CAPITULO 6
Crecimiento microbiano
Los filtros de membrana se utilizan en el recuento de microorganismos. Este filtro ha sido utilizado para determinar el número de unidades formadoras de colonias;
aparecen coloreadas gracias al indicador de pH empleado,
facilitándose su recuento.
índice
6.1 Curva de crecimiento 119 Fase de latericia (Lag) 119 Fase exponencial 120 Fase estacionaria 121 Fase de muerte 121 Expresión matemática del crecimiento 121
6.2 Determinación del crecimiento microbiano 124
Determinación del número de células 124
Determinación de la masa celular 125 6.3 Cultivo continuo de
microorganismos 127 Quimiostato 127 Turbidostato 128 6.4 Influencia de los factores
ambientales en el crecimiento 128
Solutos y actividad del agua 128
pH 131 Temperatura 132
Concentración de oxígeno 135 Presión 137 Radiación 137 6.5 Crecimiento microbiano en ambientes naturales 139 Limitación del crecimiento por
factores ambientales 139 Recuento de formas vegetativas viables pero no cultivables de procariotas 140 Quorum sensing y poblaciones microbianas 141
6.1 Curva de crecimiento 119
Conceptos
1. El crecimiento de un microorganismo se define como el aumento de sus componentes celulares, que puede tener como resultado un incremento de su (amaño o del número de su población, o de ambos.
2. Cuando los microorganismos crecen en un sistema cerrado, el crecimiento de la población permanece en fase exponencial durante tan sólo unas pocas generaciones, pasando a una fase estacionaria debido a factores como la limitación de nutrientes y la acumulación de residuos. En un sistema abierto, donde se renuevan continuamente los nutrientes y se eliminan los residuos, la fase exponencial puede mantenerse durante períodos largos.
3. Se pueden emplear diversas técnicas para estudiar el crecimiento microbiano, midiendo los cambios observados en el número total de células, la población de microorganismos viables o la masa celular.
4. La disponibilidad de agua, el pH, la temperatura, la concentración de oxígeno, la presión atmosférica, la radiación y muchos otros factores ambientales influyen sobre el crecimiento microbiano. Sin embargo, muchos microorganismos y, en particular, las bacterias, han conseguido adaptarse y desarrollarse en condiciones ambientales extremas que destruirían a la mayoría de los organismos superiores.
5. En el entorno natural, a menudo el crecimiento se ve severamente limitado por los nutrientes disponibles y otros muchos factores ambientales.
6. Las bacterias se pueden comunicar entre sí y conducirse de una forma cooperativa mediado por señales dependientes de la densidad de población.
n el Capítulo 5 se ha hecho hincapié en la necesidad que tienen los microorganismos de disponer de una fuente de energía y de materias primas esenciales para elaborar los componentes celulares. Todos los microor- ganismos necesitan carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y diversos minerales; muchos precisan tam- bién uno o más factores de crecimiento especiales. La célula capta estas sustancias mediante procesos de transporte a tra- vés de membrana, siendo los más importantes: la difusión facilitada, el transporte activo y la translocación de grupo.
Las células eucariotas utilizan también la endocitosis.
Este capítulo tratará más directamente sobre el creci- miento que tiene lugar en presencia de un aporte adecuado de nutrientes. En primer lugar, se describe la naturaleza del crecimiento y las formas de medirlo, para, posteriormente, tratar las técnicas del cultivo continuo. Finalmente, se dis- cutirá la influencia de los factores ambientales sobre el cre- cimiento microbiano.
El crecimiento puede definirse como un incremento en los constituyentes celulares; este crecimiento ocasiona un aumento del número de células en el caso de los microorga- nismos que se multiplican por procesos como gemación y fisión binaria. En el último caso, células individuales se agrandan y dividen para originar dos células hijas de un tamaño aproximadamente igual. Si el microorganismo es
cenocítico —esto es, multinucleado, en el que las divisiones nucleares no se acompañan de divisiones celulares— el cre- cimiento produce un incremento de tamaño, pero no del número de células. No suele ser conveniente investigar el crecimiento y la multiplicación de microorganismos indivi- duales debido a su pequeño tamaño. En consecuencia, los microbiólogos, cuando estudian el crecimiento, señalan nor- malmente los cambios observados en el número total de la población. Ciclo celular (pp. 91; 307-308).
6.1 Curva de crecimiento
El crecimiento de una población microbiana se estudia ana- lizando la curva de crecimiento de un cultivo microbiano.
Cuando los microorganismos se cultivan en un medio líqui- do, normalmente se trata de un cultivo discontinuo o en sis- tema cerrado —esto es, se incuban en un tubo de ensayo cerrado al que no se añade más cantidad de medio que la ini- cial—; en consecuencia, las concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos aumentan. Se puede represen- tar el crecimiento de los microorganismos que se multipli- can por fisión binaria como el logaritmo del número de célu- las frente al tiempo de incubación. La curva resultante tiene cuatro fases diferentes (Figura 6.1).
Fase de latencia (lag)
Cuando se introducen microorganismos en un medio de cul- tivo fresco, normalmente no se produce un aumento inme- diato del número de células o de masa y, por ello, este perío- do se denomina fase de latencia (lag). Aunque la división celular no se produce inmediatamente y no hay un incre- mento neto de masa, es un proceso activo, la célula está sin- tetizando nuevos componentes. Una fase de latencia previa
Tiempo *-
Figura 6.1 Curva de crecimiento microbiano en un sistema
cerrado. Las cuatro fases están identificadas en esta curva y descritas en el texto.
E
120
al comienzo de la división celular puede ser necesaria por diversas razones. Las células pueden ser viejas y poseer can- tidades reducidas de ATP, cofactores esenciales o de riboso- mas; estas sustancias deben sintetizarse antes de que se ini- cie el crecimiento. El medio puede ser diferente al anterior donde crecían los microorganismos; en este caso, necesitará nuevas enzimas para usar esos otros nuevos nutrientes. Por último, también es posible que los microorganismos se hayan alterado y necesiten un tiempo de recuperación. Cual- quiera que sea el motivo, durante la fase de latencia las célu- las se equipan de nuevo, replican su DNA, comienzan a incrementar su masa y por último, se dividen.
La duración de la fase de latencia varía considerable- mente según el estado de los microorganismos y la naturale- za del medio. Esta fase puede ser bastante larga si el inoculo procede de un cultivo viejo o de uno que haya sido refrigera- do. La inoculación de un cultivo en otro químicamente dife- rente resulta también en una fase de latencia mayor. En este mismo sentido, cuando se transfiere un cultivo en fase de crecimiento exponencial a un medio nuevo de la misma composición, la fase de latencia se acorta o no se produce.
Fase exponencial
Durante la fase exponencial o logarítmica (log), los micro- organismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo posi- ble, en función de su potencial genético, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; esto es, los micro- organismos se duplican en número a intervalos regulares.
