáticas de salud relevante en países como Colombia donde la prevalencia de ECNT es creciente (Perrasse et al.,2003;

Múnera et al., 2012; Asociación Colombiana de Endocrinología, 2015), por lo tanto, estudios con plantas nativas que puedan incidir en estas alteraciones son pertinentes.

12 En Colombia el uso de especies nativas sobresalen en diferentes regiones del país que contribuyen con las enfermedades digestivas, infecciosas, del sistema nervioso y del sistema inmune entre las cuales se destacan Melissa officinalis (Toronjil), Cymbopogon citratus (Citronela), Matricaria chamomilla (Manzanilla), y especies de Passiflora (granadilla, maracuyá) (Cadena-González et al., 2013; Pabón et al., 2014).

Cerca del 70% de las especies de Passiflora que han sido reportadas están concentradas en la región Andina del país, ya que la altitud es superior a 1500 m.s.n.m., lo que permite un adecuado crecimiento (Polidoro & Lozano, 1988). En el género de Passiflora, se destacan entre los componentes químicos los flavonoides C-glicosídicos (Li et al., 2011; Costa et al., 2013). En relación con las actividades biológicas más descritas son actividades antioxidantes, ansiolíticas/sedantes, hipoglicemiantes (Colomeu et al., 2014; Gupta et al, 2012; Da Silva et al., 2013; Deng et al., 2010).

Como se mencionó anteriormente, el género Passiflora ha sido muy estudiada, sin embargo, en el caso de P. manicata, se requieren más estudios por sus propiedades, además del potencial de acción que puede tener en relación del beneficio de la salud de las personas como un futuro tratamiento en hiperglucemia y hipertrigliceridemia.

En este contexto, se plantea como problema de investigación, contribuir al conocimiento de la actividad biológica de P. manicata evaluando las actividades inhibitorias de enzimas digestivas (α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática) del extracto y sus fracciones en modelos in vitro, con fines de identificar en P. manicata futuros potenciales nutricionales, químicos y/o farmacológicos.

Pregunta de investigación:

¿Cuál es la actividad inhibitoria del extracto y fracciones de las hojas de Passiflora manicata sobre las enzimas digestivas α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática?

13 4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo General

Analizar la potencial actividad inhibitoria del extracto y fracciones de las hojas de Passiflora manicata sobre enzimas digestivas α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática.

4.2. Objetivos específicos

• Determinar la actividad inhibitoria del extracto y fracciones sobre las enzimas α- amilasa, α-glucosidasa, y lipasa pancreática, mediante estudios in vitro.

• Evaluar la composición química parcialmente del extracto y fracciones obtenidos a partir de las hojas de P. manicata.

5. HIPÓTESIS

El extracto y fracciones de las hojas de P. manicata presentan elevada actividad inhibitoria en las enzimas digestivas (α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática).

6. MATERIALES Y MÉTODOS

A continuación, en la figura 1 se sintetiza la metodología y métodos realizados en el desarrollo del estudio.

14 Figura 1. Flujograma de la metodología realizada.

Fuente: Elaboración propia

6.1. Material vegetal y extracción

El extracto vegetal se encontraba disponible en las cantidades adecuadas para iniciar a realizar el fraccionamiento y las pruebas fitoquímicas. El extracto fue preparado anteriormente durante el desarrollo de la tesis de Doctorado del docente Geison Modesti Costa (2013). Brevemente, se hizo la recolección de la muestra en Villa de Leyva, Boyacá, en 2011. En cuanto al proceso de extracción de las hojas de P.

manicata, se hicieron procedimientos de secado (40 °C), triturado, luego se extrajo por infusión acuosa (95 °C, relación planta:solvente 1:10, m/v) por 10 minutos (El tiempo estimado es de uso popular y acorde a trabajos previos en los cuales los compuestos son estables a esas condiciones). Posteriormente, el extracto fue filtrado, congelado y finalmente, liofilizado para almacenarlo a temperatura de -20 °C (Costa, 2013).

