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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN MAESTRIA EN CIENCIAS DE LA SALUD
IDENTIFICACIÓN DEL RECEPTOR SV2 ISOFORMA A EN CANCER DE MAMA IN VITRO E IN VIVO
TESIS QUE PARA OBTENER EL DIPLOMA DE MAESTRIA EN CIENCIAS DE LA SALUD
PRESENTA:
CINDY RODRÍGUEZ BANDALA
DIRECTORES DE TESIS DRA. MARICRUZ ANAYA RUIZ DR. ELEAZAR LARA PADILLA
ASESOR:
D. en C. Esaú Floriano Sánchez
MÉXICO, D. F. AGOSTO DE 2010
2 ÍNDICE
Página
Agradecimiento ……… 3
Dedicatoria ……… 4
Acta de revisión ……… 5
Glosario ……… 6
Relación de Figuras, Tablas y Gráficas……… 8
Resumen ……… 9
Summary ……… 11
Introducción ……… 13
Antecedentes ……… 15
Justificación ……… 33
Objetivo ……… 34
Material y Métodos ……… 35
Resultados ……… 41
Discusión ……… 54
Conclusiones ……… 57
Bibliografía ……… 58
3
4
5 GLOSARIO
• Transdiferenciación
En cáncer, se le considera a la capacidad de una célula tumoral de presentar programas de diferenciación aberrante tanto morfológica como fenotípicamente, expresando marcadores de diferenciación adicionales a los de su tejido original.
• Diferenciación
Es un proceso mediante el cual, tras procesos proliferativos, las células sufren modificaciones dando lugar a una forma y una función determinada durante el desarrollo embrionario o la vida de un organismo pluricelular especializándose en un tipo celular.
• Neoplasia
Neoplasia es una alteración de la proliferación o diferenciación celular, que se manifiesta por la formación de una masa o tumor, se conoce comúnmente como cáncer.
• Metaplasia
En histología, es el cambio de un epitelio maduro por otro que puede tener un parentesco próximo en el caso de células diferenciadas, y remoto en los tejidos embrionarios que tienen naturalmente a diversificar, madurar y especializar sus células.
6
• Hiperplasia
Es el incremento de tamaño de un órgano o de un tejido, debido a que sus células han aumentado en número. Puede ser un proceso fisiológico o patológico.
• Displasia
Es una anormalidad en el aspecto de las células debido a los disturbios en el proceso de la maduración celular. Es conocida también como hiperplasia atípica, se caracteriza por una alteración del desarrollo de las células epiteliales y mesenquimatosas que han experimentado proliferación y alteraciones citológicas atípicas que afectan a la orientación celular dentro de un epitelio, es por tanto, un cambio pre- neoplásico.
• Fenotipo Celular
Es la expresión de los genes, estos patrones caracterizan a una estirpe celular. El fenotipo celular está determinado por su metabolismo, el cual se rige por patrones genéticos determinados y el ambiente que rodea a la célula.
7 RELACIÓN DE FIGURAS, TABLAS Y GRÁFICAS
Página
Gráfica 1 ………. 17
Gráfica 2 ………. 19
Gráfica 3 ………. 20
Gráfica 4 ………. 23
Gráfica 5 ………. 41
Gráfica 6 ……… 47
Gráfica 7 ……… 48
Figura 1 ……… 28
Figura 2 y 3 ……… 29
Figura 4 y 5 ……… 42
Figura 6 ……… 43
Figura 7 y 8 ……… 44
Figura 9 ……… 45
Figura 10 ……… 49
Tabla 1 ……… 46
Tabla 2 ……… 47
Tabla 3 ……… 50
Tabla 4 y 5 ……… 51
Tabla 6 y 7 ……… 52
8 RESUMEN
Introducción. El cáncer de mama es una enfermedad con índices de prevalencia, incidencia y mortalidad elevados en México y en el mundo. A pesar de ser un grave problema de salud pública, todavía no se conocen la totalidad de las modificaciones fenotípicas que sufren las células del tejido mamario que se convierten en tumorales. El propósito de esta investigación fue identificar la presencia del receptor SV2 isoforma A en las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231, MDA-MB-453 y T47D, así como cambios morfológicos de dichas células hacia fenotipo neuroendócrino. Material y métodos. Las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se cultivaron en medio DMEM, la línea T47D con RPMI 1640, y se suplementaron con SFB al 5% con una temperatura de 37 °C y CO2 al 5%. Al día 3 posterior a su tripsinización, las células se observaron con un microscopio invertido NIKON y las imágenes se capturaron con el software Pixera View Finder Pro. Para identificar el receptor SV2A, se utilizaron células bajo dos condiciones experimentales: sin toxina botulínica tipo A y células con toxina. Las células tratadas se incubaron con la toxina (10 U) por 24 hr, se fijaron con paraformaldehido y glutaraldehido y finalmente, la identificación del receptor SV2, se visualizó por inmunohistoquímica utilizando el Kit DAB SUBSTRATE (DakoCytomation). Las células se observaron con un microscopio invertido y la presencia del receptor se analizó con el software Axion Vision LE. La identificación del receptor se realizó en biopsias de pacientes con cáncer de mama, utilizando también la técnica de inmunohistoquímica. Resultados. Las líneas celulares mostraron los siguientes porcentajes de transdiferenciación morfológica: T47D, 4.07%; MDA-MB-231, 2.50%; MDA-MB-453, 1.62%. Los
9 porcentajes de células transdiferenciadas fueron diferentes (p = 0.09) dependiendo de la línea celular. El análisis estadístico se realizó aplicando la prueba no paramétrica de Kruskall Wallis, utilizando el software SPSS.15. Los porcentajes de transdiferenciación según la línea celular se correlacionaron intensamente con los porcentajes de expresión del receptor SV2A en células no tratadas con toxina botulínica (r = 0.953, p = 0.19). Por otro lado, se obtuvo evidencia de un comportamiento diferencial en el porcentaje del receptor entre las líneas celulares estudiadas dependiendo de la condición experimental (p = 0.13). La línea T47D mostró mayor porcentaje del receptor en la condición experimental sin toxina y menor con toxina, siendo similar este comportamiento en la línea MDA-MB-453 aunque con promedios más bajos. Por otro lado, en la línea MDA-MB-231, los porcentajes de la presencia del receptor entre las dos condiciones experimentales tienden a estar muy cercanos entre sí. El análisis estadístico se realizó a través de una prueba ANOVA, utilizando el mismo software. Conclusiones. Las líneas celulares T47D, MDA-MB-453 y MDA-MB- 231 mostraron transdiferenciación morfológica de aspecto neuronal, lo que indica que las células tumorales de mama podrían expresar diferentes marcadores fenotípicos de tipo nervioso, tal y como se ha demostrado en cáncer de colon. El receptor SV2A se identificó por vez primera en las células de cáncer de mama. Su identificación como era de esperarse, disminuyó en aquellas células expuestas a la toxina. Estos resultados abren un campo de estudio que contribuye al conocimiento del proceso tumoral de la glándula mamaria.
Palabras clave: Cáncer de mama, receptor SV2, transdiferenciación.
10 SUMMARY
Background. The breast cancer is a disease with high rates of prevalence, incidence and mortality in Mexico and in the world. Despite being a serious health problem, all the phenotypic changes that suffer the breast tissue cells that develop into tumor remain still unknown. The purpose of this research work was to identify the presence of SV2 isoform A receptor in cell lines of breast cancer: MDA-MB-231, MDA-MB-453 and T47D, as well as morphological changes of such cells towards neuroendocrine phenotype.