No existe sincronización, cada célula se divide en un momento ligeramente diferente del resto, por ello, la curva de crecimiento aumenta suavemente, en lugar de realizar saltos discretos (Figura 6.1). Durante esta fase, la población es más uniforme, química y fisiológicamente; por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan normalmente en estudios bioquímicos y fisiológicos.
El crecimiento exponencial es un crecimiento equili- brado. Es decir, todos los constituyentes celulares se produ-
cen a una velocidad constante, unos respecto de otros. Si se modifican las concentraciones de nutrientes o las condicio- nes ambientales, se origina un crecimiento desequilibrado.
Se denomina así porque las velocidades de síntesis de los componentes celulares varían entre sí, hasta que se alcanza un nuevo estado de equilibrio. Esta respuesta se observa fácilmente en un experimento en el que se inoculan bacte- rias desde un medio pobre en nutrientes a otro más rico (shift-up). Las células, en primer lugar, producen nuevos ribosomas para aumentar su capacidad de síntesis de proteí- nas. Esta fase se continúa con un obvio incremento en la concentración de proteínas y síntesis de DNA. Finalmente, tiene lugar el aumento esperado de la velocidad de multipli- cación. Síntesis de proteínas y DNA (secciones 11.3 y 12.2).
También se produce un crecimiento desequilibrado cuando se pasa una población bacteriana de un medio rico en nutrientes a otro más pobre (shift-dowrí). En el medio rico de origen, los microorganismos probablemente habrán obtenido directamente del medio muchos de los componen- tes celulares esenciales. Cuando se cambian a un medio ina- propiado nutricionalmente, necesitan tiempo para elaborar las enzimas que se precisan para realizar la biosíntesis de los nutrientes no disponibles. En consecuencia, la división celu- lar y la replicación del DNA continúan después de la trans- ferencia entre medios, pero la síntesis neta de proteínas y RNA es más lenta. Las células disminuyen de tamaño y modifican su metabolismo hasta que sean capaces de crecer de nuevo; se reanuda el crecimiento equilibrado y el cultivo entra en la fase logarítmica. Regulación de la síntesis de los ácidos nucleicos (pp. 296-305).
Estos dos tipos de experimentos {shift-up y shift-dowrí) demuestran que el crecimiento microbiano se encuentra bajo un control preciso y coordinado, respondiendo rápidamente a cambios nutricionales y en las condiciones ambientales.
Cuando el crecimiento microbiano está limitado por la baja concentración de un nutriente esencial, el crecimiento neto final o rendimiento celular aumenta con la cantidad ini- cial de dicho nutriente limitante (Figura 6.2a). Éste es el fun- damento de los ensayos microbiológicos para cuantificar vitaminas y otros factores de crecimiento. La velocidad de
Figura 6.2 Concentración de nutriente y crecimiento, (a) Efecto de los cambios en la concentración de un nutriente limitante sobre el rendimiento celular. A una concentración suficientemente alta, el rendimiento se estaciona, (b) Efecto sobre la tasa de crecimiento.
6.1 Curva de crecimiento 121
crecimiento también aumenta con la concentración de nutrientes (Figura 6.2b), aunque de forma hiperbólica, muy semejante a la observada con muchas enzimas {véase la Figu- ra 8.17). La forma de la curva parece reflejar la tasa de inte- racción de los nutrientes con las proteínas transportadoras microbianas. Con niveles suficientemente altos de nutrientes, los sistemas transportadores estarán saturados, por lo que la tasa de crecimiento no aumentará a pesar de incrementarse la concentración de nutrientes. Ensayos microbiológicos (p. 103);
Sistemas de transporte de nutrientes (pp. 104-109).
Fase estacionaria
Finalmente, el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento se hace horizontal (Figura 6.1). Las bacterias llegan normalmente a la fase estacionaria cuando la con- centración es de, aproximadamente, 109 células por mL.
Otros microorganismos no alcanzan normalmente esta den- sidad de población; los cultivos de protozoos y algas no sue- len sobrepasar concentraciones de 106 células por mL. El tamaño final de la población depende, por supuesto, de la disponibilidad de nutrientes y otros factores, así como del tipo de microorganismo que se cultive. En la fase estaciona- ria, el número total de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser el resultado del equilibrio entre la división y la muerte de las células o, simplemente, que la población deje de dividirse, aunque siga metabólica- mente activa.
Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias razones. Un factor obvio es la limitación de nutrientes; si se reduce drásticamente la concentración de un nutriente esencial, la población crecerá muy lentamente. Los organismos aerobios están limitados a menudo por la dispo- nibilidad de O2. El oxígeno no es muy soluble y puede redu- cirse tan rápidamente que sólo la superficie del cultivo tenga una concentración de O2 adecuada para el crecimiento. En este caso, las células situadas por debajo de la superficie no podrán crecer, salvo que el cultivo se agite o airee de otra forma. El crecimiento de una población puede también cesar debido a la acumulación de productos residuales tóxicos.
Parece que este factor limita el crecimiento de muchos culti- vos anaerobios (cultivos que crecen en ausencia de O2). Por ejemplo, los estreptococos pueden producir a partir de la fermentación de azúcares altas concentraciones de ácido láctico y otros ácidos orgánicos, que acidificarán su medio, inhibiendo el crecimiento. Finalmente, hay evidencias que indican que el crecimiento puede cesar cuando se alcanza un cierto nivel crítico poblacional. En definitiva, un cultivo está en fase estacionaria como consecuencia de varios factores que actúan conjuntamente.
Como acabamos de ver, las bacterias en un cultivo dis- continuo pueden entrar en fase estacionaria en respuesta al estrés nutricional, hambre. Probablemente, esto ocurre en la naturaleza ya que numerosos ambientes tienen muy bajos niveles de nutrientes. Sin embargo, el hambre puede ser una
experiencia positiva para la bacteria. Algunas responden con cambios morfológicos muy significativos, como la forma- ción de endosporas. La mayoría, simplemente disminuyen su tamaño, normalmente acompañado de una reducción del protoplasto y condensación del nucleoide, y se producen cambios significativos a nivel de la expresión génica y fisio- lógicos. Las bacterias en condiciones de estrés nutricional producen frecuentemente una serie de proteínas del ham- bre, que las hacen mucho más resistentes al daño por dife- rentes mecanismos. Incrementan los puentes cruzados del peptidoglicano y, por consiguiente, la fuerza intrínseca de la pared celular. Se producen proteínas que se unen y protegen al DNA (Dps, DNA-binding proteins from ítarved cells).
Chaperonas protegen a las proteínas de su desnaturalización, además de recuperar el estado nativo de proteínas dañadas.
Como consecuencia de estos y muchos otros mecanismos, las células en condiciones de hambre se vuelven más resis- tentes a la destrucción por el hambre en sí mismo y a otros factores, como compuestos químicos tóxicos, como el cloro.
Estos cambios son tan efectivos que algunas bacterias pue- den sobrevivir en estas condiciones de estrés nutricional durante años. Obviamente, estas consideraciones tienen una enorme implicación práctica en medicina y en la industria.
