BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
VALIDACIÓN DE LA TECNICA ANALÍTICA POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV - VISIBLE PARA LA CUANTIFICION E IDENTIFICACION DE RIBOFLAVINA.
INFORME DE PRÁCTICAS PRE PROFESIONALES PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO
AUTOR:
Br. GARCIA QUISPE, JUAN PABLO
ASESOR:
Dr. Q.F. RAMON PIMINCHUMO CARRANZA
Trujillo - Perú 2016
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Señores miembros del jurado dictaminador:Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de grados y títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, someto a consideración y elevado criterio profesional del Jurado, el informe de prácticas titulado:
“VALIDACIÓN DE LA TECNICA ANALÍTICA POR ESPECTROFOTOMETRIA UV - VISIBLE PARA LA CUANTIFICION E IDENTIFICACION DE RIBOFLAVINA”.
Con el cual pretendo optar el Título de Químico Farmacéutico. Es propicia esta oportunidad para manifestarle mi más sincero reconocimiento a nuestra alma mater y toda su plana docente, que con su capacidad y buena voluntad contribuyeron a mi formación profesional.
Dejo a vuestro criterio señores miembros del jurado dictaminador la calificación del presente informe.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
DEDICATORIA
A DIOS:
A ti Dios por qué has permitido que la sabiduría dirija y guíe nuestros
pasos. Has sido el todopoderoso, quien ha iluminado nuestro sendero
enseñándonos a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni
desfallecer en el intento.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
A mis Padres:
Félix y Martha
Por su amor, apoyo moral y espiritual y sobre todo por enseñarme que con
amor, esfuerzo y dedicación puedo lograr mis anhelados sueños.
Gracias.
Los amo.
A mi Familia:
Por acompañarme en cada momento de mi vida,
mis hermanos Cristhian, Richard e Ivett por ser
esa fuente e amor e inspiración hacia mi bienestar
espiritual.
Un profundo agradecimiento a mi hermana Nataly
mi negrita que siempre me apoyó, aconsejó y
motivó a no desfallecer y seguir.
Gracias mis queridos hermanos.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
A mis Sobrinos:
Rodrigo, Mathías y Liam que son el futuro de mi familia y los niños más
lindos del mundo.
Gracias
A mis Abuelos
Gilberto Garcia y a la memoria de mis tres abuelos
Delfín Quispe, María Rodríguez y Ninfa Arias,
que Dios los tenga en su gloría.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
AGRADECIMIENTO
Un agradecimiento especial al
Doctor Ramón Piminchumo Carranza
Por su tiempo y el apoyo brindado para el
desarrollo y culminación del presente
informe.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ÍNDICE RESUMEN ... i ABSTRACT……….………ii INTRODUCCIÓN ... 3 MATERIAL Y MÉTODO ... 9 RESULTADOS ... 22 DISCUSIÓN ... 25 CONCLUSIONES ... … 28 REFERENCIAS ... 29 ANEXOSBIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
RESUMENEl presente informe tiene como objetivo presentar evidencia documentada, que los resultados obtenidos son confiables, consistentes y reproducibles en las condiciones establecidas. Se planteó la Validación de la Técnica Analítica por Espectrofotometría UV - visible para la cuantificación e identificación de riboflavina, evaluándose parámetros como: Especificidad o Selectividad, Linealidad, Precisión y Exactitud con el fin de que cumpla con los requerimientos de la Farmacopea Estadounidense (USP), Conferencia Internacional Tripartita sobre Armonización (ICH) y recomendaciones de la Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria (AEFI). Una vez definidas las condiciones de trabajo, se realizaron los respectivos análisis para la evaluación de los parámetros de validación y se demostró mediante el diseño experimental, que la metodología analítica cumple con la característica de que es lineal porque se obtuvo un coeficiente de correlación y un coeficiente de determinación cercano a la unidad. El método es preciso ya que el coeficiente de variación o desviación estándar relativa obtenido tanto en los ensayos de repetitividad y precisión intermedia fue RSD < 2%; es exacto por tener una recuperación media dentro del rango de 98% - 102%; y es selectivo para el analito en estudio ya que no se evidenció interferencia alguna. Por lo cual se concluye que el método validado es confiable, consistente y puede emplearse en los análisis correspondientes del laboratorio.
Palabras claves: Riboflavina, validación, Espectrofotometría, Especificidad o Selectividad, Linealidad, Precisión, Exactitud
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ABSTRACTThis report aims to present documentary evidence that the results are reliable, consistent and reproducible under the conditions set. Validation of Analytical Technique raised by spectrophotometry UV - visible for quantification and identification of riboflavin, evaluated parameters such as: Specificity or Selectivity, Linearity, precision and accuracy in order to meet the requirements of the US Pharmacopeia (USP), Tripartite International Conference on Harmonization (ICH) and recommendations of the Spanish Association of Industrial Pharmacists (AEFI). Once the working conditions are defined, the respective analysis for evaluating the validation parameters were performed and demonstrated by the experimental design, the analytical methodology meets the characteristic that is linear for a correlation coefficient is obtained and coefficient close to unity determination. The method is accurate because the coefficient of variation or relative standard deviation obtained both assays intermediate precision repeatability and was RSD <2%; It is accurate as having a mean recovery within the range of 98% - 102%; and it is selective for the analyte under study since no interference is evident. Therefore it is concluded that the validated method is reliable, consistent and can be used in the corresponding laboratory analysis.