6.2. Fraccionamiento y caracterización química del extracto

El proceso de fraccionamiento se desarrolló a partir de la solubilización del extracto acuoso crudo liofilizado, posterior a ello se realizó la partición líquido - líquido con solventes orgánicos cuyo fin era obtener dos fracciones orgánicas y una fracción residual acuosa. Posteriormente se rota-evaporaron para obtener las fracciones

15 concentradas, mientras que para la fracción de residuo acuoso se realizó ese procedimiento junto con liofilización (Anexo 2).

La caracterización química del extracto y las fracciones fuer evaluada por medio de diferentes técnicas como cromatografía de capa delgada (CCD) para conocer el perfil de fenoles y flavonoides (Costa, 2013), y por espectrofotometría UV-Vis para la cuantificación de fenoles totales este se desarrolló con el método de Folin-Ciocalteu (Lévuok, 2016), (Anexo 2).

6.3. Evaluación de la actividad inhibitoria de α- amilasa

El ensayo de la actividad inhibitoria de α- amilasa fue desarrollado según el protocolo de (Rey, 2015), que esta descrito en el anexo 3.

6.4. Evaluación de la actividad inhibitoria de α-glucosidasa

El ensayo realizado para el análisis de la actividad inhibitoria de la enzima fue por el protocolo descrito por (Rey, 2015), ver en el anexo 4.

6.5. Evaluación de la actividad inhibitoria de lipasa pancreática

El ensayo fue desarrollado según el protocolo descrito por (Lévuok, 2016), ver en el anexo 5.

6.6. Análisis estadístico

El análisis estadístico fue desarrollado por medio del programa GraphPad Prism 6, en donde los valores CI50 se obtuvieron por medio de un análisis de regresión no lineal, mientras que el análisis de correlación se realizó por medio de la correlación de Pearson, ya que permite obtener la relación lineal de dos variables aleatorias y cuantitativas. Los datos reportados fueron de la media de 3 repeticiones.

16 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1. Fraccionamiento del extracto

A partir de 2 540 mg de extracto acuoso crudo se realizó el fraccionamiento y se obtuvo que la fracción de acetato de etilo logró una concentración de 88.8 mg con 3.49% de rendimiento, mientras que la fracción n-butanol presento una concentración de 163 mg con un 6.42% de rendimiento, al hacer la comparación con los porcentaje del estudio in vivo de la misma planta, en este caso, se tomaron 500 mg del extracto y obtuvieron que el mejor rendimiento fue de la fracción n-butanol que la fracción de acetato de etilo lo que induce que esta fracción por su polaridad tiene mayor atracción por los compuestos del extracto (Torres & Venegas, 2016), mientras que el residuo acuoso alcanzó a 1 580 mg con el 62.20% de rendimiento.

7.2. Composición química de P. manicata 7.2.1. Perfil de fenoles y flavonoides

La CCD es un método cualitativo cuya función principal es la separación de compuestos orgánico de acuerdo con su polaridad, en este caso se observó el perfil de fenoles y flavonoides. En la figura 2 se observa que la fracción n-butanol tiene un elevado perfil de compuestos y probablemente está asociado con el porcentaje de rendimiento que tiene la fracción orgánica, en comparación con el extracto, la fracción acetato de etilo y el residuo acuoso. El compuesto con Rf:2 para la fracción acetato de etilo es mayor debido a que extrajo los compuestos de menor polaridad, sin embargo, tanto en la placa A como en la B, el extracto y la fracción n-butanol se presencia una mancha con una alta intensidad a lo que se indica que son flavonoides por la coloración amarilla que tiene la placa A. Según un estudio previo realizado por el grupo de investigación, para el mismo extracto de P. manicata analizado en este trabajo, el análisis químico por HPLC-UV/DAD se encontró como flavonoide mayoritario la isovitexina como se muestra en la figura 3 en el pico 3, seguido de la isoorientina (pico 1) y en menor cantidad de la vitexina (pico 2) (Morrone et al., 2013), el cual puede

17 estar asociado con las manchas de mayor connotación en la placa A y B de la fracción n- butanol.

Figura 2. Cromatografía de capa delgada en el extracto y las fracciones de P. manicata.