Hay evidencias de que Salmonella typhimurium y algunos otros patógenos se vuelven más virulentos cuando pasan hambre.
Fase de muerte
Cambios ambientales perjudiciales, como privación de nu- trientes y acumulación de residuos tóxicos, originan la dismi- nución del número de células viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de una población microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase exponencial, es normalmente logarítmica (esto es, una cantidad constante de células muere cada hora). Este modelo se mantiene incluso aunque se observe que el número total de células permanece constante, ya que las células no se Usan inmediatamente des- pués de morir. A menudo, la única forma de decidir si una bacteria es viable consiste en incubarla en un medio fresco;
si no crece ni se multiplica, se considera que está muerta. Es decir, la muerte microbiana se define como la pérdida irre- versible de la capacidad de multiplicarse.
Aunque la mayor parte de una población microbiana normalmente muere de forma logarítmica, la velocidad de mortalidad puede disminuir después de reducirse drástica- mente la población. Esto se debe a la supervivencia prolon- gada de células particularmente resistentes. Por éstas y otras razones, la curva de la fase de muerte puede ser compleja.
Expresión matemática del crecimiento
El conocimiento de la velocidad de crecimiento microbiano durante la fase exponencial es indispensable para los micro-
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biólogos. Los estudios sobre la velocidad de crecimiento contribuyen a la investigación básica en fisiología y ecolo- gía, y a la solución de problemas aplicados industriales. En consecuencia, se van a analizar los aspectos cuantitativos del crecimiento de fase exponencial.
Durante la fase exponencial, cada microorganismo se divide a intervalos constantes. Por ello, la población dupli- cará su número durante un período determinado de tiempo, denominado tiempo de generación o de duplicación. Esta situación puede ilustrarse con un ejemplo sencillo. Suponga- mos que se inocula un tubo de ensayo con una célula que se divide cada 20 minutos (Tabla 6.1). La población será de 2 células después de 20 minutos, de 4 células a los 40 minu- tos, y así sucesivamente. Como la población se duplica en cada generación, el incremento de la población será expo- nencial o logarítmico, igual a 2n, donde n es el número de generaciones (Figura 6.3).
Estas observaciones pueden expresarse en ecuaciones para determinar el tiempo de generación.
La velocidad de crecimiento durante la fase exponencial en un cultivo discontinuo puede expresarse por la constante de
Figura 6.3 Crecimiento microbiano exponencial. En esta figura se han representado gráficamente los datos de la Tabla 6.1 para seis generaciones, en forma lineal (•—•) y logarítmica (■=—°). La curva de crecimiento es exponencial, como muestra la linealidad de la gráfica logarítmica.
velocidad de crecimiento (k). Equivale al número de gene- raciones por unidad de tiempo, expresado a menudo como generaciones por hora.
Tabla 6.1 Ejemplo de crecimiento exponencial
Número Población
Tiempo" de divisiones 2* (No* 2") logio N, 0 0 2" = 1 1 0.000
20 1 2' = 2 2 0.301
40 2 22 = 4 4 0.602 60 3 23 = 8 8 0.903 80 4 2" = 16 16 1.204 100 5 25 = 32 32 1.505 120 6 26 = 64 64 1.806
a El cultivo hipotético comienza con una célula con un tiempo de generación de 20 minutos.
A partir de las fórmulas anteriores se puede calcular el tiem- po que tarda una población en duplicar su número —esto es, el tiempo medio de generación o tiempo medio de duplica- ción (g)—. Si la población se duplica en un tiempo t (t = g), entonces, tras una generación,
6.1 Curva de crecimiento 123
El tiempo medio de generación es la inversa de la constante de la velocidad media de crecimiento.
El tiempo medio de generación (g) puede determinarse directamente a partir de una gráfica semilogarítmica con los datos de la multiplicación (Figura 6.4), y la constante de velocidad de crecimiento se calculará a partir del valor g. El tiempo de generación puede también calcularse directamen- te a partir de las ecuaciones anteriores. Por ejemplo, supon- gamos que una población bacteriana aumenta de 103 a 109 células en 10 horas.
Figura 6.4 Determinación del tiempo de generación. El tiempo de generación puede determinarse a partir de la curva de crecimiento microbiano. Se representan los datos de la población en un papel cuadriculado semilogarítmico, indicando el número de células en el eje logarítmico. Luego, se lee directamente el tiempo de duplicación de la población a partir de la gráfica. También puede representarse en ejes regulares utilizando el logaritmo del número de células frente al tiempo.
Tabla 6.2 Tiempos de generación de algunos microorganismos seleccionados
Temperatura Tiempo de
Microorganismo (°C) generación (horas)
Bacterias
Beneckea natriegens 37 0.16
Escherichia coli 40 0.35
Bacillus subtilis 40 0.43
Staphylococcus aureus 37 0.47
Pseudomonas aeruginosa 37 0.58
Clostridium botulimim 37 0.58
Rhodospirillum rubrum 25 4.6-5.3
Anabaena cyUndrica 25 10.6
Mycobacterium tuberculosis 37 «12
Treponema pallidum 37 33
Algas
Scenedeswus auadricauda 25 5.9
Chlorella pyrenoidosa 25 7.75
Áster ion ella formosa 20 9.6
Euglena gracilis 25 10.9
Ceratium tripas 20 82.8
Protozoos
Tetrahymena geleii 24 2.2-4.2
Leishmania donovani 26 10-12
Paramecium caudatum 26 10.4
Acanthamoeba castellana 30 11-12
Giardia lamblia 37 18
Hongos
Saccharomyces cerevisiae 30 2
Monilinia fructicola 25 30
Los tiempos de generación cambian notablemente según la especie de microorganismo y las condiciones ambientales.
Los valores varían desde menos de 10 minutos (0.17 horas) en algunas bacterias, hasta varios días, en algunos microor- ganismos eucariotas (Tabla 6.2). Los tiempos de generación en la naturaleza suelen ser más largos que en cultivo in vitro.
1. Defina crecimiento. Describa las cuatro fases de la curva de crecimiento en un sistema cerrado y razone las causas y características de cada una de ellas.
2. Defina crecimiento equilibrado, crecimiento desequilibrado, experimento shift-up y experimento shift-down.
3. ¿Cómo afecta el incremento en un nutriente limitante sobre el rendimiento celular y la tasa de crecimiento?
4. ¿Qué son tiempo de generación o duplicación, y constante de velocidad media de crecimiento? ¿Cómo pueden deducirse a partir de datos de crecimiento?
124
6.2 Determinación del crecimiento microbiano
Existen muchas formas de cuantificar el crecimiento micro- biano para determinar la velocidad de crecimiento y el tiempo de generación. Se pueden medir tanto la masa como el número de células de la población, ya que el crecimiento implica un incremento de ambos. A continuación, se anali- zan brevemente las técnicas más comúnmente empleadas para medir el crecimiento, y se exponen las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas. No siempre una deter- minada técnica es la mejor, dependerá de cada situación experimental.
