Identificación “in silico” de nuevos compuestos inhibidores de la Termolisina como nuevas alternativas terapéuticas

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(1)Universidad Central “Martha Abreu” de Las Villas. Facultad de Química-Farmacia. Departamento de Farmacia.. TRABAJO DE DIPLOMA Identificación “in silico” de nuevos compuestos inhibidores de la Termolisina como nuevas alternativas terapéuticas. Autora: Zuleidys Contreras Posadas Tutores: Lic. Yudith Cañizares Carmenate Dr.: Yovany Marrero Ponce Dr. Gerardo Casañola Martín Santa Clara. 2009..

(2) Uno no advierte jamás lo que está hecho, solo puede ver lo que queda por hacer. Marie Curie.

(3) Dedico este trabajo A mi madre y mi padre con mucho amor, por hacerme comprender que vale más fracasar por obtener un triunfo; que dejar de triunfar por temor al fracaso. A mi abuelita Fela, por su infinita bondad, por su sacrificio inigualable, eres mi guía, aunque ya no estes. A mis Hermanos y mis abuelos Dulce y Miguel por ser mi apoyo y mi resguardo. A mi novio, por comprenderme y hacerme feliz en todos estos años. A los que nunca satisfacen su necesidad de progresar, de avanzar, de buscar formas superiores de vida, de hacer más perfecta la vida del hombre.. A los que sueñan y actúan para materializar un sueño..

(4) Agradecimientos Es una satisfacción para mí expresar mis más sinceros agradecimientos a todas aquellas personas de una forma u otra me han ayudado a culminar exitosamente mis estudios y este trabajo. Quisiera agradecer especialmente a mi familia y a mi novio por confiar en mí y por todo el apoyo y el amor que me han brindado durante todo el transcurso de mi carrera. A mis tutores Yudith y Gerardo por su apoyo, ánimo y dirección durante el desarrollo de este trabajo. A mi familia de Ceballos por regalarme todo su cariño y apoyo de forma incondisional. Al Grupo de Diseño de Fármacos, especialmente a Juan Alberto por su atención y toda la ayuda que me ha brindado para el desarrollo de esta tesis. A mis compañeros de aula especialmente a Leyanis y Oremia por estar conmigo en los momentos buenos y malos durante estos cinco años de mi vida estudiantil. A mis viejos amigos que de una manera u otra me han apoyado y se han preocupado por mi desempeño. A todos muchas gracias..

(5) Glosario ∆G: Energía libre de Gibbs ΔP%: Diferencia de probabilidades AC: Análisis de Conglomerados ACE: Siglas en ingles de Alternating Condicional Expectations ADL: Análisis Discriminante Lineal ADM: Adrenomedulina AM1: Siglas en ingles de Austin model 1 AMPc: AMPciclico ATP: Adenosina tri-fosfato C: coeficiente de correlación de Mattews C.N.D.O: Siglas en ingles de Complete neglect differential overlap CASE: Siglas en ingles de Computer Automated Structure Evaluation CDA: Análisis discrimínate canónico CLT: Dipéptido de N-Carboxialkil CoMFA: Siglas en ingles de Comparative Molecular Field Analysis CR: Siglas en ingles de Continuum Regression D2: Cuadrado de la distancia de Mahalanobis DA: Dominio de aplicación DMs: Descriptores moleculares E: Enzima Ea: Energia de activación EC: Clasificación enzimática ECA: Enzima convertidora de Angiotensina ECE: Enzima convertidora de endotelina EHT: Teoría de Hückel EI: Complejo Enzima-Inhibidor EPN: Endopeptidasa Neutra ES: Complejo Enzima-Sustrato.

(6) FP: Falsos positivos FN: Falsos negativos GMPc: GMP cíclico gran-ET I: Gran endotelina I GTP: Guanosina trifosfato HTA: Hipertensión arterial I.N.D.O: Siglas en ingles de Intermediate neglect differential overlap I: Inhibidor IC: Insuficiencia Cardiaca ILP: Siglas en ingles de Inductive logic programming ITs: Índices Topológicos Ki: Coeficiente de inhibición enzimática Km: Constante de Michaelis KNN: K –esimo vecino más Cercano LTA4H: Leukotrieno hidrolasa A4 M.I.N.D.O: Siglas en ingles de Modified INDO M.N.D.O: Siglas en ingles de Modified neglect of diatomic overlap MW: Peso molecular Nx: conteo de átomos-tipo OECD: Siglas en ingles de Organization for Economic Cooperation and Development OLS: Siglas en ingles de Ordinary Least Squares P: Producto P(actv): Probabilidad con que la ecuación clasifica un compuesto como activo P(inactv): Probabilidad con que el modelo clasifica un compuesto como inactivo PCR: Siglas en ingles de Principal Components Regression PFC: Clasificadores de función potenciales PLSR: Siglas en ingles de Partial Least Squares Regression PM3: Siglas en ingles de Parametric model 3 PN: Péptidos Natriuréticos PNA: Péptido Natriurético Auricular o de tipo A PNB: Péptido Natriurético Cerebral o de tipo B PNC: Péptido Natriurético de tipo C.

(7) Q: Porcentajes de buena clasificación o Exactitud QDA: Análisis Discriminante Cuadrático QSAR: Siglas en ingles de Quantitative Structure Activity Relationships QSPR: Siglas en ingles de Quantitative Structure Property Relationships RDA: Análisis Discriminante Regularizado REACH: Siglas en ingles de Registration, Evaluation, Authorization of Chemicals RFP: Razón de Falsos Positivos RLM: Regresión Lineal Múltiple S: Sustrato SCE: Suma de Cuadrados Error SCF MO: Métodos semiempíricos basados en la teoría de los orbitales moleculares SE: Serie de entrenamiento SP: Serie de predicción SRAA: Sistema Renina Angiotensina Aldosterona SWR: StepWise Regression TLN: Termolisina V0: Velocidad inicial Vmax: Velocidad Máxima VC: Validación cruzada VP: Verdaderos positivos VN: Verdaderos negativos.

(8) Resumen La Termolisina (EC 3.4.24.27), aislada del Bacillus thermoproteolyticus, es una metaloendoproteasa neutra que contiene cuatro iones de calcio necesarios para su estabilidad térmica y un ion de zinc esenciales para su actividad catalítica. Esta enzima constituye un excelente modelo farmacológico y biológico para varios miembros de esta clase de proteasas, en particular la Endopeptidasa Neutra (EC 3.4.24.11), la cual juega un papel muy importante en el metabolismo de los Péptidos Natriuréticos. Por lo que, inhibidores de esta enzima se consideran potenciales agentes terapéuticos antihipertensivos. En este trabajo se desarrollan modelos QSAR predictivos basados en descriptores del DRAGON, que incluye descriptores 0D, 1D, 2D y 3D utilizando el Análisis Discriminante Lineal como técnica estadística para la obtención de las funciones de clasificación. Los modelos QSAR propuestos son capaces de explicar con ocho variables más del 80% de la varianza en potencia inhibidora y muestran una buena capacidad de predicción en la validación externa y la validación cruzada (dejando grupos fuera). Además se realiza la prueba de la Y-aleatoria, también como método de validación interna. Posteriormente se determina el dominio de aplicación del modelo donde solo tres compuestos de la serie de entrenamiento. quedan fuera, así como 26 compuestos de una serie de 121 dipéptidos. utilizados posteriormente para un cribado virtual. Los resultados obtenidos indican que los modelos QSAR desarrollados son estadísticamente significativos, robustos y poseen una elevada efectividad predictiva. Por ello, estos modelos QSAR constituyen una herramienta factible y práctica para el descubrimiento de nuevos y potentes fármacos con actividad inhibitoria de la Termolisina..

