LABORATORIO N° 6
CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA, BILIRRUBINA Y ÁCIDO ÚRICO
CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA 1. INTRODUCCIÓN
La hemoglobina es la molécula que transporta el oxígeno desde los pulmones a los tejidos y se encuentra en los hematíes, formados en la médula ósea. Está formada por cuatro subunidades, en el adulto dos alfa y dos beta. Cada subunidad está formada por una cadena de globina que tiene un núcleo heme con Fe ++.
La disminución de la concentración de hemoglobina constituye la anemia. La OMS ha establecido como criterio de anemia <13 g/dl en varones, <12 g/dl en mujeres, <11 g/dl en gestantes. En niños está en función de la edad.
La anemia tiene diversas causas: menor formación por razones nutricionales (deficiencia de hierro, de vitamina B12, de ácido fólico) o deficiencia de la médula ósea (aplasia), hemólisis por problemas del glóbulo rojo (hemoglobinopatías, esferocitosis, etc.) o por presencia de anticuerpos (anemia hemolítica autoinmune, eritroblastosis fetal, etc.) o por hemorragia.
2. MUESTRA:
Sangre total. Volumen de la muestra de solo 8 o 10 µl.
3. REACTIVOS.
A.-MATERIALES
Micro cubeta compatible con el hemoglobinómetro.
Torundas de algodón.
Guantes no estériles.
Alcohol B.-EQUIPO:
Hemoglobinómetro
4. PROCEDIMIENTO:
Una vez que se retire la lanceta retráctil de la zona de punción, esperar que fluya o se forme espontáneamente la primera gota, sin presionar el dedo.
Si la gota no se forma espontáneamente, estirar ligeramente la piel del dedo hacia ambos lados de la punción, evitar la presión ya que puede ocasionar “ordeño” involuntario y puede ocasionar hemólisis por lo tanto error en los resultados.
Limpiar las dos primeras gotas de sangre con una torunda de algodón limpia y seca. Estas gotas de sangre contienen líquido intersticial y pueden dar resultados falsos.
Sostener la microcubeta de la zona distal opuesta a la zona de reacción.
En este paso y en relación a la micro cubeta se debe tener en cuenta lo siguiente:
Observar la integridad de la microcubeta, coloración y homogeneidad del reactivo. Descartar si esta tiene coloración anaranjada o presenta grumos dentro de la zona de reacción.
Mantener la tapa del contenedor cerrada, para evitar la exposición innecesaria de las microcubetas al aire, a la humedad y al calor, especialmente en climas húmedos, de esta manera se evita la oxidación de los reactivos.
Descartar la microcubeta que haya estado expuesta por más de 15 minutos fuera de su envase original.
5. RESULTADOS
Estudiante varón de 19 años, nacido en Trujillo. Lectura del equipo: 14 g/dl Estudiante mujer de 18 años, nacida en Chimbote. Lectura del equipo: 11 g/dl 6. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
7. VALORES DE REFERENCIA:
VARONES: 14 a 16 g/dl
MUJERES: 12 a 14 g/dl a nivel del mar.
Niños en función de la edad.
(Ver tabla del INS) Cuestionario
1. Haga un esquema de la síntesis de la hemoglobina 2. ¿ Cómo se clasifican las anemias?
3. ¿En una anemia por deficiencia de hierro cuáles son los exámenes bioquímicos que se solicitan?
4. ¿Qué es una anemia megaloblástica y cuáles son sus causas?
5. ¿Cómo se corrige el efecto de la altura sobre la concentración de hemoglobina?
6. ¿Cuáles son las hemoglobinas embrionarias y fetales?
7. ¿Cuáles son las hemoglobinas del adulto y cómo se diferencian?
Jordán T. MINSA Guía Técnica: Procedimiento para la determinación de la hemoglobina mediante hemoglobinómetro portátil , Lima 2013
https://web.ins.gob.pe/sites/default/files/Archivos/cenan/van/tecnica_vigilancia_nutricional/
bioquimica/Determinaci%C3%B3n_hemoglobina_mediante_hemoglobin%C3%B3metro_portat il.pdf
https://www.youtube.com/watch?v=ODaV_SI9_24 https://www.youtube.com/watch?v=XE9REvYo2ek
CUANTIFICACIÓN DE BILIRRUBINA 1. Introducción
Producto del catabolismo de la hemoglobina (70 a 90%) y de otras hemoproteínas.