Determinación del número de células
La forma más obvia de determinar el número de células microbianas es por recuento directo. La utilización de una cámara de recuento es fácil, económica y relativamente rápi- da; ofrece también información acerca del tamaño y la mor- fología de los microorganismos. Las cámaras de Petroff- Hausser se pueden emplear para contar procariotas; los hemocitómetros pueden utilizarse para ambos, procariotas y eucariotas. Para facilitar el recuento de microorganismos procariotas en estas cámaras, éstos deben teñirse, o bien, emplear un microscopio de contraste de fases o de fluores- cencia. Estos portaobjetos especialmente diseñados tienen cámaras tipo rejilla, excavadas en el fondo de la cámara, con una profundidad conocida (Figura 6.5). Se puede calcular el número de microorganismos en una muestra, a partir del volumen de la cámara y la dilución que se efectuó a la mues- tra. Esta técnica presenta algunos inconvenientes. Debido al pequeño volumen de las microcámaras excavadas, normal- mente 0.001 mL, la concentración de la población microbia- na tiene que ser bastante alta para que el resultado sea repre- sentativo. Es también difícil distinguir entre células vivas y muertas sin el empleo de técnicas especiales.
Los microorganismos de mayor tamaño, como protozoos, algas y levaduras no filamentosas, pueden contarse directa- mente con contadores electrónicos, como el Contador Coul- ter. Este método consiste en hacer pasar una suspensión microbiana a través de un pequeño orifico. Una corriente eléctrica fluye a través del mismo, y los electrodos situados a ambos lados miden su resistencia eléctrica. Cada vez que una célula microbiana atraviesa el orificio, aumenta la resis- tencia eléctrica (o disminuye la conductividad) y se cuenta la célula. El Contador Coulter ofrece resultados precisos con células grandes y se utiliza ampliamente en los laboratorios de los hospitales para el recuento de eritrocitos y leucocitos.
No es tan eficaz para contar bacterias debido, entre otros problemas, a la interferencia con partículas pequeñas de residuos y con la formación de filamentos.
Las cámaras de recuento y los contadores electrónicos permiten contar todas las células, vivas o muertas. Existen también otras técnicas, que son procedimientos específicos
Figura 6.5 Cámara de recuento de Petroff-Hausser. (a) Vista lateral de la cámara, mostrando el cubreobjetos y el espacio entre ambos, ocupado por la suspensión bacteriana en estudio, (b) Vista superior de la cámara. La rejilla se encuentra en el centro del portaobjetos, (c) Vista aumentada de la rejilla. Se cuentan bacterias en varios cuadrados centrales, normalmente a un aumento de x400 a x500. El número medio de bacterias en estos cuadrados sirve para calcular la concentración de células en la muestra original. Como hay 25 cuadrados en un área de 1 mm2, el número total de bacterias en 1 mm de la cámara es (n.° de bacterias/cuadrado) x (25 cuadrados). La cámara tiene una profundidad de 0.02 mm y por ello,
N.° de bacterias/mm3 = (n.° de bacterias/cuadrado)(25 cuadrados)(50) El número de bacterias por cnr (mL) es 10 veces este valor. Por ejemplo, supongamos que el recuento medio por cuadrado es de 28 bacterias:
N.° de bacterias/cm3 = (28 bacterias)(25 cuadrados)(50)(103) = 3.5xlO7
para contar células capaces de crecer y multiplicarse. En la mayoría de estos métodos de recuento, se dispersa una muestra diluida de bacterias u otros microorganismos sobre una superficie de agar sólido. Cada microorganismo o agre- gado de microorganismos desarrolla una colonia individual.
El número original de microorganismos viables en la mués-
6.2 Determinación del crecimiento microbiano 125
tra puede calcularse a partir del número de colonias forma- das y la dilución de la muestra. Por ejemplo, si 1.0 mL de una dilución de 1 x 10~6 produce 150 colonias, la muestra original contendría alrededor de 1.5 x 10* células por mL.
Normalmente, el recuento es más exacto si se utiliza un con- tador especial de colonias. De esta forma, se pueden emple- ar las técnicas de siembra por extensión y en profundidad para determinar el número de microorganismos viables en una muestra.
Las técnicas de siembra en placa son sencillas, sensibles y se utilizan ampliamente para el recuento de bacterias y otros microorganismos en muestras como alimentos, agua y suelo. Sin embargo, existen varios problemas que pueden producir imprecisiones. Es necesario desagregar previamente las agrupaciones de células ya que, de lo contrario, el número de colonias será inferior al esperado. En cualquier caso, como no es posible estar totalmente seguro de que cada colonia proceda de una célula individual, los resultados suelen expresarse en unidades formadoras de colonias (UFC, colony forming unii), en lugar de expresarlo como número de microorganismos. El número de colonias por placa debe ser entre 30 y 300 para que sea un valor estadísti- camente fiable. Igualmente, el recuento no será fiable si el medio con agar empleado no puede mantener el crecimiento de todos los microorganismos viables presentes. El agar caliente que se utiliza en la siembra en profundidad puede dañar o matar células sensibles; por ello, la siembra en placa por extensión ofrece a veces recuentos superiores que con la técnica de siembra en profundidad. Técnicas de siembra en placa por extensión y en profundidad (pp. 112-114).
El número de microorganismos se determina también con frecuencia a partir de colonias que crecen sobre filtros especiales de membrana, que tienen poros de un tamaño lo suficientemente pequeño para retener bacterias. En esta téc- nica, se pasa una muestra a través de un filtro de membra- na (Figura 6.6), luego, el filtro se coloca sobre un medio
con agar y se incuba hasta que cada célula forme una colo- nia individual. Un recuento de colonias permite obtener el número de microorganismos presentes en la muestra filtra- da, y pueden emplearse medios especiales para seleccionar microorganismos específicos (Figura 6.7). Esta técnica es especialmente útil en el análisis de muestras de agua. Aná- lisis de la pureza del agua (pp. 704-707).
Los filtros de membrana se utilizan también para contar bacterias directamente. Primero se filtra la muestra a través de un filtro negro de membrana de policarbonato para crear un fondo oscuro que permita observar objetos fluorescentes.
Luego, se tifien las bacterias con un colorante fluorescente, como naranja de acridina o DAPI, y se observan al micros- copio. Los microorganismos teñidos con naranja de acridina brillan con un color naranja o verde y pueden contarse fácil- mente con un microscopio de epifluorescencia {véase la sec- ción 2.2). Normalmente, los recuentos obtenidos por este método son mucho más elevados que con las técnicas de cultivo ya que algunas de las bacterias están muertas.
Actualmente se dispone de pruebas comerciales que permi- ten contar directamente el número de microorganismos vivos y muertos en una muestra, empleando reactivos fluo- rescentes que marcan diferencialmente las células vivas y las muertas (véase la Figura 2.13d).
