OSTEOARTRITE DE JOELHO EM RATOS INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO

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(1)OSTEOARTRITE DE JOELHO EM RATOS INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO. Marciele Amaral 1 Morgana Duarte da Silva 2 Eloá Ferreira Yamada 3 Vanderlei Folmer 4. Resumo: A Osteoartrite (OA) manifesta-se por quadro álgico, diminuição da amplitude de movimento e força muscular. Há um desequilíbrio entre síntese e degradação de cartilagem provocando degeneração cartilaginosa, desgaste do osso subcondral e formação de osteófitos. Essas alterações teciduais acarretam a produção de radicais livres, podendo causar stress oxidativo, e consequentemente aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio, porém uma das formas de defesa do organismo é o sistema enzimático, a partir de enzimas antioxidantes. O monoiodoacetato de sódio (MIA) é uma substância que leva a lesões muito semelhantes à OA humana, através da inibição da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que leva à morte celular e redução na quantidade de proteoglicanos. Assim o objetivo do presente estudo foi analisar as alterações de comportamento e relacionadas ao stress oxidativo proporcionadas por diferentes doses de MIA na articulação do joelho. Foram utilizados 40 ratos Wistar machos, aproximadamente 250g de peso corporal, divididos em Grupo Controle, no qual receberam 50µl de soro fisiológico, Grupo MIA 0,5mg, Grupo MIA 1,0mg e o Grupo MIA 1,5mg (todas as doses de MIA foram diluídas em 50µl de soro fisiológico). Os animais receberam as substâncias pela injeção intraarticular no joelho direito. O limiar nociceptivo mecânico foi avaliado através dos filamentos de Von Frey, com diferentes graus de estimulação mecânica nociva (retirada da pata) ou inócua (permanência da pata). As avaliações foram realizadas antes das injeções intra-articulares, e nos dias 1, 4, 7, 11 e 14 após intervenção. Foi realizada a avaliação do estado oxidativo das células através da quantificação total de tióis (GSH) e peroxidação lipídica, através do teste TBARS. Os dados foram tratados estatisticamente pela análise de variância de uma via (ANOVA) e expressos como média ± erro padrão da média, sendo considerados significativos aqueles que obtiveram p Palavras-chave: Osteoartrite de joelho; Monoiodoacetato de sódio.

(2) Modalidade de Participação: Iniciação Científica. OSTEOARTRITE DE JOELHO EM RATOS INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO 1 Aluno de graduação. marciele.d.amaral@gmail.com. Autor principal 2 Docente. morganaduartesilva@gmail.com. Co-autor 3 Aluno de pós-graduação. eloayamada@unipampa.edu.br. Co-autor 4 Docente. vanderleifolmer@unipampa.edu.br. Orientador. Anais do 9º SALÃO INTERNACIONAL DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO - SIEPE Universidade Federal do Pampa | Santana do Livramento, 21 a 23 de novembro de 2017.