Keywords: Riboflavin, validation, spectrophotometry, specificity or selectivity, linearity, precision, accuracy
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
I. INTRODUCCIÓNLa industria farmacéutica es el sector dedicado a la fabricación y preparación de productos químicos medicinales para la prevención o tratamiento de las enfermedades. Estas empresas del sector fabrican sus productos mediante procesos altamente automatizados, en los que se encuentran la fabricación de fármacos dosificados, como pastillas, cápsulas, jarabes, suspensiones ó sobres para la administración oral, soluciones para inyección, óvulos y supositorios.1
El fin de la industria farmacéutica desde siempre ha sido producir medicamentos de calidad y con total garantía de seguridad. Desde el “hágase según arte” hasta el cumplimiento de las ICH, con los años, se han ido desarrollando recomendaciones e incorporando requerimientos que han evolucionado hasta una reglamentación estricta. La garantía de la calidad de un producto deriva de una cuidadosa atención a todos aquellos factores que pueden influir en su calidad: selección de sus componentes y materiales, diseño adecuado y control del proceso. 2, 3,4
Para la industria farmacéutica una de las características más importantes de toda la empresa es la calidad de sus productos, ya que de ésta dependerá tanto el prestigio como el desarrollo económico y el crecimiento de la misma. Atendiendo a esta necesidad se han venido formulando diferentes programas y parámetros por varias instituciones para lograr el aseguramiento de la calidad de los distintos productos. Entre los entes reguladores más importantes tenemos la Food and Drug Administration (FDA), la Internacional Conferenceon Amonization (ICH), y en nuestro país tenemos a la Dirección General de Medicamentos Insumos y Drogas (DIGEMID), quienes a través de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) y las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL), aseguran la calidad de los medicamentos.5, 6
De acuerdo a la exigencia y normatividad vigente referida a buenas prácticas de fabricación de productos farmacéuticos, se considera sumamente necesario que los procesos que participan en el
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ciclo productivo, incluyendo los métodos de análisis aplicados tanto para la evaluación de materias primas como para productos terminados, se encuentren validados; es por esto que en nuestro medio durante los últimos años, las empresas farmacéuticas, en cumplimiento de las exigencias de calidad, están orientando sus esfuerzos al desarrollo y ejecución de la validación de sus procesos.7
Calidad es un parámetro importante en todos los sectores industriales, está es aún de más relevancia en la industria farmacéutica, ya que consciente de su alta responsabilidad, actúa siempre buscando mejorar la calidad del medicamento a lo largo del proceso que lo crea. El objetivo es uno y es importante conseguirlo plenamente, esto es, el medicamento seguro estable y eficaz. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de control y fabricación, se exige una mejora continua y máximas garantías de la calidad. Y es en el avance para conseguir un total dominio de la calidad, es cuando surge el concepto de validación.8, 9
El método o técnica analítica consiste en el estudio de cada parte y/o procedimiento, comprendiendo la causa, la naturaleza y los efectos. El análisis es la observación y examen de un hecho en particular. Es necesario conocer la naturaleza del fenómeno y objeto que se estudia para comprender su esencia. El método analítico permite conocer más el objeto de estudio, con lo cual se puede: explicar, hacer analogías, comprender mejor su comportamiento y establecer nuevas teorías.10, 11
Los métodos analíticos son ampliamente utilizados en la industria farmacéutica para la identificación y cuantificación de los componentes activos, impurezas y productos de degradación en materias primas y formas terminadas, así como para la determinación de propiedades específicas que influyen en la acción del producto, como la disolución y la velocidad de liberación. La industria farmacéutica tiene como objetivo principal producir medicamentos seguros, estables y eficaces; es por ello que actualmente las validaciones son una exigencia legal de las agencias reguladoras, ya no solo la validación de los procesos, sino también la validación de los métodos analíticos.12
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
La validación de un método analítico provoca una mayor fiabilidad y aceptación de los datos generados, estando estas en proporción con la calidad del proceso de obtención de los mismos. Es por ello, que su realización es una tarea que puede ser tediosa, pero las consecuencias de no hacerlo, son seguro, una pérdida de tiempo, dinero y recursos. Dentro de las razones que justifican la validación de métodos analíticos se encuentran: a) Demostrar que los métodos son adecuados a los análisis propuestos en las condiciones descritas. La validación es la herramienta que permite obtener las pruebas documentales al respecto y b) Trabajar con métodos que ofrezcan confianza y seguridad en los resultados, lo cual a su vez minimizara el número de fallos y repeticiones permitiendo un importante ahorro de costos.13, 14
Las características de desempeño analítico o de fiabilidad comprenden criterios fundamentales de validación y de los que derivan en la práctica todos los parámetros de validación, así tenemos: Selectividad, Linealidad, Precisión, Exactitud, Rango, Robustez, Límite de detección y Límite de Cuantificación.15, 16, 17,18
Selectividad, es la capacidad de un método para determinar exacta y específicamente el analito sin interferencia de impurezas, productos de degradación, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra. Este parámetro se debería determinar antes de iniciar el estudio cualquier otro parámetro de validación dado que debe conocerse en qué grado la respuesta del método es únicamente proporcionada por el analito, sin interferencia de otras sustancias con él, de una u otra forma.19,20,21,22
Linealidad de un método analítico es su capacidad de producir resultados que son directamente proporcionales (o se convierten en directamente proporcionales mediante una transformación matemática bien definida) a la concentración de analito dentro de un intervalo dado. La linealidad generalmente se expresa en función de la varianza alrededor de la pendiente de la recta de regresión calculada, según una relación matemática establecida, a partir de los resultados obtenidos mediante el análisis de muestras con diferentes concentraciones de analito.19, 20, 21,22
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Precisión de un método analítico es la proximidad entre los resultados, obtenidos por ese método y el valor real. La exactitud puede a menudo expresarse como un porcentaje de recuperación, por medio de la valoración de cantidades conocidas agregadas de analito. Representa el grado en que un método analítico se ajusta al valor verdadero para todo propósito práctico. La exactitud de un método analítico puede determinarse mediante la aplicación del método a muestras de valor conocido o mezclas de excipientes a las que se agregan cantidades conocidas del analito, tanto por encima como por debajo del nivel normal previsto. A partir de los resultados, luego se calcula la exactitud como el porcentaje de analito recuperado por medio de la valoración.19, 20, 21,22
Exactitud, es la proximidad entre los resultados, obtenidos por el método y el valor real. Capacidad del método analítico para proporcionar resultados lo más cercanos posibles al valor teórico o nominal.21, 22
Rango, es el intervalo entre los niveles superior e inferior del analito (incluyendo estos valores) en el que se ha demostrado la precisión, exactitud y linealidad del método tal cual está escrito. Normalmente, se expresa en las mismas unidades que los resultados de la prueba (por ciento, partes por millón, etc. 19, 20, 21, 22
Límite de Detección, es la mínima cantidad de analito en una muestra que puede ser detectado pero no necesariamente cuantificado con precisión y exactitud. 19, 20, 21, 22
Límite de cuantificación, es la mínima cantidad del analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precisión. 19, 20, 21, 22
La validación de metodologías analíticas se fundamenta en la determinación de estos parámetros, que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan. Según USP 38 las metodologías se clasifican en cuatro categorías para su validación y ésta indica los parámetros a evaluarse.19
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Categoría I; cuantificación de componentes principales de fármacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservadores) en productos farmacéuticos terminados.