(9) Tabla de contenido Introducción.............................................................................................................................................. 1 1. Revisión Bibliográfica .......................................................................................................................... 5 1.1 Generalidades de las enzimas. ................................................................................................... 5 1.1.1 Introducción al estudio de las enzimas ............................................................................... 5 1.1.2 Clasificación ....................................................................................................................... 5 1.1.3 Actividad catalítica y especificidad de las enzimas............................................................ 6 1.1.4 . Cinética enzimática y ecuación de Michaelis y Menten................................................... 8 1.1.5 . Inhibición.......................................................................................................................... 9 1.2 Termolisina .............................................................................................................................. 12 1.2.1 Generalidades. .................................................................................................................. 12 1.2.2 Mecanismo de acción ....................................................................................................... 13 1.2.3 Importancia de los inhibidores de la TLN como modelos potenciales para metalopeptidasas mamíferas fisiológicamente importantes. .......................................................... 14 1.2.4 Homología entre la TLN y metaloproteinas relacionadas ................................................ 16 1.2.5 . Características generales de la Endopeptidasa Neutra.................................................... 17 1.2.6 Péptidos Natriuréticos....................................................................................................... 17 1.2.7 Hipertensión arterial ......................................................................................................... 20 1.2.8 Estudios QSAR en el desarrollo de inhibidores de TLN.................................................. 22 1.3 Estudios QSAR ........................................................................................................................ 24 1.3.1 Descriptores Moleculares ................................................................................................. 25 1.3.2 Descriptores del software DRAGON. .............................................................................. 27 1.3.3 Métodos Quimiométricos en estudios QSAR................................................................... 28 1.3.4 Diseño Experimental ........................................................................................................ 29 1.3.5 Análisis de Regresión ....................................................................................................... 29 1.3.6 Análisis discriminante ...................................................................................................... 30 1.3.7 Análisis de conglomerado................................................................................................. 31 1.3.8 Métodos semiempíricos .................................................................................................... 31 1.3.9 Regulaciones de los Métodos QSAR................................................................................ 32 1.3.10 Situación actual y Tendencias futuras del diseño de fármacos......................................... 33 Materiales y métodos...................................................................................................................... 35 2 2.1. Base de Datos .............................................................................................................................. 35 2.2. Cálculo de Descriptores Moleculares. ......................................................................................... 35 2.3. Diseño de las series de entrenamiento y predicción utilizando Análisis de Conglomerados (AC) ............................................................................................................................................................ 36 2.3.1. Análisis de conglomerados jerárquico.................................................................................. 36 2.3.2. Análisis de K medias ............................................................................................................ 38 2.3.3. Diseño de las series de entrenamiento y predicción. ........................................................... 38 2.4. Desarrollo y validación de las funciones discriminante. ............................................................. 38 2.5. Identificación/Selección “in silico” de compuestos .................................................................... 40 3 . Resultados y discusión.................................................................................................................. 41 3.1. Estudio de corte ........................................................................................................................... 41 3.2. Análisis de conglomerados .......................................................................................................... 41 3.2.1. Análisis de Conglomerados jerárquico................................................................................. 42 3.2.2. Análisis de Conglomerados de k-medias.............................................................................. 44 3.3. Determinación de la dimensión del modelo. ............................................................................... 45.

(10) 3.4. Obtención y validación de los modelos QSAR-ADL.................................................................. 46 3.4.1. Validación Externa. .............................................................................................................. 47 3.4.2. Validación Interna. ............................................................................................................... 47 3.4.3. Prueba de Y-aleatoria. .......................................................................................................... 48 3.5. Dominio de Aplicación................................................................................................................ 49 3.6. Cribado virtual. ............................................................................................................................ 51 Conclusiones........................................................................................................................................... 52 Recomendaciones ................................................................................................................................... 53 Referencias Bibliográficas...................................................................................................................... 54 Anexos .................................................................................................................................................... 58.

(11) Introducción. Introducción De los virus a los organismos multicelulares, la vida es inseparable de las instrucciones genéticas apuntadas a regular su mantenimiento, división, multiplicación, diferenciación y muerte (apoptosis). (1) La enorme variedad de reacciones bioquímicas que comprenden estos mecanismos son mediadas, en su mayoría, por una serie de catalizadores biológicos conocidos como enzimas. (2) El papel fisiológico de algunas enzimas de la superficie de la membrana, esencialmente las metalopéptidasas de cinc, sus relaciones con otros sistemas peptídicos y el papel jugado por sus inhibidores, constituyen dianas sobre las cuales se dirigen actualmente importantes estudios. La peptidasa bacteriana termolisina (TLN: EC 3.4.24.27) aislada del Bacillus thermoproteolyticus, es la representante de este grupo de metalopeptidasas de cinc. La TLN se ha cristalizado y co-cristalizado con diferentes grupos de inhibidores, con una estructura y mecanismo de acción bien definidos por lo que ha servido de referencia estructural para enzimas mamíferas con características similares. (1) Las metalopeptidasas de la membrana endotelial homologas de la TLN, juegan un papel vital en la regulación de funciones cardiovasculares y endocrinas favoreciendo la formación o metabolismo de péptidos vasoactivos (3) que influyen en patologías tan comunes como la hipertensión arterial (HTA) la cual representa el mayor factor de riesgo de accidente cerebro-vascular, cardiopatía coronaria, insuficiencia cardíaca e insuficiencia renal. (4) Existen dos grupos de péptidos vasoactivos: los vasoconstrictores, como la angiotensina II y la endotelina y vasodilatadores, como los péptidos natriuréticos, las kininas y la superfamilia del péptido relacionado al gen de la calcitonina, que incluye también a la adrenomedulina. La producción y el metabolismo de estos péptidos depende de tres vasopeptidasas zinc dependientes localizadas en la superficie del endotelio vascular: la Enzima Convertidora de Angitensina (ECA: EC 3.4.15.1) (5), también conocida como Kinasa II por degradar a las kininas, la Endopeptidasa Neutra (EPN: EC 3.4.24.11) (6), que degrada los péptidos natriuréticos (PN) y la Enzima Convertidora de Endotelina (ECE: EC 3.4.24.71) (6), que transforma la gran-ET I en el potente vasoconstrictor endotelina. (7) En los últimos años han tenido un gran desarrollo los inhibidores de endopeptidasas, especialmente los inhibidores de la ECA, los cuales han logrado gran éxito en la práctica clínica, lo cual ha conducido a esfuerzos por bloquear otros sistemas humorales. (8) La inhibición de NEP aumenta niveles del péptido natriurético atrial (ANP) que se origina en los atrios del corazón, de lo cual debe su nombre; péptido natriurético cerebral (BNP) de origen de célula 1.

(12) Introducción miocárdicas y el péptido natriurético tipo C (CNP), que se origina en células endoteliales así como bradiquinina y adrenomedulina. Inhibiendo simultáneamente el sistema renina-angiotensinaaldosterona, potenciado los péptidos natriuréticos y los sistemas kininas, los. inhibidores de las. vasopeptidasas reducen la vasoconstricción, realzan la vasodilatación, mejoran el equilibrio de sodio/agua y, por su parte, disminuyen la resistencia vascular periférica y la tensión arterial mejorando el flujo de sangre local. Las experiencias clínicas preliminares con inhibidores de vasopeptidasas son alentadoras. (8) Teniendo en cuenta que la hipertensión arterial es altamente prevalente en la sociedad moderna y no obstante los notables avances en el conocimiento de sus mecanismos, el impacto sobre su control es universalmente pobre (9), manteniendose la prevalencia de la hipertensión arterial (HTA) alrededor del 20%, alcanzando en la actualidad magnitudes epidémicas: 3.450 millones de adultos mayores de 20 años en el mundo son hipertensos y en los mayores de 60 años, es aún mayor: alrededor del 50%. (4) La inhibición combinada del ECA y NEP es un nuevo y prometedor acercamiento para tratar pacientes con hipertensión, aterosclerosis, o paro cardíaco. (8) Es bien conocido que los avances en el tratamiento de la hipertensión arterial han producido un cambio notable en el manejo de la misma, especialmente en el transcurso de las últimas dos décadas. En estudios llevados a cabo en la hipertensión humana se ha podido observar que estos agentes son eficaces independientemente de la raza y edad de los pacientes. Sin embargo, son necesarios estudios más extensos con puntos finales clínicos, algunos de ellos en desarrollo, para establecer las indicaciones precisas de estos agentes en lo concerniente tanto a la hipertensión arterial como a la insuficiencia cardíaca y la enfermedad renal. Desafortunadamente, el omaprilat, fármaco de esta familia que fue más extensamente estudiado y utilizado en investigación clínica, mostró efectos adversos serios, caracterizados por edema angioneurótico, en pacientes de raza negra. Este es el motivo por el cual aún estos fármacos no han sido incorporados a la terapéutica cardiovascular. (10) Por consiguiente el descubrimiento y desarrollo de inhibidores de estas vasopeptidasas aun continúan siendo un reto para la industria farmacéutica. La inhibición de las endopeptidasas por el producto natural fosforamidón. y el CLT, potentes. inhibidores de TLN y debido a su homología con el sitio activo, convierten a esta enzima bacteriana en un modelo potencial para las enzimas mamíferas de esta clase, además de la existencia de estudios que avalan las similitudes entre ambas enzimas. (1, 5, 11) El descubrimiento de un nuevo medicamento y desarrollo posterior del mismo, son dos fases que condicionan para lograr un nuevo producto útil en la terapéutica. El diseño racional de fármacos, 2.