(3) OSTEOARTRITE DE JOELHO EM RATOS INDUZIDA POR MONOIODOACETATO DE SÓDIO 1. INTRODUÇÃO A Osteoartrite (OA) é uma das afecções mais frequentes do sistema músculoesquelético e a que mais está relacionada com o envelhecimento biológico, podendo ser secundária a outros eventos como os hábitos de vida (Vad et al., 2002). Manifesta-se por quadro álgico, diminuição da amplitude de movimento (ADM) e da força muscular, o que acarreta limitação funcional interferindo nas atividades de vida diária. Há um desequilíbrio entre síntese de cartilagem e sua degradação afetando todos os tecidos ao redor da articulação, provocando lesões anatômicas representadas pela degeneração cartilaginosa, desgaste do osso subcondral e remodelagem óssea pela tentativa de reparação do osso, o que determina a formação de osteófitos (Shrier, 2004). Essas alterações teciduais que ocorrem na OA acarretam a produção de radicais livres, podendo causar stress oxidativo. A produção de radicais livres é um processo fisiológico, mas em disfunções teciduais, pode aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) ou depleção de defesas antioxidantes, provocando o estresse oxidativo. Assim, o corpo possui inúmeros sistemas de defesa antioxidante envolvidos na desintoxicação de ROS de maneiras diferentes, sendo uma das formas o sistema enzimático, com a participação de enzimas antioxidantes (Pierezan et al., 2014). O monoiodoacetato de sódio (MIA) é uma substância que quando aplicada a partir de uma injeção intra-articular leva a lesões muito semelhantes à OA humana. O MIA inibe a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que atua em uma das etapas da via glicolítica, o que resulta em desequilíbrio entre catabolismo e anabolismo dos condrócitos (Combe et al., 2004). Isso leva à morte dessas células, degeneração do osso subcondral e consequentemente a formação de osteófitos em uma tentativa de reparar os danos, também alterações nos componentes da matriz extracelular como a redução na quantidade de proteoglicanos acompanhado de alterações nociceptivas e patológicas (Guzman et al., 2003; Cialdai et al., 2013). Tal processo é semelhante às lesões de osteoartrite em humanos (Barve et al., 2007; Naveen et al., 2014). Assim o objetivo do presente estudo foi analisar as alterações de comportamento e relacionadas ao stress oxidativo proporcionadas por diferentes doses de MIA na articulação do joelho. 2. METODOLOGIA Os procedimentos experimentais do presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Unipampa (CEUA), protocolo 004/2016. Animais: foram utilizados 40 ratos Wistar machos, com aproximadamente 3 meses de idade e 250g de peso, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Federal de Santa Maria. Os animais foram mantidos em gabinetes com ventilação controlada, divididos em 4 ratos por caixa, sob controle de temperatura (22 ± 2°C) e umidade (60-80%) em ciclos de 12 horas claro-escuro, com livre acesso a água e ração. Todos os experimentos foram realizados durante a fase clara do ciclo. Os animais foram divididos da seguinte forma: (1) Grupo Controle: os animais receberam 50µl de soro fisiológico; (2) Grupo MIA 0,5mg: os animais receberam.

