Comparación de metodologías para la purificación de proteínas de membrana externa de Brucella abortus
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(2) REVISTA ICA, Vol. 25, Julio - Septienthre 1990. teins were characterized by polycrilamide gel electrophoresis. Detergent and lysozyme treatment demonstrated superiority over SDS extraction regarding selectivity, antigenicity and yield. The proteins obtained from strain RB-51 had less LPS contamination. The molecular weights of the porin proteins obtained ranged between 37 and 41 kD, and a 14 kD protein was also detected. Specific reaction of the purified proteins was detected by western-blotting with positive bovine control serums.. Additional Index Words: Sonication time, dipolar detergents.. La brucelosis bovina es una enfermedad prevalente en Ia mayoria de los paises del mundo. En Colombia esta enfermedad ha estado presente en diferentes especies animales y en el hombre desde hace más de 50 anos (15, 16). Aunque los programas de control han logrado lievar los porcentajes de infecciOn desde un 14% en 1961 hasta un 4% en 1986, Pena y colaboradores (30) mediante estudios epidemiolOgicos han reportado que actualmente existe una p0blaci6n a riesgo de más de 10 miliones de bovinos. Las elevadas pérdidas econOmicas ocasionadas por esta enfermedad, se deben principalmente a infertilidad, abortos y disminuciOn en Ia producciOn de leche, haciendo de esta infecciOn una de las de mayor prioridad en investigaciOn,. Además Ia brucelosis es una zoonosis de reconocida importancia que afecta principaimente a personal involucrado en el manejo de ganado y sus subproductos (2, 15, 16). El agente causal, Ia B. ahorrus, es un patOgeno intracelular y como tal, Ia inmunidad mediada por céluias desempena un papel fundamental en Ia inducciOn de Ia protecciOn, mediante Ia estimulaciOn de los linfocitos Ic por antigenos exterrios generaimente de naturaleza proteica (1, 3, 12, 31). Los antigenos principales de Ia brucelia son el lipopolisacärido (LPS) y las proteinas de membrana externa. Algunos autores entre elios Berman (5) y Dubray y coiaboradores (11) han demostrado que ci LPS es el antigeno diferenciai entre cepas lisa y rugosa, se sabe además, es un factor de activaciOn policlonal inespecIfica para Ia producciOn de anticuerpos por los linhocitos B (9, 27). Actualmente, los programas de control de Ia brucelosis bovina se realizan a través de Ia vacunaciOn de hembras entre los tres y nueve me194. ses de edad, con B. abortus, Cepa 19(12, 16), Ia cual induce un aumento en los tItulos de anticuerpos, titulos que persisten durante tiempos variables post-vacunaciOn y dificultan ci diagnOstico. Además, las preparaciones crudas empleadas como antigenos para el diagnOstico consisten esencialmente de lipopoiisacärido asociado a protelnas, el cual estimula Ia roducciOn de anticuerpos que pueden dar reacciones cruzadas con los lipopolisacáridos de otras bacterias Gram negativos como Ia Y. enterocolitica 0:9, E. coIl 0:116, E. coli 0:157, F. rularensis, Salmonella urbana, Salinonella kauffinann- White y Canpilohacrer fetus (2, 27,32). Dc esta manera, sOlo Ia utilizaciOn de un antigeno purificado, de cadena 0 presente unicamente en cepas lisas, permitiria Ia diferenciaciOn entre animales infectados naturalmente y vacunados (2, 9,32,34). Por 10 anterior, y con ci objeto de apoyar mãs efectivametne los planes de control de Ia enfermedad, ha sido necesarlo buscar pruebas más especIficas y confiables, que evaluen otro tipo de respuesta inmune, diferente a Ia inducida por el lipopolisacárido, como es el caso de Ia producida por las proteinas de membrana externa (12, 38). La caracterizaciOn inicial de las proteinas de Ia membrana externa de B. abortus fue realizada por Douglas y colaboradores (10) y Verstreate y colaboradores (36), quienes identificaron tres grupos de proteinas con base en sus pesos moleculares, empleando geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS PAGE). El grupo 1 comprende proteinas que van de 88 a 94 kD, ci grupo 2 proteinas entre 34 y 40 kD, los cuales posteriormente se denominaron porinas, pues se comprobO que form an poros de difusiOn a través de los cuales penetran compuestos hidrofilicos de bajo peso molecular (10, 29). Se cree que estas son las protelnas antigénicas debido a su mayor.