Material and methods. The cell lines MDA-MB-231 and MDA-MB-453 were cultured in DMEM medium and the T47D cell line in RPMI 1640. All of them were supplemented with FBS 5% at a temperature of 37 °C and 5% CO2. After of three days the cells were treated with trypsin and then were observed under a Nikon inverted microscope. Their images were captured with the software Pixera View Finder Pro. To identify the SV2A receptor in cells were used two types of experimental treatments: without and with botulinum toxin. The treated cells were incubated with botulinum toxin (10 U) for 24 hr and fixed with paraformaldehyde and glutaraldehyde. Finally, the SV2A receptor was identified by immunohistochemistry, using a DAB kit.
The cells were observed with an inverted microscope and the receptor presence was analyzed with Axion Vision LE software. The SV2A receptor was also identified by immunohistochemistry in patients biopsies with breast cancer. Results. The studied cell lines showed the following percentages of morphological transdifferentiation: T47D, 4.07%; MDA-MB-231, 2.50% and
11 MDA-MB-453, 1.62%. The percentages of transdifferentiated cells were statistically differents (p = 0.09) depending on the cell line. The statistic analysis was realized with the non-parametric test of Kruskall Wallis, using a software SPSS.15. The percentages of cellular transdifferentiation were strongly correlated with the percentages of SV2A receptor expression in not treated cells with botulinum toxin (r = 0.953, p = 0.19). On the other hand, we obtained evidence of differential behavior in the percentage of receptor between the cell lines studied, depending on the experimental condition (p = 0.13). The cell line T47D showed a higher percentage of receptor when was treated without toxin. This behavior was similar in the cell line MDA-MB-453, but with lower averages. Furthermore, in the cell line MDA-MB-231, the percentages of the presence of the receptor between the two experimental conditions tend to be very close. Statistic analysis was realized with an ANOVA test, using the same software. Conclusions. The cell lines T47D, MDA-MB-453 and MDA-MB-231 showed morphological transdiferenciation of neuronal appearance, indicating that breast tumor cells could express different phenotypic of nervous type, as has been demonstrated in colon cancer. In this work, the SV2A receptor was identified by the first time in cells of breast cancer. The SV2A receptor identification was lower in the cells exposed to the botulinum toxin. The obtained results open a field of study that can help to know the molecular process of breast cancer.
Key words: cellular transdifferentiation, botulinum toxin, neuronal phenotype. .
12 INTRODUCCIÓN
El cáncer de la glándula mamaria es la manifestación oncológica más frecuente en mujeres en todo el mundo. En México esta forma de cáncer presenta tasas de mortalidad que van en aumento sin que se conozca con certeza la razón de este incremento. La mortalidad está ligada a los estadios más avanzados de la enfermedad donde se presenta diseminación del cáncer a órganos como pulmón, hígado y hueso (1). En México, el carcinoma de mama (CaMa) se convirtió en la primera causa de muerte por cáncer en mujeres y la segunda causa de muerte por todas las enfermedades en mujeres de 30 a 54 años (2).
En las células tumorales, existen programas de diferenciación aberrantes que modifican su patrón fenotípico, permitiendo que se expresen marcadores específicos de una estirpe celular diferente. Se ha demostrado que en líneas celulares de CaMa se han encontrado marcadores específicos de melanocitos, así como marcadores de linaje de tipo neuronal/glial, indicando que la transdiferenciación aberrante es un fenómeno que se presenta en el cáncer (3).
La proteína de vesícula sináptica-2 (SV2) se ha identificado en vesículas secretoras de células sinápticas y endócrinas durante la exocitosis, la proteína SV2 se expone en la superficie de la célula, permitiendo que diferentes neurotoxinas puedan anclarse y sean internalizadas cuando ocurre el reciclado vesicular (4,5)
El propósito de esta investigación fue identificar la presencia del receptor SV2 en líneas celulares de CaMa T47D, MDA-MB-231 y MDA-MB-453, además
13 de conocer si dichas células tumorales pueden presentar cambios de transdiferenciación hacia fenotipo neuroendócrino. Dicho receptor es importante para la endocitosis de diferentes toxinas bacterianas como la toxina botulínica tipo A en neuronas y próstata.
La investigación se realizó en el centro de investigación Biomédica de Oriente del Instituto Mexicano del Seguro Social, en la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional y en la Escuela Médico Militar de la Universidad del Ejército y la Fuerza Aérea, durante el periodo comprendido de agosto del 2009 a agosto del 2010.
14 ANTECEDENTES
ANTECEDENTES GENERALES
Anatomía de la glándula mamaria.
Los lobulillos están formados por diez a cien acinos, cada cual con su conducto excretor denominado conducto terminal. Los acinos están estructurados por un conjunto de células secretoras que producen la secreción láctea y conforman una cavidad a la cual vierten esta secreción, están rodeados de células mioepiteliales y capilares sanguíneos de singular importancia en el proceso de secreción y eyección de la leche. El sistema de conductos lactíferos que vacía la glándula mamaria es el siguiente: el acino se vacía a través de un conducto terminal, el cual converge con sus congéneres para formar el conducto lobulillar, que recoge la secreción láctea de todos los acinos de un lobulillo. Los conductos lobulillares se reúnen para formar el conducto interlobulillar, que al unirse con otros conductos de éste tipo, forma el conducto lobular o segmentario, de mayor calibre que los anteriores, que se dirige al pezón y antes de llegar a él, bajo la areola mamaria, se dilata formando el seno lactífero, el que se angosta nuevamente al desembocar en el pezón.
Fisiología de la glándula mamaria.
La glándula mamaria sufre diversos cambios a lo largo de la vida de la mujer; durante los ciclos menstruales, durante el embarazo y la lactancia, básicamente debidos a los diferentes niveles de hormonas femeninas. Por todo
15 ello y por su principal función, la mama necesita un gran aporte de oxígeno, función que lleva a cabo una importante red de vasos sanguíneos que trasportan la sangre necesaria a la glándula. Además de estos vasos, la mama tiene una enorme cantidad de vasos linfáticos, los responsables del transporte de la linfa hacia los ganglios linfáticos. La mama esta formada por lóbulos y lobulillos, ductos, tejido conectivo graso, vasos sanguíneos y vasos linfáticos.
Cáncer de Mama.
El cáncer de mama (CaMa) es la proliferación acelerada, desordenada y no controlada de las células de los tejidos de la glándula mamaria que desarrollan mutaciones. Las mutaciones ocurren en los genes que actúan normalmente suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular.
Epidemiología.