Condiciones cromatográficas: FE: Sílica gel; FM: acetato de etilo:acetona:ácido acético:agua (6:2:1:1, v:v:v:v); Revelador: A-Vainillina Sulfúrica, B -Luz UV 254nm.

Nota: se realizaron los Rf para la distancia recorrida del extracto y las fracciones.

Extracto: 1: 0.53 - 2: 0.59 - 3: 0.68 ; Acetato de etilo: 1: 0.59 - 2: 0.68 ; n-butanol: 1: 0.46 - 2: 0.53 - 3: 0.59 - 4: 0.68 - 5: 0.70 ; Residuo acuoso: 1: 0.59 - 2: 0.68

Figura 3. Perfil de HPLC–DAD del extracto acuoso crudo de hoja de P. manicata a 340 nm. 1: Isoorientina; 2: Vitexina; y 3: Isovitexina.

Tomado de: Morrone et al., 2013

18 7.2.2. Cuantificación de fenoles totales

Por medio del método cuantitativo del Folin- Ciocalteu se determinó la cuantificación de fenoles, para ello se relacionó la ecuación de la curva de calibración de mg Equivalentes de ácido gálico (mgEAG) (ver anexo 1) con las absorbancias del extracto y fracciones de los cuales se presenta que la fracción n-butanol tiene una mayor cantidad de fenoles totales, seguido del extracto crudo, residuo acuoso y en menor cantidad la fracción de acetato de etilo como se observa en la tabla 2 respectivamente.

Se estima que la mayor cantidad de fenoles está relacionado con la capacidad antioxidante que contiene el extracto, demostrados mediante ensayos in vitro de la capacidad antioxidante reactiva total (TRAP) y capacidad antioxidante total (TAR) en la eliminación de radicales peroxilo (Morrone et al., 2013).

Tabla 2. Contenido fenólico total (mgEAG)

Contenido fenólico total (mg EAG)

Extracto crudo 0.081 0.085 0.078

Fr. AcOEt 0.046 0.050 0.041

Fr BuOH 0.127 0.140 0.144

Residuo H20 0.055 0.060 0.062

7.3. Actividad inhibitoria del extracto y fracciones de las hojas de P. manicata sobre las enzimas digestivas α-amilasa, α-glucosidasa y lipasa pancreática.

7.3.1. Inhibición de α-amilasa y α-glucosidasa

La enzima α-amilasa y α-glucosidasa tienen la importante función en la hidrólisis de los carbohidratos para ejercer una adecuada digestión en el organismo. Por lo tanto, la presencia de inhibición de estas puede contribuir con el retraso y a su vez un prolongamiento en el tiempo de la digestión de los carbohidratos a nivel intestinal, de tal manera que se disminuye la tasa de absorción de glucosa para evitar el aumento de hiperglicemias (Liu et al., 2013).

En relación con la actividad biológica del extracto y fracciones sobre la α-amilasa presentada en la tabla 3, en donde se relaciona la concentración a la cual fue expuesto

19 el extracto, el porcentaje de inhibición obtenido y la concentración inhibitoria 50 (CI50) que se refiere a la concentración para que haya una inhibición del 50% y así lograr obtener actividad enzimática (Yilmazer-Musa et al., 2012). Primeramente, se observó en la mayor concentración de la fracción n-butanol (4 mg/mL) se presenta un porcentaje de inhibición de 96.8% con un CI50 de 0.937 ± 0.01, que en relación con el patrón acarbosa (0.80 ± 0.01), tiene un efecto inhibitorio significativo sobre la enzima lo que indica que directamente está asociado con el contenido de fenoles totales mencionado anteriormente en los ensayos y que probablemente tiene el mismo potencial que el patrón, mientras que, la fracción acetato de etilo a la misma concentración no presento actividad debido a su bajo contenido de fenoles y flavonoides observados en la CCD. Por otra parte, el extracto y el residuo acuoso para obtener un mejor resultado de inhibición se requirió una mayor concentración de la muestra para el ensayo de 30 mg/mL, ya que el contenido de flavonoides, aunque está presente no es muy activo en bajas concentraciones. El extracto alcanzo una CI50 de 12.64 ± 6.52, mientras que el residuo acuoso fue de 8.46 ± 8.98 que comparado con el patrón indica que presentan actividad enzimática, sin embargo, no se puede conocer de qué tipo de mecanismo inhibitorio tiene.