Categoría II; determinación de impurezas en fármacos a granel o productos de degradación en productos farmacéuticos terminados.
Categoría III; determinación de las características de desempeño (disolución, liberación de fármacos).
Categoría IV; pruebas de identificación. 19, 21, 22
Para cada categoría se necesita diferente información analítica; el método que fue objeto de estudio en el presente trabajo corresponde a la categoría I, para el cual se evaluará los parámetros antes mencionados.
Los métodos para los análisis, en los casos más favorables son selectivos; pocos, si es que los hay, son verdaderamente específicos. En consecuencia, la separación del analito de las posibles interferencias es a menudo una etapa de vital importancia en los procedimientos analíticos. Sin duda, uno de los métodos más comúnmente utilizado para realizar separaciones analíticas es, espectrofotometría UV - visible, un método que tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia.22
La vitamina B2 es una vitamina hidrosoluble y bajo esta denominación, o la genérica de "Riboflavina" se agrupan la riboflavina propiamente dicha y las coenzimas derivados suyos, cuya estructura está formada básicamente por un grupo de tres anillos, dos de ellos heterocíclicos (la isoalloxazina), unido a una cadena lineal de ribosa. Pueden sintetizar riboflavina todos los vegetales y muchos microorganismos, pero no los animales superiores, que si pueden obtener las coenzimas a partir de ella. En forma sólida, la riboflavina es de color amarillo anaranjado intenso. En solución acuosa, tienen una fluorescencia amarillo-verdosa muy intensa23
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Hoy en día los laboratorios deben demostrar que sus métodos analíticos proporcionan resultados fiables y adecuados para su finalidad y propósito perseguido, ya que muchas de las decisiones que se toman están basadas en la información que estos datos proporcionan. La validación de las metodologías, junto a otras actividades englobadas en el control y aseguramiento de la calidad permite demostrar a los laboratorios que sus métodos analíticos proporcionan resultados fiables, que han permitido al mercado farmacéutico alcances mundiales, progresos en ciencia y tecnología que han llevado al desarrollo de numerosas drogas sintéticas de uso masivo. Debido a esto crece la necesidad de disponer de métodos para la determinación de compuestos activos de diversas formulaciones farmacéuticas.24, 25
Por lo expuesto anteriormente se pretende alcanzar los siguientes objetivos:
OBJETIVO GENERAL:
Validar la técnica analítica utilizada para determinar la cuantificación e identificación de Riboflavina por espectrofotometría UV – visible.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Evaluar los parámetros de Especificidad, Linealidad, Exactitud y Precisión, según el protocolo de validación de métodos analíticos
Establecer si los parámetros de validación mencionados cumplen con los parámetros planteados por la Farmacopea Americana (USP 39)
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
II. MATERIAL Y MÉTODO A. MATERIALA.1. MATERIAL DE ESTUDIO
Materia Prima: Riboflavina
Lote: RPS / 072 / 2013 – 2014; H201505006N; RPS / 075 / 2014 – 2015
Fabricante : Harman Finochem LTD.
Origen : India
A.2. MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO: A.2.1 Estándar:
Estándar secundario Riboflavina Lab. Biomont S.A Lote N°: 90115228. Potencia T/C: 98.1%
A.2.2 Reactivos:
Solución Reactivo de Hidróxido de Sodio Diluido
Ácido Acético Glacial Reactivo
Acetato de Sodio 14 g/L
Agua Purificada A.2.3 Material de vidrio:
De uso común del laboratorio A.2.4 Equipos:
Balanza analítica
Marca : METTLER TOLEDO Modelo : ML 204
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Calibración y/o verificación : CONFORME EspectrofotómetroMarca : PERKIN ELMER Modelo : LAMBDA 25 Calibración y/o verificación : CONFORME Sonicador
Marca : FISHER Modelo : FS -23
Calibración y/o verificación : CONFORME A.2.5 Otros:
Bombillas
Jeringas descartables de 5 y 10 mL
Papel metálico y parafina para film
Papel toalla
B. MÉTODO
B.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA:
Las muestras analizadas fueron compradas a nuestro proveedor Andenex Chemie cuyo fabricante de las materias primas es Harman Finochem Ltd, cuyo origen es la India.
B.2 RECOLECCIÓN DE DATOS:
B.2.1 Determinación del muestreo de las materias primas:
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
suficiente para el análisis.B.2.1 Método analítico por espectrofotometría UV/VIS:
Se trabajó con el método espectrofotométrico modificado y propuesto por el departamento de control de calidad de Laboratorios Biomont11.
a) Condiciones espectrofotométricas:
Equipo : Espectrofotómetro UV - VIS
Celda : 10 mm
Longitud de Onda : 300nm
Blanco : 3,5 mL de acetato de sodio 14g/L llevar a 200 mL con agua.
b) Preparación estándar 11
En un matraz aforado de color topacio, de 500 mL de capacidad, sé colocó en suspensión 65,5 mg de la sustancia que sé examinó, en 5 mL de agua R, de modo que quedó completamente humedecida y sé disolvió en 5 mL de solución diluida de hidróxido de sodio R. En el momento en el que se completó la solución se añadió 100 mL de agua R y 2,5 mL de ácido acético glacial R. y sé diluyó hasta 500,0 mL con agua R.
Se colocó 20,0 mL de esta disolución a un matraz aforado de color topacio de 200 mL de capacidad, y sé añadió 3,5 mL de una solución de 14g/L de acetato de sodio R y se diluyó hasta 200,0 mL con agua R. Se Midió la absorbancia en el máximo de 444 nm
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
absorbancia especificac) Preparación de la muestra11
En un matraz aforado de color topacio, de 500 mL de capacidad, se colocó en suspensión 65,5 mg de la sustancia que sé examinó, en 5 mL de agua R, de modo que quedó completamente humedecida y sé disolvió en 5 mL de solución diluida de hidróxido de sodio R. En el momento en el que se completó la solución se añadió 100 mL de agua R y 2,5 mL de ácido acético glacial R. y sé diluyó hasta 500,0 mL con agua R.
Se colocó 20,0 mL de esta disolución a un matraz aforado de color topacio de 200 mL de capacidad, y sé añadió 3,5 mL de una solución de 14g/L de acetato de sodio R y se diluyó hasta 200,0 mL con agua R. Se Midió la absorbancia en el máximo de 444 nm.