(13) Introducción constituye una herramienta casi indispensable en el desarrollo actual de nuevos medicamentos; si tomamos en cuenta que el paso limitante en el descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos continúa siendo la identificación y la optimización de nuevos compuestos líderes de un modo efectivo, este contribuye a un aumento de las posibilidades de éxito y a una disminución de los costos. (12) El enfoque de diseño/descubrimiento de fármacos asistido por computadoras ofrece una alternativa a los métodos tradicionales de ‘prueba y error’ para la obtención de nuevas entidades moleculares. Podemos plantear que los estudios QSAR/QSPR/QSTR (siglas en inglés acrónimos de Quantitative Structure Activity/Property/Toxicity Relationships) se han convertido en una importante área de investigación en la química computacional. Este procedimiento engloba todas las técnicas asistidas por ordenadores usadas en el diseño/descubrimiento y optimización de compuestos con propiedades deseadas y ha jugado un rol fundamental en el desarrollo de un número de fármacos que están ahora en el mercado. Este tipo de procedimiento ‘in sílico’ evita los procesos actuales de síntesis y bioensayos, los cuales se hacen solamente después de la exploración de los conceptos iniciales con modelos computacionales. (13) Los inhibidores de la TLN han sido estudiados utilizando diferentes métodos QSAR (14-16), los cuales se han realizado con bases de datos pequeñas y poco heterogéneas, además de que todos los modelos fueron hallados con la utilización de métodos de regresión, por lo tanto el principal problema de dichos estudios radica en su limitado alcance y variabilidad en las técnicas usadas. El mayor reto sigue estando en poder obtener modelos QSAR que permitan describir una mayor diversidad estructural simultáneamente con el uso de otras técnicas que aun no han sido empleadas por los investigadores. Por todo lo anterior se plantea el siguiente problema científico: La baja efectividad en la identificación de nuevos compuestos lideres inhibidores de la endopeptidasa neutra como nuevas alternativas antihipertensivas hace necesaria la utilización de métodos mas eficaces para la obtención de nuevas entidades moleculares inhibidoras de esta enzima. Para dar solución al problema científico planteado se formula la siguiente hipótesis: Desarrollando modelos QSAR basados en la aplicación de diferentes familias de descriptores moleculares y Analisis Discriminante Lineal (ADL), se pueden identificar nuevos compuestos inhibidores de la endopeptidasa neutra a través del cribado virtual de bases de datos utilizando como modelo farmacológico y biológico la enzima bacteriana Termolisina.. 3.

(14) Introducción Objetivo general: •. Proponer modelos teóricos que permitan la identificación de nuevos compuestos inhibidores de la termolisina a través de un sistema multiclasificador de cribado virtual.. Objetivos específicos: •. Conformar una base de datos de compuestos estructuralmente diversos a partir de la literatura a los que se le ha reportado experimentalmente el coeficiente de inhibición enzimático para la Termolisina.. •. Obtener modelos QSAR utilizando descriptores moleculares 0D, 1D, 2D y 3D combinado con Análisis Discriminante Lineal que permitan predecir la actividad inhibidora de nuevos compuestos contra la enzima Termolisina.. •. Identificar nuevos compuestos con actividad inhibidora de la enzima Termolisina a través del cribado virtual de una base de datos de 121 dipéptidos.. 4.

(15) Revisión Bibliográfica. 1. Revisión Bibliográfica 1.1 Generalidades de las enzimas. 1.1.1 Introducción al estudio de las enzimas Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están facilitadas por enzimas (del griego: en, en + zyme, Levadura). Estos catalizadores notables son individualmente muy específicos de reacciones determinadas. No obstante desde el punto de vista colectivo son extremadamente versátiles en el sentido de que varios millares de enzimas conocidas llevan a cabo reacciones tan diversas como son la hidrólisis, la polimerización, transferencia de grupos funcionales, oxidación-reducción, deshidratación e isomerización, por solo mencionar las clases más comunes de reacciones catalizadas enzimáticamente. (2). 1.1.2 Clasificación Las enzimas se clasifican y designan de acuerdo con la naturaleza de las reacciones que catalizan. Existen 6 clases principales de reacciones que catalizan los enzimas (Tabla1), así como subclases y sub-subclases dentro de las clases. A cada enzima se le asignan dos nombres: nombres recomendado, nombre sistemático y una clasificación de cuatro números: código de la comisión enzimática (enzyme comisión en inglés). Su nombre recomendado, resulta conveniente para el empleo diario y es, con frecuencia, un nombre trivial de la enzima. Su nombre sistemático se emplea cuando debe hacerse mínima la ambigüedad: consiste en el nombre del (de los) sustrato (s) seguido de una palabra que acabe en “-asa” y que especifica el tipo de reacción que cataliza el enzima, de acuerdo con la clasificación del grupo principal. Por ejemplo la enzima cuyo nombre recomendado es carboxipeptidasa A tiene el nombre sistemático de peptidil-L-amino ácido hidrolasa y número de clasificación EC 3.4.17.1, donde EC significa Comisión de Enzimas, el primer número (3) indica la clase principal del enzima (hidrolasas, tabla1), el segundo número (4) la subclase (enlace peptídico), el tercer número (17) indica la sub-subclase (metalocarboxipeptidasas) y el cuarto número (1) es el número de serie asignado arbitrariamente a la sub-subclase. (2, 17). 5.

(16) Revisión Bibliográfica. Tabla 1. Clasificasión de los enzimas de acuerdo con el tipo de reacción. 1.1.3 Actividad catalítica y especificidad de las enzimas. Las enzimas son maquinarias moleculares complejas que operan mediante una gran variedad de mecanismos, cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos, cuyo orden de fijación puede ser obligatorio o no serlo. Las propiedades de las enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como catalizadores. Como proteínas, poseen una conformación natural más estable que las demás conformaciones posibles. Así, cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad catalítica. En las reacciones espontaneas, los productos finales tienen menos energía libre de Gibbs (∆G) que los reactantes. Por tanto, en las reacciones espontaneas se libera energía de Gibbs (∆G<0). Sin embargo, el comienzo de la reacción requiere un aporte inicial de energía. Esta energía inicial que hay que suministrar a los reactantes para que la reacción transcurra se llama energía de activación (Ea). Cuanto menor es la Ea más fácilmente transcurre la reacción. La acción de los catalizadores consiste, precisamente, en disminuir la Ea. Los enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes deben chocar con una energía y una orientación adecuadas. La actuación del enzima permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientación óptima para que la reacción se produzca y 6.