En la figura 4 se relaciona el porcentaje de inhibición del extracto y el residuo acuoso con la concentración utilizada para obtener el punto de unión en la CI50 de las dos variables que refleja la mitad de actividad, además, de observar que hay una mejor actividad en el extracto que en el residuo acuoso, una posible razón es porque en el extracto se encuentran todos los compuestos, mientras que los residuos restantes del fraccionamiento están el residuo acuoso.

En cuanto a los resultados obtenidos en la tabla 4 para α-glucosidasa, el porcentaje de inhibición enzimática denota que solo la fracción n-butanol exhibió una inhibición del 21% siendo la única que presenta actividad, pero el porcentaje no alcanza a cubrir el valor mínimo para realizar un CI50 por lo cual se requiere sacar una curva de concentraciones para lograr obtener una mayor actividad con esta fracción, es decir que a pesar de que se presentó una baja actividad hay una asociación positiva con el

20 contenido de fenoles totales, mientras que, por el contrario, las demás no tienen actividad alguna presente para inhibir la enzima.

Se estima que la funcionalidad de la acarbosa (pseudotetrasacárido) es dada por medio de un mecanismo inhibitorio competitivo sobre estas enzimas, en donde la absorción de este a nivel del intestino delgado es más rápida cuyo fin es de generar un efecto terapéutico sobre la presencia de hiperglicemia. Estudios realizados acerca del mecanismo inhibitorio que tienen los flavonoides indican su correlación con la cantidad de los grupos hidroxilo en el anillo B del esqueleto ya que favorecen que el ligando interactúe con los residuos del centro catalítico y probablemente está asociado con el mismo mecanismo de la acarbosa (Tadera et al., 2006; Piparo et al., 2008). Del mismo modo otro estudio relaciona el potencial inhibitorio de los flavonoides como la isoorientina, isovitexina y vitexina con un efecto inhibitorio elevado adicionalmente que demuestran que estos presentan un mecanismo de tipo competitivo, de manera que seguramente esta directamente asociado con los porcentajes de inhibición que presentaron los resultados del extracto y fracciones para la enzima α-amilasa y α- glucosidasa en especial de la fracción n-butanol (Yang et al., 2014). Por otra parte, recientes estudios estos indican que se requiere de mayor CI50 de extracto para observar presencia de actividad en la enzima α-glucosidasa que en α-amilasa, que está relacionado con los valores obtenidos en el presente estudio, sin embargo, la actividad inhibitoria que exhibe la fracción n-butanol indica que podría considerarse promisoria para futuros estudios con enfoque en tratamientos de hiperglicemia (Tadera et al., 2006;

Lévuok, 2016; Costa et al., 2015).

21 Tabla 3. Porcentajes de inhibición α-Amilasa

NA: No activo.

Figura 4. Porcentaje de inhibición de α-amilasa con el extracto crudo y el residuo acuoso.

L o g [ ] m g / m L

% de Inhibición-Amilasa

0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0

0 2 5 5 0 7 5 1 0 0

E x t r a c to C r u d o R e s id u o a c u o s o

Log [ ]

g/mL

[ ] extracto

mg/ml

Extracto Crudo Residuo acuoso

Log [ ]

g/mL [ ] extracto

mg/ml

Fracción n-butanol Fracción Acetato de etilo

4.079181 30 88.1 60.8 74.4 76.6 73.4 85.5 0.602060 4 96.2 96.8 97.6 57.3 31.1 49.2

3.778151 15 60.7 68.6 52.9 49.7 58.9 58.2 0.301030 2 66.4 66.4 66.8 -0.3 -6.9 1.4