Determinación de la masa celular
El crecimiento de una población también supone el aumento de la masa total celular, por ello, las técnicas empleadas para medir los cambios de masa pueden utilizarse para medir el crecimiento. El método más directo consiste en determinar el peso seco microbiano. Se recogen las células que crecen en un medio líquido por centrifugación, se lavan, se secan en estufa y se pesan. Esta técnica es espe- cialmente útil para medir el crecimiento de hongos. Sin
Figura 6.6 Sistema de filtración con membrana. Para retener diferentes tipos de microorganismos se utilizan membranas con diferente tamaño de poro. Posteriormente, los tiempos de incubación variarán dependiendo del medio y del tipo de microorganismo.
Figura 6.7 Colonias sobre filtros de membrana. Muestras filtradas con membrana y cultivadas en diversos medios, (a) Medio estándar de nutrientes para un recuento bacteriano total. Un indicador colorea las colonias de rojo para facilitar el recuento, (b) Medio para coliformes fecales para detectar estos microorganismos que forman colonias azules, (c) Agar m-Endo para detectar E. coli y otros coliformes que producen colonias con un brillo verde, (d) Agar mosto para cultivar levaduras y mohos.
embargo, lleva mucho tiempo y no es muy sensible. Como las bacterias pesan tan poco puede ser necesario centrifu- gar varios cientos de mililitros de cultivo para recoger una cantidad suficiente.
Existen técnicas más sensibles y rápidas que se basan en la capacidad de las células de dispersar la luz que incide sobre ellas. Como el tamaño de las células microbianas en un cultivo puro es casi constante, el grado de dispersión es directamente proporcional a la biomasa celular presente, e indirectamente relacionado con el número de células. Cuan- do la concentración de las bacterias alcanza aproximada- mente 107 células por mL, el medio aparece ligeramente tur- bio. Incrementos posteriores en la concentración producen nuevos incrementos de la turbidez —disminución de la luz transmitida a través del medio—. Se puede medir el grado
de dispersión de la luz con un espectrofotómetro, y, en nive- les de absorbancia pequeños, está casi linealmente relacio- nada con la concentración bacteriana (Figura 6.8). Por tanto, el crecimiento de una población puede medirse fácil- mente espectrofotométricamente, siempre que la población sea lo suficientemente grande para que pueda medirse la tur- bidez.
Si la cantidad de una sustancia determinada es constante en cada célula, la cantidad total de dicho constituyente celu- lar estará directamente relacionada con la masa celular total microbiana. Así, por ejemplo, se puede analizar la cantidad total de proteínas o nitrógeno de una muestra de células lavadas recogidas a partir de un volumen conocido de medio. Un aumento en la población microbiana se reflejará en un incremento en el nivel total de proteínas. De forma
Figura 6.8 Determinación de la turbidez y masa microbiana. Determinación de la masa microbiana por la medida de la absorción de luz. Al aumentar la población y la turbidez, se dispersa más cantidad de luz y aumenta la absorbancia leída en el espectrofotómetro. El contador de este aparato tiene dos escalas. La escala inferior muestra la absorbancia, y la superior indica la transmitancia en porcentaje.
La absorbancia aumenta al disminuir la transmitancia.
6.3 Cultivo continuo de microorganismos 127
similar, se puede utilizar el análisis de clorofila para medir poblaciones de algas, y la cantidad de ATP, para estimar la cantidad de masa microbiana viva.
1. Describa brevemente cada técnica de determinación del número de células en una población microbiana, exponien do sus ventajas e inconvenientes.
2. ¿Por qué los resultados de recuento en placa se deben expresar como unidades formadoras de colonias?
6.3 Cultivo continuo de microorganismos
Hasta ahora se han tratado los sistemas cerrados, denomina- dos cultivos discontinuos, en los que no se renuevan los aportes de nutrientes ni se eliminan los residuos. El creci- miento exponencial dura solamente unas pocas generacio- nes y el cultivo alcanza pronto la fase estacionaria. Sin embargo, es posible cultivar microorganismos en un sistema abierto, en el que se mantengan constantes las condiciones ambientales gracias a un suministro continuo de nutrientes y la retirada de los residuos. Estas condiciones se cumplen en un laboratorio mediante los sistemas de cultivo continuo.
En este tipo de cultivo, se puede mantener una población microbiana en fase de crecimiento exponencial y a una con- centración constante de biomasa durante un período largo de tiempo.
Colector
Figura 6.9 Sistema de cultivo continuo: el quimiostato.
Diagrama esquemático del sistema. El medio fresco contiene una cantidad limitante de un nutriente esencial. La tasa de crecimiento está determinada por la velocidad de flujo del medio ai frasco de cultivo.
Quimiostato
Se utilizan dos clases principales de sistemas de cultivo con- tinuo: 1) quimiostatos, y 2) turbidostatos. Un quimiostato se construye de forma que se alimenta un recipiente de culti- vo con un medio estéril a la misma velocidad con que los microorganismos consumen los nutrientes que contiene (Figura 6.9). El medio de cultivo de un quimiostato contie- ne un nutriente esencial (p. ej., un aminoácido) en cantida- des limitantes. Debido a la presencia de este nutriente limi- tante, tanto el crecimiento como la densidad final celular dependen de las concentraciones del mismo; es decir, la velocidad de crecimiento podrá variarse dependiendo de la velocidad con la que se incorpore nuevo medio en el reci- piente. La velocidad de recambio del nutriente se expresa como velocidad de dilución (D), que equivale a la tasa con la que el medio fluye al recipiente de cultivo en relación al volumen de este recipiente, en donde / es la tasa de flujo (mL/h), y V es el volumen del recipiente (mL).
D=flV
Por ejemplo, si /es 30 mL/h y V, 100 mL, la velocidad de dilución será de 0.30 h"1.
La concentración celular microbiana y el tiempo de generación están relacionados con la velocidad de dilución (Figura 6.10). La densidad de la población microbiana per- manece inalterada a lo largo de un amplio rango de veloci- dades de dilución. El tiempo de generación disminuye (esto es, la velocidad de crecimiento aumenta), al aumentar la velocidad de dilución. El nutriente limitante quedará casi completamente agotado en estas condiciones de equilibrio.
Si la velocidad de dilución aumenta con demasiada rapidez, los microorganismos pueden realmente desaparecer del reci- piente de cultivo antes de que se multipliquen, porque la velocidad de dilución es superior a la velocidad máxima de crecimiento. La concentración de nutriente limitante aumenta a velocidades de dilución elevadas porque hay pocos microorganismos presentes para utilizarlo.
A velocidad de dilución muy baja, un aumento de D causa un incremento tanto de la densidad celular como de la velocidad de crecimiento. Esto se debe al efecto de la con- centración del nutriente sobre la velocidad de crecimiento, a veces denominada relación de Monod (Figura 6.2b). A velocidades de dilución bajas, sólo hay disponible una can- tidad limitada de nutriente. La velocidad de crecimiento aumenta cuando la energía total disponible supera la ener- gía de mantenimiento. Gran parte de la energía disponible debe utilizarse para el mantenimiento celular, no para el
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Figura 6.10 Velocidad de dilución y crecimiento microbiano en un quimiostato. Efectos del cambio en la velocidad de dilución en un quimiostato.
crecimiento ni la multiplicación. A medida que aumenta la velocidad de dilución, aumentan la cantidad de nutrientes y la densidad celular resultante, porque la energía está dis- ponible, tanto para el mantenimiento como para el creci- miento.