(17) Revisión Bibliográfica modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de otros nuevos (Figura 1): (18). Figura1: a) Transcurso de la reacción sin presencia de un catalizador, elevada Ea en el estado de transición b) Unión de un enzima complementaria al sustrato transcurriendo la reacción con una disminución de la energía de activación. (17) Las fuerzas no covalentes mediante las que los sustratos y otras moléculas se unen a los enzimas son de carácter idéntico a las fuerzas que dictan las conformaciones de las propias proteínas, en general el sitio de unión del sustrato esta constituido por una entalladura o grieta sobre la superficie de un enzima que es de forma complementaria con la del sustrato. Las moléculas que se diferencian en la forma o distribución de grupo funcional respecto al sustrato no pueden unirse de modo productivo. (2) Existen dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: •. Modelo llave-cerradura.. •. Modelo del ajuste inducido.. El modelo llave-cerradura supone que la estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias, de la misma forma que una llave encaja en una cerradura. Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto.. 7.

(18) Revisión Bibliográfica En algunos casos, el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto. Este es el modelo del ajuste inducido. (18). a). b). Figura 2: Modelos propuestos de la unión del (los) sustratos a el enzima. a) Llave y cerradura. b). Ajuste inducido. De lo anterior se denota que los enzimas se unen de modo específico a sus sustratos a través de interacciones geométricas y físicamente complementarias, tanto respecto a la unión de sustratos quirales como respecto a las reacciones que catalizan. La estereoespecificidad de los enzimas viene dado por su quiralidad inherente (las proteínas están constituidas solo por L-aminoácidos por lo que forman sitios activos asimétricos). Un sustrato cuya quiraldad no sea la adecuada no se acoplara al sitio de unión del enzima por las mismas razones que no se puede adaptar la mano derecha un guante para la mano izquierda. Además de su estereoespecificidad, la mayor parte de los enzimas son completamente selectivos acerca de las identidades de los grupos químicos situados en los sustratos (especificidad. geométrica),. esta. especificidad. es. una. condición. más. rigurosa. que. la. estereoespecificidad. Los enzimas varían grandemente en su grado de especificidad geométrica, unos pocos enzimas son absolutamente específicos para un único compuesto. (2). 1.1.4 . Cinética enzimática y ecuación de Michaelis y Menten Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor. 8.

(19) Revisión Bibliográfica Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas. Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato (ES) y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto (P), liberando la enzima libre (E), representada por la siguiente reacción 1:. La velocidad de formación del producto se expresa mediante la ecuación de Michaelis-Menten, (Ecuación 1).. (1) Michaelis y Menten derivaron esta ecuación de su hipótesis básica, la cual propone que la etapa que limita el paso en las reacciones enzimáticas es la transición del complejo ES al producto y la enzima libre, es decir la segunda etapa. La ecuación de Michaelis y Menten, tiene dos parámetros: Vmax, la velocidad máxima de reacción, que tiene lugar cuando la concentración de sustrato es saturante, es decir, cuando está en su totalidad en la forma ES y Km, la constante de Michaelis, que es igual a la concentración de sustrato cuando la velocidad de reacción es igual a la mitad de la velocidad máxima, por tanto si un enzima tiene un valor pequeño de Km, consigue una eficiencia catalítica máxima a bajas concentraciones de sustrato. (2, 17). 1.1.5 . Inhibición Muchas sustancias alteran la actividad de una enzima al combinarse con la misma en una forma que afecta la fijación del sustrato y/o su número de recambio. Las sustancias que reducen la actividad de una enzima de esta forma se denominan inhibidores.. 9.

(20) Revisión Bibliográfica Muchos inhibidores son sustancias que se parecen estructuralmente al sustrato de la enzima, pero que, o bien no reaccionan o reaccionan muy lentamente en comparación con el sustrato. Este tipo de inhibidores se utiliza usualmente para conocer la naturaleza química y conformacional de un sitio de fijación de sustrato como parte de un esfuerzo para dilucidar el mecanismo catalítico del enzima. Muchos inhibidores enzimáticos son agentes quimioterapéuticos efectivos, ya que un análogo “no natural” del sustrato pude bloquear la acción de una enzima específica. Las enzimas pueden ser inhibidas por inhibición competitiva, incompetitiva, e inhibición mixta. Los inhibidores competitivos compiten directamente con un sustrato normal por un sitio de fijación enzimático. Este tipo de inhibidor, normalmente, se parece al sustrato en cuanto se fija específicamente al sitio activo, pero difiere del mismo en que no es reactivo. El modelo general que caracteriza a la inhibición competitiva viene dado por el siguiente esquema de reacción 2:. +. Donde, I representa el inhibidor y EI el complejo enzima–inhibidor. En la presencia de un inhibidor competitivo, la ecuación de Michaelis-Menten se vuelve:. (2) donde: (3). Siendo Ki la constante de inhibición la cual se expresa mediante la ecuación Ecs 4: (4). 10.

(21) Revisión Bibliográfica I, se une reversiblemente a la enzima estando en equilibrio rápido con el mismo de manera que EI, es catalíticamente inactivo. Por consiguiente un inhibidor competitivo actúa reduciendo la concentración de enzima libre disponible para la fijación del sustrato. El efecto de un inhibidor competitivo puede ser revertido aumentando las concentraciones de sustrato. Un inhibidor incompetitivo inactiva el complejo de Michaelis fijándose sobre el mismo. La velocidad máxima de un enzima inhibido de manera incompetitiva es función de la concentración de inhibidor y, por tanto, el efecto de un inhibidor incompetitivo no se puede neutralizar incrementando la concentración de sustrato.. Donde ESI representa la unión del inhibidor al complejo ES, y la ecuación de Michaelis-Menten frente a un inhibidor incompetitivo se define de la siguiente forma:. (5) Siendo:. (6) Donde:. (7) En la inhibición mixta, el inhibidor se fija tanto al enzima como al complejo enzima-sustrato, formando un complejo que es catalíticamente inactivo. La ecuación que describe esta reacción 4 tiene tanto características de las reacciones competitivas como incompetitivas como se demuestra en las ecuaciones 7 y 8. (2, 17). 11.

(22) Revisión Bibliográfica. Visto de esta forma Ki se representa como:. (7) y (8) Convirtiendo la ecuación de Michaelis-Menten en:. (9) Donde α se define en las ecuaciones (3) y (6). 1.2 Termolisina 1.2.1 Generalidades. La termolisina (EC 3.4.24.27) fue una de las primeras metaloproteasas de la cual se obtuvo su estructura en solución cristalográfica, desde que la información estructural detallada de la enzima ha estado disponible se ha estudiado extensivamente como un ejemplar de las metaloendopeptidasas de cinc. (19) La termolisina es una metaloendopeptidasa extracelular estable al calor de peso molecular 34600, aislada del Bacillus thermoproteolyticus. (16) Es una enzima proteolítica que contiene un ion de cinc esencial para la actividad catalítica y cuatro iones de calcio necesario para la estabilidad térmica. También es una proteasa neutra por poseer movimiento de bisagra característico de este tipo de enzimas y óptimamente activa a pH neutro. La enzima es específica para enlaces peptídico que contienen residuos hidrófobos de aminoácidos como L-leucina, L-isoleucina, valina y L-fenilalanina, además es especialmente útil para la hidrólisis parcial de polipéptidos que no contengan arginina o lisina y se ha usado para la determinación de la secuencia de aminoácidos de péptidos y proteínas. (16, 17) La estructura de la termolisina es bilobal, con un pronunciado sitio activo formándose en la unión de los dos dominios (Figura 3). (16, 20). 12.

