Antígeno específico y perfil lectinológico en sangre de Bubalus bubalis y de Bos taurus

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(1)TESIS DE DIPLOMA. Antígeno específico y perfil lectinológico en sangre de Bubalus bubalis y de Bos taurus. Autor: Jorge Luis Paz Treto. Santa Clara 2013.

(2) Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Facultad de Ciencias Agropecuarias Departamento de Biología. TESIS DE DIPLOMA. Antígeno específico y perfil lectinológico en sangre de Bubalus bubalis y de Bos taurus. Autor: Jorge Luis Paz Treto Tutores:. Dr.C. Luis Orlando Maroto Martín Dr. M.V. Yuderkis Hurtado Farías. Santa Clara 2013.

(3) A mis abuelas: Elda y Elisa.

(4) Si quieres ser sabio, aprende a interrogar razonablemente, a escuchar con atención, a responder serenamente y a callar cuando no tengas nada que decir. Johann Kaspar Lavater.

(5) Agradecimientos A Maroto, profesor y amigo que se entregó a esta causa de investigación, por ser cómplice de mis desvelos y convertirse en la persona imprescindible para la realización de este trabajo. A Yuderkis participe de esta investigación y futura colega de trabajo. A mis profesores por ser ejemplo y exigir cada día un poco más A mis compañeros de aula por compartir estos años. A Yumy, Kopull, Annarella, Lungo, Odaymis y Luis Angel por estar dispuestos a ayudarme sin importar el momento. A Luis, Baby y Dalia por acogerme y ayudarme cuando más lo necesitaba. A Odalys, Kenia y Odaymis por sus trámites oportunos. A Solander por su buen carácter y dominio de la informática. A Adrian por su ayuda durante la carrera. A Llilian, Enif y Damilsa por estar siempre pendientes de mi. A Chary, Bouza, Charo y Judith, porque estar lejos no significa estar ausentes. A Annia por siempre estar presente y ser una más de la familia. A Skipy y Alfredo porque llegaron para quedarse. A Kenia, compañera de estudio de todos los tiempos, manifestación de entrega, incondicionalidad y apoyo. A la nueva alegría de la casa, Alfredito. A abuela, porque su amor por mí no conocía barreras. Donde estés me estarás protegiendo. A papi por su sabiduría y cariño..

(6) A Eldys por su disposición y tolerancia para conmigo. A tía, porque a pesar de estar lejos la sentía siempre junto a mi. A mami por siempre seguir adelante, regañarme tanto, despertarme temprano y mantenernos unidos. A mi hermana Maylén por estar presente en todos los momentos de mi vida, por su madurez y carácter. A mi padre por ser sustento, apoyo y preocupación constante A mi madre por ser mi inspiración y orgullo..

(7) Resumen El ganado bovino y bufalino pertenece desde el punto de vista filogenético a la misma familia. La importancia de ambos radica fundamentalmente en que constituyen fuentes de proteína animal de alta demanda: carne y leche. El incremento de la masa ganadera en Cuba es un aspecto que se ha visto influenciado negativamente por hechos delictivos (hurto y sacrificio). La técnica criminalística no cuenta en la actualidad con un sistema eficiente de diferenciación para la carne de ambas especies. La presente investigación se realizó con el objetivo de encontrar un antígeno específico para una de las dos especies y diferenciar desde el punto de vista lectinológico la sangre bufalina y bovina. Se realizó precipitación del suero bufalino y bovino en tres niveles de saturación con Sulfato de Amonio (0-25%, 25-50% y 50-75%). El suero de ambas especies fue filtrado utilizando una columna de Sephadex G-100 (100x15 mm) montada en un FPLC Biologic HR, Biorad). En ambos casos se procedió a la comprobación de los resultados mediante SDS-PAGE. Las células rojas sanguíneas (CRSs) de bufalino y bovino se enfrentaron a las lectinas: ConA, RCA, WGA, PHA-M y PHA-P. En la electroforesis se evidenció la existencia de una proteína (25-35 kDa) en el suero de la especie bufalina, ausente esta en bovino. Las CRSs de búfalo fueron aglutinadas por todas las lectinas mientras que las CRSs de bovino solo pudieron ser aglutinadas por WGA y RCA. La ConA puede ser perfectamente utilizada en la diferenciación de sangre bovina y bufalina en pruebas rápidas.. Palabras clave: bovino, búfalo, proteínas séricas, antígeno, CRSs, lectinas.

(8) Abstract Bovine and buffalo belong to the same phylogenetic family. The significance of these species is due to their role as animal protein source, meat and milk, highly demanded. The total amount of cattle in Cuba has been affected by the increment in criminal acts (theft and slaughter). Up to date technical criminology do not have an efficient system to differentiate meat of both species. Present investigation have the aim of finding a specific antigen for one of the species, and to differentiate blood from bovine and buffalo using lectins. Sera from bovine and buffalo were precipitated with ammonium sulphate (0-25%, 25-50% y 50-75%). The sera from both species were filtered through a Sephadex G-100 (100x15 mm) column coupled to FPLC equipment (Biologic HR, Biorad). Results were proven in SDSPAGE. Red blood cells (RBCs) from buffalo and bovine were challenged to the following lectins: ConA, RCA, WGA, PHA-M y PHA-P. A protein band (25-35 kDa) was observed in the buffalo sample, but not in bovine. RBCs from buffalo were agglutinated for the five lectins while those from bovine were only recognized by WGA y RCA. ConA might be perfectly used to differentiate the blood from bovine and buffalo in quick assays.. Key words: bovine, buffalo, sera proteins, antigen, RBCs, lectins.

(9) Tabla de contenido 1.. Introducción ..................................................................................................................... 1. 2.. Revisión bibliográfica ...................................................................................................... 4 2.1 Caracterización de la especie Bubalus bubalis ........................................................... 4 2.1.1 Ubicación taxonómica y descripción morfológica de Bubalus bubalis. ................... 4 2.1.2 Distribución geográfica de la especie ....................................................................... 5 2.1.3 Introducción del búfalo en Cuba................................................................................ 5 2.2 Caracterización de la especie Bos taurus ................................................................... 5 2.2.1 Ubicación taxonómica y descripción morfológica Bos taurus.................................. 5 2.2.2 Distribución geográfica de la especie ....................................................................... 6 2.2.3 Introducción del ganado bovino en Cuba.................................................................. 7 2.3 Situación actual de la explotación ganadera en Cuba ................................................ 7 2.4 Caracterización hematológica de Bubalus bubalis y Bos taurus ................................. 7 2.5 Caracterización serológica de Bubalus bubalis y Bos taurus ...................................... 8 2.6 Generalidades de las lectinas vegetales...................................................................... 8 2.6.1 Definición y descubrimiento....................................................................................... 8 2.6.2 Estructura y clasificación ........................................................................................... 9 2.6.3 Utilización de lectinas vegetales en la detección de sangre ................................. 11 2.6.4 Aplicaciones biotecnológicas de las lectinas .......................................................... 12 2.7 Aspectos significativos de la técnica criminalística en Cuba ..................................... 13 2.7.1 Generalidades del Hurto y Sacrificio Ilegal de Ganado Mayor ............................... 13. 3. Materiales y Métodos ....................................................................................................... 15 3.1. Obtención de muestras de sueros de Bubalus bubalis y Bos taurus. ...................... 15 3.2. Fragmentación proteica por salado ....................................................................... 15. 3.2.1 Preparación de buffer de fosfato salino (PBS 10X) ............................................... 16 3.2.2 Diálisis de las muestras de la fragmentación por salado ....................................... 16.