Puede ser:
a. BILIRRUBINA INDIRECTA: Es la recién formada. Requiere un solvente para unirse al reactivo de Van der Bergh. Se transporta unida a la albúmina, no se elimina por la orina. Captada por el hepatocito a través de un sistema aún no dilucidado. En el citosol se une a algunas de las glutatión-5-transferasas.
y al conjugarse con dos ácidos glucurónico se convierte en directa.
b. BILIRRUBINA DIRECTA O CONJUGADA: con una o dos moléculas de ácido glucurónico por acción de la UDP-glucuronil transferasa formando respectivamente mono o diglucurónidos de bilirrubina. Es excretada a través de la membrana plasmática de los canalículos, pasando a los propios conductos biliares a través de un transporte que requiere ATP donde participa MRP2 o proteína ligada a la multidrogo resistencia-2. La bilirrubina directa es eliminada por la bilis hacia el intestino donde es convertina en estercobilinógeno y luego a estercobilina dando el color a las heces. La bilirrubina directa es soluble y si aumenta se elimina por la orina.
c. BILIRRUBINA TOTAL: suma de directa e indirecta.
2. Fundamento del método
La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado (reacción de Ehrlich) produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso (Reactivo A) que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción.
3. Reactivos
Reactivo A: solución acuosa de benzoato de cafeína 0,13 mol/l, tamponada y estabilizada.
Reactivo B: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0,17 mol/l.
Reactivo C: solución de nitrito de sodio 0,07 mol.
Diazorreactivo: de acuerdo al volumen de trabajo, mezclar
(1 parte de Reactivo C con 21 partes de Reactivo B. Rotular y fechar.) 4. Procedimiento:
Preparar el siguiente sistema
MUESTRA BLANCO DIRECTA TOTAL
Suero 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2.5 ml 2.5 ml
Reactivo A 2.5 ml
Reactivo B 200 ul
Diazoreactivo 200 ul 200 ul
Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. Luego de 5 minutos, leer en espectrofotómetro a 530 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520-550 nm), llevando el aparato a cero con agua destilada. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos, excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. Si se lee antes, habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta. Si se lee después, habrá sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre
El equipo ha sido previamente calibrado con un estándar de biliirrubina de 10 mg/dl
5. Resultados:
Blanco: 0,020 Directa: 0, 470 Total: 0.,520
Absorbancia del estándar= 0,500 Factor= 10 mg/dl /0,500 = 20 Factor= 20
Bilirrubina directa= ( 0,470-0,020) x factor = 9 mg/dl Bilirrubina: total = (0,520-0,020) x factor 10 mg/dl
Bilirrubina indirecta= Bilirrubina total –Bilirrubina directa= 1 mg/dl Bilirrubina indirecta= 1
6. Interpretación
7. Valores de referencia
Bilirrubina en suero o plasma - ADULTOS:
DIRECTA: hasta 0.2 mg/dl (0.3) TOTAL: hasta 1 mg/dl
RECIÉN NACIDOS:
NACIDOS A TÉRMINO PREMATUROS Sangre de cordón 2.5 mg/dl
hasta las 24 hs 6.0 mg/dl 8mg/dl hasta las 48 hs 7.5 mg/dl 12 mg/dl del 3º al 5º día 12 mg/dl 24 mg/dl Cuestionario
1. Haga un esquema de la síntesis y metabolismo de la bilirrubina 2. ¿Porqué se llama bilirrubina directa?
3. ¿Porqué se llama bilirrubina indirecta?
4. ¿Cuál es el rol del reactivo A?
5. ¿Con que reactivo se une la bilirrubina para dar color’
6. Haga un cuadro de clasificación de la hiperbilirubinemia con ejemplos de los tipos
7. ¿ Qué es la ictericia ?