Turbidostato
El segundo procedimiento para conseguir cultivos continuos se basa en el empleo de un turbidostato, que tiene una foto- célula para medir la absorbancia o turbidez de un cultivo en el recipiente de cultivo. La velocidad de flujo del medio al recipiente se regula automáticamente para mantener una tur- bidez o densidad celular predeterminada. El turbidostato se diferencia del quimiostato por varias características. La velocidad de dilución en un turbidostato es variable, en lugar de permanecer constante, y el medio de cultivo carece de un factor limitante. Un turbidostato funciona mejor a velocidades de dilución altas; un quimiostato es más estable y eficaz a velocidades de dilución bajas.
Los sistemas de cultivo continuo son muy útiles porque ofrecen un aporte constante de células en fase exponencial, que crecen a una velocidad conocida. Estos sistemas permi- ten el estudio del crecimiento microbiano en niveles muy bajos de nutrientes, concentraciones próximas a las existen- tes en los medios naturales. Estos sistemas son esenciales para la investigación en muchas áreas —p. ej., en estudios sobre reacciones entre especies microbianas en condiciones ambientales similares a las de un lago o charca de agua dulce—. Los sistemas continuos también se utilizan en microbiología de los alimentos e industrial.
1. ¿En qué se diferencia un sistema abierto de uno cerrado o discontinuo?
2. Describa el funcionamiento de los dos sistemas de cultivo continuo, el quimiostato y el turbidostato.
3. ¿Qué es la velocidad de dilución? ¿Qué es la energía de mantenimiento?
6.4 Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento
Como se ha visto anteriormente (pp. 120-121), los microor- ganismos deben ser capaces de responder a variaciones en los niveles de nutrientes y, particularmente, a la limitación en nutrientes. El crecimiento de los microorganismos está influido notablemente por la naturaleza química y física de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambienta- les permitirá controlar el crecimiento microbiano y estudiar la distribución ecológica de los microorganismos.
La habilidad de algunos microorganismos para adaptar- se a ambientes extremos e inhóspitos es realmente extraordi- naria. Los procariotas son virtualmente ubícuotas, se encuentran en cualquier lugar. Muchos habitat donde las bacterias pueden prosperar destruirían a la mayoría del resto de microorganismos. Bacterias como Bacillus infernus pue- den incluso multiplicarse a más de 2.5 km bajo la superficie terrestre, sin oxígeno y a temperaturas próximas a los 60 °C.
Los microorganismos que crecen en condiciones tan extre- mas se suelen denominar extremófilos.
En esta sección revisaremos brevemente cómo afectan al crecimiento microbiano algunos de los más importantes factores ambientales. Un mayor énfasis se pondrá en el efec- to de los solutos y la actividad del agua, pH, temperatura, nivel de oxígeno, presión y radiación. La Tabla 6.3 resume cómo pueden catalogarse los microorganismos según su res- puesta a estos factores.
Solutos y actividad del agua
Una membrana plasmática selectivamente permeable separa el contenido citoplasmático del microorganismo de su ambiente, por ello, alteraciones en la concentración osmóti- ca del medio extracelular podrán afectar incluso a la viabili- dad de los mismos. Si se coloca un microorganismo en una solución hipotónica (con una concentración osmótica infe- rior), entrará agua en la célula causando su estallido, salvo que la propia célula desarrolle alguna estrategia para evitar su entrada. Por ejemplo, la concentración osmótica del cito- plasma puede reducirse gracias a los cuerpos de inclusión (véanse las pp. 52-55). Los procariotas también pueden con- tener canales sensibles a la presión osmótica, que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno se vuelve más baja que la del citoplasma.
6.4 Influencia de los factores ambientales sobre el crecimiento 129
Factor y término descriptor Definición Microorganismos representativos
Solutos y actividad del agua Osmotolerunte
Halófilo
Capaz de crecer en un amplkio rango de actividad del agua o presión osmótica Requiere altas concentraciones de cloruro sódico
para crecer, normalmente por encima de 0.2 M
Staphylococcus aureus, Saccharomyces rouxii Halobacterhtm, Dunaliella, Ectothiorhodospira
pH Acidófilo Neutrófilo Alcalófilo Temperatura
Psicrófilo Psicrotrofo Mesófilo Termófilo Hipertermófilo Concentración de oxígeno
Aerobio obligado Anaerobio facultativo Anaerobio aerotolerante Anaerobio obligado Microaerófilo Presión
Barófilo
Óptimo de crecimiento entre pH 0 y 5.5 Óptimo de crecimiento entre pH 5.5 y 8.0 Óptimo de crecimiento entre pH 8.5 y 1 1.5
Crece bien a 0 °C y tiene una temperatura óptima de 15 °C o inferior Puede crecer a 0-7
°C; óptima entre 20
y 30 °C; máxima alrededor de 35 °C Temperartura óptima alrededor de 20-45 °C Puede crecer a 55 °C o superior; la óptima a menudo entre 55 y 65 °C Temperatura óptima entre 80 y 113 °C
Completamente dependiente del O2 atmosférico para crecer No requiere O2 para crecer, pero crece mejor en su
presencia Crece igualmente bien en presencia como en
ausencia de O2
No tolera el O2 y muere en su presencia Requiere niveles de O2 por debajo de 2-10 % para
crecer, y es dañado por el O2 atmosférico (20 %) Crece más rápido a altas presiones hidrostáticas
Sulfolobus, Picrophilus, Ferroplasma, Acontium, Cyanidium caldarium
Escherichia, Euglena, Paramecium Badilas alcalophilus. N a I ronobacíeri um
Badilas psychrophilus, Chlamydomonas nivalis Listeria monocytogenes, P seudomonas fluorescens
Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis Badilas stearothethermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium
caldarium, Chaetomium thermophile Sulfoliibiis, Pyrococcus, Pyrodictium
Micrococcus luteus, Pseudomonas, Mycobacterium; la mayoría de las algas, hongos y protozoos Escherichia,
Enlerococcus, Saccharomyces cerevisiae Strcptococcus pyogenes
Clostridium, Bacteroides, Methanobacterium, Trepomonas agilis Campylobacler, Spirillum volutans, Treponema pallidum
Photobacterium pmfundum, Shewanella benlhica, Methanococais jannaschü
La mayoría de las bacterias, algas y hongos poseen una pared celular rígida que mantiene la forma e integridad celu- lar, pero cuando se colocan microorganismos con pared celular rígida en ambientes hipertónicos, disminuye el nivel de agua celular, la célula se contrae, y la membrana plasmá- tica se separa de la pared celular. Este proceso se denomina plasmolisis. Esta situación deshidrata la célula y puede dañar la membrana plasmática; normalmente, la célula no muere, aunque es inactiva metabólicamente y deja de crecer.