(10) 3.3 Cromatografía de exclusión molecular ....................................................................... 17 3.3.1 Preparación de la columna cromatográfica ............................................................ 17 3.3.2 Corrida cromatográfica ............................................................................................ 17 3.4 Electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida ............................................... 18 3.5 Determinación del perfil lectinológico ......................................................................... 18 3.5.1 Lectinas vegetales empleadas ................................................................................ 18 3.5.2. Preparación de la solución de eritrocitos al 4% ..................................................... 19 3.5.3 Preparación de la solución de Alsever .................................................................... 19 3.5.4 Ensayo de Hemoaglutinación .................................................................................. 20 3.6 Comprobación de la efectividad de las lectinas en la identificación de sangre bovina y bufalina mediante pruebas de campo ........................................................................... 21 3.6.1 Preparación de las muestras de sangre y lectinas ................................................. 21 3.6.2 Proceso de prueba de campo ................................................................................. 22 4. Resultados ........................................................................................................................ 23 4.1 Proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus obtenidas mediante fragmentación por salado y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).......... 23 4.2 Purificación de las proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante cromatografía de exclusión molecular y electroforesis SDS-PAGE ................ 24 4.3. Determinación del perfil lectinológico ........................................................................ 26 4.3.1. Ensayo con ConA y PHA-M ................................................................................... 26 4.3.2. Ensayo con lectinas WGA y PHA-P ....................................................................... 27 4.3.3 Ensayo con lectina RCA .......................................................................................... 28 4.4. Comprobación mediante pruebas de campo de la efectividad de las lectinas en la identificación de sangre bovina y bufalina. ...................................................................... 29 5. Discusión .......................................................................................................................... 31 5.1 Proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante fragmentación por salado y electroforesis SDS-PAGE. .................................................. 31 5.2 Proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante cromatografía de exclusión molecular y electroforesis SDS-PAGE ................................ 32.

(11) 5.3 Determinación del perfil lectinológico ......................................................................... 33 5.4 Comprobación mediante pruebas campo de la efectividad de las lectinas en la identificación de sangre bovina y bufalina. ...................................................................... 35 6.. Conclusiones ................................................................................................................. 36. 7.. Recomendaciones ........................................................................................................ 37. 8.. Referencias bibliográficas ............................................................................................. 38. Anexo .................................................................................................................................... 45.

(12) 1. Introducción El ganado bovino y bufalino constituyen a nivel mundial uno de los principales recursos económicos explotado por el hombre, al ser el sistema de producción ganadera una técnica empleada desde la antigüedad. Su importancia está dada por la alta demanda en el mercado y el comercio de la carne, la leche y los diferentes productos derivados que se obtienen, que representan una solución para los requerimientos nutricionales de una población cada vez más numerosa y que cuenta con menores recursos para satisfacer sus necesidades de alimentación (FAO, 2012). Bubalus bubalis (Cockrill, 1974) o búfalo de río y Bos taurus (Calzadilla et al., 1983) son especies pertenecientes a la familia Bovidae que difieren en cuanto a sus características morfológicas y etológicas. El búfalo de río es un animal multipropósito, capaz de adaptarse a una gran diversidad de ambientes, es resistente a enfermedades y aprovecha los alimentos de una manera superior al ganado bovino (García et al, 2011). A pesar de que las características organolépticas y las propiedades físico-químicas de las carnes de ambas especies no difieren significativamente, la del búfalo tiene menos grasa y el contenido proteico es mayor, así como la calidad de la leche, la cual es superior debido a su alto valor energético, dado por la presencia de un mayor contenido de grasa, proteínas y minerales (Almaguer, 2007; Simón y Galloso, 2011). Teniendo en cuenta estas características, el gobierno cubano en 1983 introduce en el país dos razas de ganado bufalino provenientes de Panamá y Trinidad – Tobago (Milat, 2009). Actualmente se encuentran distribuidos en todas las provincias del país y el municipio especial Isla de la Juventud (Morales, 2012). Debido a la importancia que reviste la producción de ganado bovino y bufalino para sectores esenciales y vulnerables de la economía cubana se establece en el Código Penal, en el Capítulo XVI, referente al Sacrificio Ilegal de Ganado Mayor y venta de sus carnes, diversas sanciones. 1.

(13) Introducción. En Villa Clara, el delito de Hurto y Sacrificio Ilegal de Ganado Mayor (HSIGM) es considerado como uno de los más frecuentes, producto al gran desarrollo de la ganadería en sectores estatales y privados. Según el Centro de Control Pecuario de la provincia (CENCOP), en el año 2011 se reportaron 1147 casos de HSIGM, mientras que en 2012 se reportaban 2054 casos. Para el esclarecimiento de estos hechos delictivos la técnica criminalística cubana es esencial, pero se ve limitada debido a que no se cuenta con un sistema de diferenciación que permita discriminar la sangre del ganado bufalino con respecto al ganado bovino. El departamento de Biología Criminalística de Villa Clara cuenta con un antisuero policlonal contra proteínas séricas, perteneciente al ganado bovino, y que producto a la homología filogenética reacciona con el ganado bufalino. En la actualidad el trabajo con lectinas vegetales ha propiciado grandes avances en cuanto a la detección y purificación de glicoproteínas, la separación de células y la triplicación de grupo sanguíneos (Van Driessche et al., 2000). Su aplicación para la diferenciación del tipo de sangre de ambas especies puede ser una técnica viable para la criminalística en Cuba, por lo que resulta vital la realización de esta investigación que tributa al esclarecimiento de hechos delictivos relacionados con Hurto y Sacrificio Ilegal del Ganado Mayor. Por tales motivos se trazan los siguientes objetivos: Objetivo general . Identificar un antígeno específico y perfil lectinológico en sangre de Bubalus bubalis y Bos taurus.. Objetivos específicos . Identificar proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante fragmentación por salado y cromatografía de filtración en gel.. . Diferenciar mediante SDS-PAGE las proteínas séricas de Bubalus bubalis con las de Bos taurus. 2.

(14) Introducción. . Enfrentar baterías de lectinas vegetales a sangre de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante la prueba de hemoaglutinación.. . Comprobar la efectividad de las lectinas en la diferenciación de sangre bovina y bufalina en prueba de campo.. 3.

(15) 2. Revisión bibliográfica 2.1 Caracterización de la especie Bubalus bubalis 2.1.1 Ubicación taxonómica y descripción morfológica de Bubalus bubalis. Ubicación taxonómica según (García et al., 2011) Reino: Animalia Phylum: Chordata Sub-phylum: Vertebrata Clase: Mammalia Orden: Artiodactyla Suborden: Ruminantia Familia: Bovidae Sub – familia: Bubalinae Género: Bubalus Especie: Bubalus bubalis Descripción morfológica Los búfalos de río, representados en el país por el Buffalypso, presentan indicadores fisiológicos semejantes a los del bovino. Esta raza es el producto de la selección sobre un rebaño de Trinidad y Tobago que se mezcló de manera indiscriminada entre las razas de la India Bhadawari, Jaffarabadi, Murrah, Nili-Ravi y Surti con el objetivo de seleccionar un búfalo para producir carne (Galloso, 2009). Su diferencia es marcada con respecto a otras razas pertenecientes a esta especie, ya que presentan una gran diversidad de colores, tanto de la piel como del pelo, encontrándose el negro azabache, pasando por el cerezo hasta el marrón claro, con pelo desde negro hasta blanco, de piel negra o marrón (García et al.,2011). La piel es gruesa y dura, tiene la cabeza ancha y con ojos prominentes así como cuernos que crecen hacia atrás con un rizo hacia arriba. El cuerpo es bajo, de patas cortas y compacto con una línea recta en la parte superior (Milat, 2009). 4.