Video: https://www.youtube.com/watch?v=qmPGYwM9Ii4 https://www.youtube.com/watch?v=wA7gtt0CkQY
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO 1. Introducción
El ácido úrico es el producto del catabolismo de las purinas, bases de los ácidos nucleicos. Se sintetiza en el hígado y en el intestino delgado por acción de la xantino oxidasa. Su producción varía en función del contenido de purinas del alimento y de las síntesis de novo, de recuperación y degradación de las purinas. Es eliminado por los riñones 66 a 75% El incremento de ácido úrico en sangre o hiperuricemia, conforme incrementa su valor se asocia a artritis gotosa o urolitiasias (gota), de hecho la principal complicación de la hiperuricemia es la artritis gotosa, cuando el ácido úrico es >9 mg/dl la frecuencia de gota es de 4.9% La gota es una enfermedad metabólica que afecta más a varones adultos en la etapa media de la vida o de edad avanzada y a mujeres postmenopáusicas; se caracteriza por episodios de artritis aguda o crónica por depósito de cristales de urato monosódico en la articulaciones y por tofos en el tejido conjuntivo, litiasis urinaria, nefropatía por urato e insuficiencia renal.
2. Muestra: Suero
3. Fundamento del método
El esquema de reacción es el siguiente:
UOD
ácido úrico + 2 H2 O + O2 alantoína + H2 O2 + CO2
POD
2 H2 O2 + 4-AF + 3,5-DHS quinonimina roja.
4. Reactivos:
S. Standard: solución de ácido úrico 10 mg/dl.
A. Reactivo A: viales conteniendo uricasa (UOD), peroxidasa (POD), 4- aminofenazona (4-AF) y ferrocianuro de potasio.
B. Reactivo B: solución de diclorohidroxibenceno sulfónico (DHS) en buffer fosfatos pH 7,4.
5. Procedimiento
TÉCNICA CON REACTIVOS SEPARADOS
En tres tubos o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco), S (Standard) y D (Desconocido), colocar: B
Mezclar suavemente e incubar 5 minutos en baño de agua a 37o C o 20 minutos a temperatura ambiente (18-25o C). Retirar, enfriar y leer en espectrofotómetro
B S D
Standard - 20 ul -
Muestra - - 20ul
Reactivo de Trabajo 1ml 1ml 1ml
a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm), llevando el aparato a cero con el Blanco.
Estabilidad de la mezcla de reacción final
El color de reacción final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso
6. Resultados
Blanco= 0,00 Estándar= 0,300 Desconocido= 0,350
Factor = 10 mg/dl = 33,3 0,300
Desconocido= 0,350 x factor Desconocido= 11,65 mg/dl 7. Interpretación de resultados
8. Valores de referencia del método enzimático Hombres: 3,5-7,2 mg/dl
Mujeres: 2,6-6,0 mg/dl CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las características de los cristales de ácido úrico en la orina?
2. ¿Qué es la gota?´
3. ¿Qué dieta debe seguir un paciente con hiperuricemia?
4. ¿Cuál es la base genética de la hiperuricemia?
5. ¿Cuáles son las causas de la hiperuricemia?
6. ¿Qué es gota primaria y la gota secundaria?
Videos https://www.youtube.com/watch?v=mWCPL3eXKMI Referencias Bibliográficas
1. Kasper D , Fauci A, Hauser S, Longo D, Jameson L, Loscalzo J. Ed, Harrison, Principios de Medicina Interna, Ed19 ed, 2016, McGraw Hill Interamericana Ed, Mexico, pg 2232-2237
2. RodwelL V, Bender D, Botham K, Kennelly P, Weil P.Harper.
Bioquímica Ilustrada
3. Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretacion , 2 edición Edit. Universitaria . Trujillo, 2018 4. Vademecum Wiener Lab, Rosario Argentina
5. Jordán T. MINSA Guía Técnica: Procedimiento para la determinación de la hemoglobina mediante hemoglobinómetro portátil , Lima 2013
https://web.ins.gob.pe/sites/default/files/Archivos/cenan/van/tecnica_vigilan cia_nutricional/bioquimica/Determinaci%C3%B3n_hemoglobina_mediante_he moglobin%C3%B3metro_portatil.pdf