(3) FORERO DE LLERAS, C. ET AL. Metodologlas para Ia purificaciôn de proteinas.. exposiciOn al sistema inmune (29, 38), presentan asociaciones con Ia capa de peptidoglican, siendo su extracciOn eficiente sOlo después de una digestion con lisozima (25, 26), Par ültimo el grupo 3 comprende protelnas de 25 a 30 kD y al igual que las del grupo 2 presentan relaciOn antigenica entre cepas de diferentes especies de Brucella (11, 37). El propósito de este trabajo fue purificar las proteinas de membrana externa (porinas grupo 2) de dos cepas, de B. abortus a traves del empleo de metodologias bioquimicas que permitan conservar su estructura antigénica, ya que estas participan primordialmente en Ia inducciOn de respuesta inmune (1, 7, 13, 28). A su vez estas serian ant igenos más especificos para evaluar Ia protecciOn y realizar pruebas in vitro tales coma inmunotransferencia, inmunoenzimäticas (ELISA), además de pruebas de evaluaciOn de respuesta inmune celular coma Ia blastogenesis y Ia citotoxicidad,. taciOn por 18 h, a 4°C y posteriormente por Cabr a 65°C durante una hora (11, 38). Se realizaron pruebas de inocuidad durante 96 horas post-inactivaciOn a todos los cultivos trabajados. Luego de centrifugaciOn a 5000 x g y de realizar lavados con buffer fosfato salino (PBS) (pH 7.2), el precipitado se reconstituyO en buffer TrisHCI (BT) 10 mM, pH 7,5 (36, 38), agregando RNasa y DNasa (Sigma Chemical Co.) en una proporciOn de 1 mg/100 ml de suspensiOn de cada una de ellas. La ruptura bacterial se IlevO a cabo por medio de sonicaciOn (4, 24) buscando alcanzar un maximo porcentaje de lisis entre 2 y 45 minutos en baño de hielo. Para sonicaciones mayores de 10 minutos se utilizaron intervalos de reposo cinco minutos y despues del tratamiento se centrifugO a 2.500 x g durante 30 minutos (Sorval RC-5) para obtener en el sobrenadante Ia fracciOn rica en membranas.. MATERIALES V METODOS Cultivo y Ruptura Bacterial Se utilizaron dos cepas de B. abortus; Ia vacunal(Cepa 19), cepa lisa yla RB-51, cepa rugosa, mutante estable de Ia cepa virulenta 2308 carente de la cadena 0 del LPS**. Esta Oltima fue cultivada en el Laboratorio de Bacteriologla de Investigaciones Médicas Veterinarias (LIMV-ICA) uti lizando Agar tn ptosa (Dif co- Laboratories) Segun el método de Alton y colaboradores (2). Posteriormente se comprobO Ia pureza de los cultivos y luego de 72 horas a 37°C las células se colectaron por media de un lavado suave sobre Ia superficie del agar con buffer fosfato (pH 7.2) para proceder a su almacenamiento a -70°C. Los cultivos fueron inactivados por sistemas diferentes en bUsqueda del método mäs seguro, pero a su vez de mayor rendimiento en funciOn de las protemnas y Ia conservaciOn de Ia capacidad antigenica de las mismas. Inicialmente, Ia inactivaciOn se realizO con formaldehido de 0.5 al 2% y agi-. * Suministrada de cultivos en fermentador por Ia Empresa Colombiana de Productos Veterinarios VECOL. "Suministrada por el Dr. G.G. Shunng (Virginia-Maryland College of Veterinary medicine, Blacksburg, Virginia. USA.. Extracción de Ia Membrana Interna y del Peptidoglican Para Ia extracciOn de Ia membrana interna se emplearon dos procedimientos. El inicial con material proveniente del sonicado por 2 minutos y ultracentrifugado a 150.000 x g por 1 hora a 4°C, cuyo pellet fue resuspendido en BT 10 mM, 1% EDTA y tratado