(16) Revisión bibliográfica. 2.1.2 Distribución geográfica de la especie Actualmente la población bufalina mundial asciende a más de 202 millones de cabezas, siendo el continente de Asia el que concentra la mayor cantidad de búfalos. Dentro de los países que se destacan se encuentran: India, Pakistán y China (Anuario, 2008). Desde Asia, el búfalo fue llevado a Europa en países como Italia, Bulgaria, Rumanía y Hungría. Posteriormente, el búfalo fue introducido en Sudamérica por los europeos para ser utilizados como animal de tracción. Dada su gran rusticidad, longevidad y fuerza tuvo una rápida difusión en los países del norte de Sudamérica, especialmente en Venezuela, Colombia y Brasil, hasta llegar a las islas del Caribe (Almaguer, 2007). 2.1.3 Introducción del búfalo en Cuba Los búfalos se introdujeron en Cuba, en la década de los 80 del siglo XX en la Empresa Pecuaria Genética ―Los Naranjos‖, ubicada en la antigua provincia la Habana. Se acondicionaron 6 307,4 ha de tierra en una franja costera pantanosa del sur de esta provincia, con el objetivo de producir alimentos para el consumo humano. Se adquirieron 2 984 animales, de ellos 279 de río (Buffalypso) y 2 705 de pantano o Carabao (Milat, 1987). La introducción de esta nueva especie al archipiélago cubano se debió a las ventajas que presenta esta especie para su explotación, como son: su capacidad reproductiva, mejor aprovechamiento de los pastos de baja calidad, requerimiento de un número menor de inversiones por parte del hombre y su fácil adaptación a cambios climáticos (García et al., 2011). 2.2 Caracterización de la especie Bos taurus 2.2.1 Ubicación taxonómica y descripción morfológica Bos taurus Ubicación taxonómica según (Calzadilla et al., 1983).. 5.

(17) Revisión bibliográfica. Reino: Animalia Phylum: Chordata Sub-phylum: Vertebrata Clase: Mammalia Orden: Artiodactyla Suborden: Ruminantia Familia: Bovidae Sub – familia: Bovinae Género: Bos Especie: Bos taurus. Descripción morfológica Bos taurus es una especie que carece de giba, en comparación con Bos indicus su cabeza es más pequeña. Los cuernos son musculosos y finos, con presencia de un cuello corto y un tórax amplio con costillas largas y arqueadas. Las extremidades son cortas y la piel es menos abundante, más suave al tacto, con menos glándulas sudoríparas y de menor tamaño y de color variado (Calzadilla et al, 2006).. 2.2.2 Distribución geográfica de la especie La mayoría de los elementos de esta especie se congregan en grupos grandes con estructuras sociales muy complejas, pero existen casos en los que su comportamiento no es gregario. Los bóvidos cubren un extensivo rango de diferentes climas y hábitats, que abarcan desde desiertos hasta bosques tropicales y se ubican en todos los continentes (Planas, 1998). Los principales países productores de carne y explotación de ganado bovino son Estados Unidos, Brasil, China y los que integran la Unión Europea, que concentran el 60.7% de la oferta total mundial. De acuerdo con las cifras disponibles, entre 2000 y 2008, estos países produjeron en promedio 11,9; 8,3; 7,9 y 5,6 millones de toneladas en promedio anual, respectivamente (Puricelli, 2011). 6.

(18) Revisión bibliográfica. 2.2.3 Introducción del ganado bovino en Cuba El ganado bovino fue introducido por los españoles a nuestro país, donde se adaptó rápidamente a las condiciones ambientales, pasando a convertirse en la primera industria establecida en Cuba y ocupó el primer lugar en importancia hasta el siglo XVIII (Calzadilla et al., 1996). 2.3 Situación actual de la explotación ganadera en Cuba El desarrollo de la ganadería en Cuba ha estado marcado por diferentes etapas, condicionadas por el momento histórico (Calzadilla, et al 2006). En la actualidad se producen cambios importantes y beneficiosos para este sector a favor del crecimiento económico del país. La explotación actual del búfalo es una propuesta viable que a lo largo de 30 años ha demostrado que fue una decisión correcta, ya que la masa bufalina inicial se ha multiplicado 20 veces y con respecto a su reproducción, 30 veces. (García et al., 2011). Tanto el búfalo como el ganado bovino se encuentran distribuidos en todas las provincias del país y el municipio especial Isla de la Juventud. En los últimos años los niveles de producción de carne y leche de ambas especies han aumentado de manera considerable en todo el territorio nacional, destacándose las provincias de Mayabeque, Artemisa, Villa Clara y Camagüey (Morales, 2012). 2.4 Caracterización hematológica de Bubalus bubalis y Bos taurus La sangre constituye un tejido conjuntivo especializado que circula por los capilares, venas y arterias de todos los vertebrados e invertebrados. Su color rojo está dado por la presencia del pigmento hemoglobínico contenido en los eritrocitos y se distinguen dos fases: una sólida, que incluye a los elementos formes y una líquida, representada por el plasma sanguíneo (Cotter, 2001). 7.

(19) Revisión bibliográfica. Diversos investigadores han planteado que el cuadro hemático de los animales es el resultado de una interacción entre el medio, principalmente la domesticación, y los factores hereditarios (Ferrer et al., 2000). Existen diferencias en los valores hematológicos e índices hematométricos normales para distintas especies de rumiantes (Ramírez et al., 1998; Londoño et al., 2012). Tanto en el ganado bovino como bufalino se han reportado en los recién nacidos valores eritrocitarios altos, los cuales disminuyen durante las tres primeras semanas de vida, para luego incrementarse y alcanzar los valores hematológicos de adultos, demostrando la influencia de los valores etarios (Álvarez, 2001). 2.5 Caracterización serológica de Bubalus bubalis y Bos taurus El suero sanguíneo o suero hemático es el componente de la sangre resultante tras permitir la coagulación de ésta y desechar el coágulo resultante. La albúmina constituye una fracción importante de las proteínas del suero sanguíneo, influye en el poder coloide osmótico y la capacidad amortiguadora de la sangre, así como en el transporte de sustancias (Elmaouhoub et al., 2007). Para el ganado bovino las concentraciones de albúminas son bajas en el recién nacido y tienden a incrementarse con la edad, alcanzando valores en estado adulto de 27-39 g/L., igualmente se ha podido apreciar la influencia que tiene en el factor racial, al encontrarse diferencias significativas entre las razas y sus cruces (Álvarez, 2001). Por su parte, las globulinas constituyen una fracción compleja compuesta según su migración electroforética por las alfa (que pueden denominarse mucoproteínas y glicoproteínas cuando están en unión con glúcidos), beta (son lipoproteínas encargadas del transporte de lípidos y otras sustancias) y gamma globulinas, denominadas inmunoglobulinas, que actúan como anticuerpos (Janků, 2011). 2.6 Generalidades de las lectinas vegetales 2.6.1 Definición y descubrimiento 8.