(23) Revisión Bibliográfica. Figura 3 Unidad biológica de la termolisina.. 1.2.2 Mecanismo de acción Análisis cristalográficos de los complejos de enzima-inhibidor se utilizan para sugerir cómo interactúan las enzimas con sus substratos. Elegido convenientemente los inhibidores pueden proporcionar los modelos estructurales para varias etapas en catálisis, incluyendo el complejo de Michaelis, estados de transición, y productos. Tales estudios pueden sugerir, o por lo menos proscribir seriamente, los mecanismos posibles de la catálisis. Los detalles de los supuestos caminos catalíticos pueden ser explorados detalladamente edificando modelos y gráficos computacionales. Tal se ha hecho para la termolisina. El mecanismo de acción de la termolisina que ha surgido de una extendida serie de estudios estructurales se resume en la Figura 4. En la termolisina nativa donde el ion del zinc tiene coordinación tetraédrica aproximada, con tres ligandos proporcionados por la proteína (His 142, His 146, y Glu 166) y con un cuarto ligando proporcionado por una molécula de agua, el ion de zinc tiene dos funciones: polarizar el grupo carbonilo del sustrato y facilitar la desprotonación del agua nucleofílica. (20, 21). Figura 4. Mecanismo propuesto para el clivaje de péptidos catalizado por la enzima Termolisina. (20). 13.

(24) Revisión Bibliográfica El substrato entrante se presume que desplace a la molécula de solvente para cambiar el sitio de esta hacia Glu 143. En este complejo el oxígeno del carbonilo se supone para formar los enlaces de hidrógeno con His 231 y la molécula de agua ligada al cinc. Los estudios estructurales tempranos sugirieron que la división catalizada por la termolisina de los enlaces peptídico procedían por un mecanismo base, de tipo general con el ataque de una molécula de agua o de iones de hidróxido a el carbono carbonilo del enlace peptídico. El mecanismo base es también consistente con el pH y la temperatura dependientes de la catálisis de la termolisina. El modelo detallado construido sugiere que el substrato entrante optimice sus interacciones en los subsitios S2, S1, S1' y, S2' conduciendo la molécula de agua cinc-limitante hacia Glu 143. El carácter nucleofílico de esta molécula de agua podría reforzarse teniendo ambos protones de hidrógeno enlazados a Glu 143, y, al mismo tiempo, teniendo el oxígeno ligado al ion del cinc según lo sugerido en la figura 4a. Esta interacción tripartita saldría de los pares solitarios restantes dirigidos hacia el carbono carbonilo del substrato y alineados para el ataque nucleofílico. Bajo influencia combinada del ion metálico y del glutamato, el agua ataca el carbono carbonilo para formar un intermediario pentacoordinado demostrado en la Figura 4b. Aceptado el protón por Glu 143 entonces es inmediatamente transferida la salida del nitrógeno (figura 4c). Uno de los oxígenos del péptido hidratado interactúa con el ion del cinc y, además, es estabilizado por los enlaces de hidrógeno de ambas His 231 y Tyr 157 (figura 4b). El segundo oxígeno del péptido hidratado también es estabilizado por la interacción con el cinc así como un enlace de hidrógeno fuerte con Glu 143. El oxígeno de la cadena lateral de Asn 112 y el carbonilo de la cadena principal del Ala 113 aceptan enlaces de hidrógeno del nitrógeno tetraédrico doble protonado formado por la ruptura del enlace (figura 4c). El paso de este producto intermedio (figura 4c) a los productos (figura 4d) se presume sea facilitado por una segunda transferencia del protón vía Glu 143. En este caso el protón se acepta por el péptido hidratado y el nitrógeno. Se evidencia que la His 231 debe estar en su estado protonado para la catálisis lo cual es constante con la idea de que este residuo ayuda a estabilizar el estado de transición donando un enlace de hidrógeno al péptido hidratado (figura 4b). (20, 21). 1.2.3 Importancia de los inhibidores de la TLN como modelos potenciales para metalopeptidasas mamíferas fisiológicamente importantes. El papel fisiológico de las neuropéptidasas y sus relaciones con otros sistemas peptídicos pueden investigarse con los inhibidores de las peptidasas y los antagonistas selectivos. La comprensión del mecanismo hidrolítico de estas peptidasas mamíferas fisiológicamente importantes, así como su 14.

(25) Revisión Bibliográfica interacción con los inhibidores, ha sido facilitada por el estudio de la termolisina bacteriana, cuya estructura se ha divulgado tanto en su estado natural como formando complejos con sus inhibidores. (11) En el centro del diseño de inhibidores de metalloproteasas es de selección un grupo funcional que obre recíprocamente con el metal. Los Tioles 1 tienen una afinidad intrínseca para el cinc y se han empleado comúnmente en esta capacidad. Las cetonas 2 se han encontrado para ser inhibidores útiles de metalloproteasas, y la quelación fuerte del cinc por los ácidos hidroxámicos 3 ha dado lugar a inhibidores potentes. Los grupos aniónicos, tales como carboxilatos 4 y fosfonatos 5, análogos del inhibidor natural fosforamidón, en los cuales la carga proporciona una atracción de Coulombic al catión del cinc, se encuentran en muchos acertados inhibidores. Los silanodioles 6 recientemente introducidos de hidratados de carbono inestable, empleando un átomo de silicio central, el elemento más similar al carbono también han resultado ser de gran utilidad. Ver figura 5. (19). Figura 5: Principales grupos usados en el diseño de inhibidores sintéticos de metaloproteasas El tiorpan primer inhibidor sintético de la NEP pasa ha formar parte de este grupo de inhibidores incluyéndose además el retrotiorpan y el acetotiorpan. (1) Los dipéptidos de N-Carboxialkil tales como CLT han emergido como clases importantes de inhibidores de las peptidasas de cinc. Una característica de esta serie de inhibidores es el sustituyente amino del nitrógeno que parece estar implicado en las interacciones por puente de hidrogeno con la enzima principal. Los derivados de glutaramidas como el Candoxatrilat que posee un grupo de características estructurales inusuales comparadas con el CLT y los heterociclos fusionados derivados de los mercaptoacetilos como el Omaprilat se encuentran actualmente bajo investigación terapéutica. (7, 11) La TLN aparece para ser un modelo potencial para las enzimas mamíferas de esta clase, particularmente las endopeptidasas, debido a su homología con el sitio activo y a la inhibición de ambas enzimas por el producto natural del phosphoramidon y el N-carboxyalkyl inhibidor del dipéptido CLT mencionadas anteriormente. (11) Todos ellos constituyen herramientas poderosas para definir las contribuciones fisiológicas particularmente de las metalopeptidasas del cinc identificando como juegan los importantes papeles 15.

(26) Revisión Bibliográfica biológicos en la activación o metabolismo de los péptidos. Esta importancia se ha comprobado en el caso de los inhibidores del enzima convertidora de angiotensina (ACE), que han demostrado ventaja clínica en el tratamiento de la hipertensión y del paro cardíaco congestivo. Más recientemente, los inhibidores de la endopeptidasa neutra (NEP) se divulgan para estar bajo investigación como terapias para el paro cardíaco congestivo. (1, 11). 1.2.4 Homología entre la TLN y metaloproteinas relacionadas La homología estructural en el sitio activo así como la secuencia de estos y el papel que juega el cinc en la actividad catalítica de las endopeptidasas mamíferas favorece el mecanismo de acción propuesto para la TLN bacteriana. Generalmente los enzimas que se encuentran en esta superfamilia presentan una estructura helicoidal homóloga a la de la TLN, así como dos secuencias estructurales generales HExxH y ExxxD (1) mostradas en la figura 6:. a). b). Figura 6: a) Semejanzas entre los sitio activos de termolisina (TLN), enzima convertidora de angiotensina (ACE), neprilysin (NEP), leukotrieno hidrolasa A4 (LTA4H). Todos ellos toman forma UX representado en caso de ACE, cerca del sitio catalítico. (5) b) Secuencias de consenso que contienen aminoácidos implicados en el proceso catalítico en las metaloproteasas de cinc. (1) La NEP una de las enzimas que vuelve inactiva la enkepalina y metaboliza los péptidos natriuréticos, fue la primera peptidasa de cinc fisiológica de esta familia en ser duplicada y secuenciada. (1) Hay similitudes significativas entre la especificidad del substrato y los inhibidores de la NEP y la TLN. Ambas enzimas catalizan la hidrólisis de oligopeptidos uniendose al estremo N-términal de residuos de aminoácido hidrófobos. Una de las similitudes llamativas de las dos enzimas son las exigencias estereoquímicas del residuo P1’. A diferencia de la ACE, tanto NEP y TLN se inhiben por (S) - y 16.