Muchos microorganismos conservan la concentración osmótica de su protoplasma por encima del correspondiente a su habitat utilizando solutos compatibles, de manera que aunque estén en medios teóricamente hipotónicos, no entra agua a la célula. Estos solutos son compatibles con el metabolismo y el crecimiento aun cuando se encuentren en concentraciones intracelulares elevadas. Así, por ejemplo, la mayoría de las bacterias eleva su concentración osmóti- ca interna mediante la síntesis o captación de colina, betaí- na, prolina, ácido glutámico y otros aminoácidos; también participan, en cierto grado, cantidades elevadas de ion
potasio. Con el mismo objetivo, algas y hongos utilizan sacarosa y polioles —p. ej., arabitol, glicerol y manitol—.
Los polioles y aminoácidos son solutos ideales para esta función porque normalmente no alteran la estructura y fun- ción de las enzimas. Algunas bacterias como Halobacte- rium salinarium elevan su concentración osmótica con iones potasio (también aumentan los iones sodio, pero no tanto). De hecho, las enzimas de Halobacterium son tan peculiares que requieren concentraciones de sal elevadas para poder desarrollar una actividad normal {véase la sec- ción 20.3). Como los protozoos no tienen pared celular, deben utilizar vacuolas contráctiles (véase la Figura 27.3) para eliminar el exceso de agua cuando habitan en entornos hipotónicos. Osmosis y función protectora de la pared celular (p. 64).
La cantidad de agua disponible para el microorganismo se puede reducir debido a las interacciones de la misma con moléculas de soluto (efecto osmótico) o por adsorción a las superficies de sólidos (efecto matricial). Como la concentra- ción osmótica de un habitat tiene efectos tan marcados sobre
Respuestas microbianas a factores ambientales
aumentar simplemente las concentraciones intracelulares de solutos, sistema utilizado por la mayoría de los microorga- nismos osmotolerantes. Estos halófilos extremos acumulan grandes cantidades de potasio para mantener hipertónico el ambiente intracelular; la concentración interna de potasio puede llegar a un valor de 4 a 7 M. Las enzimas, los riboso- mas y las proteínas transportadoras precisan niveles eleva- dos de potasio para ser estables y activas. Además, la mem- brana plasmática y la pared celular de Halobacterium se estabilizan por concentraciones elevadas de ion sodio. Si la concentración de sodio disminuye demasiado, la pared y la membrana plasmática se desintegran. Las bacterias halófilas extremas se han adaptado con éxito a condiciones ambien- tales que destruirían a la mayoría de los organismos. Duran- te el proceso, se han especializado tanto que han perdido la flexibilidad ecológica y pueden desarrollarse solamente en unos muy restringidos habitat extremos. Halobacterias (sec- ción 20.3).
1. ¿Cómo se adaptan los microorganismos a ambientes hipotónicos e hipertónicos? ¿Qué es la plasmólisis?
2. Defina actividad del agua y describa brevemente cómo puede determinarse.
3. ¿Por qué es difícil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
4. ¿Qué son microorganismos halófilos, y por qué los miembros de Halobacterium precisan iones de sodio y potasio.
PH
El pH es una medida de la actividad de los iones de hidróge- no de una solución, que se define como el valor negativo del logaritmo de la concentración de iones de hidrógeno (expre- sada en moles).
La escala de pH se extiende de 0.0 (1.0 M H+) a 14.0 (1.0 x 10~14 M H+), representando cada unidad de pH un cambio de 10 veces en la concentración de iones de hidrógeno. La Figura 6.11 muestra cómo los habitat en que crecen los microorganismos varían ampliamente —desde valores de pH entre 1 y 2, en el extremo ácido, hasta pH entre 9 y 10, en algunos lagos y suelos alcalinos.
No resulta sorprendente que el pH afecte intensamente al crecimiento microbiano. Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo. Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5; los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0; y los alcalófi- los prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5. Los alcalófilos extremos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento de 10 o más. En general, cada grupo microbiano posee preferen-
cias de pH características. La mayoría de las bacterias y pro- tozoos son neutrófilos. La mayor parte de los hongos prefie- ren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6;
las algas prefieren también una ligera acidez. Existen nume- rosas excepciones a esta norma. Por ejemplo, el alga Cyani- dium caldarium y el archaeon Sulfolobus acidocaldarius habitan comúnmente aguas termales acidas; ambos crecen bien a pH de 1 a 3 y a temperaturas elevadas. Las archaea Ferroplasma acidavmanus y Picrophilus oshimae pueden multiplicarse a pH 0, o muy próximos a este nivel.
Aunque los microorganismos crecen a menudo en medios con un amplio rango de pH, su tolerancia tiene un límite. Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática o inhi- biendo la actividad de las enzimas y las proteínas transporta- doras. En general, los procariotas mueren si el pH interno desciende por debajo de 5.0 a 5.5. Los cambios en el pH externo pueden modificar también la ionización de las molé- culas de nutrientes, disminuyendo, por ello, su disponibili- dad para el organismo.
Se han propuesto diversos mecanismos para el manteni- miento del pH neutro en el citoplasma. La membrana plas- mática puede ser relativamente permeable a los protones.
Parece ser que los neutrófilos intercambian protones por potasio mediante un sistema de transporte antiporte (p. 107).
Acidófilos extremos mantienen su pH interno próximo a la neutralidad, intercambiando protones externos por iones de sodio internos. También los búferes internos pueden contri- buir a la homeostasis del pH.
Los microorganismos tienen que adaptase a menudo a cambios ambientales de pH para sobrevivir. En las bacterias, los sistemas antiporte potasio/protón y sodio/protón corri- gen probablemente pequeñas variaciones de pH. Si el pH se vuelve demasiado ácido, se ponen en marcha otros mecanis- mos. Cuando el pH baja hasta valores de 5.5 a 6.0, Salmone- lla typhimurium y E. coli sintetizan un grupo de nuevas pro- teínas, como parte de la denominada respuesta de tolerancia a un medio ácido. La ATPasa translocadora de protones con- tribuye a esta respuesta protectora, produciendo más ATP o bombeando protones fuera de la célula. Si el pH externo dis- minuye a valores de 4.5 o inferiores, se sintetizan chapero- nas como las proteínas de choque ácido o de choque térmico {véanse las pp. 293-294). Probablemente, estas sustancias eviten la desnaturalización de las proteínas y faciliten de nuevo el plegamiento de las desnaturalizadas.
Los microorganismos cambian con frecuencia el pH de su propio habitat, al producir productos residuales metabóli- cos ácidos o básicos. Los microorganismos fermentadores producen ácidos orgánicos a partir de hidratos de carbono, mientras que los quimiolitotrofos como Thiobacillus oxidan compuestos reducidos de azufre a ácido sulfúrico. Otros alcalinizan su ambiente produciendo amonio mediante la degradación de los aminoácidos. Fermentaciones microbia- nas (pp. 192-194); Bacterias oxidantes del azufre (pp. 537-539).