(20) Revisión bibliográfica. El término lectina se aplica a proteínas o glicoproteínas de origen no inmune que reconocen de manera específica carbohidratos de la superficie celular o en suspensión, aglutinan células y precipitan glicoconjugados; poseen por los menos dos sitios de reconocimiento a carbohidrato, de ahí su capacidad para aglutinar células (Goldstein et al., 1980; Gabius, 1997). Se encuentran. en. mayor concentración. en las semillas. y tejidos de. almacenamiento, constituyendo entre el 2 y el 10% del total de las proteínas, principalmente en las semillas de leguminosas. Estas proteínas en semillas se localizan principalmente en los cuerpos proteicos de las células de los cotiledones y en menor cantidad, en hojas, raíces y tallos (Hernández et al., 1999). El estudio de las lectinas fue iniciado por Hermman Stillmark en 1888, al descubrir el fenómeno de la hemoaglutinación por extractos de semillas de ricino (Ricinus communis). Stillmark demostró que la toxicidad de las semillas se debía a la presencia de un factor aglutinante de eritrocitos. 2.6.2 Estructura y clasificación Las lectinas vegetales se caracterizan por presentar una pequeña alfa hélice de cinco residuos. Cada dominio presenta un sitio de reconocimiento a carbohidrato, que no necesita la presencia de iones metálicos (Mákela, 1957). Las lectinas vegetales suelen clasificarse de varias maneras, por ejemplo: teniendo en cuenta la especificidad hacia el monosacárido que inhibe su actividad hemoaglutinante (Tabla I) y hacia las estructuras oligosacarídicas que reconocen. Se clasifican en lectinas que reconocen N-glicanos, que son oligosacáridos unidos a un residuo de asparagina en las proteínas mediante una N-acetilglucosamina y lectinas que reconocen a los O-glicanos, que son oligosacáridos unidos a un residuo de serina o treonina en las proteínas mediante una N-acetilgalactosamina (Hernández et al., 2005).. 9.

(21) Revisión bibliográfica. Tabla I. Lectinas vegetales utilizadas para el estudio de glicoproteínas y su clasificación según su especificidad hacia monosacáridos.. Según su estructura se diferencian en tres tipos principales de lectinas (figura 1) según: Peumans y Van Damme (1995) 1. Merolectinas: son proteínas constituidas por un único dominio estructural que alberga un solo sitio de unión a carbohidratos .Las merolectinas no poseen actividad hemoaglutinante. 2. Hololectinas: contienen dos o más dominios del mismo tipo estructural y funcional. Al menos dos de estos dominios deben presentar actividad de unión a carbohidratos, tienen la capacidad de aglutinar células o precipitar glicoconjugados. 3. Quimerolectinas: además de poseer un dominio de unión a carbohidratos, presentan. otro(s). dominio(s). con. actividad. biológica. distinta. del. reconocimiento de carbohidratos. Dependiendo del número y topología de 10.

(22) Revisión bibliográfica. sitios de uniones a azúcares, estas lectinas pueden presentar o no actividad hemoaglutinante.. Figura 1. Representación esquemática de los tres tipos de lectinas: merolectinas, hololectinas y quimerolectinas (Adaptado de Peumans y Van Damme, 1995). 2.6.3 Utilización de lectinas vegetales en la detección de sangre Las lectinas pueden aglutinar células, mostrando un alto grado de especificidad por eritrocitos humanos de grupos sanguíneos específicos, así como por eritrocitos de diferentes especies animales (Boyd y Shapleigh, 1954a). Se ha propuesto que el término lectina se utilice genéricamente para definir a todas las proteínas que se ligan específicamente a azúcares, designándolas como fitolectinas, zoolectinas o micolectinas, dependiendo de su origen (Sharon y Lis, 1972; Sharon, 1996; Wang et al., 2002). 11.

(23) Revisión bibliográfica. La aglutinación de células consiste en la agregación sistemática de células mediada por macromoléculas específicas (anticuerpos o lectinas) que reconocen estructuras moleculares sobre la superficie celular (Figura 2). Este proceso depende del número de determinantes antigénicos y de su localización en la célula, así como del tipo de macromolécula y del medio de reacción (Rodríguez et al., 2004).. Figura 2. Aglutinación de eritrocitos por lectinas. Imágenes con un aumento de 100X mostrando tres situaciones diferentes debido al efecto de las lectinas sobre glóbulos rojos en donde (a) aglutinado, (b) moderadamente aglutinado, (c) no aglutinado (Rodríguez et al., 2004).. 2.6.4 Aplicaciones biotecnológicas de las lectinas Además de ser moléculas paradigmáticas para el estudio de las bases estructurales de reconocimiento de azúcares, las lectinas (especialmente las de origen vegetal), debido a su exquisita selectividad y fácil purificación, representan valiosas herramientas bioquímicas para estudios histoquímicos y biofísicos. Su utilidad está basada en la propiedad que tiene de combinarse con varios tipos de glicoconjugados presentes en superficies celulares y fluidos corporales. Esta 12.

(24) Revisión bibliográfica. singular característica ha permitido que las lectinas sean utilizadas en cromatografías de afinidad para la purificación de glicoproteínas, glicopéptidos y glicolípidos (Peumans y Van Damme, 1998), para la identificación de patógenos (Athamna et al., 2005), como marcadores de técnicas histoquímicas (Horvart, 1993) y de microscopía (Hamid et al., 2005).. En el diagnóstico clínico, las lectinas pueden ser empleadas como herramientas en detección de transformaciones malignas celulares (Mederios et al., 2000) comprobadas en la biomedicina con propósitos analíticos y preparativos, así como para el diagnóstico y terapia en el cáncer (Hajito et al., 2003). 2.7 Aspectos significativos de la técnica criminalística en Cuba La criminalística es una ciencia jurídica que estudia las leyes particulares del trabajo con las pruebas materiales y los métodos de su investigación procesal en el esclarecimiento y prevención de los delitos. Su objeto de estudio es la lucha contra la criminalidad mediante la elaboración de métodos y medios especiales que permitan esclarecer y prevenir los delitos. Establece los principios de la planificación de la investigación, la teoría general de las versiones, la leyes de elección de línea de conducta del investigador durante el proceso investigativo y las herramientas para llevar a cabo la investigación criminal, el “modus operandi‖, la generalización de las experiencias investigativas e integra las acciones de especialistas e instituciones de la sociedad para su empleo en la investigación de un delito dado, en especial los dirigidos contra la vida y la integridad corporal de las personas, contra la seguridad del Estado, contra la economía ,entre otros (Correa, 2001). 2.7.1 Generalidades del Hurto y Sacrificio ilegal de Ganado Mayor En Cuba, la difícil situación económica a partir del arreciado bloqueo imperialista ha impuesto la necesidad de regular el sacrificio de ganado mayor, situación que se ha hecho más crítica en el período especial, lo que ha traído como consecuencia que un hecho que para otros países del mundo no constituye 13.

(25) Revisión bibliográfica. categoría criminal, se haya constituido en un delito previsto y sancionado por la legislación vigente. El irrespeto a esta regulación de sacrificio de ganado mayor llevó a la penalización de los hechos ilícitos que se cometieran, medida que no logró -por sí sola- la eliminación de esta conducta y requirió de un tratamiento cada vez más riguroso, de manera que se sanciona, no solo al que sacrifica ilegalmente la res, sino también a quienes se encargan de transportarla, distribuirla o venderla, así como también a quienes la adquieren a sabiendas o debiendo presumir su ilícita procedencia (Bodes, 1999).. 14.