con Triton x-100 al 1% por 2 horas a 22°C. El exceso de detergente fue eliminado por diálisis y se realizO hidrOlisis enzimática a liberaciOn de peptidoglican por tratamiento con Iisozima, 1 mg/50 ml a 37°C por 18 horas. En el segundo procedimiento, Ia fracciOn de membranas fue centnifugada a 154.400 x g, durante cuatro horas a 4°C y el precipitado denominado fracciOn rica en "membranas crudas" fue reconstruido en Tris HCI 10 mM con 5 mM de EDTA y N-laurilsarcosinata de sodio (Sigma Chemical Co,) al 0.5% (14, 35) y agitado por una hora a 23°C. El precipitado obtenido luega de una centrifugaciOn a 100.000 x g durante 30 minutos (fracciOn rica en membranas externas), fue reconstituldo en 20 ml de Tris-HCI por cada 10-20 mg de proteIna, y el detergente eliminado por UItrasonificaciOn a través de Ia membrana YM5 (Amicon Corp, Danvers, Mass). Cada fracciOn fue diluida con cuatra volumenes de Tris-HCI y fil195.
(4) REVISTA ICA, Vol. 25, Julio - Septiembre 1990. trada hasta obtener el volumen inicial dentro de Ia celda de ultrafiltraciOn (modelo 8200 Amicon Corp), el proceso se repitiO cuatro veces. Esta fracciOn libre de detergente se tratO con lisozima (Sigma Chemical Co.), en una proporciOn de 1 mg/SO mg de proteina (36) durante Ia noche a 37°C, posteriormente se centrifugO a 100.000 x 30 minutos a 4°C.. (5t 7h co., ONjsJ. 07C4... 43° 4'C C ,,'c'cccos,6o. 25og. 30. W—b— 75i. 4X 2. .,PC. S,d,meo,o delCo.. 700CC'30. Liberación de Proteinas de Ia Membrana Externa La solubilizaciOn de las proteinas de Ia membrana externa se IlevO a cabo con el detergente iOnico dipolar Zwittergent 3-14 (Calbiochem, San Diego Co.), 0.2% en Tris-HCI 10 mM, 0.25 M NaCl durante 1 hora a 37°C (17, 23, 35). El sobrenadante obtenido luego de centrifugaciOn a 100.000 x g durante 30 minutos (rotor Beckman SW50) contiene las proteinas solubilizadas (Figura 1). Estas se concentraron por ultracentrifugaciOn o por liofilizaciOn, segün Ia disponibilidad. En el proceso inicial se buscO separar las proteinas obtenidas por cromatografia de intercambia iOnico en gradiente de Tris-HCI 10 mM, 0.1% Zwittergent 3-14, 0.5 - 0.75 M (24). Con el objeto de solubilizar proteinas no solubilizadas por el detergente iOnico dipolar se adicionO Deoxicolato de sodio al 1 % por 1 hora a 37°C en agitaciOn al precipitado del paso anterior y se ultracentrifugO a 100.000 x g durante 20 minutos a 4°C (Figura 1).. Par otra parte, se realizó Ia extracciOn de las proteinas por el método de Rosenbusch (33) reportado por Moriyon y Berman en B. abortus (25), el cual consiste en una separaciOn diferencial de las envolturas celulares por medio de tratamientos con SDS y temperatura. La ruptura celular se efectuO igual que en el primer método, pero Ia fracciOn de x"membranas crudas" se resuspendiO en Tris-HCI, SOS al 2%, 2-fl-Mercaptoetanol al 0.7% y glicerol al 10% (SDS, 2-13 ME) en una proporciOn de 5 mg de membranalml de buffer. Se IlevO a 50°C durante 30 minutos con agitadOn, se centrifugO a 100.000 x g por 20 minutos, el precipitado recibiO un segundo tratamiento en a misrna forma, para asI obtener las envolturas Rosenbush, las cuales se resuspendieron en buffer (SDS-20-ME) con MgCl2 50 mM y se trataron a 37°C, durante 30 minutos. Luego de una centrifugaciOn a 100.000 x g durante una hora, el sobrenadante contiene las protenas de matriz a 196. 