(27) Revisión Bibliográfica (R)-tiorpan y (R)-retrotiorpan y, en un grado menor, por (S)-retrotiorpan. Esto indica que el volumen alrededor de la base de los subsitios S1’ deben ser similares en ambas enzimas. También es probable que la posición de los átomos del enzima que forman enlaces de hidrógeno de la amida y la vinculación del grupo P1’ a P2’ del sustrato sea muy similar en las dos enzimas inferidas por la habilidad del tiorpan, retrotiorpan, y 10-miembros del anillo lactámico de inhibir NEP y TLN. Una diferencia significante entre el TLN y NEP es el tamaño de los subsitios S1’. El NEP acepta inhibidores con un grupo grande como un bifenilmetil en P1’mientras que tales compuestos no inhiben el TLN. Por consiguiente, al usar la TLN como un modelo para NEP, es importante saber qué regiones pueden inferirse para ser estructuralmente similares a NEP y qué parece ser significativamente diferente. (22). 1.2.5 . Características generales de la Endopeptidasa Neutra. La endopeptidasa neutra (EPN) se localiza en la superficie celular y por consiguiente funciona como una ectoenzima que cataliza la hidrolisis de los péptidos extracelulares en la superficie de la membrana plasmática. De aproximadamente 700 residuos con un dominio citoplasmático N-terminal corto, una región transmembrana hidrófoba y un dominio luminal grande que contienen el sitio activo en el cual se encuentra un ión de zinc esencial para la actividad enzimática. (6) La NEP es extensamente distribuida en células endoteliales, células del músculo liso, miocitos cardíacos, células epiteliales renales, y fibroblastos. También es encontrada en el pulmón, glándula suprarrenal, cerebro, corazón, entre otros. Esta cataliza la degradación de péptidos vasodilatadores, ANP, BNP, CNP, sustancia P, y bradikinina. Además de la degradación de péptidos vasoactivos a productos inactivos, la NEP también está implicada en la conversión enzimática del péptido vasoconstrictor gran-endothelina 1 (gran-ET1) a su forma activa, endothelina-1 y del péptido Angiotensina II. De ahí, el equilibrio de efectos de la inhibición NEP en el tono vascular dependerá de si los substratos predominantes degradados son vasodilatadores o vasoconstrictores y en el grado de la participación de la NEP en el procesamiento de la gran-ET1. (6, 8). 1.2.6 Péptidos Natriuréticos Los Péptidos Natriuréticos (PN) son hormonas de naturaleza proteica liberadas principalmente por las células miocárdicas de los atrios y ventrículos en respuesta a una sobrecarga de volumen o al aumento de las presiones intracavitarias. (23) Tienen propiedades diuréticas y vasodilatadoras. La familia de péptidos natriuréticos consiste en 3 isoformas: ANP, BNP, y CNP. (24) Ver figura 7. 17.

(28) Revisión Bibliográfica. 1.2.6.1 PNA: Fue el primero de la familia en descubrirse. Es liberado por las células de los atrios, y en menor cuantía por las de los ventrículos, en respuesta a la sobrecarga de volumen y al aumento de las presiones de llenado. Se trata de un péptido compuesto por 28 aminoácidos, 99 al 126 del fragmento terminal C de su pro hormona: Pro-PNA. Algunos factores humorales circulantes y locales (endotelina y norepinefrina) pueden también regular la síntesis de PNA. El PNA produce dilatación arterial, venodilatación, natriuresis y diuresis, actuando como un modulador o neutralizador del efecto vasoconstrictor, e inhibiendo la secreción de Renina y Aldosterona por mecanismos no conocidos. También reduce la reabsorción tubular de sodio e incrementa la filtración glomerular originando natriuresis y pérdida de agua.. 1.2.6.2 PNB: En 1988 fue aislado en el cerebro porcino el segundo componente de la familia conocido como Péptido Natriurético Cerebral (PNB). Está presente también en las células miocárdicas, en especial en los ventrículos; aunque en menor cuantía puede hallarse en las aurículas. Esto último es motivo de controversia, ya que hay autores que plantean que son los atrios la fuente principal de PNB. La estructura química del PNB es similar a la del PNA. Es almacenado en el miocardio ventricular y el estímulo básico para su liberación son las sobrecargas ventriculares de presión o de volumen. Se le atribuyen acciones semejantes al PNA, o sea: efecto hipotensor, diurético, natriurético y relajante de la musculatura lisa. Contrarresta los efectos de la Norepinefrina, Endotelina y Angiotensina II. Hay evidencia de que inhibe la acumulación de fibras colágenas y de esa manera contrarresta el remodelado ventricular patológico que contribuye a la progresión de la Insuficiencia Cardíaca.. 1.2.6.3 Péptido tipo C: Es el tercer miembro de la familia y fue aislado por primera vez por Matsuo y cols., en 1990. Se han logrado identificar in vivo, dos tipos de Péptido Natriurético tipo C (PNC), uno con 22 y otro de 53 aminoácidos. El péptido tipo C de 22 aminoácidos está presente principalmente en el Sistema Nervioso Central, la hipófisis anterior, riñón, células endoteliales vasculares y el plasma y es más potente que la forma de 53 aminoácidos. Las concentraciones sistémicas del Péptido Natriurético tipo C son muy bajas, parece localizarse casi exclusivamente en el Sistema Nervioso Central y sus niveles en estas áreas son de 30 a 70 veces más altos que las de los PNA y PNB. Se cree que actúa como un neurotransmisor que coordina los aspectos relacionados con el equilibrio de la sal, el agua y la presión 18.

(29) Revisión Bibliográfica sanguínea. Su utilidad es muy limitada, pues no se eleva en el plasma de los pacientes con IC. Su concentración local en las aurículas y ventrículos sí aumentan con la IC, con efectos locales paracrinos que pueden resultar importantes en dicha situación.. Figura 7: Secuencia aminoacídica de los PNs.. 1.2.6.4 ADM Recientemente se habla en la literatura de un cuarto péptido natriuréticos conocido como la Adrenomedulina o Péptido tipo D (ADM) La ADM es un péptido de 52 aminoácidos aislado originalmente del Feocromocitoma humano. Está presente en el sistema cardiovascular, riñón, pulmón, hipófisis anterior, tálamo e hipotálamo, medula y corteza suprarrenal. A nivel renal se ha demostrado su presencia en glomérulo, túbulo distal cortical y túbulo colector medular. Además se sintetiza y secreta por células endoteliales, fibra muscular lisa vascular, cardiomiocitos, fibroblastos, macrófagos y células mesangiales. Estimula la liberación de calcio desde los depósitos intracelulares y la activación de la proteincinasa C, activándose el flujo de calcio a través de canales tipo L. La infusión intravenosa de ADM en casos con IC produjo una disminución significativa de las presiones de llenado ventricular y de las concentraciones plasmática de aldosterona. Tiene efectos inotrópicos positivos por mecanismos independientes de AMPc. Interacciona con receptores en algunas células como las células endoteliales y glomerulares que poseen alta afinidad para ADM. En animales de experimentación la administración intravenosa de ADM produce marcada y prolongada hipotensión. (23). 19.