(26) 3. Materiales y Métodos 3.1. Obtención de muestras de sueros de Bubalus bubalis y Bos taurus. La toma de muestras de sangre de animales correspondiente a la especie Bubalus bubalis se realizó en la Vaquería Uriarte, perteneciente a la Empresa Pecuaria MACÚN, ubicada en el municipio de Sagua la Grande. Se seleccionaron ocho búfalos de río, cuyas edades oscilaban entre los 4 y 6 años de edad. Por su parte, las muestras de sangre de animales pertenecientes a la especie Bos taurus se tomaron en la Unidad Experimental y Zootecnia de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad ―Marta Abreu ―de las Villas. Se seleccionaron seis ejemplares cuyas edades oscilaban entre los 4 y 9 años de edad. Las muestras de sangre (50 mL x animal) en el caso de ambas especies se tomaron empleando tubos de falcon, por punción de la vena yugular. La sangre se mantuvo en reposo durante un período de 30 minutos, se logró obtener aproximadamente 15 mL de suero por muestra de sangre. Los sueros obtenidos fueron trasladados y refrigerados en el Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Agropecuarias (FCA) en la Universidad ―Marta Abreu ―de las Villas. 3.2. Fragmentación proteica por salado. Los sueros obtenidos fueron sometidos a una fragmentación por salado en el Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la FCA. Inicialmente se tomaron y guardaron 2 mL de suero de ambas especies. Se seleccionaron cuatro muestras de suero por especie para ser fragmentadas con (NH4)2SO4. en tres secuencias. específicas de 0-25, 25-50 y 50-75, de acuerdo a los cálculos realizados y las concentraciones iniciales de (NH4)2SO4 según Wingfield, (2001). Se decidió nombrar las muestras de la forma siguiente: Secuencia 0-25: A y B correspondientes al suero bovino, C y D identificando al suero bufalino. Secuencia 25-50: A1 y B1 corresponden al suero bovino y C1 y D1 al suero bufalino. 15.

(27) Materiales y Métodos. Secuencia 50- 75: A2 y B2 se le atribuyen a las muestras de suero bovino y C2 y D2 a las muestras de suero bufalino. Las muestras fragmentadas obtenidas de la última secuencia fueron nombradas A 3 y B3 referentes al ganado bovino y C3 y D3 relacionadas con las muestras del ganado bufalino. El proceso fue el mismo en las diferentes secuencias, se mantuvieron precipitando por una hora a 100C y luego se centrifugó a una temperatura de 100C a 1000 g por 15 minutos en una centrifuga de mesa refrigerada (Eppendorf, modelo 5810).El precipitado obtenido de cada secuencia fue resuspendido en 0,5 mL de PBS 10 x por muestra para posteriormente realizar la diálisis. 3.2.1 Preparación de buffer de fosfato salino (PBS 10X) Para la preparación del PBS 10 X se utilizó:  0,26 g de KH2PO4  2,17g de Na2 HPO4  8,71 g de NaCl  800 mL de agua destilada A continuación se ajustó el pH de la solución a 7,4 y se completó con agua destilada hasta obtener un litro de la solución. 3.2.2 Diálisis de las muestras de la fragmentación por salado Las muestras fragmentadas fueron dializadas con la utilización de una membrana de diálisis Spectra_Par (MwCO: 3,500 Da) La membrana fue depositada en un beaker con agua destilada durante 30 min. Posteriormente fue picada en 12 fragmentos de 13 cm para ubicar en su interior las muestras obtenidas de la fragmentación. Se utilizaron 2 beaker, cada uno con 900 mL de PBS para dializar las muestras de ganado bovino y bufalino, de forma separada, por un período de 12 horas. Al término de las 12 horas, el PBS fue cambiado y se 16.

(28) Materiales y Métodos. mantuvieron las muestras dializando por otras 4 horas. A continuación se realizó una electroforesis SDS-PAGE a todas las muestras obtenidas. 3.3 Cromatografía de exclusión molecular 3.3.1 Preparación de la columna cromatográfica Para el inicio de este experimento se utilizaron 10 g de Sephadex G-100 a los que se le adicionaron PBS hasta que se formó el gel en el Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular de la FCA. Para la preparación de la columna se tomó una jeringuilla de 10 mL, a la que se colocó en su interior recortes de papel de filtro Watman de acuerdo a su diámetro. Posteriormente se le introdujo el gel preparado y se posicionó en un soporte universal, donde durante 12 horas se logró compactar el gel con el goteo permanente de PBS. Este procedimiento se puede apreciar en la figura 3 que se muestra a continuación.. Figura 3. Columna cromatográfica.. 3.3.2 Corrida cromatográfica La columna y las muestras de suero bovino y bufalino fueron trasladadas al Laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP).. 17.

(29) Materiales y Métodos. Se seleccionó una muestra por especie y a través de un equipo FPLC (Biologic HR, Chromatography System, BIO-RAD) se realizaron las corridas cromatográficas. Previamente, las muestras fueron filtradas con la utilización de un filtro Milleport y colocadas en un eppendorf estéril y fue creado un protocolo de trabajo para el suero bovino y bufalino a través del programa informático Biologic HR (ver anexo). Se observaron las curvas y fueron colectados los rangos de fracciones de las muestras donde se observaba una mayor concentración de proteínas para su posterior diferenciación a través de una electroforesis SDS-PAGE. 3.4 Electroforesis SDS-PAGE en geles de poliacrilamida Para la realización de la electroforesis se utilizó el equipo modelo Power PAC 300 de marca BIO-RAD y se prepararon los diferentes tampones acorde con Laemli (1970). Las muestras fueron aplicadas en geles de 10% de poliacrilamida y se hizo la electroforesis vertical empleando una intensidad de corriente variable (100-200 Volts). Se utilizó como patrón de tallas moleculares PageRuler™ Prestained Protein Ladder 10-170kDa (Fermentas, GmbH). Las bandas fueron visualizadas por tinción con una solución azul Coomassie y los geles fueron colocados durante una hora en una plancha giratoria marca Stuart Scientific que mantuvo a los geles en movimiento para su posterior análisis comparativo. 3.5 Determinación del perfil lectinológico 3.5.1 Lectinas vegetales empleadas Para el desarrollo de este ensayo se emplearon cinco lectinas de origen vegetal de procedencia Sigma Aldrich a la concentración de 2 mg/l. 1. ConA Tipo IV (Canavalia ensiformis) 2. PHA-M (Phaseolus vulgaris ) 3. WGA (Tricticum vulgaris) 4. PHA-P ( Phaseolus vulgaris ) 18.

(30) Materiales y Métodos. 5. RCA (Ricinus comunis) 3.5.2. Preparación de la solución de eritrocitos al 4% Se tomó una muestra de 50 ml de sangre de ganado bufalino pertenecientes a la UEB Industrial ―MACÚN‖ en el municipio de Sagua la Grande, Villa Clara. La sangre fue colectada en un tubo falcon que contenía 25 ml de Alsever para evitar la coagulación de la sangre. La punción se realizó por la vena yugular, con la utilización de una aguja california. El mismo proceso fue realizado con la muestra de ganado bovino perteneciente la Unidad Experimental y Zootecnia de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad ―Marta Abreu ―de las Villas. Para la obtención de las muestras, estos animales fueron separados días antes, evitando así la hemólisis ante situaciones de estrés. 3.5.3 Preparación de la solución de Alsever Para la preparación de Alsever se utilizaron:  2,05 g de Glucosa  0,42 g de Cloruro de Sodio  0,80 g de Citrato de Sodio  0,05 g de Ácido cítrico  100 ml de agua destilada  pH ajustado a 7,0. Los 50 mL de sangre obtenida de ambas especies fueron dividas en dos tubos falcon para obtener dos muestras por especie de 25 mL. A estas muestras le fue añadido PBS 10 x hasta completar 40 mL por frasco. Las muestras fueron centrifugadas a 2000 rpm por un tiempo aproximado de 10 minutos a 10 0C. El sobrenadante fue desechado con el uso de una pipeta muticanal y fue añadido nuevamente PBS hasta completar los 40 ml, se centrifugó nuevamente y el resultado fue refrigerado hasta su utilización en la hemoaglutinación en placa. 19.