4°C. F,,,c,6., oh.bk ric.e,,. OflCa,fl,. 1COOW. o,. 30, 4°C. Ex,ncc;d,, so., Zc,nn,,.o,, 374 1(7000,7 304°C. eoo.n,1 (,od'.odo.). Ptt,t(j, * no.b,a.a. lOW1OI. FIGURA 1. Diagrama de flujo para obtención de proteinas de iembrana externa de B. abortus.. porinas. Para eliminar el exceso de SDS se realizO diãlisis extensiva con acetona al 20% en agua y luego contra agua destilada. Las proteinas se concentraron precipitando con 5 voICmenes de acetona frIa y luego resuspendiendo a la mitad del volümen (26).. Microscopia Etectrónica. Con el objeto de confirmar el grado de ruptura bacterial resultante de los efectos mecánicos realizados para obtener la membrana citoplasmática y debido a Ia deuiciencia observada con tinciOn bacterial corriente, se tomaron muestras de bacterias sin sonicar y sonicadas durante 20, 30 y 45 minutos, las cuales fueron fijadas en buffer Mihoning (18) con glutaraldehido al 5% durante 24 horas a temperatura ambiente, centrifugadas a 3.000 rpm durante 30 minutos y el precipitado fue resuspendido en agar noble al 2% una vez enfriado. Luego se cortaron pequeños bloques que fueron tratados con tetrOxido de osmio al 2% y deshidratados con etanol al 70%, 95% y 100% sucesivamente, Ia inclusiOn se realizO con una mezcla de Spurr y etanol al 100% La polimerizaciOn se llevO a cabo durante 48 horas a 60°C..
(5) FORERO DE LLERAS, C. ET AL. Metodologlas para Ia purificación de protemnas.. La tinciOn de los cortes ultrafinos se realizO con acetato de uranilo y citrato de plomo y posteriormente se observO en microscopio electrOnico (Jeol. Modelo bOB).. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida. Fue Ilevada a cabo segin el método de Laemmli (22) con geles de 10 y 12% T, se utilizO el buffer de extracciOn descrito por Rosenbuch (33) y la muestra se IlevO a 100°C por 10 minutos, se utilizaron como patrones de peso molecular (Pharmacia): fosforilasa b 94 kD, albümina sérica bovina 67 kD, ovoalbtmina 43 kD, anhidrasa carbOnica 30 kD, inhibidor de tripsina 20 kD y lactoalbUmina 14.4 kD, se tiñO con azul briIlante de Coomasie A. 250.. Otros Métodos Analiticos. La determinaciOn de proteina se efectuO por el método de Bradford (8), utilizando albUmina bovina como referencia. La presencia de LPS se detectO mediante Ia determinaciOn de KDO (2ceto-3-deoxioctanato), con el método descrito por Karkhanis y cotaboradores (21) y cotoraciOn especIfica de plata para glicoproteInas (19). La antigenicidad de las proteinas obtenidas se confirmO por inmunoelectrotransferencia en papel de nitrocelulosa (6) con suero bovino control positivo de referenda y Ia reacciOn se visualizO con el conjugado anti-lgG bovina-peroxidasa y H202thaminobencidina como sistema substratocromOgeno.. RESULTADOS Y DISCUSION. El proceso de purificaciOn y caracterizaciOn de las proteinas de membrana externa (PME), se realizO en dos etapas, una que comprendiO Ia aplicaciOn de Ia metodologia descrita por Verstreate y colaboradores 1982 (36) para B. abortus cepa 19 obtenida de cultivo en fermentador y una segunda, modificaciOn de Ia inicial, en bUsqueda de mayor estabilidad y pureza de las proteinas de interés, obtenidas tanto para Ia cepa 19 como para Ia cepa RB-51 (Figura 1). AsI mismo, se cornparO esta moditicaciOn con el proceso estandar. de extracciOn mediante acciOn del SDS (25). En este trabajo, Ia inactivaciOn con formalina desde