Sé calculó el contenido de C17H20N4O6 tomando 328 como el valor de la
absorbancia especifica
Especificación:
98,0 % – 102,0 % de Riboflavina (C17H20N4O6 Mr 376,4)
d) Cálculos
Dónde:
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Pmp : Peso de la muestra en mgF : Factor de conversión
B.3 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICO:
B.3.1 Selectividad
IDENTIFICACIÓN DEL PICO DE RIBOFLAVINA EN MUESTRA
Se Preparó la solución estándar y solución muestra según lo descrito en el procedimiento analítico
Procedimiento:
Se midió las absorbancias de las soluciones obtenidas en un espectrofotómetro UV - VIS realizando un barrido espectral entre 200 nm y 600 nm a intervalo de 1 nm en celdas con 1 cm de paso óptico, utilizando como blanco una solución de 3,5 mL de acetato de sodio 14g/L llevar a 200 mL con agua Realizar las lecturas por duplicado.
ENSAYO DE COLOR Y FLUORESCENCIA DE LA SOLUCION
Solución muestra: 0.01 mg/mL en agua.
Análisis: Alternativamente, se expusó a luz transmitida y luz UV de longitud de onda larga
Criterios de aceptación: La Solución muestra es de color amarillo verdoso pálido con luz transmitida con luz reflejada, presenta una fluorescencia verde amarillenta intensa que desaparece al agregarle álcalis o ácidos minerales.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
B.3.2 LinealidadSe preparó 3 muestras de trabajo en el rango de: 80 %, 90%, 100%, 110%, 120%.
Muestra 80%: Se pesó aproximadamente 52,0 mg de estándar secundario de Riboflavina, se prosiguió según técnica de análisis.
Muestra 90%: Se pesó aproximadamente 58,5 mg de estándar secundario de Riboflavina, se prosiguió según técnica de análisis.
Muestra 100%: Se pesó aproximadamente 65,0 mg de estándar secundario de Riboflavina, se prosiguió según técnica de análisis.
Muestra 110%: Se pesó aproximadamente 71,5 mg de estándar secundario de Riboflavina, se prosiguió según técnica de análisis.
Muestra 120%: Se pesó aproximadamente 78,0 mg de estándar secundario de Riboflavina, se prosiguió según técnica de análisis.
B.3.3 Ensayo de exactitud
Se trabajó con las muestras de la linealidad y aparte se pesó 2 estándares secundarios a una concentración del 100% para comparar, y se prosiguió según técnica de análisis.
B.3.4 Ensayo de precisión
Este parámetro se evaluó en términos de repetibilidad y precisión intermedia
Repetibilidad instrumental: Se preparó las muestras según la técnica analítica, y se determinó este parámetro leyendo 6 veces de forma consecutiva un estándar secundario al 100%.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
analizó las 6 muestras de concentraciones al 100% de la muestra.Precisión intermedia: Se preparó las muestras según técnica analítica. Luego, se realizó los ensayos con distintos analistas, determinándose el coeficiente de variación.
B.3.5 Rango
Cumplidas las especificaciones de linealidad del sistema, linealidad del método, precisión y la exactitud, se estableció que el rango de este método analítico es de 98,0 % a 102,0 %, verificándose que el método analítico funciona correctamente cuando se aplican a muestras que contienen concentraciones iguales a los extremos superior e inferior, así como dentro del intervalo de concentración definido.
B.4 ANÁLISIS DE DATOS:
Los datos obtenidos fueron sometidos a análisis estadístico de regresión lineal, test G de Cochran y test t-Student.
B.4.1 EVALUACIÓN ESTADÍSTICA
Identificación del pico de Riboflavina
Criterio de aceptación: Los espectros de absorción UV de la preparación muestra y preparación estándar presentarón máximos y mínimos a longitudes de onda semejantes.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LINEALIDADLinealidad del estándar
Se determinó la curva de calibración relacionando la respuesta (Absorbancia) con la concentración de analito sobre los puntos sin promediar por el método de los cuadrados mínimos.
Cálculo de la recta de regresión:
Ecuación de la recta:
Y= bX + a
Dónde:
X : Concentración de analito
Y : Absorbancia del analito
b : Valor de la pendiente de la recta
a : Valor de intercepto de la recta con el eje “Y”
a y b se obtienen de:
b
Xi Yi
Xi
Yi n
X
i2
X i
2 na
Yi b
Xi nBIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Coeficiente de correlación "r"El coeficiente de correlación "r" refleja el grado de relación o ligazón existente entre las variables X (concentración) e Y (respuesta). Si es cercano a la unidad significa que existe correlación con una probabilidad elevada.
Criterio de aceptación: r no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,995 se consideran como aceptables.
Coeficiente de determinación (r2):
Es el cuadrado del coeficiente de correlación "r", e indica la proporción de la varianza total de "Y".
Criterio de aceptación: r2 no debe ser significativamente diferente de 1. Valores mayores a 0,990 se consideran como aceptables.
Test de hipótesis para demostrar regresión lineal en función del coeficiente de correlación "r"
HO: no hay correlación entre X e Y
Criterio de aceptación: Si el valor de "tr" obtenido es mayor que el "t" de tabla calculado para (n - 2) grados de libertad y un nivel de significación del 95% (probabilidad α = 0,05), entonces existe correlación lineal significativa.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
r : Coeficiente de correlación linealn : Número de mediciones
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE EXACTITUD
Cantidad de muestra: se calcula la cantidad de analito hallado en cada muestra, mediante la aplicación de la siguiente formula:
mg Muestra
Amp
x Pst x f Ast
Donde:
mg Muestra: Cantidad de Riboflavina hallado en la muestra
A mp : Absorbancia de Riboflavina, obtenido con la solución muestra.
A st : Absorbancia de Riboflavina, obtenida con la solución estándar.
P st : Peso de estándar de referencia de Riboflavina
f : Factor de dilución de estándar y muestra.
Calculo de exactitud: la exactitud se expresa como el porcentaje de analito recuperado por el ensayo
R
mg (h)
x 100 mg (a)
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
R : Porcentaje de recuperación promedio mg (h) : miligramos de Riboflavina hallados mg (a) : miligramos de Riboflavina añadidos
Criterio de aceptación:
La recuperación (R) debe acercarse al 100%. En este caso, por tratarse del análisis de los principios activos como materia prima se consideran como indicativo de exactitud valores de 98 – 102%.