A nivel mundial, el CaMa, es el cáncer más común entre las mujeres, registrándose 411,000 muertes al año a causa de esta enfermedad. Éste es el cáncer más prevalente a nivel mundial: en los últimos cinco años hubo 4.4 millones de mujeres con la enfermedad. En 2009 se presentaron 1.35 millones de nuevos casos, que aumentarán a 1.5 millones en 2010. El CaMa corresponde al 10.5% de todos los nuevos casos de cánceres, el único tipo de cáncer que registra más casos es el de pulmón (6,7). El 45% de los casos, así como la mayoría de las muertes por CaMa, se registran en los países en vías de desarrollo, y se estima un aumento en las proporciones tanto de casos como de muertes (6, 8, 9). De los 1.35 millones de nuevos casos presentados en 2009, 69,000 se ubicaron en los países de ingresos bajos, 415,000 en los
16 países de ingreso medio-bajo y 224,000 en los países de ingreso medio-alto (7). La mortalidad por CaMa se concentra en los países en vías de desarrollo debido, en gran medida, a la falta de acceso a la detección temprana y al tratamiento, y muestra una relación clara con el nivel de desarrollo del país. La letalidad medida como la razón de mortalidad y nuevos casos (entre mujeres) es 56%, 44% y 39% entre los países de ingresos bajos, medio-bajo y medio- alto, respectivamente; comparado con el 24% observado en los países que cuentan con ingresos altos (7). Entre los países de ingreso medio-alto, el cáncer de mama es el segundo cáncer más común a nivel poblacional después de cáncer pulmonar, con 11.5% y 11.8% de los nuevos casos presentados en 2009, respectivamente. Entre los países de ingreso medio-bajo es el cuarto cáncer más común, después de pulmón, estómago e hígado, con 13.3%, 11.9% y 10.2% respectivamente. Las cifras para los países de ingresos bajos reflejan una mayor proporción de cánceres relacionados con infecciones, siendo el cáncer de cérvix, con 11.8%, el más común, seguido por hígado con 8.5%, pero aún allí el cáncer de mama corresponde al 7.7% de los casos, y es el tercero más común en términos de nuevos casos. Además, para 2020 se proyecta un aumento de 36%, 28%, y 20% en el número de nuevos casos en los países de ingresos bajos, medio-bajo y medio-alto, comparado con 14% en los países de ingresos altos (7). Como proporción de todas las muertes por cáncer entre mujeres, en los países en vías de desarrollo, el CaMa representa el 6.4% de las muertes y el 7.4% del total de los años de vida saludable potencialmente perdidos (AVISA, DALYs por sus siglas en el inglés).
Respectivamente, para los países de ingresos altos el CaMa representó el 7.5% de todas las muertes por cáncer y el 9.7% del total de la pérdida de
17 AVISA. Comparado con el cáncer cérvicouterino, el CaMa representa una mayor proporción, tanto de las muertes como de la pérdida de años de vida saludables AVISA (9,10). Debido a las muertes tempranas por cáncer de mama, la Organización Mundial de la Salud ha estimado que los años de vida perdidos (AVISA) por CaMa son alrededor de 600,000 en la región de Latinoamérica, cifra tres veces mayor que los años perdidos por muertes de cáncer pulmonar. En ausencia de intervenciones efectivas en los sistemas de salud para la detección y control del CaMa la cifra aumentará a 900,000 AVISA en el 2020 (11).
Estas cifras son aún más impactantes si se considera que la estructura de edades de la población de estos países es más joven. Sin embargo, aún prevalece la concepción errónea de que el CaMa es un problema de mujeres de edad avanzada y de países de altos niveles socioeconómicos. Por lo mismo,
18 el CaMa se considera una prioridad apremiante para la salud pública de los países en vías de desarrollo (7, 8, 9, 12).
Tendencias en la mortalidad en México.
En México, doce mujeres mueren diariamente a causa de CaMa, lo cual representa, aproximadamente, una tercera parte de las pacientes diagnosticadas con este tumor maligno (13). La tendencia observada en la mortalidad de esta enfermedad en nuestro país muestra incrementos constantes; basta mencionar que en el período de 1980 a 2005 se registraron un total de 67,854 defunciones por cáncer de mama, con un aumento estimado anual del 3.6% en los últimos 18 años (14). Adicionalmente, a partir de 2006 el CaMa es la segunda causa de muerte general en mujeres de 30 a 54 años y la primera por cáncer, desplazando al cáncer cérvicouterino (15). Las tasas de mortalidad ajustadas por edad presentadas en la gráfica 2 muestran que la mortalidad por cáncer cérvicouterino en las mujeres mexicanas superó la mortalidad por CaMa en el período 1955-2005. En 1980 el riesgo de morir por cáncer cérvicouterino era dos veces mayor respecto del CaMa. No obstante, desde 1990 las tasas de mortalidad por este cáncer descienden en forma rápida y constante. En sentido inverso, a lo largo del mismo período, las tasas de mortalidad atribuibles al cáncer de mama se incrementaron y para el año 2006, por primera vez, el CaMa superó al cáncer cérvicouterino como causa de muerte entre las mujeres mexicanas (15). Es importante enfatizar que deacuerdo al análisis estadístico realizado por el Dr. Knaul y colaboradores se denota que a mayor edad de la paciente al momento del diagnóstico de CaMa, es menor el porcentaje de sobrevida (15).
19 La disminución de la morbilidad y mortalidad por cáncer cérvicouterino en comparación con el CaMa, se observa no sólo a nivel nacional, sino también a nivel estatal y entre áreas geográficas, tanto en aquellas con un desarrollo económico mayor como en las zonas con un desarrollo económico menor. El riesgo de morir por CaMa ha aumentado en la gran mayoría de las entidades federativas de la República Mexicana, aunque el fenómeno es más marcado en el norte y el centro (16). En el Distrito Federal y Nuevo León, por ejemplo, las tasas de mortalidad observadas del cáncer de mama son mayores que las del cáncer cérvicouterino desde finales de la década de los ochenta. Si bien el cáncer cérvicouterino sigue siendo más común entre los segmentos pobres de la población, el cáncer de mama ha ganado terreno con rapidez. Aún en los estados con mayor marginación, donde el cáncer cérvicouterino presenta las
Gráfica 2
20 mayores tasas de incidencia en el país (como Oaxaca y Tabasco), el cáncer de mama está próximo a desplazarlo de acuerdo a las tendencias de los últimos años, pues el primero muestra un franco descenso y el segundo sigue en aumento (15).
Los carcinomas de la glándula mamaria se han convertido en la lesión tumoral maligna más frecuente en los países desarrollados con un millón de casos en el mundo por año. En la actualidad, a pesar de los esfuerzos encaminados para conocer la etiología del CaMa aún no se tiene la totalidad de los factores de riesgo y, por lo tanto no se ha logrado establecer una estrategia sólida de prevención. Estas observaciones sugieren que los factores ambientales, estilo de vida, particularmente la alimentación, el sedentarismo y la obesidad, así como el aumento en el consumo de alcohol y tabaco aunados a dietas saturadas de grasas y azúcar son factores de riesgo comprobados que
Gráfica 3
21 propician el aumento de casos y, tienen un papel muy importante en la evolución de la enfermedad. En base a este análisis epidemiológico podemos concluir que el cáncer de mama es un grave problema de salud pública de gran relevancia en nuestro País (17,18,19).
Desarrollo del cáncer.
El desarrollo del cáncer es una proliferación celular descontrolada causada por factores físicos, químicos, genéticos o biológicos. El proceso de la división celular depende de una secuencia de eventos muy bien controlados.
Estos eventos dependen de los niveles apropiados de la transcripción y traducción de ciertos genes. Cuando este proceso no ocurre como debería de ser, el resultado puede ser el crecimiento descontrolado de la célula. De los más o menos 30,000 genes que se piensan que existen en el genoma humano, hay un grupo pequeño que parece importante para la prevención, desarrollo, y progresión del cáncer. Se ha encontrado que estos genes están funcionando mal o no funcionan en varios tipos de cánceres (20).