el 0.5% hasta el 2% no fue efectiva y su acciOn formadora de enlaces covalentes con los grupos amino libres de Ia protelna causO desnaturalizaciOn, 10 cual se evidenciO en menor rendimiento de las protelnas extraidas y deficiente capacidad de reacciOn antigenica. A diferencia, Ia inactivaciOn por calor a 65°C por una hora, proporcionO confiabilidad, estabilidad antigénica y mejor rendimiento en Ia concentraciOn proteica final. AsI mismo, se buscO optimizar Ia extracciOn micial de membrana externa estudiando el efecto de Ia acciOn mecánica del ultrasonido en Ia integridad de las bacterias, observándose por monitoria en microscopla electrOnica, que sOlo despues de 30 minutos de sonicaciOn Ia membrana citoplasmática presentaba evidencias de ruptura (Figura 2)*, mientras que a los 45 minutos el porcentaje de destrucciOn fue de 25%. Sin embargo, aunque estos datos fueron diferentes a los recomendados por otros autores (4, 25, 34), su efecto fue similar al producido por acciOn de Ia prensa francesa (35), y sin los riesgos inherentes aI aerosol generado por esta ültima. En un experimento realizado simultáneamente, el efecto 01 fricciOn a abrasiOn con perlas de vidrio a alta velocidad (licuadora) no fue observado en microscopla electrOnica a los tiempos reportados, como apropiados por otros autores (20). El procedimiento empleado inicialmente para extracciOn de Ia membrana interna y el peptidoglican con base en el detergente no iOnico, tritOn x-1 00, no proporcionO Ia dispersiOn necesaria de los lipidos de Ia membrana, debido a Ia excesiva hidrofobicidad de Ia B. abortus; adicionalmente Ia rernociOn del TritOn X-100 por diálisis prolongada afectO Ia estabilidad de Ia preparaciOn y por tanto el renimiento en concentraciOn de protelnas y Ia calidad (baja selectividad) de las protein as de interés. A diferencia, el tratarniento con Nlaurilsarcosinato de sodio por sus caracteristicas aniOnicas débiles fue más acorde con las propiedades especificas de Ia membrana interna de B. abortus (14, 26, 35) y Ia extracciOn del detergente. Realizada gracias a Ia Colaboraciôn del laboratorlo de microscopia electrOnica deja Universidad Nacional de Colombia.. 197.
(6) REVISTA ICA, Vol. 25, Julio - Septiembre 1990. en el rendimiento como se pudo observar en los geles de SDS-PAGE empleados como monitores de cada paso del proceso (Figura 3). La solubilizaciOn de las proteinas de membrana por el detergente dipolar, Zwinergent 3-14, fue adecuada en su liberack5n y logrO eliminar en alto porcentaje el LPS sin causar efecto desnaturalizante sobre Ia proteina, como ha sido observado por otros autores (17, 23). La cantidad de LPS detectado en las proteinas aisladas por medio del KDO, fue de 0.6% para RB-51 y 10 veces mayor para Ia cepa 19, apoyando Ia selecciOn de esta Ultima para Ia obtenciOn de las proteinas de interés. Asi mismo, Ia coloraciOn especifica de plata para glicoproteInas (19) aplicada a los geles de poliacrilamida, dernostrO LPS sOlo en Ia regiOn de peso molecular menor de 14 kD, apreciándose las porinas libres del mismo. . R. 7 6. 5 4 3 2 1 IcO. W 94. 0. FIGIJRA 2. Bruce//a abortus Cepa 19. Fotografia al rnicroscopio electrônico a) sin sonicar obsérvese interidad de membrana externa, interna y espacio penplásmico (X20. 