En los medios de cultivo suelen añadirse búferes para evitar la inhibición del crecimiento por cambios grandes de
132 Capítulo 6 Crecimiento microbiano
Ejemplos de ambientes
Ácido nítrico concentrado
Contenido gástrico, aguas termales acidas Zumo de limón Drenaje ácido de minas
Vinagre, gingerale Pina
Tomate, zumo de naranja Suelo muy ácido Queso, repollo Pan
Carne de vacuno, pollo Agua de lluvia Leche Saliva Agua pura Sangre Agua de mar
Suelo muy alcalino Lagos alcalinos Jabón
Amoníaco de uso doméstico
Solución saturada de hldróxido calcico Lejía Desatascador
Mayor alcalinidad
Figura 6.11 Escala de pH. Escala de pH y algunos ejemplos de sustancias con diferentes valores de pH. Se muestran ejemplos de microorganismos a los pH óptimos indicados.
pH. El fosfato es el búfer más común y un buen ejemplo de amortiguación mediante un ácido débil (H2PO4~) y su base conjugada
(HPO42~).
H+ + HPO42 OH- +H2PO4"
Si se añaden protones a la mezcla, se combinan con la sal formada para producir un ácido débil. Se previene un aumento de alcalinidad porque el ácido débil neutraliza los iones hidroxilos, al donar protones para formar agua. Los péptidos y los aminoácidos en medios complejos producen también un fuerte efecto de amortiguación.
Temperatura
La temperatura ambiental afecta intensamente a los micro- organismos, así como al resto de organismos. De hecho, los
microorganismos son especialmente susceptibles porque son generalmente unicelulares y su temperatura varía con la ambiental. Por estas razones, la temperatura de la célula microbiana refleja directamente la de su ambiente. Las reac- ciones catalíticas son las más vulnerables, ya que, el factor que más influye sobre el efecto de la temperatura en el creci- miento es la termosensibilidad de las enzimas. En condicio- nes por debajo de la temperatura óptima, un aumento en la temperatura eleva la velocidad de crecimiento, porque la velocidad de una reacción catalizada por enzimas, como la de cualquier reacción química, casi se duplica por cada aumento de temperatura de 10°C. Como la velocidad de cada reacción aumenta, el metabolismo en general es más activo a temperaturas altas y el microorganismo crece más rápidamente. A partir de cierto punto (temperatura óptima), un mayor aumento disminuye la velocidad de crecimiento, y temperaturas más altas llegarán a ser letales. Las altas tem- peraturas ocasionan daños a los microorganismos al desna- turalizar las enzimas, las proteínas transportadoras, y otras
Ejemplos microbianos
Ferroplasma Picrophilus oshimae Dunaliella acidophila Cyanidium caldarium Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius
Physarum polycephalum Acanthamoeba castellana Lactobacillus acidophilus E. cotí, Pseudomonas aeruginosa Euglena gracilis, Paramecium bursaria Staphylococcus aureus
Nltrosomonas spp.
Mycrocystis aeruginosa Bacillus alcalophilus
—> H2PO4"
HPO42 + HOH
133
Temperatura
Figura 6.12 Temperatura y crecimiento. Efecto de la temperatura en la velocidad de crecimiento.
proteínas. El calor también deteriora las membranas micro- bianas; la doble capa lipídica puede fundirse y desintegrarse.
Por ello, a pesar de que las enzimas funcionales actúan más rápidamente a temperaturas elevadas, el microorganismo puede alterarse hasta el punto de inhibirse su crecimiento, porque el daño no puede repararse. A muy bajas temperatu- ras, las membranas gelifican y las enzimas no operan a gran velocidad. En definitiva, cuando los organismos están por encima de la temperatura óptima, tanto la estructura como la función celular están afectadas. Si las temperaturas son muy bajas, la función se ve afectada pero no necesariamente su
estructura ni la composición química. Dependencia de la actividad enzimática respecto de la temperatura (pp. 174-175).
Debido a estos efectos opuestos de la temperatura, el crecimiento microbiano tiene una dependencia bastante característica de la temperatura, existiendo temperaturas cardinales distintivas —temperaturas mínima, óptima y máxima de crecimiento— (Figura 6.12). Aunque la forma de la curva de dependencia de la temperatura puede variar, la óptima está siempre más próxima a la máxima que a la mínima. Las temperaturas cardinales de una especie en par- ticular no son invariables, sino que dependen de otros facto- res ambientales, como el pH y los nutrientes disponibles.
Por ejemplo, Crithidia fasciculata, protozoo flagelado que habita en el intestino de los mosquitos, crecerá en un medio simple entre 22 y 27 °C. Sin embargo, no puede cultivarse a temperaturas de entre 33 y 34 °C, sin añadir metales, amino- ácidos, vitaminas y lípidos.
Las temperaturas cardinales varían ampliamente entre microorganismos (Tabla 6.5). Las óptimas se encuentran normalmente en un rango de 0 °C hasta un valor tan alto como 75 °C, mientras que el crecimiento microbiano se pro- duce en un rango de -20 °C hasta más de 100 °C. El princi- pal factor que determina este rango de crecimiento parece ser el agua, ya que, incluso a las temperaturas más extremas, los microorganismos necesitan agua líquida para crecer. La temperatura de crecimiento de un microorganismo determi- nado abarca normalmente un margen de 30°. Algunas espe- cies (p. ej., Neisseria gonorrhoeae) tienen un rango peque- ño; otras, como Enterococcus faecalis, crecen en un amplio
Vida por encima de 100 °C
asta hace poco, la temperatura más alta publicada de cre- cimiento bacteriano era de 105 °C. De hecho, se creía que el límite superior de temperatura para la vida se encontraba en aproximadamente 100 °C, punto de ebullición del agua. En la actualidad, se han descrito bacterias que crecen en chimeneas sulfurosas o «black smokers», situadas a lo largo de grietas y estrías del suelo oceánico, que expulsan agua bentónica rica en sulfuro, con. temperaturas muy altas, por encima de 350 °C (véase la figura del recuadro). Se ha demostrado que estas bacterias pueden crecer y multiplicarse a 113 °C. Es posi- ble que las bacterias puedan crecer a temperaturas superiores. La presión existente en este habitat es suficiente para mantener al agua en estado líquido (a 265 atm, el agua de mar no hierve hasta los 460 °C).
Las consecuencias de este descubrimiento son numerosas.
Las proteínas, las membranas y los ácidos nucleicos de estas bacterias son extremadamente termoestables y constituyen un tema idóneo para estudiar los mecanismos de estabilización de las macromoléculas y membranas. En el futuro, puede ser posi- ble diseñar enzimas que puedan actuar a temperaturas muy altas.
Algunas enzimas termoestables de estas bacterias pueden tener
usos industriales y científicos importantes. Por ejemplo, la Taq polimerasa del termófilo Thermus aquaticus se utiliza con mucha frecuencia en la PCR {véanse las pp. 349-352).