(31) Materiales y Métodos. 3.5.4 Ensayo de Hemoaglutinación Se utilizaron seis placas, ubicando dos placas en forma sucesiva (i.e. 1 y 2; 3 y 4; 5 y 6) para obtener una mayor dilución de las lectinas y definir así de forma efectiva el título de las mismas. En la Tabla II se aprecia la ubicación de las lectinas por fila en cada placa. Tabla II Distribución de las lectinas en las placas # de Placa Placas # 1 y # 2. Placa # 3 y # 4. Placa # 5 y # 6. Fila utilizada A ,B C, D. Lectina utilizada Concanavalin Tipo VI. Solución empleada Bufalino Bovino. E, F G,H A ,B C, D E, F G,H A ,B C, D. PHA-M. Bufalino Bovino Bufalino Bovino Bufalino Bovino Bufalino Bovino. WGA PHA-P RCA. Se utilizó el primer pocillo como control negativo, donde fueron adicionados 50 μL de PBS. En el segundo se adicionaron 50 μL de la lectina seleccionada y del tercero en adelante hasta el último pocillo se colocaron 25 μL de PBS. Se realizó una dilución sucesiva seriada doble, posteriormente se aplicó 25 μL de la solución de eritrocitos al 4 % de ganado bovino y ganado bufalino. En la figura 4A se puede apreciar cómo se realizó el proceso de aglutinación y la interpretación de los resultados se observa en la figura 4B.. 20.

(32) Materiales y Métodos. Figura 4A. Ensayo de aglutinación en placa de fondo ―U‖.. Pocillos con resultado positivo.. Pocillos con resultado negativo. Figura 4B. Interpretación de resultados.. 3.6 Comprobación de la efectividad de las lectinas en la identificación de sangre bovina y bufalina mediante pruebas de campo 3.6.1 Preparación de las muestras de sangre y lectinas Se tomaron dos muestras de sangre de ambas especies (0.5mL x animal), obtenidas de muestras de carnes en la UEB Industrial ―MACÚN‖ en el municipio de Sagua la Grande, Villa Clara. Seguidamente, se adicionó PBS hasta completar 2 mL. Se seleccionaron las lectinas correspondientes para la realización del experimento y se diluyeron según el título de trabajo (4 UH) de cada una. 21.

(33) Materiales y Métodos. 3.6.2 Proceso de prueba de campo Se tomó 40 µL de cada muestra de lectina y se ubicó en una placa a la que posteriormente se le adicionó 40 µL de la muestra de sangre correspondiente de cada animal .Los resultados se pudieron apreciar pasados los 30 min. La secuencia de realización de esta prueba de campo se puede visualizar en la Figura 5.. Figura 5 Ensayo de aglutinación en placa. Prueba de campo.. 22.

(34) 4. Resultados 4.1 Proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus obtenidas mediante fragmentación por salado y electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) La electroforesis en geles de poliacrilamida de las proteínas séricas obtenidas de la fragmentación por salado de ambas especies se puede apreciar en la figura 6. Como se puede observar, no existen diferencias entre las bandas proteicas de las secuencias fragmentadas de 0-25% y 25-50% de saturación con [NH4]2SO4 en ambas especies (Figura 6A). Sin embargo, en la Figura 6B se puede apreciar una banda más gruesa (entre 55 – 70 kDa) en los carriles correspondientes a los sobrenadantes de la especie bufalina (carriles 5 y 7).. A. B. Figura 6. A: SDS-PAGE realizada a muestras de suero bovino y bufalino. Carril 1 y 2 muestras precipitadas de 0-25 de ganado bovino; carril 3 y 4 - muestras precipitadas de 025 de ganado bufalino; carril 5 y 6 - muestras precipitadas de 25-50 de ganado bovino; carril 7 y 8 - muestras precipitadas de 25-50 de ganado bufalino y carril 10 - marcador de peso molecular. B Carril 1 y 2 - suero bovino; carril 3 y 4 - suero bufalino; carril 5 y 7 sobrenadante de muestras fragmentadas bufalinas; carril 6 y 8 -, sobrenadante de muestras fragmentadas bovinas y carril 10 - marcador de peso molecular.. 23.

(35) Resultados. 4.2 Purificación de las proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante cromatografía de exclusión molecular y electroforesis SDS-PAGE Las Figuras 7 y 8 muestran, respectivamente, la presencia de un pico máximo de densidad óptica de 0,55 y un pico con valores superiores a 1,0. No se aprecian en ninguno de los dos casos otros picos, transcurridos 30 minutos.. 24.

(36) Figura 7. Cromatograma de la filtración en Sephadex G100 de 1 ml de la muestra de suero bovino.. Figura 8. Cromatograma de la filtración en Sephadex G100 de 1ml de la muestra de suero bufalino.. 25.

(37) Resultados. A través de la electroforesis SDS-PAGE en gel de poliacrilamida, se identificó que no existen grandes diferencias en cuanto a la presencia de bandas proteicas. La característica distintiva lo constituye, sin lugar a dudas, la mayor (apreciable) concentración de proteínas en las fracciones del suero bufalino. A pesar de las deficiencias presentes en el Gel B, se puede evidenciar la existencia de una banda proteica de entre 25 – 35 KDa de peso molecular, la cual no aparece en la muestra bovina.. B. A 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Figura 9 A: .SDS-PAGE, Muestras de suero bovino. Carril 1 - fracción cromatográfica 4; carril 2 - fracción cromatográfica 5; carril 3 - fracción cromatográfica 6; carril 4 - fracción cromatográfica 7; carril 5 - fracción cromatográfica 8; carril 6 - fracción cromatográfica 9 y carril 8 - marcador de peso molecular. B: Muestras de suero bufalino. Carril 1 - fracción cromatográfica 7; carril 2 - fracción cromatográfica 6; carril 3 - fracción cromatográfica 8; carril 4 - fracción cromatográfica 9; carril 5 - fracción cromatográfica 10; carril 6 - fracción cromatográfica 11; carril 7 - fracción cromatográfica 12, carril 8 - fracción cromatográfica 13 y carril 9 - marcador de peso molecular.. 4.3. Determinación del perfil lectinológico 4.3.1. Ensayo con ConA y PHA-M En el ensayo de hemoaglutinación (Figura 10) donde se utilizó la ConA y PHA-M , aplicadas a las muestras de sangre de ambas especies, se obtuvo que en el caso de la ConA con respecto a la sangre bufalina (A y B) resultó positivo. Se determinó 26.