000 aumentos). b y c). Sonicaciôn por 45 minutos (15.000 Db), se observan fragmeitos y cambios de Ia membrana citoplasrnática (X50.000 aumentos) asi como ruptura y salida de material citoplasmético (X69.000 aumentos). P01 dialisis con ultrafiltraciOn mejorO notablemente Ia selectividad del material requerido en esta etapa, complementada por hidrOlisis enzimática (liberaciOn de peptidoglican) con lisozima. Asi mismo, el aumento en las velocidades de centrifugaciOn con respecto al mOtodo de Verstreate y colaboradores (36) comprobO ser mOs el'ectivo. 43. 20.1 14.4. FIGURA 3. Perfiles electroforéticos de los pasos de purificación de proteinas de membrana externa. 1. Niarcadores de peso molecular. 2. B. abortus Cepa 19 crudo. 3. B. abortus Cepa 19 proteInasde membrana externa. 4. B. abortus Cepa RB-51 crudo. 5. B. abortus Cepa RB-51 proteinas de membrana externa. 7. Cepa 19 post-tratamiento con Sarcosil. 8. Cepa 19 post-tratamiento con Zwitergent 3-14. 9. Cepa 19 post-tratamiento con Triton X. 100. Gel de separaciôn 100/ode acnilamida. Tinción azul de Coo masie..
(7) FOR ERO DE LLERAS, C. El AL. Metodologias para la purificaciôn de proteinas.. Las proteinas obtenidas (Figura 4) son esencialmente porinas con pesos moleculares de 37 a 41 kD ya que presentan el patron electroforético acorde con el definido para el primero reportado (1, 36, 38). También se detectO una banda de peso molecular de 14 kD, Jo cual confirma Ia eliminaci6n selectiva de contaminantes del metodo escogido y Ia obtenciOn de un producto bastante especifico. Un mayor rendimiento de PME se obtuvo por tratamiento del pellet at final con doxicolato de sodio (35), Jo cual liberO más PME tipo 2y manifestO otras dos bandas de peso aproximado, 20 kD. La identidad de estas bandas (Figura 5) no fue analizada pero pueden ser productos de degradaciOn segUn informes de otros autores (35).. :. •1p 2. ••. I. F I. es -•. 5-. 94. 66. 4S. 36. r FIGURA 5. B. abortus Cepa RB-51. Transferencia en papel de Nitrocelulosa luego de SOS-PAGE. Gel de separación at 120/0 se colocaron 35 ug de proteina en cada pozo. 1. Sobrenadante luego de son icacibn durante 45 ridnutos. PZw. Precipitado luego de tratamiento con Zwitergont 3-14. 2. Sobrenadante luec!o de tratamiento con Zwiterqent 3-14. 3. Sobrenadante luego de tratamiento con Dcoxicolato de Sodio. 4. 1arca6ores de peso molecular.. 29. FIGURA 4. Proteinas de la membrana externa luego de tratamiento con Zwitergent 3-14. Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Gel de separacion at 100 /0, se colocaron 35 ug de protelna en cada pzo. 1. B. abortus Cepa 19. 2. B. abortus RB-Si. 3. Marcadores de peso molecular. Colocación azul de Coomasie.. El sistema de obtenciOn de proteinas mediante el tratamiento selectivo con detergente fue a su vez comparado con el tratamiento fuerte con SDS y temperatura (25, 26) para liberar las envolturas celulares, esreropiastos, Jo cual permite separar Ia membrana interna de Ia externa, actuando esencialmente sobre Ia primera (33). El detergente SDS fue efectivo en Ia extracciOn de Ia PME, pero posee efecto desnaturalizante sobre ellas (35), 10 cual to hace inapropiado para efectos preparativos (Figura 6). Ademes el sistema de elimirtaciOn de SDS pot diãlisis prolongadas disminuyO también el rendimiento. Es importante mencionar que los tratamientos con los diferentes detergentes utilizados no son 100% efectivos en la solubilizaciOn de las proteinas en cada 199.