Los genes que se han identificado hasta hoy han sido ordenados en dos categorías amplias, dependiendo de sus funciones normales en las células.
• Genes cuyas proteínas estimulan o aumentan la división y la viabilidad de las células. Esta es la primera categoría que incluye los genes que contribuyen al crecimiento de los tumores por medio de la inhibición de la muerte celular.
• Genes cuyos productos (proteínas) pueden prevenir directa o indirectamente la división celular o conllevar a la muerte celular.
22 Los genes en el primer grupo se llaman protooncogenes. Las versiones mutadas o dañadas de estos genes se llaman oncogenes. Los genes de la segunda categoría son conocidos como los supresores de tumor (20, 21, 22).
Todos los cánceres demuestran alteraciones en uno o más de sus supresores de tumor y oncogenes. En las células normales, estos dos grupos de proteínas trabajan juntas para regular la división celular pero en las células cancerosas los controles ya no funcionan apropiadamente. Los protooncogenes que han sido identificados hasta hoy tienen funciones muy diferentes en la célula. A pesar de las diferencias en sus funciones normales, estos genes contribuyen a la división celular descontrolada si se encuentran presentes en la forma mutante (oncogénica). Las proteínas mutantes pueden retener algunas de sus habilidades anteriores pero ya no tienen la misma sensibilidad hacia los controles que las regulan, algunos oncogenes que están asociados con varios tipos de cáncer se mencionan a continuación:
• Ras: Es una molécula para la transducción de señales.
• Myc: Factor de transcripción.
• Src: Una tirosina quinasa.
• hTERT: Una enzima que funciona en la replicación celular.
• Bcl-2: Una proteína para prevenir apoptosis.
• HER-2/neu (erbB-2): un receptor de factores de crecimiento.
Los genes supresores de tumor son genes cuyos productos sirven para controlar la división celular. Ellos difieren de los oncogenes en que los productos que producen los supresores de tumor inhiben la división de las
23 células si las condiciones para su crecimiento no son completados. Las condiciones que activarían los "frenos" de la célula incluyen daños al ADN, falta de factores de crecimiento o defectos en el aparato de la división.
• p53 (TP53): Es un factor de transcripción que regula la división celular.
• Rb: Controla la disponibilidad de un factor de transcripción.
• BRCA: Involucrado en el reparo del ADN.
El gen p53 (o TP53) fue descubierto en 1979 y ha emergido como uno de los genes relacionados al cáncer más importantes hasta la fecha. Este gen, encontrado en la cromosoma 17, produce una proteína que funciona como un factor de transcripción, los genes controlados por p53 se encuentran involucrados en la división y la viabilidad celular. Como otros supresores de tumor, la proteína p53 funciona para prevenir el crecimiento celular descontrolado. La proteína p53 interactúa directamente con el ADN. Ésta también interactúa con otras proteínas que dirigen las acciones celulares.
Cuando el daño al ADN u otros riesgos celulares son detectados, p53 tiene el poder de causar muerte celular o apoptosis. Las mutaciones que inactivan p53 pueden ser adquiridas durante la vida del individuo (mutaciones esporádicas) o pueden ser heredadas (21, 22, 23).
La proteína p53 juega un rol íntegro en la célula y esta presente normalmente en todos los tipos de células. La proteína se encuentra en el núcleo donde funciona como un factor de transcripción. La proteína p53 está al centro de una gran red de proteínas que controlan la división celular y el ADN celular; la proteína p53 ayuda en la decisión entre reparo y la inducción de la muerte celular. La mutación de p53 es uno de los cambios genéticos más frecuentes que se presencia en las células cancerosas. La
24 función de Rb también influencia la probabilidad del desarrollo de cáncer de mama, Rb normalmente regula el punto de chequeo G1 del ciclo celular, pero los estudios han demostrado que algunos cánceres de mama tienen una irregularidad en este punto de chequeo, implicando que Rb puede ser un factor contribuyente en este tipo de cáncer. Rb ha sido implicado como un contribuidor de varios otros tipos de cánceres, tales como los cánceres pulmonares. Aunque los genes BRCA fueron nombrados tras su asociación con el cáncer de mama, las mutaciones en estos genes también son asociadas con cánceres de los ovarios. Las formas de cáncer de los ovarios hereditaria y espontánea son similares pero un poco diferentes. El cáncer de ovarios hereditario tiende a tener una histología más seria, desde moderada a mal diferenciada, invasiva, y es usualmente descubierta en una etapa muy avanzada. Así mismo, los individuos con mutaciones BRCA tienen una frecuencia más alta de lesiones en las trompas de Falopio. Sea la paciente una cargadora de la mutación o no, tumores de los ovarios benignos o de bajo potencial maligno no son considerados precursores de carcinoma de ovario invasivo.
El cáncer de los senos que se desarrolla por una mutación heredada del gen BRCA tiene características diferentes a la forma espontánea, y las diferencias incluyen: un aumento en la proliferación celular, grado histológico más alto, mayor número de linfocitos en o alrededor del tumor, la presencia de una orilla de aspecto suave y no infiltrativo, expresión de los receptores de hormonas reducida, mayor frecuencia de mutaciones de p53. (24, 25, 26).
25 Tipos histológicos del Cáncer de Mama.
Aproximadamente el 90% de todos los tumores en la mama se originan en los conductos o los lóbulos. El 75% comienza en las células cuboides y columnares que recubren internamente los conductos galactóforos, denominado Carcinoma Ductal Infiltrante. El que comienza en los lobulillos se denomina lobular o lobulillar. El carcinoma ductal infiltrante es el más importante por su tipo histológico y distribución, ocurre en el 79-80% de los casos (4,12, 13, 18). El resto de los tipos histológicos se describen en la gráfica 4.
Frecuencia de los Tipos histológicos de cáncer de mama en México.
Fuente: SSA 2007 Gráfica 4
26 ANTECEDENTES ESPECÍFICOS
Líneas Celulares de Cáncer de Mama.
T47D (ATCC HB-133)
Esta línea celular fue obtenida de un tumor de glándula mamaria del tipo histológico ductal infiltrante de una paciente femenina caucásica de 54 años.
Son células adherentes, tienen receptores a 17 beta estradiol, otros esteroides y a la calcitonina. El medio de cultivo necesario para su crecimiento es RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino del 5 al 10% (27). (Fig. 1)
Figura 1. Línea celular de cáncer de mama T47D Fuente: Imagen tomada del archivo de líneas celulares de CaMa del Banco Berkeley.
MDA-MB-453 (ATCC HTB-131)
Esta línea celular fue obtenida de un carcinoma metastásico de glándula mamaria de una paciente femenina caucásica de 48 años. Son células adherentes, sobre-expresan el receptor del factor de crecimiento F, el medio de cultivo que requieren para su crecimiento es DMEM suplementado con suero fetal bovino del 5 al 10%. (28). (Fig. 2).
27
Figura 2. Línea celular de cáncer de mama MDA-MB-453 Fuente: Imagen tomada del archivo
de líneas celulares de CaMa del Banco Berkeley.
MDA-MB-231 (HTB-26)
Esta línea celular fue obtenida de un adenocarcinoma grado III de glándula mamaria de una paciente femenina caucásica de 51 años. Son células adherentes, el medio de cultivo que requieren es DMEM suplementado con suero fetal bovino del 5 al 10% (29,30,31).