Prueba t de Student para determinar exactitud:
La exactitud se determina mediante la aplicación del test “t” de Student:
t (exp)
100 R
nRSD
Dónde:
t (exp) : Valor de t obtenido experimentalmente R : Porcentaje de recuperación promedio n : Número de datos o mediciones
RSD : desviación estándar relativa del total de mediciones
Criterio de aceptación:
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
libertad y un nivel de significación del 95 % (α= 0,05), entonces no existe diferencia significativa entre la recuperación media y la cantidad añadida de analito.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE PRECISIÓN
Cálculos:
La precisión está relacionada con la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central y corresponde al grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el análisis se aplica repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra homogénea
La precisión se expresa matemáticamente como la desviación estándar (s) o como la desviación estándar relativa (DSR). El estimador de la desviación estándar se calcula como: n
s
X i X p
2 i1 n 1 Dónde: n : Número de medidasXi : Valor medido por el ensayo i
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
nX
X i p i1 nLa desviación estándar relativa (DSR) se calcula como:
DSR
s
.100 X PEvaluar la precisión del método a nivel de repetibilidad y precisión
Intermedia:
Repetibilidad: Evaluar los resultados obtenidos por un mismo analista, el mismo día y en la misma serie de análisis.
-Precisión intermedia: Evaluar los resultados obtenidos en el análisis de la misma muestra por otros analistas.
Criterio de aceptación:
Precisión del sistema : DSR no mayor de 2,0% Precisión del método
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
III.RESULTADOSTABLA Nº 1: PARÁMETRO DE SELECTIVIDAD DE RIBOFLAVINA POR EL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO UV -VISIBLE
SELECTIVIDAD
ESPECIFICACIONES RESULTADOS
Identificación
Los espectros de absorción UV d e l a Conforme preparación muestra y preparación
estándar presentan máximos y mínimos
a longitud de onda semejantes.
Ensayo de color y Fluorescencia de la solución
La solución muestra es de color amarillo verdoso pálido con luz transmitida con luz reflejada, presenta una fluorescencia verde amarillenta intensa que
desaparece al agregarle álcalis o
ácidos minerales Conforme
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
TABLA N° 2: PARÁMETRO DE EXACTITUD DE RIBOFLAVINA POR EL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO UV-VISIBLE.
EXACTITUD
ESPECIFICACIONES RESULTADOS Porcentaje de recuperación promedio 98,00 – 102,00% 99,4
Prueba t de Student t exp. > t tabla 0,189
(t tabla= 4.303)
Prueba G de Cochran t exp. > t tabla 0,343
(t tabla= 0.871)
TABLA N° 3: PARÁMETRO DE LINEALIDAD DE RIBOFLAVINA POR EL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO UV-VISIBLE.
LINEALIDAD
ESPECIFICACIONES RESULTADOS Linealidad de
Ecuación de la recta Y=bX +a Y=0,0042585X + 5.8739779 Coeficiente de correlación Mayor a 0,995 0,999352 Coeficiente de determinación Mayor a 0,990 0,9987044 Pruebas de t de Student t exp. > t tabla 62.41
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
TABLA N° 4: RESULTADOS DEL PARÁMETRO DE PRECISIÓN DERIBOFLAVINA, POR EL MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO UV-VISIBLE.
PRECISION
ESPECIFICACIONES RESULTADOS PRECISIÓN SISTEMA
Coeficiente de variación Menor a 2,0% 0,05 de absorbancias del
Estándar
PRECISIÓN DEL MÉTODO
Coeficiente de variación o Menor a 2,0% 0,37 desviación del estándar
Relativa
REPETITIBILIDAD
Coeficiente de variación o Menor a 2,0% Analista Analista Analista
desviación del estándar 1 2 3
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
IV. DISCUSIONEl presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de control de calidad, que cuenta con las exigencias de BPM, por lo tanto los resultados de sus análisis deben de cumplir con las exigencias gubernamentales.
En la tabla 1 se presentan los resultados del parámetro de selectividad los cuales muestran conformidad entre los picos máximos en la comparación del estándar y la muestra, además de los resultados conformes de los ensayos de color y Fluorescencia de la solución.
La selectividad y especificidad del método analítico se debe determinar antes de iniciar el estudio de otros parámetros de validación, dado que así se conoce en qué grado de respuesta del método es únicamente es proporcionada por el analito, sin interferencia de otras sustancias relacionadas con el de una u otra forma, como son las impurezas y productos de degradación. 19, 20, 25
El grado de selectividad asociado a un método analítico adquiere mayor relevancia si su finalidad es evaluar la estabilidad del principio activo o de la fórmula farmacéutica; este es el parámetro que debe revisarse en mayores ocasiones, pues está vinculado al origen de la muestra, la optimización de la preparación, la especificidad de la medida y las condiciones instrumentales. 19, 20, 2425
La exactitud de un procedimiento analítico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimental encontrado. 19,20,24,25
En la tabla 2 se evidencia los resultados del parámetro de exactitud, teniendo como resultado un porcentaje de recuperación promedio de 99,4% dentro de las especificaciones (98,00 -102,00%), al aplicar la prueba t de student para evaluar la recuperación del método resulta 0,189, siendo menor a t de tabla (t tabla= 4,303), cumpliendo con la especificación (t exp < t tabla) por lo que se puede interpretar que no existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%. Para evaluar la influencia de la concentración sobre los resultados se aplicó la prueba G de Cochran dando como resultado 0,343 siendo menor que el G tabla= 0,871 estando
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Especificación (G exp < G tabla) por lo que se puede concluir que el factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados. Este resultado nos condujo a considerar que los errores sistemáticos del método no fueron significativos, por lo que puede considerarse exacto. 19,20,21,24, 25
En la tabla 3 se presentan los resultados obtenidos durante la evaluación de la linealidad, se demostró que el método produce resultados que son proporcionales a la concentración de trabajo del analito, en un intervalo definido de 80% a 120%. Con la evaluación estadística de los datos; se obtuvo un coeficiente de correlación (r) de 0,999352 lo que indica una significativa correlación lineal entre la concentración y el área de lectura que reporta el analito en el análisis. De igual forma, el análisis estadístico de regresión lineal para la muestra ofreció al método una pendiente el valor de t de Student experimental fue mayor que el t Tabla (62.41> 2,160) para el p=0,05 % de confianza, por lo que la pendiente difiere significativamente de cero. En el test de linealidad DSR de la muestra es 0,989 ambos cumplen con las especificaciones (DSR<5,0%). Por lo que se infiere que tanto el estándar muestra cumplen con el parámetro de linealidad. 19, 20, 21,24, 25
La linealidad determina la región de la curva respuesta o de cuantificación en que hay relación directa entre la señal instrumental y la concentración del producto analizado, siendo un método lineal, estos valores pueden verse afectados si existe un cambio en la valoración del contenido de principio activo. 19, 20, 21, 25
En la tabla 4; la precisión, evaluada como repetibilidad, mostró resultados satisfactorios, pues el coeficiente de variación determinado para el sistema fue 0,05%, estando dentro de la especificación (menor de 2,0%). El resultado de la precisión del método arrojo un coeficiente de variación de 0,37% cumpliendo también con las especificación (menor de 2.0%). Asi mismo la repetibilidad de 3 analistas aplicando el coeficiente de variación de 0.96; 1,07 y 0,94% estando dentro de la especificación (menor del 2,0%).