(8) REVISTA ICA, Vol. 25, Julio - Septiembre 1990. KDa. FIGURA 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. Bruce//a abortus Cepa 19. Purificacin segCin Ia metodologla do Moriyon-Berman. Gel de separaciOn al 100 /0. Coloración azul de Coornasie. 1. Bacteria son icada clurante 45 minutos. 2. Protelnas de Ia membrana externa luego de tratamiento con temperatura y SDS: 350C durante 30 minutos, ( Sobrenadante). 3. Proteirias de a membrana externa luego de diâlisis extensiva. Se observa Ia desaparición ue las bandas correspondientes a las proteinas del grup0 2. 4. Marcacores de peso molecular.. FIGURA 7. B. abortus Cepa 19, Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS. Gel de separación al 100 /0. Se colocaroii 30 ug de proteina en cada pozo. Coloracibn azul de Coomasie. Sobrenadante luego de tratamiento con sarkosyl. Sobrenadante cie tratamiento con lisozirna. 3. Precipitado luego de tratarniento con Zvitergent 3-14. 4. Sobrenadante luego de tratamiento con Zwiterqent 3-14. (ProteInas de Ia membrana external. 5. IVtarcadores de peso molecular.. etapa de purificaciOn, pues en las muestras de as precipitados en PAGE presentan bandas que correspanden a las mismas fracciones solubilizadas (Figura 7).. se logra en soluciOn en Zwittergent a diferencia del efecto desnaturalizante producido al emplear tratamiento con SDS y posterior diIisis. De otra parte, Ia utilizaciOn de Ia cepa B. abortus RB-51 contribuyO a la mayor selectividad del producto, puesto que Ia ausencia de cadena 0 en esta mutante reduce contaminantes y permite trabajar con proteinas más especIficas.. Es asI coma en general, eI proceso utilizado micialmente diO en nuestro caso, baja rendimiento y poca selectividad aun luego de Ia cromatografia del producto final*, sin embargo, se logrO luego de modificar Ia forma de inactivaciOn, el tipo de detergerite y las velocidades de centrifugaciOn Ilegar a un rendimiento superior y en especial de alta selectividad de las proteinas de interés (Figura 4). Ademés, Ia estabilidad de las mismas. Informe de Avances de Proyecto UNU-Brucelosis, Valdivia Chile 1987.. 200. Se sugiere a partir de Ins resultados preliminares de las reacciones de inmunotransferencia con sueros bovinos positivos a Ia infecciOn, que las proteinas purificadas son antigenicas (1 3, 7, 12) y corresponden a componentes diferentes del antigeno inmunodominante LPS. Estudios con Ia técnica de ELISA para evaluar Ia antigenicidad y Ia reactividad de las proteinas en sueros de diferentes etapas de infecci6n están en progreso..