3.477121 7.5 25 35.3 27.6 38.9 55.8 47.35 0.000000 1 39.1 39.2 39.1 -28.2 -37.7 -42.4 3.176091 3.75 15.5 13.9 14.7 37.1 38.4 39.7 -0.301030 0.5 31.4 31.1 32.8 -27.9 -29.9 9.6

2.875061 1.87 5 8 7 21.9 33 30 -0.602060 0.25 28 28.3 25.7 -14.2 -21.4 -7.3

2.572872 0.935 2 1 3 0 0 0 -0.903090 0.125 14.4 17.9 24.2 -5.8 -3.1 -2.0

CI50 12.64 ± 6.52 8.46 ± 8.98 CI50 0.937 ± 0.01 NA

Acarbosa 0.80 ± 1.0

22 Tabla 4. Porcentajes de inhibición α-glucosidasa

Log [ ]

g/mL

[ ] extracto

mg/ml

Extracto Crudo Residuo acuoso Log [ ]

g/mL [ ] extracto

mg/ml Fracción n-butanol Fracción Acetato de etilo 3.380211 12 -79.9 -63.9 -61.0 -21.9 -38.6 -24.1 2.602060 2 21.4 21.1 20.7 -4.1 -15.3 -27.2

3.079181 6 -50.9 -41.1 -61.3 -19.5 -27.4 -24.5 2.301030 1 17.8 17.9 18.1 8.8 12.5 12.0

2.778151 3 -31.0 -30.5 -31.9 -21.6 -34.8 -17.3 2.000000 0.5 14.5 29.2 13.4 -12.0 -18.1 -15.4 2.477121 1.5 -14.0 -10.0 -18.9 -27.6 -50.0 -37.4 1.698970 0.25 9.9 22.6 12.9 -18.1 -21.0 -24.3 2.176091 0.75 -26.0 -23.4 -33.4 -29.7 -51.6 -39.9 1.397940 0.125 14.6 26.7 19.8 -10.3 12.0 -3.5 1.875061 0.375 -38.9 -24.2 -36.7 -23.2 -44.0 -31.6 1.096910 0.0625 8.2 37.5 14.0 -31.5 -35.9 -38.3

CI50 NA NA CI50 BA NA

Acarbosa 104 ± 2.9

NA: No activo; BA: Baja actividad

23 7.3.2 Inhibición de lipasa pancreática

La función principal de la lipasa pancreática está asociada a la digestión y absorción de las grasas provenientes de la dieta, precisamente en la hidrólisis de los triglicéridos para ser convertidos en monoglicéridos y ácidos grasos (Liu et al., 2013). Por lo tanto, la inhibición de esta enzima por parte del extracto y fracciones puede permitir un mayor conocimiento de la actividad biológica que presenta y brindar vía a un posible tratamiento para alteraciones metabólicas como la hipertrigliceridemia.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos para la tabla 5, se evidenció que la mayor actividad enzimática de P. manicata está más asociada a la fracción n-butanol dado a su porcentaje de inhibición del 100% a una concentración de 9 mg/mL y un CI50 de 90.82 ± 5.10, en comparación con el patrón Orlistat que presenta 4.41 ± 2.04 se induce que el potencial inhibidor de esta fracción es significativamente alto relacionado con el porcentaje de rendimiento que tiene y el elevado contenido de fenoles totales. Con respecto al extracto se observa que a la misma concentración de la fracción n-butanol tiene actividad inhibitoria con un CI50 de 240.7 ± 4.49, por lo cual indica que requiere de una mayor concentración para generar el efecto enzimático. En cuanto al residuo acuoso y la fracción de acetato de etilo no presentaron resultados consistentes acordes a la concentración en la cual se realizó para obtener un CI50 confiable, es por ello que no se puede predecir si existe inhibición de alguna de estas. Como se refleja en la figura 5, la asociación directa que tienen el extracto y la fracción n-butanol sobre la inhibición de la enzima es evidente, ya que la afinidad de la fracción permite que haya inhibición en menores concentraciones que el extracto, además de establecer una fuerte correlación de los compuestos fenoles por la actividad enzimática.