(30) Revisión Bibliográfica Los péptidos natriuréticos ejercen sus efectos biológicos ligándose a receptores específicos en las superficies celulares endoteliales, epiteliales, y de las células vasculares musculares lisas. El PNA y el PNB se unen a un receptores ligados a la guanidil ciclasa, el receptor RPN-A; mientras que el PNC o endotelial se une a otro receptor ligado a la guanidil ciclasa, el receptor RPN-B. Los tres péptidos son removidos de la circulación por el receptor RPN-C y degradados por la enzima EPN. Los receptores RPN-A, RPN-B y RPN-C, actuando a través de la guanosina trifosfato (GTP) incrementan la generación del GMP cíclico (GMPc), siendo esta sustancia la responsable del efecto natriurético, de la vasodilatación arterial y venosa al abrir los canales de potasio y facilitar la hiperpolarización vascular, as! como, de la inhibición del SRAA y de la liberación de endotelina, de la inhibición del crecimiento de las Mulas vasculares musculares lisas y endoteliales y, del efecto antimitogenético. La vía del GTP también activa a la adenosina tri-fosfato (ATP) aumentando así el contenido intracelular del AMPcíclico (AMPc) facilitando así la vaso-relajación. (24). 1.2.7 Hipertensión arterial La hipertensión arterial, que académicamente podría definirse como una elevación crónica de la presión arterial sistólica y/o diastólica, constituye con toda probabilidad la enfermedad crónica más frecuente de las muchas que azotan a la Humanidad. (25) La prevalencia de la hipertensión arterial (HTA) es de alrededor del 20%, alcanzando en la actualidad magnitudes epidémicas: 3.450 millones de adultos mayores de 20 años en el mundo son hipertensos. En los mayores de sesenta años, su prevalencia es aún mayor: alrededor del 50%. (4). 1.2.7.1 Importancia de la inhibición de ACE/NEP El sistema cardiovascular es regulado por mecanismos hemodinámico y neurohumorales. Estos sistemas reguladores desempeñan un papel fundamental en la modulación de la función cardíaca, tono vascular, y la estructura. Aunque los sistemas neurohumorales sean esenciales en homeostasis vascular, ellos se hacen deficientes en estados de enfermedad como hipertensión, enfermedad coronaria, y paro cardíaco. El éxito clínico de inhibidores de ACE ha conducido a esfuerzos a bloquear otros sistemas humorales. El NEP es el camino enzimático principal para la degradación de péptidos natriuréticos, un camino enzimático secundario para la degradación de kininas, y adrenomedulina. Los péptidos natriurético pueden ser vistos como inhibidores endógenos del sistema renina angiotensina. (8) En un individuo normal, las pequeñas elevaciones de la presión arterial producen aumentos de la excreción renal de sodio y agua que tienden a normalizar la anomalía. Este fenómeno de natriuresis de 20.

(31) Revisión Bibliográfica presión, constituye un poderoso mecanismo de retroalimentación. En el paciente con HTA hay un reajuste y cierto aplanamiento de la curva de natriuresis de presión, por lo que son necesarios mayores niveles tensionales para obtener dicha respuesta natriurética lo que equivale a decir que hay una cierta retención de sodio. La relación presión-natriuresis se restablece a otro nivel y a costa de un persistente aumento de la presión arterial. (25) La inhibición de NEP aumenta niveles PN así como bradikinina y adrenomodulina. Inhibiendo simultáneamente el sistema renina-angiotensina-aldosterona y potenciando los péptidos natriuréticos y los sistemas kinina, inhibidores de las vasopeptidasas reducen vasoconstricción, realzan vasodilatación, mejoran el equilibrio de sodio y de agua, y, por su parte, disminuyen la resistencia vascular periférica y la tensión arterial y mejoran el flujo de sangre local. Dentro de las paredes de vasos sanguíneos, este conduce a una reducción de la vasoconstricción y de mediadores proliferativos como angiotensina II y niveles locales aumentados de bradykinina (y, por su parte, óxido nítrico) y péptidos natriuréticos. (8). 1.2.7.2 Nuevo desarrollo en terapia antihipertensiva Es bien conocido que los avances en el tratamiento de la hipertensión arterial han producido un cambio notable en el manejo de la misma, especialmente en el transcurso de las últimas dos décadas. En este aspecto, el desarrollo de fármacos con acción sobre el sistema renina angiotensinaaldosterona ha ocupado un lugar de preeminencia. Los mismos han demostrado beneficios tanto como agentes antihipertensivos como también más allá del control de la presión arterial, en el campo de la insuficiencia cardíaca, la nefroprotección, la inhibición de la hipertrofia y proliferación celular, por citar algunos de los más destacados. En el mismo sentido, nuevas drogas en fase de experimentación parecen ofrecer beneficios adicionales. (10) El fármaco más representativo es el omapatrilat produce una reducción de las presiones arteriales sistólica y diastólica superior a la de otros antihipertensivos (amlodipino, lisinoprilo), independientemente de la edad, el sexo y la raza del paciente. Se absorbe bien por vía oral y alcanza concentraciones plasmáticas máximas entre 0.5 a 2 horas. Presenta una semivida de 14 a 19 horas, lo que permite administrar el fármaco una vez al día. Se biotransforma en varios metabolitos inactivos que se eliminan por vía renal. La semivida del fármaco no se altera en pacientes con insuficiencia renal. (23) Sin embargo mostró efectos adversos serios, caracterizados por edema angioneurótico, en 21.

(32) Revisión Bibliográfica pacientes de raza negra, siendo este el motivo por el cual aún no ha sido incorporado a la terapia cardiovascular. (10) También como alternativa para aumentar las concentraciones de PN encontramos la administración de péptidos natriuréticos obtenidos por tecnología recombinante. Nesiritida: Es el péptido natriurético humano tipo B de 32 aminoácidos obtenido mediante tecnología recombinante. Por vía intravenosa, sus efectos aparecen a los 15 minutos de su administración y persisten durante 2 a 3 horas. La Nesiritida presenta un volumen de distribución de 0.19 l/kg y se biotransforma a través de la endopeptidasa neutra, con una semivida de 18 a 23 minutos, muy superior a los 4 minutos, del PNA, si bien sus efectos biológicos persisten durante 1 a 4 horas. Anaritida: En la actualidad se están estudiando nuevos péptidos obtenidos por tecnología recombinante: PNAα (28 aminoácidos), mini-PNA (15 aminoácidos), anaritida (PNA de 25 aminoácidos) y vasonatrida (quimera de PNA y PNC). La anaritida produce vasodilatación de la arteriola glomerular aferente y vasoconstricción de la arteriola eferente, aumentando la velocidad de filtración glomerular en pacientes con insuficiencia renal aguda y oliguria. Estas infusiones reducen las concentraciones plasmáticas de renina y aldosterona e inhibe la secreción de la angiotensina II, estimulada por la secreción de la aldosterona; sin cambios significativos en el volumen efectivo. La investigación con inhibidores de la EPN ha sido suspendida debido a sus efectos secundarios. En el. momento actual, sólo continúa la investigación clínica con nesiritida, que ha sido recientemente comercializada en varios países. (23). 1.2.8 Estudios QSAR en el desarrollo de inhibidores de TLN Particularmente, en las ciencias biológicas, las relaciones cuantitativas de la estructura-actividad (QSARs) se han estudiado durante muchos años para aclarar procesos biológicos o para desarrollar los nuevos fármacos. Estos estudios se basan en el concepto de que un efecto biológico (o farmacéutico) causado por una molécula dada (fármaco) es a función de su estructura química. (14) En la búsqueda de inhibidores de termolisina y la comprobación de la hipótesis con respecto al sitio activo y mecanismos catalíticos de enzimas relacionadas, se han llevado a cabo estudios de inhibición para varios péptidos y compuestos sintéticos utilizando diferentes métodos QSAR. En la mayoría de estos estudios la predicción de la actividad inhibitoria fue determinada mediante métodos de regresión. El primero de estos estudios fue realizado por Klopman y col (16) en 1989 utilizando el programa Evaluación de Estructura Automatizada por Computadora (CASE: Computer Automated Structure Evaluation) partiendo de una base de datos compuesta por 73 péptidos y sus derivados, evaluando la 22.