Figura 3. Línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 Fuente: Imagen tomada del archivo
de líneas celulares de CaMa del Banco Berkeley.
28 Transdiferenciación en cáncer de mama a fenotipo neuronal.
El diagnóstico de cáncer de origen metastásico y especialmente en aquellos tumores primaros ocultos depende de la expresión de marcadores de diferenciación celular o del tejido. Estudios recientes clínicos y pre-clínicos evidencian programas de diferenciación aberrantes en células tumorales, que permiten la expresión de marcadores de diferenciación que no se encuentran en el tejido en condiciones normales (3,31,32,33). Estas observaciones tienen implicaciones para la investigación biomédica y clínica en cáncer. Sin embargo, esta propiedad no ha sido bien estudiada en líneas celulares de CaMa humanas, frecuentemente utilizadas para la investigación.
Trabajos recientes confirmaron la capacidad de la línea celular MDA-MB- 435 de co-expresar marcadores de epitelio mamario y melanocítico, tanto in vitro como in vivo y postulan que la infidelidad de la línea celular a su linaje es
un mecanismo de su transdiferenciación (3). En otros estudios se ha observado la co-expresión de tres marcadores de linaje de células ectodérmicas en líneas celulares de cáncer de mama luminales (MCF-7 y SKBR3) y basales (MDA- MB-231), estos marcadores son de tipo epitelial (ESA), epitelial mamario (EMA CK 19 y CK 17), melanocítico (Melan-A, MITF TYR) y neuronal/glial (Nestina, TUBB3, GFAP). Estas observaciones indican que la infidelidad del linaje o la transdiferenciación del linaje aberrante ocurren frecuentemente en múltiples tipos de cáncer humano comportándose como un fenómeno ampliamente distribuido (3).
29 Proteínas de Vesículas sinápticas ( SVs)
Las proteínas de las SVs (synaptic vesicles protein), se dividen en dos clases funcionales: proteínas involucradas en la captación de neurotransmisores (proteínas de transporte), y proteínas que participan en el tráfico de las membranas SVs (proteínas translocadoras). Entre las primeras se han identificado cinco transportadores de neurotransmisores; algunos de ellos son similares a los transportadores involucrados en la resistencia bacteriana a los antibióticos. También se han identificado transportadores (canales) para zinc y cloro, así como una proteína de transporte de electrones (citocromo b561) y una bomba de protones que establece el gradiente electroquímico necesario para la incorporación de los neurotransmisores. En este grupo se incluye una serie de proteínas secretoras (SCAMPs). Durante la preparación se forma un complejo en el que participan proteínas de la membrana plasmática (sintaxina y SNAP25) y de la SV (sinaptobrevina/VAMPs y sinaptofisinas);
complejo que forma un soporte para una cascada de interacciones proteícas necesarias para el proceso de exocitosis, que es inhibido por las toxinas tetánica y botulínica. Las sinaptotagminas participan en las fases finales del proceso de fusión, y las dinaminas y la auxilina-clatrina, lo hacen en la endocitosis de las SVs. Las proteínas Rabs y rabfilinas, dirigen el tráfico de las membranas. En íntima relación con el ciclo de las SVs se sitúa la plasticidad sináptica, que, desde el lado presináptico, involucra modificaciones en la liberación de los neurotransmisores. Varias proteína quinasas (sinapsinas y sinaptogirinas) participan en la plasticidad sináptica a través de la regulación del tráfico vesicular, plasticidad que especifica las conexiones interneuronales y que exige alineaciones precisas mediante especializaciones pre- y
30 postsinápticas. La familia de las neurexinas puede proporcionar los marcadores de esa especificidad (34,35).
Composición Proteica de las Vesículas Sinápticas
% proteínas totales
No. De copias/vesícula Sinaptofisina 10.20 ± 1.54 39.5
Sinaptobrevina 2 8.60 ± 1.55 69.8
Sintaxina 1 2.00 ± 0.27 6.2
SNAP-25 0.40 ± 0.06 1.8
Sinapsina 6 8.3
Rab3A 2.5 10.3
Sinaptotagmina
1 7 15.2
Sinaptogirina 1 0.5 2.0
SV2 1.4 1.7
SCAMP 0.3 0.8
CSP 0.6 2.8
VGLUT1 5.36 ± 1.11 9.0
VGLUT2 9.01 ± 2.31 14.4
Subunidad
V-ATPasa V1-B 1.15 ± 0.21 1.4
31 Receptor SV2A en Cáncer
El receptor SV2 tiene tres isoformas: SV2A, SV2B y SV2C, teniendo variaciones en su secuencia nucleotídica, así como en su conformación estéreotipica. El receptor SV2A se determinó como el sitio que reconoce la neurotoxina botulínica tipo A, a través de este sitio de reconocimiento, es como esta toxina puede ingresar a las neuronas (4). Posteriormente, se menciona que el SV2 es una glicoproteína de membrana que se expresa en vertebrados, incluyendo en los humanos, que es localizado en vesículas sinápticas y en vesículas secretoras de ciertos tejidos glandulares como la próstata, tiroides, paratiroides, páncreas, glándula pituitaria y medula adrenal (36,37). Además es un marcador de tumores neuroendocrinos en el tracto gastrointestinal (38).
Sin embargo, el receptor SV2 A identificado en tejido neuro-endócrino no ha sido descrito en células de CaMa, debido a ello nos propusimos llevar a cabo dicha identificación en biopsias y líneas celularesT47D, MDA-MB-231, MDA-MB-453, así como identificar posibles cambios fenotípicos de transdiferenciación celular.
32 JUSTIFICACION
A nivel mundial, el CaMa es el cáncer más común entre las mujeres, registrándose 411,000 muertes al año a causa de esta enfermedad. Éste es el cáncer más prevalente a nivel mundial: en los últimos cinco años hay 4.4 millones de mujeres que viven con la enfermedad. En México, doce mujeres mueren diariamente a causa de cáncer mamario, lo cual representa, aproximadamente, una tercera parte de las pacientes diagnosticadas con este tumor maligno. Adicionalmente, a partir de 2006 el CaMa es la segunda causa de muerte general en mujeres de 30 a 54 años y la primera por cáncer, desplazando al cáncer cérvicouterino.
A pesar del aumento en las tasas de prevalencia e incidencia del cáncer de mama en México y en el mundo, se desconocen aspectos importantes respecto a las modificaciones que llevan a cabo las células tumorales para sobrevivir y para evadir al sistema inmunológico. Una de estas estrategias recientemente descrita es la transdiferenciación celular. Aunado a este fenómeno se presentan cambios fenotípicos en las células tumorales, cuya trascendencia dentro del contexto fisiopatológico es desconocida. Por tal motivo en este trabajo se pretendió identificar el receptor neuronal SV2A en líneas celulares de CaMa, así como cambios fenotípicos sugerentes de la infidelidad de linaje. Esto podría sentar un precedente para poder realizar estudios moleculares y celulares que contribuyan a dilucidar la finalidad que persiguen las células tumorales al modificar su morfología y expresión fenotípica.
33 OBJETIVO GENERAL
Identificar el receptor SV2 isoforma A neuronal en células de Cáncer de Mama.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Describir si la morfología de las líneas celulares de CaMa sugieren un aspecto neuronal.