El orlistat tiene como mecanismo de acción la unión covalente al residuo de serina del sitio activo de la lipasa lo que conlleva a reducir la hidrólisis de triglicéridos y el tipo de cinética competitiva con el sitio de unión (Al-Omar et al., 2006). Sin embargo, el efecto inhibidor de los flavonoides va a ser directamente proporcional al número y posición de los grupos hidroxilo fenólicos, que los determinan como potenciales

24 inhibidores; Varios estudios demuestran la presencia de actividad de sobre la enzima lipolítica con CI50 de 7 mg/mL (extracto acuoso) en catequina, quercitrina y rutina (Buchholz & Melzig, 2015), que son más cercanos al valor del orlistat mientras que en comparación con un estudio realizado con otra especie el IC50 correspondió a 250 ± 5.40 con extractos hidro-alcohólicos (Lévuok, 2016), que corresponde a la misma respuesta obtenida para el extracto, sin embargo para la fracción n-butanol se destaca que la actividad enzimática es más activa, con probabilidades de continuar estudiándola con el fin desarrollar nuevos tratamientos sobre la hipertrigliceridemia a futuro.

25 Tabla 5. Porcentajes de inhibición lipasa pancreática

NA: No activo

Log [ ]

g/mL

[ ] extracto

mg/ml

Extracto Crudo Residuo acuoso Fracción n-butanol Fracción Acetato de etilo 3.000000 9 69.27 61.65 53.94 13.40 12.10 21.16 100.00 100.00 100.00 82.73 90.33 85.46 2.698970 4.5 54.30 53.40 55.20 28.49 59.18 43.83 100.00 100.00 100.00 88.70 74.18 64.50 2.397940 2.25 45.56 54.56 50.05 26.89 26.60 27.18 78.65 74.06 67.90 64.50 75.80 49.92 2.096910 1.125 42.50 42.25 53.03 39.94 17.42 62.46 63.70 43.80 60.00 63.26 55.97 70.26 1.794139 0.562 35.87 42.87 44.37 65.82 77.11 64.50 24.22 30.54 36.86 73.03 70.18 74.85 1.494850 0.281 40.20 40.93 40.48 56.57 51.93 61.22 23.40 21.55 20.11 74.34 73.68 78.91 1.193125 0.141 30.76 30.29 30.09 51.09 58.57 60.42 10.00 10.00 10.00 71.13 70.48 69.50 0.892651 0.070 25.78 28.83 27.75 53.21 54.08 34.69 5.00 5.00 5.00 71.06 79.37 75.22

CI50 240.7 ± 4.49 NA 90.82 ± 5.10 NA

Orlistat 4.41 ± 2.04

26 Figura 5. Porcentaje de inhibición de lipasa pancreática con el extracto crudo y la fracción n-butanol.

L o g [ ]g /m L

(%) inhibición lipasa pancreática

0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 0 2 . 5 3 . 0 3 . 5 4 . 0 0

5 0 1 0 0 1 5 0

P . m a n i c a t a ( E x . c r u d o ) F r a c c i ó n n - b u t a n o l

7.3.3. Correlación por el coeficiente de Pearson con las enzimas lipasa pancreática y α-amilasa.

Según el coeficiente de Pearson, se establece la correlación de la actividad biológica de las enzimas lipasa pancreática y α-amilasa con el contenido fenólico total (mg EAG), por lo tanto, la figura 6 representa la capacidad inhibitoria para lipasa pancreática que presenta un r² de 0.9261 con un efecto (***Pvalor: <0.003) que indica que es estadísticamente muy significativo a diferencia de la α-amilasa que cuenta con un r²: 0.7569 junto con un efecto (*Pvalor: <0.0182) que solo es significativo en relación a la actividad presente, que evidencia la correlación directa con el contenido fenólico total positivamente. En un estudio realizado por (Lévuok, 2016), precisa actividad en enzimas como α-amilasa con un r²:0.7090 que es semejante al que resultado obtenido de correlación, mientras que este no presenta asociación en lipasa pancreática. En relación con la dosis-respuesta de diferentes extractos que inhiben la actividad enzimática con un alto contenido fenólico, el análisis de correlación indica