(4) 0,5mg de MIA diluído em 50µl de soro fisiológico (Pitcher, Sousa-Valente e Malcangio, 2016); (3) Grupo MIA 1,0mg: os animais receberam 1,0mg de MIA diluído em 50µl de soro fisiológico (Bove et al., 2003; Guzman et al., 2003, Nagase, Kumakura e Shimada, 2012); e (4) Grupo MIA 1,5mg: os animais receberam 1,5mg de MIA diluído em 50µl de soro fisiológico. Indução da Osteoartrite de Joelho: os ratos foram anestesiados com injeção xilazina (10mg/kg, i.p.) e cetamina (80mg/kg, i.p.). Após a tricotomia do local os animais receberam uma injeção intra-articular no joelho direito de MIA. A perna direita foi flexionada a um ângulo de 90°, a agulha foi posicionada ao lado do ligamento patelar e a solução injetada na região intra-articular do joelho. Os ratos do Grupo controle receberam uma injeção intra-articular de saliQD HVWpULO O Avaliação da Sensibilidade Mecânica na Pata: para a avaliação do limiar nociceptivo mecânico foram utilizados filamentos de Von Frey, descritos por Chaplan et al. (1994). Os animais foram aclimatados por no mínimo 1 hora antes dos experimentos, em compartimentos individuais de acrílico (7x9x11cm), sobre uma plataforma de fundo gradeado, possibilitando o acesso à superfície ventral das patas traseiras dos animais. O estímulo mecânico foi direcionado perpendicularmente à superfície plantar dos animais, e então foram analisadas as respostas (retirada ou não da pata) em relação à tensão aplicada pelos diferentes filamentos de Von Frey (Semmes-Weinsntein monofilaments, Stoelting, EUA) calibrados para produzir forças (0,02; 0,04; 0,07; 0,16; 0,4; 1,0; 2,0; 4,0 gramas), que produzem diferentes graus de estimulação mecânica. As avaliações iniciaram com a aplicação do filamento 0,4g, e no caso de estímulo nocivo (indicado pela retirada da pata) foi utilizado um filamento com menor valor em gramas, e para o estímulo inócuo (indicado pela permanência da pata) foi testado o filamento com maior valor subsequente em gramas. As avaliações foram UHDOL]DGDV D SDUWLU GR PpWRGR GHQRPLQDGR GH ³up-and-down´ RX ³PpWRGR GH FLPD SDUD EDL[R´ SURSRVWR SRU 'L[RQ 0), portanto foram realizadas um total de no máximo seis estímulos não consecutivos em cada animal. Os dados obtidos a partir dele, fornecem a força correspondente a 50% do limiar de retirada da pata (em g). Intensa redução no limiar de retirada da pata caracteriza o aparecimento de hipersensibilidade mecânica. Quantidade Total de Tióis (GSH): para a quantificação total de tióis, as estruturas do joelho utilizadas foram cápsula, ligamentos cruzados e colaterais, meniscos todos homogeneizados, submetidos à centrifugação 2000 rpm, 4qC, por 10 minutos, e o sobrenadante foi precipitado com ácido tricloro acético a 10% na proporção 1:1. A mistura foi submetida a centrifugação novamente com os mesmos parâmetros. A reação iniciou pela adição de 5,50-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A absorbância foi mensurada a 405nm (Ellnan, 1959). Peroxidação Lipídica (TBARS): o sobrenadante das estruturas do joelho homogeneizadas e centrifugadas como descritos anteriormente foi incubado a 100qC por 1h, com tampão de ácido acético e ácido 2-tiobarbitúrico, em seguida foi adicionado duodecil sulfato de sódio a 8,1%, e então a absorbância foi mensurada a 545nm (Ohkawa et al., 1979). Análise Estatística: os resultados foram avaliados estatisticamente pela análise de variância de uma via (ANOVA) seguida de teste post hoc de Bonferroni (avaliação comportamental) e Newman-Keuls (análise bioquímica). Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média. Os valores p<0,05 foram considerados significativos..

(5) 3. RESULTADOS e DISCUSSÃO Na avaliação do limiar nociceptivo mecânico, a partir do Von Frey, os animais apresentaram maior resistência ao estímulo dos filamentos na primeira avaliação (indicada pela letra B - basal, na Figura 1), nesse ponto, os animais ainda não tinham sofrido nenhuma intervenção. No dia 1, após a injeção intra-articular de soro fisiológico ou MIA, os animais dos grupos que receberam 1,0mg e 1,5mg apresentaram resultados estatisticamente significantes, esse efeito perdurou até o 7q dia. Nas avaliações do 11q e 14qdias, somente nos animais que receberam a dose de 1,5mg, houve a persistência dos sintomas dolorosos (significante estatisticamente). A partir dos dados obtidos no teste de von Frey observa-se que a grupo MIA 1,5mg apresentou intensa redução no limiar de retirada da pata, caracterizando a hipersensibilidade mecânica e consequentemente a presença do quadro álgico devido ao dano tecidual. Assim para esse modelo de OA, a substância de MIA 1,5mg pode ser considerada a mais danosa à articulação do joelho, provocando maior algesia (Hendiani et al., 2003).. Figura 1. Limiar nociceptivo mecânico da pata nos grupos que receberam salina estéril (controle), ou MIA. Sendo B, avaliação basal, sem nenhuma intervenção, **p<0,01 e ***p<0,001 comparação do grupo salina e do grupo MIA 1.0mg, +p<0,05, ++p<0,01 e +++p<0,001 comparação do grupo salina e do grupo MIA 1.5mg.. Os níveis de GSH são uma medida que demonstra o estado oxidativo da célula, sendo o principal antioxidante tiol não-protéico em células de mamíferos, caracteriza um possível aumento do stress oxidativo, indicando que há um aumento de espécies reativas ao oxigênio. No presente trabalho, o teste de GSH demonstrou diminuição dos níveis da quantidade total de tióis em todas as concentrações de MIA (Figura 2A), mas esses dados não apresentaram diferenças estatísticas em relação ao grupo controle. Esse resultado sugere que não houve ação antioxidante nas diferentes doses de MIA (Schafer e Buettner, 2001; Feijóo et al., 2010). A. B. Figura 2. A) Níveis médios de tióis totais nos grupos que receberam soro fisiológico (controle), e MIA. B) Valores médios dos níveis de malondialdeído (MDA) através do ensaio de TBARS, nos grupos que receberam soro fisiológico (controle), e MIA. Sendo **p<0,01, significante estatisticamente..