(38) Resultados. el título aglutinante siendo 1/128, así como la mínima concentración de aglutinación (0.031 mg/mL) y el título de trabajo fue 1/32. En el caso de la sangre bovina (C, D) no ocurrió el proceso de aglutinación con el uso de la ConA. Por su parte, el uso de PHA-M con las muestras bufalinas (E, F) ocurrió el proceso de aglutinación. Se determinó el título aglutinante siendo 1/1024. La mínima concentración de aglutinación fue de 0.004 mg/mL y el título de trabajo fue 1/256. Para el caso de las muestra bovina (G, H) el proceso de aglutinación fue negativo.. Figura 10. Ensayo de Hemoaglutinación con (ConA) y (PHA-M). 4.3.2. Ensayo con lectinas WGA y PHA-P La aplicación de la lectina WGA en el proceso de aglutinación resultó positivo para ambas muestras de sangre, comportándose de manera diferente en cada caso. Se determinó como título aglutinante para las muestras de ganado bufalino, A y B, 1/256, mientras que para las muestras de ganado bovino, C y D, 1/32. La mínima concentración de aglutinación para la sangre bufalina fue de 0.016 mg/mL y para la sangre bovina fue de 0.125 mg/mL. El título de trabajo para la muestra bufalina fue 1/64, mientras que en la muestra bovina fue 1/8. 27.

(39) Resultados. El proceso de aglutinación ocurrió entre la lectina PHA-P y las muestras de sangre bufalina (E, F) y no así con la muestra de sangre bovina (G, H) donde el proceso resultó negativo. El título aglutinante es 1/2048, la mínima concentración de aglutinación: 0.002 mg/ml y el título de trabajo: 1/512. Este ensayo de aglutinación se puede apreciar en la figura 11 que se muestra a continuación.. Figura 11.Ensayo de Hemoaglutinación con (WGA) y (PHA-P). 4.3.3 Ensayo con lectina RCA El ensayo de hemoaglutinación en el caso de la lectina (RCA) con respecto a las muestras es positivo para ambos casos (figura 12). El título de aglutinación para la lectina es de 1/1024 con la sangre bufalina (A, B), mientras que para la sangre bovina (C, D) es 1/32. La mínima concentración de aglutinación para la muestra bufalina es de 0,004 mg/mL y 0,125 mg/mL para la muestra bovina. Por su parte, el título de trabajo para la sangre bufalina es 1/256 y para la sangre bovina 1/8.. 28.

(40) Resultados. Figura 12. Ensayo de Hemoaglutinación con (RCA).. 4.4. Comprobación mediante pruebas de campo de la efectividad de las lectinas en la identificación de sangre bovina y bufalina. Producto a los resultados obtenidos en la determinación del perfil lectinológico, se decidió realizar un ensayo de aglutinación basado en una prueba de campo con la utilización de Con A, WGA y RCA. Se demostró que las tres lectinas aglutinaban con la muestra de sangre bufalina; sin embargo, en la muestra de sangre bovina no ocurrió el proceso de aglutinación (figura 13).. 29.

(41) Resultados. Figura 13. Pruebas de Hemoaglutinación en campo. A- sangre bovina enfrentada a Con A, B- sangre bovina enfrentada a WGA, C- sangre bovina enfrentada a RCA, D- sangre bufalina enfrentada a Con A, E- sangre bufalina enfrentada a WGA, F sangre bufalina enfrentada a RCA.. 30.

(42) 5. Discusión El suero sanguíneo es un complejo fluido que contiene concentraciones variables de proteínas que participan en la nutrición celular, en cascadas de señalización y regulan múltiples eventos inmunológicos. El mayor porcentaje lo constituyen las albúminas, globulinas, inmunoglobulinas, trasferrinas y lipoproteínas y en menor constitución se encuentran otras proteínas que son sintetizadas y secretadas por células y tejidos del organismo (Schrader y Schulz-Knappe, 2001; Kennedy, 2001). 5.1 Proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante fragmentación por salado y electroforesis SDS-PAGE. Históricamente, las electroforesis SDS-PAGE se emplean para analizar la complejidad y la variedad de proteínas en los fluidos del organismo, que conlleva al diagnóstico de diferentes enfermedades como hemoglobinopatías, deficiencias del sistema inmune y anomalías genéticas (Azim et al., 2004). A través de este método, varios investigadores sugieren que la detección de proteínas en el suero puede presentar valor taxonómico (Miyazaki et al., 1998; Pinerio et al., 2001) por lo que se utilizó para la diferenciación de los géneros Bubalus y Bos pertenecientes a la familia Bovidae. Con la aplicación de la fragmentación por salado previa a la electroforesis no se observan diferencias entre las secuencias fragmentadas de 0-25 y 25-50 (Figura 6A), en las especies bovina y bufalina. No obstante, en la figura 6B, en los carriles correspondientes a los sobrenadantes, se puede apreciar una banda más gruesa. Esto sugiere que tanto en las muestras bovinas como bufalinas existe gran diversidad de proteínas. En este método, las sales remueven la capa de agua de la superficie de las proteínas, revelando los parches hidrofóbicos a los cuales se unen, causando que la proteína precipite. Generalmente es efectiva y poco costosa; además, causa poca desnaturalización, pero existen variables que pueden condicionar su resultado, como la temperatura, la agitación, la concentración inicial de la proteína y el nivel de co-precipitación (Doran, 1995). 31.

(43) Discusión. Las bandas gruesas que se observan en los geles de poliacrilamida, específicamente las dos bandas anchas correspondientes al sobrenadante de la especie bufalina, podrían constituir agregados proteicos. Estos agregados han sido causa fundamental de confusiones, malas interpretaciones e, incluso, falseo de resultados en algunas investigaciones. En la mayoría de las ocasiones, estos agregados contribuyen a la modificación de la estructura de la proteína de forma irreversible y, por ende, a la pérdida de su función (Bondos y Bicknell, 2003). 5.2 Proteínas séricas específicas de Bubalus bubalis y Bos taurus mediante cromatografía de exclusión molecular y electroforesis SDS-PAGE La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada filtración en gel o de tamiz molecular) es una de las técnicas más sencillas de las empleadas en la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Dentro de sus múltiples aplicaciones se encuentran: el desalado de proteínas, polisacáridos y polipéptidos, la eliminación de productos, cofactores, inhibidores, así como la purificación de macromoléculas y la determinación del peso molecular de las proteínas. La inclusión de esta técnica dentro de las pruebas utilizadas en nuestra investigación se soporta en estas afirmaciones que han sido de una forma u otra señalada por varios autores (Beeckmans, 1999; Coligan et al., 2003). Contrastantemente, los resultados obtenidos no verificaron la claridad deseada. No obstante, es un aspecto que debe mejorarse mediante la utilización de otras técnicas cromatográficas, como la cromatografía de intercambio iónico. De cualquier forma, no ha sido errada la utilización de esta técnica, pues en la actualidad se recomienda incluso para la purificación de bio-conjugados QDs (quantum dots) (Wang et al., 2013). Los resultados permitieron visualizar una proteína en el suero bufalino de aproximadamente 25 – 35 kDa, no apreciable en la electroforesis de la muestra bovina (Figura 7 y 8). Futuras investigaciones podrían centrarse en la clarificación de estos resultados, para lograr definir la posible utilización de esta proteína como antígeno específico para la producción de anticuerpos policlonales. 32.