2. Identificar el receptor SV2 isoforma A en las líneas celulares: T47D, MDA-MB-231 y MDA-MB-453 derivadas de CaMa.
3. Identificar el receptor SV2 isoforma A en biopsias obtenidas de pacientes con CaMa.
34 MATERIAL Y MÉTODOS
Conformación de los grupos TIPO DE ESTUDIO
Se realizó un estudio observacional, descriptivo, longitudinal, prospectivo, de intervención deliberada.
UNIVERSO Y MUESTRA DE TRABAJO POBLACION
Se trabajó con biopsias y líneas celulares MDA-MB-231, MDA-MB-453 y T47D, las cuales fueron donadas por el Instituto Nacional de Cancerología. La investigación se efectuó en el Centro de Investigación Biomédica de Oriente del IMSS, así como en la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional y en la Escuela Médico Militar de la Universidad del Ejército y Fuerza Aérea.
CRITERIOS DE SELECCIÓN
a) Criterios de inclusión Líneas celulares
1. Líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-453 cultivadas con medio DMEM y línea celular T47D con medio RPMI-1640. Suero fetal bovino (SFB) al 5% para las tres líneas.
2. Células con índice de adherencia mayor del 90%
Biopsias
Pacientes con diagnóstico histopatológico de CaMa
b) Criterios de exclusión Líneas celulares
1. Contaminación de las líneas celulares 2. Células con viabilidad menor al 70%
Biopsias
Pacientes con enfermedades hormonales concomitantes
35 c) Criterios de eliminación
Líneas Celulares
Error en la ejecución de la metodología a las que se sometieron los cultivos celulares.
Biopsias
Las muestras serán eliminadas si el control de la técnica es positivo.
FORMACIÓN DE LOS GRUPOS DE ESTUDIO
Demarcación
Se confirmó la viabilidad de las células mediante observación de las características morfológicas típicas. Se utilizaron anticuerpos en las diluciones recomendadas.
Obtención y procesamiento de las muestras
Líneas celulares, condiciones de cultivo y anticuerpos utilizados
Las líneas celulares MDA-MB-231, MDA-MB-453 y T47D de CaMa, fueron donadas por el Instituto Nacional de Cancerología. La línea celular T47D se cultivó en medio RPMI-1640 (GIBCO) suplementado con suero fetal bovino (GIBCO) al 10% , 10,000 U de penicilina y 10mg de estreptomicina (SIGMA) bajo condiciones ambientales de 10% de CO2 a 37 ºC. Las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se cultivaron en medio DMEM (SIGMA) suplementado con suero fetal bovino al 10% bajo condiciones ambientales de 10% de CO2 a 37 ºC. El recambio de medio se llevó a cabo cada 4 días, para esto, se lavaron las células con PBS pH 7.3, se trataron con tripsina Triple Express (GIBCO). El numero ATCC de la línea MDA-MB-231 es HTB-132™, tiene receptores para el factor de crecimiento epidermoide y para el factor de
36 crecimiento transformante α. Se trata de células aisladas de adenocarcinoma de mama de humano. El número de ATCC de la línea T47D es HTB-22™ tiene receptores para estrógenos, se trata de células aisladas de adenocarcinoma de mama de humano. El anticuerpo primario utilizado para la identificación del receptor SV2A tanto en biopsias como en las líneas celulares fue anti-SV2 isoforma A (donkey polyclonal anti-goat IgG) de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. El anticuerpo secundario utilizado para las inmunohistoquimicas tanto en líneas celulares como en biopsias fue anti-goat IgG, también de SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.
Toxina Botulínica tipo A
Se utilizó el agente terapéutico comercial inyectable, que contiene 4.8 ng por vial de 100 Unidades (Allegargan, Inc., Markham, Ontario, Canada), se reconstituyó en solución salina estéril al 0.9%.
Descripción de aspectos morfológicos de las líneas celulares.
Las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se cultivaron en medio DMEM, la línea T47D con RPMI 1640, se suplementaron con SFB al 5% con una temperatura de 37 ºC y CO2 al 5%. Al día 3 posterior a su tripsinización, las células se observaron con un microscopio invertido NIKON y las imágenes se capturaron con el software Pixera View Finder Pro. El análisis estadístico se realizó aplicando la prueba no paramétrica de Kruskall Wallis, utilizando el software SPSS.15 para su análisis.
37 Identificación del receptor SV2A
a) Inmunohistoquímica de líneas celulares de cáncer de mama.
Las líneas celulares MDA-MB-231 y MDA-MB-453 se cultivaron en cubreobjetos de vidrio en medio DMEM y la línea T47D con RPMI 1640. Se suplementaron con SFB al 5% a 37 ⁰C y CO2 al 5%. Las células se incubaron con 10 U de toxina botulínica recién reconstituida (menos de 2 horas) por 24 hr, se fijaron con paraformaldehido al 2% y glutaraldehido al 2% con PBS 0.1 M pH 7.4 durante 2 horas. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con PBS. Se bloqueó con H2O2 al 6% por 15 min y se aplicó el anticuerpo primario Anti SV2A (1:100 en solución bloqueadora: Tritón 1%, suero de caballo 5% y solución de borato 5%), se incubó durante 14 h a 4°C. Transcurrido el tiempo, se lavaron las muestras 3 veces con Tris, se aplicó el complejo Avidina-Biotina (AB) en una dilución 1:300 con PBS estéril y se incubaron a 4°C durante 30 min. Posteriormente, se lavaron la muestras 3 veces con Tris. Finalmente, se aplicaron 20 µl de diaminobencidina (DAB) (cromógeno diaminobencidina Kit DakoCytomation 1ml de buffer más 15 µl de DAB) en cada una de las muestras. Se incubaron los tejidos a temperatura ambiente durante 5 min, evitando la exposición a la luz, se lavaron con agua molecular para proceder a su tinción con Hematoxilina de Meyer, filtrada durante 5 min. Se lavó con dos cambios de agua destilada, se colocaron los tejidos en hidróxido de amonio por 30 segundos, se lavaron con agua destilada, 3 a 5 veces. Se procedió a una deshidratación leve con Xilol al 25% durante un minuto y finalmente se aplicó la resina Tissue-Tek O.C. T. 4583 Compund para el montaje. Las células se
38 observaron con un microscopio invertido y la presencia del receptor se analizó con el software Axion Vision LE.
b) Inmunohistoquímica de biopsias de pacientes con cáncer de mama.
Los tejidos se fijaron con formol al 10% por un tiempo mínimo de 24 horas previa inclusión y se incluyeron en parafina a 60°C. En seguida se desparafinaron introduciéndolos en un horno de desecación a una temperatura de 60º- 80º C por 10 min y luego se colocaron en Xilol a 60ºC por 10 min, para completar el desparafinado.
Posteriormente, se hidrataron pasándolos en Xilol a temperatura ambiente durante 3 min, usando dos cambios cada uno; posteriormente, se sometieron al alcohol-Xilol repitiendo estas condiciones, después, en etanol al 100%, 96%, 80%, 70 % por 3 minutos cada uno, terminando en agua destilada. Finalmente, se introdujeron en un recipiente con PBS. Una vez terminado el proceso de hidratación, los tejidos se delimitaron con un lápiz graso (Dako Cytomation).