(6) Com relação à peroxidação lipídica, através do teste TBARS foi possível observar que o grupo MIA 1,5mg obteve uma diferença significativa quando comparado ao grupo controle. Os resultados foram, para o grupo controle de 1,746±0,1386 molMDA/mg e para o grupo MIA 1,5mg os resultados foram de 2,462±0,1632 molMDA/mg (Figura 2B). Esses dados demonstram que o grupo MIA 1,5mg provoca maior oxidação lipídica nesse modelo, sugerindo lesões teciduais maiores devido ao aumento de radicais livres presentes nas estruturas da articulação do joelho desses animais (Ashkavand et al., 2012; Adeyemi e Olayaki, 2017). 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS O MIA, nas diferentes doses, induziu a lesão tecidual acarretando o aumento da sensibilidade mecânica, caracterizado pela presença de um quadro álgico intenso, demonstrado pela avaliação da sensibilidade mecânica. Na dose mais elevada de MIA (1,5mg), observou-se uma elevação dos níveis de malondialdeído, sugerindo lesões maiores nas estruturas do joelho, por um possível aumento do stress oxidativo, que é caracterizado por um aumento de radicais livres. 5. REFERÊNCIAS ADEYEMI, W.J.; OLAYAKI, L. A. Effects of single or combined administration of salmon calcitonin and omega-3 fatty acids versus diclofenac sodium in sodium monoiodoacetate-induced knee osteoarthritis in male Wistar rats. J Basic Clin Physiol Pharmacol. 2017 pii: /j/jbcpp.ahead-of-print/jbcpp-2017-0032/jbcpp-20170032.xml. doi: 10.1515/jbcpp-2017-0032. ASHKAVAND, Z.; MALEKINEJAD, H.; AMNIATTALAB, A.; REZAEI-GOLMISHEH, A.; VISHWANATH, B.S. Silymarin potentiates the anti-inflammatory effects of Celecoxib on chemically induced osteoarthritis in rats. Phytomedicine. v. 19, n. 13, p.1200-5, 2012. BARVE, R.A.; MINNERLY, J.C.; WEISS, D.J.; MEYER, D.M.; AGUIAR, D.J.; SULLIVAN, P.M.; WEINRICH, S.L.; HEAD, R.D. Transcriptional profiling and pathway analysis of monosodium iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats: relevance to human disease. Osteoarthritis and Cartilage. v. 15, n.10, p. 1190±1198, 2007. BOVE, S.E.; CALCATERRA, S.L.; BROOKER, R.M.; HUBER, C.M.; GUZMAN, R.E., JUNEAU, P.L.; SCHRIER, D.J.; KILGORE, K.S. Weight bearing as a measure of disease progression and efficacy of anti-inflammatory compounds in a model of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. v. 11, n.11, p.821-30, 2003. CHAPLAN, S.R.; BACH, F.W. POGREL, J.W.; CHUNG, J.M.; YAKSH, T.L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. v. 53, n. 1, p. 55-63, 1994. CIALDAI, C.; GIULIANI, S.; VALENTI, C.; TRAMONTANA. M.; MAGGI, C.A. Comparison between oral and intra-articular antinociceptive effect of dexketoprofen and tramadol combination in monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats. European Journal of Pharmacology. v. 714, n. 1-3, p. 346±351, 2013..

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