(44) Discusión. 5.3 Determinación del perfil lectinológico El estudio de una gran diversidad de lectinas, aisladas y caracterizadas, de diferentes especies vegetales y animales permitió identificar que existe una gran similitud estructural entre las lectinas de una misma familia. Actualmente son utilizadas para el estudio de numerosas actividades biológicas que pueden inducir, tales como aglutinación de eritrocitos (hemoaglutinación) humano y animal, aglutinación de células malignas y actividad inmunosupresora (Rodríguez et al., 1996, Sharon y Lis., 2004). En virtud de esta propiedad, son herramientas útiles no solo para la purificación de polisacáridos, glicoproteínas y glicolípidos, sino también para evidenciar la topología de superficies celulares y los cambios inducidos por transformaciones de las mismas (Hernández et al., 2005). La actividad aglutinante de las lectinas (Con-A, PHA-M, WGA, PHA-P y RCA) se comportó de forma diferente para las muestras de sangre bufalina y bovina (Tabla III), lo que evidencia la especificidad de estas por estructuras sacarídicas altamente conservadas en las proteínas. Tabla III. Hemoaglutinación y título aglutinante para las muestras de sangre bufalina y bovina. Hemoaglutinación. Título Aglutinante. Muestra Bufalina. Muestra Bovina. Muestra Bufalina. Lectina. Origen. Con-A. Canavalia ensiformis. Positivo. Negativo. 1/128. PHA-M. Phaseolus vulgaris. Positivo. Negativo. 1/1024. WGA. Tricticum vulgaris. Positivo. Positivo. 1/256. PHA-P. Phaseolus vulgaris. Positivo. Negativo. 1/2048. RCA. Ricinus comunis. Positivo. Positivo. 1/1024. Muestra Bovina. 1/32. 1/32. 33.

(45) Discusión Las lectinas Con-A, PHA-M y PHA-P, procedentes de plantas pertenecientes a la familia Fabaceae (leguminosas) generalmente se encuentran constituidas por dos o cuatro subunidades idénticas de 25-30 kDa. Cada una de las subunidades contiene un sitio de unión para iones metálicos como Ca2+, Mg2+y Mn2+ (Sharon y Lis, 2004).. Estas lectinas aglutinaron solamente las muestras de sangre bufalina, lo que indica la presencia de diferentes carbohidratos en la membrana de sus eritrocitos (Castillo–Villanueva y Abdullaev, 2005). Independientemente de su especificidad, reconocen a los carbohidratos gracias a la presencia de tres aminoácidos invariantes: ácido aspártico, asparagina y un residuo aromático o una leucina. El hecho de que estos aminoácidos se encuentran altamente conservados en todos los miembros de una familia, sugiere que la especificidad está dada por la orientación de los monosacáridos en el sitio de reconocimiento. Con-A actúa específicamente uniéndose a restos de α-D-glucosa y α-D- manosa, mientras PHA-M y PHA-P reconocen oligosacáridos (Hernández et al., 2005). Sin embargo, RCA y WGA, pertenecientes a la familia Euphorbiaceae y Poaceae respectivamente, aglutinaron tanto las muestras de sangre bufalina como bovina, por lo que se infiere que los eritrocitos de ambas especies presentan los monosacáridos ß-galactosa y N-acetil-α-D-galactosamina (GalNAc), reconocidos por. RCA. y. N-acetil-α-D-glucosamina. (GluNAc),. específicos. para. WGA.. Conociendo estas características, son varios los investigadores que han utilizado, o propuesto utilizar estas lectinas para la caracterización de glicotopos de carbohidratos complejos en mamíferos (Wu et al., 2006) y también para la identificación de glicoconjugados, tales como glicosaminoglicanos (Barbeito et al., 2013). La capacidad aglutinante de la Con A para eritrocitos de búfalo se ha señalado anteriormente por (Sharma y Gokhale, 2012), al compararla con la aglutinación de eritrocitos de cabras y humanos. Es esta investigación se evidenció que existen diferencias básicas a nivel de las proteínas de membrana presentes en los eritrocitos de estas especies. 34.

(46) Discusión. 5.4 Comprobación mediante pruebas campo de la efectividad de las lectinas en la identificación de sangre bovina y bufalina. La utilización de lectinas de diferente origen para identificar, seleccionar y aislar células ha sido ampliamente estudiada. No obstante, sus aplicaciones van mucho más allá del simple reconocimiento celular. En nuestro país no existen antecedentes de investigación sobre el uso de estas proteínas para identificar células sanguíneas de origen bovino y/o bufalino, y menos aún en pruebas de campo. Sin embargo, el papel de las lectinas vegetales en la identificación de grupos sanguíneos humanos ha sido referida por varios autores desde hace varios años (Boyd y Shapleigh, 1954b; Judd, 1980; Khan et al., 2002; Lam y Ng, 2011) Existe una gran ventaja en cuanto a la posibilidad de realizar el ensayo de aglutinación en condiciones de campo. 1ro – la obtención de ConA con buen grado de pureza es relativamente fácil (Agrawal y Goldstein, 1967; Ganem y Martín, 2000), 2do – la efectividad de la prueba en condiciones de campo garantiza que no se requieran condiciones especiales como en un laboratorio, 3ro – el procedimiento general es más económico que la obtención de un antisuero específico (pAb o mAb, anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal).. 35.

(47) 6. Conclusiones 1. La proteína localizada entre los 25 – 35 kDa, obtenida en la cromatografía del suero sanguíneo de la especie bufalina no se localiza en el suero de la especie bovina. 2. Los eritrocitos de Bubalus bubalis poseen epítopos para las cinco lectinas utilizadas y los eritrocitos de Bos taurus los posee para RCA y WGA. 3. ConA puede ser utilizada para diferenciar la sangre bufalina de la sangre bovina en pruebas de campo.. 36.

(48) 7. Recomendaciones 1.. Definir la especificidad o no de la banda proteica presente en el suero bufalino.. 2.. Desarrollar un protocolo de separación de proteínas séricas basado en la cromatografía de intercambio iónico.. 3.. Investigar otras lectinas que puedan ser utilizadas para incrementar el nivel de diferenciación.. 37.

(49) 8. Referencias bibliográficas Agrawal, B., y I. J. Goldstein (1967): Protein — carbohydrate interaction VI. Isolation of concanavalin A by specific adsorption on cross—linked dextran gels. Biochim Biophys Acta. 147:262-271. Almaguer, Y. (2007): El búfalo, una opción de la ganadería. REDVET 6(8):1-23 Álvarez, J. (2001): Bioquímica nutricional y metabólica del bovino en el trópico. Editorial Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia, 200 pp. Anuario, L. (2008): Producción bufalina. Dirección de Ganadería. Área bufalina. Disponible en: http://www.Sagpya.mecon.ar [Consulta: 4 de enero del 2013] Athamna, A., D. Cohen, M. Athamna, I. Ofek y H. Stavri (2005): Rapid identification of Mycobacterium species by lectin agglutination. J Microbiol Methods. 65 (2):209-215. Azim, W., A. Khalid, S. Haleema y R. Tariq (2004): Diagnostic significance of serum protein electrophoresis, Biomedica. 20(2):40-44. Barbeito, C., H. Ortega, V Matiller, E. Gimeno y N. Salvetti (2013): Lectin-Binding Pattern in Ovarian Structures of Rats with Experimental Polycystic Ovaries. Reprod. Domest. Anim.. Apr. 18.. Disponible. en:. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23594274 [Consultado el 14 de mayo. de. 2013]. Beeckmans, S. (1999): Chromatographic Methods to study protein–protein interactions. Methods. 19, 278 – 305. Bodes, J., (1999). Sacrificio Ilegal de Ganado Mayor. Disponible en: http://www.granma.cu/codigo/007-e.html. [Consultado el 14 de Julio. de. 2011].. 38.

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