Después se aplicaron 20 µl de Avidina (A) en cada tejido, se incubó a 4°C por 15 minutos, transcurrido este tiempo se lavó con Tris. Posteriormente, se aplicaron 20 µl de B (Biotina), se incubó a 4°C por 15 minutos, y se lavó con Tris. Se aplicaron 20 µl de solución de peróxido de hidrogeno al 6% (dilución con metanol), luego se incubaron a 4ºC por 15 min, se bloqueó nuevamente con el peróxido de hidrogeno al 6%, incubándolos 4ºC por 15 min, al concluir este tiempo se lavaron con Tris. Se aplicó el anticuerpo primario en una dilución 1:100, se incubó a 4°C por 24 horas, se lavaron los tejidos dos veces con solución Tris. Se aplicó el anticuerpo secundario anti-cabra biotinilado con una dilución 1:200 con solución bloqueadora (Tritón al 1%, suero anti caballo al
39 5%, solución de borato al 5%), se incubó a 4°C por 2 horas, se lavó dos veces con solución Tris.
Posteriormente, se aplicaron 20 µl del complejo AB en una dilución 1:200 con PBS estéril y se incubó a 4°C por 30 min, se lavó con tres cambios de solución Tris. Se aplicó 20 µl de la DAB (cromógeno diaminobencidina Kit DakocCytomation 1ml de buffer más 15 µl de DAB) en cada uno de los tejidos, luego se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min, evitando la exposición a la luz, se lavaron con agua molecular para proceder a la tinción con hematoxilina de Meyer filtrada durante 5 min. Se lavó con dos cambios de agua destilada, se colocaron en hidróxido de amonio por 30 s, se lavaron con agua destilada, 3 a 5 veces. A continuación, se procedió a la deshidratación de los tejidos, para lo cual se introdujeron en etanol al 70, 80 y 96%, dos cambios de etanol al 100%, etanol-xilol, dos cambios de xileno al 100% por 3 a 5 minutos en cada solución. Se aplicó la resina Tissue-Tek O.C. T. 4583 Compound para el montaje. Finalmente, se observaron al microscopio invertido y se tomaron fotografías.
Captura y procesamiento estadístico de datos
El procesamiento de los resultados se realizó con el programa SPSS.15, utilizando de ANOVA de un camino, particularmente con el modelo lineal general univariante, y el coeficiente de correlación de Pearson.
40 RESULTADOS
Las células provenientes de las líneas de cáncer de mama sugieren una morfología neuronal/glial.
Con la finalidad de saber si las líneas celulares estudiadas pueden cambiar su aspecto morfológico hacia uno neuronal; se tomaron registros del desarrollo de los cultivos con ayuda de un microscopio invertido. En general, se pudo apreciar un patrón morfológico relevante. Es decir, se observaron células con diferente aspecto morfológico con respecto al habitual, tanto en la línea celular T47D (Fig. 4), como en las líneas MDA-MB-231 (Fig. 5) y MDA-MB-453 (Fig. 6).
Figura 4. Cambios morfológicos en la línea celular T47D.
Microscopía de Contraste de Fases de cultivos de células T47D: a) Células de morfología tumoral habitual; b, c y d) Células transdiferenciadas (cabeza de flecha), prolongaciones citoplásmicas que parecen hacer sinapsis entre células (flecha).
41 Figura 5. Cambios morfológicos en la línea celular MDA-MB-231.
Microscopía de Contraste de Fases de cultivos de células MDA-MB-231: a) Células de morfología tumoral habitual; b, c y d) Células transdiferenciadas (cabeza de flecha), prolongaciones citoplásmicas caracteristicas (flecha).
Figura 6. Cambios morfológicos en la línea celular MDA-MB-453.
Microscopía de Contraste de Fases de cultivos de células MDA-MB-453: a) Células de morfología tumoral habitual; b, c y d) Células transdiferenciadas (cabeza de flecha), prolongaciones citoplásmicas que parecen hacer sinapsis entre células (flecha).
42 Como se puede observar en las figuras anteriores (Figs. 4, 5 y 6), las células, en todos los casos, mostraron una morfología uniforme hasta el tercer día de haberlas cultivado (Figs. 4 a y 5 a), sin embargo, pasado este tiempo, la morfología de algunas de ellas comenzó a cambiar, es decir, el aspecto morfológico que tomaron estas células denota particularmente semejanza con células neuronales, es decir; las células con aspecto diferente al habitual, en las tres líneas estudiadas, desarrollaron prolongaciones semejantes a axones.
Esta morfología característica se pudo apreciar mejor cuando las células se encontraban dispersas y no en agregados. (Figs, 4, 5 y 6 incisos c y d). Estas observaciones demuestran que los cultivos de las tres líneas celulares estudiadas tienen la habilidad de transdiferenciarse hacia un fenotipo neuronal/glial. Este resultado abre un campo de estudio que contribuye al conocimiento del proceso tumoral de la glándula mamaria.
Los resultados anteriores se pueden entender mejor al realizar la estadística entre las células con aspecto normal y aquellas con aspecto neuronal/glial. En la línea celular T47D el 4.09 % de células sufrieron transdiferenciación, en la línea celular MDA-MB-231 el 2.52 % y en la línea celular MDA-MB-453 sólo el 1.69 % (Gráfica 5). Nótese que la línea celular T47D tuvo 37.8 % mas porcentaje de transdiferenciación que la MDA-MB-231 (p = 0.30) y 60.1 % mayor respecto a MDA-MB-453 (p = 0.09); por otra parte, la diferencia entre MDA-MB-231 y MDA-MB-453 ascendió a 35.2 % (p = 0.69).
43 Gráfica 5. Porcentaje de transdiferenciación entre líneas celulares de
Cáncer de Mama.
Identificación del receptor SV2A en líneas celulares de Cáncer de Mama.
Se logró identificar el receptor SV2A en las tres líneas celulares estudiadas. Sin embargo, cabe resaltar que éste, se pudo observar mayormente expresado en la línea celular T47D (Fig. 7). Mediante densitometría se identificó de manera más clara la localización de dicho receptor en las células y sus agregados (Figs. 7 b y d, 8 b y d y 9 b y d). En donde se puede observar claramente que en la condición experimental sin toxina botulínica tipo A (Figs. 7 a y b, 8 a y b y 9 a y b), el receptor tiene una distribución central, mientras que en las células expuestas a dicha toxina, se localizó en la periferia, cerca de la membrana plasmática primordialmente, esto ocurrió en las tres líneas celulares (Figs. 7 c y d, 8 c y d y 9 c y d).
44
Figura 7. Identificación del Receptor SV2A en la línea celular T47D.
a) Células sin exposición a la toxina botulínica tipo A. b) Densitometría de las células sin exposición a la toxina. c) Células expuestas a la toxina botulínica tipo A. d) Densitometría de las células expuestas a la toxina. 400X
Figura 8. Identificación del Receptor SV2A en la línea celular MDA-MB-231.
a) Células sin exposición a la toxina botulínica tipo A. b) Densitometría de las células sin exposición a la toxina. c) Células expuestas a la toxina botulínica tipo A. d) Densitometría de células expuestas a la toxina.
45 Figura 9. Identificación del Receptor SV2A en la línea celular MDA-MB-453.
a) Células sin exposición a la toxina botulínica tipo A. b) Densitometría de las células sin exposición a la toxina. c) Células expuestas a la toxina botulínica tipo A. d) Densitometría de las células expuestas a la toxina.