El cálculo del coeficiente de variación permite deducir el número de replicados que se deben realizar en el ensayo para un determinado intervalo de aceptación. Según la ICH Q2B recomienda introducir los intervalos de confianza en el estudio de precisión – repetibilidad. 19, 20, 21, 25
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
El objetivo del estudio de la precisión es conocer la variabilidad del método, esta variación puede deberse a errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo. Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados como al analista, el equipo instrumental, los reactivos, el tiempo, etc., es por ello la importancia de este ensayo. 19, 20, 21,24, 25
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
V. CONCLUSIONES En el ensayo de linealidad se encontró 0,999352 y 0,9987044 para el
coeficiente de correlación (R) y coeficiente de determinación respectivamente.
En el ensayo de selectividad y especificidad se encontró un analito sin
interferencias.
En el ensayo de exactitud, no existió diferencia significativa entre la
recuperación media de 99.4% y en el test de G de Cochran, el G experimental 0,343 es menor que el G tabla 0,871.
En el ensayo de precisión se encontró 0,05%; 0,37% y para el coeficiente de
variación del sistema y método respectivamente así mismo 0,96, 1,07 y 0,94 % para el coeficiente de variación de repetibilidad.
El método analítico es específico, lineal, exacto y preciso, aplicable para la
cuantificación e identificación de Riboflavina.
El método analítico es válido por cumplir con los parámetros de linealidad,
exactitud y precisión, aplicable para la cuantificación e identificación de Riboflavina.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Aspectos Generales de la Industria Farmacéutica. Capítulo I [En línea] [Con fecha de acceso el 20 de Octubre del 2016]. Web disponible en: http://wwwisis.ufg.edu.sv/wwwisis/documentos/TE/615.19-A385d/615.19-A385d-CAPITULO%20I.pdf
2. Rudolph JS. Validation of solid dosage forms. En: Berry IR yNash R, editors. New York, 1993: 167-190
3. Salazar R. Aplicación del concepto de Calidad Total a la Industria Farmacéutica. Real Academia de Farmacia de Barcelona, discurso de recepción. Barcelona: Romargraf S.A., 1998; 1:991
4. Ylla-Catala M. La validación un reto actual. Normas para la práctica de una correcta validación. Ciencia e industria farmacéutica 19883; 2(2da época) (1):25-28
5. A laboratory guide to method validation and related topics. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. Eurachem Guide. Guía para la validación de métodos de ensayo. OAA.DC-LE-05. 2009. [En línea] [Con fecha de acceso el 20 de Octubre del 2016]. Web disponible en: http://www.suelos.org.ar/adjuntos/validacion_metodos_analiticos.pdf
6. Dirección General de Medicamentos Insumos y Drogas (DIGEMID).: “manual de buenas prácticas de manufactura de productos farmaceuticos”. Aprobado bajo la Resolución Ministerial N° 055-99. SA/DM. Perú. 1999; 26,71.
7. Giovanna Francisca Mayorga Bustinza; Validación de una técnica de análisis por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) para cuantificar
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
norfloxacino y fenazopiridina clorhidrato en cápsulas orales. [En línea] [Con fecha de acceso el 21 de Octubre del 2016]. Web disponible en:
http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/1639
8. Romero Miguel. Desarrollo de nuevas metodologías analíticas en el control de calidad de la industria farmacéutica.[Tesis para optar el grado de doctor en ciencias Químicas]. Barcelona: Universidad Autónoma de Barcelona; 2001.[Fecha de acceso 20 de octubre de 2016]Barcelona. Disponible en: http://www.tesisenxarxa.net/TDX/TDX_UAB/TESIS/AVALIABLE/TDX-0712102-102928//marglde9.pdf
9. Dalmau Roch R, Suñe negre JM, Cemeli Pons J. Control de Calidad en la industria farmacéutica: Concepto de validación. Industria Farmacéutica. España 1989. Pp. 85- 91
10. Ruiz R. Historia y Evolución del pensamiento Científico. Eumed.net. Enciclopedia Virtual. [En Internet]; agosto 1997. [Acceso 21 de octubre del 2016]. Disponible en: http://www.eumed.net/libros-gratis/2007a/257/7.1.htm 11. Lopera J. El método analítico como método natural.Rev Critica de ciencias
sociales y jurídicas. 2010. [Acceso 21 de octubre del 2016];25(1) Disponible en:
http://www.pendientedemigracion.ucm.es/info/nomadas/25/juandiegolopera. pdf
12. Marrero D. y Gonzales V. Acercamiento a la validacion de métodos analíticos en la industria farmaceutica cubana. Revista CENIC. 2009 [Acceso 20 de octubre del 2016]; 36(1):21-23. Disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/1816/181620586005.pdf.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
13. Gomara F. Desarrollo y validación de un método espectrofotométrico para cuantificación de ácido kojico. Revista ArsPharm. 2004. [Acceso 20 de octubre del 2016];45(2): 145-153. Disponible en: http://www.ugr.es/ars/abstract/vol45/145-153.pdf.
14. Oficina de las Naciones Unidas contra la droga y el delito. [UNODC]. Directrices para la validación de métodos analíticos y la calibración del equipo utilizado para el análisis de drogas ilícitas en materiales incautados y especímenes biológicos.[En Internet]2010.[Acceso 20 de octubre del 2016].