(33) Revisión Bibliográfica actividad inhibitoria basada en la constante Ki obtenidos de una compilación de estructuras de extensos estudios cinéticos. La entrada del programa consiste en la estructura molecular y la actividad moderada de las moléculas de la base de datos (Klopman, 1984; El Klopman & Rosenkranz, 1984,; El Kiopman & Contreras, 1984). En el programa se generaron todos los fragmentos posibles rompiendo la molécula en subunidades de 3-10 átomos pesados con hidrógenos atados, estos fragmentos son etiquetados como activos o inactivos dependiendo de la actividad molecular, seleccionando automáticamente los fragmentos más significativos. El análisis de regresión lineal múltiple rinde el número mínimo de fragmentos requeridos para describir cuantitativamente la base de datos entera.Los valores de Ki fueron considerados como la expresión de la actividad inhibitoria. Aquellos inhibidores con Ki pequeña (≤ 1.1 x 10-3 mol) fueron considerados como inhibidores activos. Con estas definiciones la base de datos de 73 compuestos fue encontrada para contener 27 activos, 6 marginales y 40 compuestos inactivos. (16) La introducción del método Análisis Comparativo de Campos Moleculares (CoMFA: Comparative Molecular Field Analysis) realizado por Waller y Marshall (1993), que constituye un método QSAR3D; de una simplificación razonable, de elevado grado de automatización, de magníficas posibilidades de visualización e interpretaciones físico-químicas claras de los descriptores estéricos y electrostáticos implicados en el método, hacen del CoMFA uno de los métodos más populares para estudios QSAR. Partiendo de una base de datos de 68 inhibidores para la ACE y 61 para la TLN se desarrollaron modelos predictivos de dichos inhibidores. Fueron evaluadas las energías de interacción de orbitales estéricos, electrostáticos, y moleculares usando campos orbitales moleculares sacados de cálculos semiempíricos como descriptores adicionales, y las correlaciones predictivas fueron producidas basadas en CoMFA tanto para los inhibidores de TLN como para los de ACE. Los análisis de regresión fueron hechos usando la metodología de mínimos-cuadrados parciales junto con la validación cruzada, para la cual se utilizaron la serie análoga de inhibidores de TLN gracias a la disponibilidad de datos cristalográfica para el receptor termolisina se presentó la oportunidad única de usar las coordenadas, el tipo de átomo, y la información de carga atómica parcial en la definición de la región CoMFA. Un modelo predictivo para los inhibidores de ACE fue obtenido, pero varias limitaciones de la metodología CoMFA corriente fueron notadas, la capacidad predictiva del modelo CoMFA (sin la presencia de cálculos semiempiricos) presentó deficiencias en el capacidad de discernir entre tipos diferentes de ligandos de Zn y en segundo lugar los modelos brindaban información arbitraria acerca de la alineación de las moléculas en el estudio dentro del sitio activo introduciendo ambigüedades en el estudio de CoMFA los cuales fueron resueltos con la inclusión del descriptor adicional. (15) 23.

(34) Revisión Bibliográfica Un nuevo acercamiento a la correlación de farmacoforos y al análisis QSAR se realizó usando Programación Lógica Inductiva (ILP: Inductive logic programming) aplicado a inhibidores de termolisina e inhibidores de glucógeno fosforilasa b, llevado a cabo por Marchand-Geneste y col (2002). A diferencia de otros métodos QSAR, que usan atributos para describir la estructura química, ILP usa relaciones mediante algoritmos de máquina de aprendizaje donde todas las entradas (serie de ejemplos positivos y negativos que definen compuestos como activo o inactivo, respectivamente, y conocimiento químico de fondo) y salidas (serie de hipótesis, expresadas como reglas, que predicen los ejemplos positivos y negativos usando conocimientos previos) son declaraciones lógicas en lenguaje de computadora, tales declaraciones son fácilmente comprensibles porque están estrechamente relacionadas a el lenguaje natural. Las estructuras cristalina de 12 inhibidores ligados al sitio activo de termolisina fueron extraídos del Banco de Datos de Proteína, el complejo fue identificado y usado como nuevas variables de indicadores de correlación, con sus correspondientes valores de actividad (pKi=-logKi), y 19 inhibidores adicionales con valores de Ki en los límites de 10-3 a 10-8 ms fueron tomados de la literatura y modelados utilizando descriptores 3D, unificando Programación Lógica Inductiva (ILP) y técnicas de regresión estándar y comparándolos con modelos obtenidos por el Análisis Comparativo de Campos Moleculares (CoMFA) de los mismos inhibidores. En cada caso la adición de variables ILP produjo según las estadísticas mejores resultados (P <0.01 para termolisina y P <0.05 para GP datasets) que el análisis CoMFA. Además, las nuevas variables encontradas ILP no aumentaron la complejidad de las ecuaciones de QSAR finales y dieron la posibles perspectivas en el mecanismo obligatorio del complejo formado por la unión entre el ligando y la proteína en el estudio. Para lograr un mejor entendimiento de lo que engloban las técnicas QSAR en el desarrollo de nuevos Fármacos a continuación enunciaremos una serie de conceptos y términos que serán utilizados en el desarrollo de esta tesis y que son imprescindibles para la comprensión de los resultados tanto de la literatura como los alcanzados en el presente trabajo. (14). 1.3 Estudios QSAR Los denominados modelos QSAR han agrupado históricamente a todas las técnicas que han intentado establecer modelos de comportamiento de compuestos o familias de ellos en cuanto a actividad biológica, a partir de datos de un número limitado de productos. Los estudios QSAR engloban las relaciones cuantitativas entre la estructura molecular y la actividad biológica lo cual constituye uno de los paradigmas de la Química Médica. En dependencia de la metodología empleada y los descriptores pueden distinguirse varias clasificaciones. 24.

(35) Revisión Bibliográfica Este tipo de estudios se encuentra en la intersección entre la biología, la química y la computación y tienen dos objetivos fundamentales. El primero es brindar una vía para estimar, con un aceptable grado de precisión, la actividad/propiedad/toxicidad estudiada a nuevos compuestos. El segundo, pero no menos. importante,. es. obtener. una. interpretación. en. términos. estructurales. de. la. actividad/propiedad/toxicidad estudiada. (13). 1.3.1 Descriptores Moleculares Los descriptores moleculares o índices como también se le conocen son ‘términos que caracterizan un aspecto específico de una molécula’ y contienen información estructural derivada de la representación estructural de las moléculas bajo estudio. La naturaleza de los descriptores, depende de cual haya sido el proceder utilizado para la definición de los mismos, pudiendo tener en cuenta rasgos topológicos (2D), geométricos (3D), y electrónicos de las moléculas. Algunos de estos descriptores sin embargo, tienen ‘más información’ de propiedades físico-químicas que de los rasgos estructurales de la molécula. Estos incluyen los basados en la determinación experimental de propiedades físicoquímicas, tales como la mayoría de las constantes de los sustituyentes, hidrofóbicas, electrónicas y estéricas. (26, 27) La adecuada representación de la estructura molecular de un compuesto es un factor de vital importancia para el desarrollo de cualquier estudio de Correlación Estructura Respuesta. (26) La descripción numérica de la estructura de los compuestos químicos, es esencial para la manipulación de las moléculas y para los cálculos de los índices moleculares que de ella se derivan. Mediante la obtención de descriptores moleculares se “transforma” parte de la estructura química en números, permitiendo el tratamiento matemático de la información química contenida en la molécula y la realización de las ya definidas Correlaciones Estructura-Respuesta. Por tanto los descriptores moleculares se pueden definir de la siguiente forma: Constituyen el resultado final de un procedimiento matemático y lógico que transforma la información química codificada en una representación simbólica de una molécula en un número útil o el resultado de algún experimento estandarizado. (26) El término útiles tiene aquí un significado doble: significa que estos números pueden brindar una visión más amplia en la interpretación de las propiedades moleculares y/o son capaces de tomar parte en un modelo para la predicción de propiedades moleculares interesantes. En este sentido, si la interpretación del DM fuera débil, provisional, o carente completamente de significado, aún el mismo pudiera estar fuertemente correlacionado con alguna propiedad molecular, lo cual sería útil en la 25.