(9) FORERO DE LLERAS, C. ET AL. Metodologlas para Ia purificaciOn de- proteInas.. Trabajo realizado como parte del Contrato University Program/Development Studies. N. CON. 85-1 09 de Ia Universidad de las Naciones Unidas. Tokio JapOn. Red. de Biotecnologia en Brucelosis.. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS. Ficht, TA.; Bearden, S.W.; Sowa, BA.; Adams, L.G. 1988. A 36 kilodalton Bruce/ia abortus cell envelope protein is encoded by repeated sequences closely linked in the Genomic DNA. Infec. Immun. 56:2036-2046. Filip, C.; Fletcher, G.; Wuiff, J.L.; Earhant, F. 1973. Solubilization of the cytoplasmic membrane of Es-cherichia coil by the ionic detergent sodium lauril sarcozinate. J. Bacteriol. 115:717-722. Gallego, M.L.; de Leon, S.L. 1987. Situación de Ia brucelosis en Colombia. Revista ICA (En prensa).. AfzaI, M.; Brodie, S.J.; Tengerdy, R.P.; Squire, P.G. 1987. Isolation and antigen ic reactivity of B. mis outer membrane proteins. J. Clin. Microbiol. 25(11):21322135. Alton, G.G.; Jones, L.M.; Pietz, D.E. 1976. Las tOcnicas de laboratorio en Ia Brucelosis, 2da. Ed. OrganizaciOri Mundial de Ia Salud. Serie de monografias. No. 55. Ginebra p. 11. Baldwin, C.; Verstreate, D.; Winter, A.J. 1985. Immune response of cattle to Bruce/Ia aboruis outer membrane proteins measured by lymphocyte blastogenesis. Vet. Immunopathol. 9:383-396. Baughn, R.E.; Freeman, B.A. 1966. Antigenic structure of i/no-ella suis spheroplasts. J. Bacteriol. 92:12981303. S.. Berman, D.T. 1984. Toward a molecular anatomy of a brucella cell. Brucellosis symposium, Agriculture Canadá. ADRI. Nepean, Canada. p.2. Bisigiel, U. 1986. protein blotting. Electrophoresis. 7:118. Bosseray, N.M.; Plommet, M.; Dubray, G.C. 1978. Immunogenic activity of a cell-wall fraction extracted from Bruce//a abortus in guinea pigs. Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. 129B:571-579. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254. Bundle, D.R.; Cherwonogrodzky, J.W.; Caroft, M.; M.B. 1987. The Iipopotysaccharides of Bruce/Ia abortus and B. ,nelilensi.c. Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. 138:92-98.. garcia-Carrillo, C. 1987. La brucelosis de los animalos en America y su relaciôn con Ia infecciôn humana. Office Inter. Epizoot. Paris. p. 81 Conenne, A.; Ernest, R. 1978. Solubilization of membrane proteins by su Ifobetaines, novel zwitterionicsurfactants. Anal. Biochem. 87:28-38. Hayat, M.A. 1970. Principles and technique of electron microscopy: Biological applications. Nostrand reinhold Co. New York. vol. 1. p. 20. Hitchicock, P.J.; Brown, T.M. 1983. Morphological heterogeneity among Sal,nonella I ipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gells. J. Bacteriol. 154:268-277. Hunter, S.B.; Bibb, W.F.; Shih, C.N.; Kaufmann, A.F.; Mitchell, J.R.; Mckinney. 1986. Enzyme linked immunosorbent assay with major outer membrane proro teins of Bruce/la ,neiiierisis to measure immune response to Brucella species. J. Clin. Microbiols. 24:566-572. Karkhanis, V.; Zeither, J.Y.; Jackson, J.J.; Carlo, O.J. 1978. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonale. Anal. Biochem. 85:595601. Laemmly, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685. Mandrell, R.E.; Zollinger, W.D. 1984. Use of zwitterionic detergent for the restoration of the antibody binding capacity of electroblotted meningococcal outer membrane proteins. J. Immunol. 67:1-11.. Perry,. Douglas, J.T.; Rosemberg, E.Y.; Nokaido, H.; Verstreate, DR.; Winter, A.J. 1984. porins of Bruce/Ia species. Infect. Immun. 44:16-21.. McGhee,J.R.; Freeman, B.A. 1970. Separation of soluble brucella antigens by gel filtration chromatography. Infec. Immun. 2:48-53. Morlyon, I.; Berman, D.T. 1982. Effects on non-ionic, ionic and dipolar ionic detergents and EDTA on the brucella cell envelope. J. Bacteriol. 152:822-828.. Dubray, G.C.; Charriaut, C. 1983. Evidence of three major polypeptide species and two major polisaccharide species in the brucella outer membrane. Ann. Rech. vet. 14:311-318.. Morlyon, 1; Berman, D.T. 1983. Isolation, purification and partial characterization of Bruce//a abous matrix protein. Infec. Immun. 39:394-402.. Dubray, G.C. 1987. Protective antigens in brucellosis. Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. 138:84-87.. Morrison, D.C. 1983. Bacterial endotoxins and pathogenesis. Rev. Infec. Dis. 5:5733-5747.. 201.
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