Disponible en:
http://www.unodc.org/documents/scientific/validation_Manual_STNAR41_ Ebook:S.pdf
15. Oleksiuk, A.: “validación de la metodología analítica por hplc para la cuantificación de losartán potásico en comprimidos recubiertos”. Unidad de práctica profesional para optar el título de Químico Farmacéutico. Universidad de Chile. Santiago – Chile. 2009. [en línea]. [Con fecha de acceso el 21 de Abril del 2015]. Web disponible en: http://www.cybertesis.cl/tesis/uchile/2006/oleksiuk_a/html/index.html
16. Morales de la Cruz.: “desarrollo y validacion prospectiva de una tecnica analitica por cromatografia liquida de alta performance (hplc) para enalapril 10 mg tabletas recubiertas”. Tesis de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima-Perú. 2008. [en línea]. [Con fecha de acceso el 23 de Abril del 2015].
17. British Pharmacopeia. Bp 2014-commission.: Vol. IV. England. 2014; A563 – Suplementary chapter III F.
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
18. Convención de Inspección Farmacéutica (PIC).: Guía de Buenas Práctica de Fabricación de Medicamentos. Anexos. Abril 2008.
19. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Validación de Métodos Analíticos. Sección catalana de AEFI. España – Barcelona. 2001 20. International conference harmonization-harmonised tripartite guideline.:
Text on validation of analytical procedures. ICH QualityGuidelines. EE.UU. pp: 1-3
21. MERCK.:Chrom Book Merck. EE.UU. pp: 44-45
22. Skoog D. y Leary J.: Principios de Análisis Instrumental. 5°ed. Ed. McGraw Hill. Madrid-España. Pp: 674-675, 746-747.
23. Bioquímica de los alimento;2016 [Acceso 20 de octubre de 2016] Disponible
en: http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/vitamins/riboflavina.html
24. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of analytical procedures: Text and methodology Q2 (R1). ICH Harmonised Tripartite Guideline; 2005. [Acceso 20 de octubre de 2016]. Disponible en: ‹http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines /Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf›
25. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios, anexo 15.: “cualificación y validación”. España. [en línea]. [Con fecha de acceso el 21 de octubre del 2016]. Web disponible en: http://www.agemed.es/actividad/sgInspección/docs/28-anexo15.pdf
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ANEXO 1: SELECTIVIDAD
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ANEXO 2: EXACTITUD
DATOS DEL PARAMETRO DE EXACTITUD PARA LA VALIDACION DEL METODO ANALITICO POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS PARA LA CUANTIFICACION DE RIBOFLAVINA COMO MATERIA PRIMA
PARÁMETRO: EXACTITUD
ANALITO: RIBOFLAVINA
Evaluación de la exactitud en el rango de 80% - 120%
DATOS DE MUESTRA
Dilución Absorbancia
X s DSR
(mg) Abs Abs Abs
52.1 500 20 200 0.33504 0.33337 0.33261 0.3337 0.001243 0.37254 65.6 500 20 200 0.42185 0.41975 0.41880 0.4201 0.001560 0.37148 78.3 500 20 200 0.50352 0.50101 0.49988 0.50147 0.001866 0.37153
DATOS DEL ESTANDAR
Peso
Dilución Absorbancia
X s DSR
(mg) Abs Abs Abs
65.6 500 20 200 0.4220 0.4217 0.4219 0.42187 0.000153 0.03621 65.5 500 20 200 0.4198 0.4197 0.4197 0.419773 0.0000577 0.01376 65.4 500 20 200 0.4188 0.4188 0.4189 0.41883 0.0000577 0.01378 % mg % hallados % Recuperación s s2 añadidos X Varianza
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
80 52.1 79.52 79.50 79.58 99.4 99.40 99.48 79.55 0.0354 0.001256 100 65.6 99.35 99.43 99.44 99.35 99.43 99.44 99.41 0.0354 0.001256 120 78.3 119.53 119.45 119.58 99.61 99.54 99.65 50.55 0.0354 0.001256 Numero de datos n : 9 % Recuperación promedio R : 99.48 % Desviación estándar s : 1.18Desviación estándar relativa DSR : 1.18 %
EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN SOBRE LOS RESULTADOS
Aplicación de la prueba estadística: G de Cochran
Gexp = s2 máx = 0.001256 = 0.343 s21+s22+s23 0.003768 Gtabla(p=0,05;k=3;n=3) = 0.871
Especificación: G exp < G tabla
POR LO TANTO: El factor de concentración no influye en la variabilidad de los resultados
EVALUACION DE LA RECUPERACIÓN DEL MÉTODO
Aplicación de la Prueba estadística: t de Student
texp = [100-R](n)1/2 = 0.1890 t tabla (α : 0,05; v: 8) = 4.303
DSR Especificación: texp < t tabla POR LO TANTO: No existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100%
CONCLUSION: EXACTO
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ANEXO N° 3: LINEALIDAD1.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA MÉTODO ANALÍTICO:
Materia Prima: Riboflavina Dosaje nominal de la Materia
Prima base seca : 98,0% – 102,0%
Estándar Riboflavina Potencia T/C
(%) 98.1
Concentración = 500 x 200 x ABS x 1000
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
DATOS: muestras 80% 90% 100% 110% 120%Pesos concentración Pesos concentración Pesos concentración Pesos concentración Pesos Concentración
mg % mg % mg % mg mg/mL mg mg/mL M1 52.1 79.52 58.6 89.55 65.6 99.35 71.6 109.41 78.3 119.53 M2 52.1 79.50 58.8 89.67 65.5 99.43 71.8 109.91 78.2 119.45 M3 52.2 79.58 58.7 89.61 65.4 99.44 71.5 109.40 78.4 119.58 Abs 80% 90% 100% 110% 120% M1 0.3350 0.37966 0.42185 0.46403 0.50352 0.3334 0.37897 0.41975 0.46446 0.50101 0.3326 0.37765 0.41880 0.46596 0.49888 M2 0.3351 0.37986 0.41980 0.46758 0.50254 0.3334 0.37567 0.41970 0.46786 0.50248 0.3324 0.37769 0.41970 0.46777 0.50214 M3 0.3329 0.37786 0.41880 0.46576 0.50325
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
0.3333 0.37675 0.41890 0.46549 0.50295 0.3335 0.37684 0.41880 0.46612 0.50303 RESULTADOS: Concentraciones Concentración Abs yi xi2 yi2 xiyi Factor % respuesta (f) xi yi/xi 80% 79.52 0.33367 6323.4304 0.111335669 26.533438 0.004196051 90% 89.55 0.37876 8019.2025 0.143459138 33.917958 0.004229592 100% 99.35 0.42013 9870.4225 0.176509217 41.739916 0.004228878 110% 109.41 0.46481 11970.5481 0.216048336 50.854862 0.004248332 120% 119.53 0.50113 14287.4209 0.251131277 59.900069 0.004192504BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Suma 497.36 2.0985 50471.0244 0.898483636 212.9462429 0.021095267 Concentraciones Concentración Abs yi xi2 yi2 xiyi Factor % respuesta (f) Xi yi/xi 80% 79.5 0.33366 6320.25 0.1113288996 26.52597 0.004196981 90% 89.67 0.37774 8040.7089 0.142687508 33.871946 0.004212557 100% 99.43 0.41973 9886.3249 0.176173273 41.733754 0.004221362 110% 109.91 0.46773 12080.2081 0.218771353 51.408204 0.004255573 120% 119.45 0.50238 14268.3025 0.252385664 60.009291 0.004205776 Suma 497.96 2.10124 50595.7944 0.901346793 213.549165 0.021092249 Concentraciones Concentración Abs yi xi2 yi2 xiyi Factor % respuesta (f) Xi yi/xi 80% 79.58 0.33324 6332.9764 0.111048898 26.519239 0.004187484 90% 89.61 0.37715 8029.9521 0.142242123 33.796412 0.004208794 100% 99.44 0.41883 9888.3136 0.175418569 41.6484455 0.004211887BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
110% 109.4 0.46579 11968.36 0.216960324 50.957426 0.004257678 120% 119.58 0.50307 14299.3764 0.253079425 60.157111 0.004206974 Suma 497.61 2.09808 50518.9785 0.898749338 213.0786425 0.021072817 Suma 1492.93 6.29783 151585.7973 2.69857977 639.5740504 0.06326033DETERMINACIÓN DE LINEALIDAD DE SISTEMA:
Tabla de los 15 datos de linealidad xi yi 79.52 0.33367 89.55 0.37876 r = 0.999352 r2 = 0.9987044 99.35 0.42013 109.41 0.46481 Pendiente (b) = 0.0042585 Intercepto = 5.8739779 119.53 0.50113 79.5 0.33366
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
89.67 0.37774 Ecuación de la recta: y = 0.0042585 + (5.8739779) 99.43 0.41973 109.91 0.46773 119.45 0.50238 79.58 0.33324 89.61 0.37715 99.44 0.41883 109.4 0.46579 119.58 0.50307BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
ANEXO 4: PRESICIÒN
DATOS DEL PARAMETRO DE PRECISIÒN PARA LA VALIDACION DEL METODO ANALITICO POR ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS PARA LA CUANTIFICACION DE RIBOFLAVINA
PARÁMETRO: PRECISIÓN
PRECISIÓN DEL SISTEMA
ANALITO: Riboflavina
N°
Iny. Absorbancia Iny. N° Absorbancia Iny. N° Absorbancia 1 0.4439 1 0.4494 1 0.4221 2 0.4441 2 0.4494 2 0.4217 3 0.4440 3 0.4496 3 0.4219 4 0.4439 4 0.4495 4 0.4220 5 0.4441 5 0.4496 5 0.4218 Promedio de Absorbancia X = 0.4440 Promedio de Absorbancia = 0.4495 X Promedio de Absorbancia = 0.4219 X Desviación estándar de s = 0.00001
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
Absorbancia Desviación estándar de Absorbancia s = 0.00001 Desviación estándar de Absorbancia s = 0.00001Desviación estándar relativa de
Abs. ST1 DSR = 0.02 %
Desviación estándar relativa de
Abs. ST2 DSR = 0.02 %
Desviación estándar relativa de
Abs. ST3 DSR = 0.02 %
Especificación: DSR f ≤ 2 %
CONCLUSIÓ
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
PARÁMETRO: PRECISIÓN REPETIBILIDAD - PRECISIÓN INTERMEDIA ANALITO:RIBOFLAVINAEvaluación de precisión en el rango de 80% - 120% Secuencia de
análisis: Día 1: Analista 1
Día 2: Analista 2 Día 3: Analista 3 % Analista Pesos Dilucio n Absorbancia s DSR X %. X s DSR (mg) Abs Abs Abs
1 52.1 500 20 200 0.3350 0.3334 0.3326 0.00122202 0.36623982 0.569 79.52 80 2 52.1 500 20 200 0.3351 0.3334 0.3324 0.00136504 0.40914368 0.573 79.50 79.53333 0.0416 0.05 3 52.2 500 20 200 0.3329 0.3333 0.3335 0.00030551 0.09167902 0.568 79.58 1 65.6 500 20 200 0.42185 0.41975 0.41880 0.00156072 0.37148103 0.703 99.35 100 2 65.5 500 20 200 0.41980 0.41970 0.41970 0.00005774 0.01375517 0.707 99.43 99.40667 0.0493 0.05 3 65.4 500 20 200 0.41880 0.41890 0.41880 0.00005774 0.01378473 0.703 99.44 1 78.3 500 20 200 0.50352 0.50101 0.49888 0.00023226 0.46346478 0.859 119.53 120 2 78.2 500 20 200 0.50254 0.50248 0.50214 0.00021572 0.04293821 0.866 119.45 119.52 0.0656 0.05 3 78.4 500 20 200 0.50325 0.50295 0.50303 0.00015535 0.03088798 0.858 119.58
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
REPETIBILIDAD:Evaluación de los resultados obtenidos por un analista, el mismo día y en la
misma serie de análisis. Especificación ≤
Analista 1 %. S DSR (%) 80% 79.52 100% 99.35 2.00 0.96 120% 119.53 Promedio 99.47 CONCLUSIÓN : CUMPLE Analista 2 %. S DSR (%) Donde: : Resultado promedio en %. 80% 79.5 X 100% 99.43 2.00 1.07 s : Desviación estándar 120% 119.45
DSR : Desviación estandar relativa Promedio 99.46 CONCLUSIÓN : CUMPLE CONCLUSIÓN : PRECISO Analista 3 %. S DSR (%) 80% 79.58 100% 99.44 2.00 0.84 120% 119.58 Promedio 99.53
BIBLIOTECA
DE
FARMACIA
Y
BIOQUIMICA
PRECISIÓN INTERMEDIA:Evaluación de los resultados del análisis de la misma muestra por 3 analistas en diferentes días Especificación : ≤ 2,0 % Analista X s DSR (%) % 1 99.47 2 99.46 0. 37 0.037 3 99.53 Promedio 215.05