El análisis estadístico de los resultados anteriores se resume en la Tabla 1, en donde se cuantificó el porcentaje de identificación del receptor SV2 en cada una de las líneas celulares, tanto con su exposición a la toxina botulínica tipo A como sin ella.
Véase (Tabla 1) que los promedios de los porcentajes de identificación del receptor fueron muy diferentes, según la condición experimental en cada línea celular evaluada (p = 0.011), con una clara tendencia a mayores porcentajes en la línea celular T47D sin toxina, aunque, tal vez por el tamaño de las muestras, no se puede establecer una diferencia significativa entre los tipos de líneas celulares (p = 0.07). Empero, véase (Tabla 2) que, a partir del análisis pareado entre T47D y MDA-MB-453 la diferencia sí es importante (p =
46 0.02). No obstante, de acuerdo a la Gráfica 6, hay evidencia de un comportamiento diferencial en el porcentaje de anticuerpos entre las líneas celulares dependiendo de la condición experimental (p = 0.13). Nótese que en la línea T47D los porcentajes de anticuerpos fueron relativamente muy elevados en la condición experimental sin toxina y bajos con toxina, siendo similar este comportamiento a la línea MDA-MB-453, aunque con promedios más bajos en esta última; en cambio, es notorio que en la línea MDA-MB-231 los promedios entre las dos condiciones experimentales tienden a estar muy cercanos entre sí.
Tabla 1. Porcentaje de identificación del receptor SV2A según líneas celulares y condición experimental
Variable dependiente: Porcentaje Líneas celulares Condición
experimental
Media aritmétic a
Desviación típica
n p
T47D (1) Sin toxina 3.986844 2.7726758 5
Con toxina 1.123095 .3915391 4
Total 2.714067 2.4858451 9 0.01
MDA-MB-231 (2) Sin toxina 1.729141 .9985213 5
Con toxina 1.464288 .5859363 5
Total 1.596715 .7843491 10 0.01
MDA-MB-453 (3) Sin toxina 1.579064 1.0116068 5
Con toxina .418857 .1593846 4
Total 1.063417 .9461033 9 0.01
Total Sin toxina 2.431683 2.0182692 15
Con toxina 1.037635 .6041749 13
Total 1.784446 1.6660250 28
1 Vs 2 p= 0.14
2 vs 3 p=0.02
2 vs 3 p=0.35
47 Tabla 2. Comparación por pares del porcentaje de identificación del
receptor SV2A en las líneas celulares de Cáncer de Mama (I) Líneas
celulares
(J) Líneas celulares
Diferencia entre medias (I-J)
Error típico.
Significa ción(a)
Intervalo de confianza al 95 % para la diferencia(a) Límite
inferior
Límite superior
Límite inferior
Límite superior
Límite inferior
T47D MDA-
MB-231
.958 .627 .141 -.343 2.259 MDA-
MB-453
1.556(*) .646 .025 .217 2.895 MDA-MB-
231
T47D -.958 .627 .141 -2.259 .343 MDA-
MB-453
.598 .627 .351 -.703 1.899 MDA-MB-
453
T47D -1.556(*) .646 .025 -2.895 -.217 MDA-
MB-231
-.598 .627 .351 -1.899 .703
Basadas en las medias marginales estimadas.
* La diferencia de las medias es significativa al nivel .05.
a Ajuste para comparaciones múltiples: Diferencia menos significativa (equivalente a la ausencia de ajuste)..
Gráfica 6. Porcentaje de identificación del receptor SV2A según líneas celulares y condición experimental
LÍNEAS CELULARESMDA-MB-453
MDA-MB-231 T47D
Medias Porcentaje de Receptor SV2A
4.0000 3.0000 2.0000 1.0000 0.0000
48 Correlación entre la transdiferenciación celular y el porcentaje del receptor SV2A identificado.
Los porcentajes de receptores SV2A expresados sin la presencia de toxina se diferenciaron claramente entre las líneas celulares: para T47D el porcentaje promedio de expresión SV2A fue de 3.98 %, para MDA-MB-231 1.72 % y para MDA-MB-453 de 1.57 %. (Gráfica 7). Obsérvese que T47D excedió 2.26 % a MDA-MB-231 equivalente a un 56.7 % más de expresión (p = 0.15) y 60.5 % mayor a la expresión de MDA-MB-453 (p = 0.12). En cambio, entre MDA-MB- 231 y MDA-MB-453 la diferencia de expresión del receptor SV2A sólo fue de un 8.7 % más para el primero (0.99). Además, los porcentajes de transdiferenciación según la línea celular correlacionaron intensamente con los porcentajes de expresión del receptor SV2A (r = 0.953, p = 0.19).
Gráfica 7. Comparación entre la transdiferenciación de las tres líneas celulares con el porcentaje de identificación del receptor SV2A
49 Identificación del receptor SV2A en biopsias de pacientes con diagnóstico de Cáncer de Mama.
En las biopsias de pacientes con CaMa, proporcionadas por el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Escuela Médico Militar de la Universidad del Ejército y la Fuerza Aérea Mexicanas, se logró identificar por Inmunohistoquímica, el receptor SV2A (Fig. 10). A diferencia del tejido control (Fig. 10 a y c), es clara la identificación de la marca en color marrón, indicando la presencia del receptor SV2A en el tejido representado en la Fig. 10 b y d.
La distribución del receptor no fue localizada en una zona del campo visualizado, sino por el contrario, se puede identificar en ciertas regiones, pero distribuido ampliamente en todo el tejido. Sin embargo, cabe señalar que, en las células del foco tumoral (células de mayor tamaño), dicho receptor, se aprecia con mayor intensidad (Fig 10. b).
Figura 10. Detección por InmunohistoquÍmica del receptor SV2A en biopsias de pacientes con Cáncer de Mama. Tejido control (a y c). Marca de identificación del receptor SV2A en color marrón (b: glándula y d: estroma). 400X
50 La Tabla 3, muestra que las medias aritméticas del porcentaje de identificación del receptor SV2A obtenido del análisis densitométrico de las biopsias de pacientes con CaMa son mayores en la glándula (31,89%) que en el estroma (15 %).
En el Gráfica 8, se puede observar claramente que el porcentaje de identificación del receptor SV2A en la Glándula es aproximadamente el doble del porcentaje encontrado en el Estroma (47%).
Tabla 3. Medias de identificación del porcentaje del receptor SV2A en Glándula y Estroma de biopsias de pacientes con Cáncer de Mama
Estadísticos descriptivos:
N Mínimo Máximo Media Desv. típ. p
GLÀNDULA 12 5,63 50,77 31,8927 15,99344 0.001
ESTROMA 12 1,57 31,99 15,0043 11,17885 0.001
N válido (según lista) 12
Gráfica 8. Medias de identificación del receptor SV2A en Glándula y Estroma de biopsias de pacientes con Cáncer de Mama.
51 Para determinar que los parámetros analizados siguen una distribución normal, se aplicó una prueba de Kolmogorov-Smirnov, tal y como se muestra en la tabla 4. Por lo tanto, se aplico una prueba T para muestras relacionadas, donde se comparó los porcentajes de identificación del receptor SV2A en glándula y estroma de cada una de las muestras (n=12). En la tabla 5, se muestra el análisis estadístico de grupo, en donde nuevamente, se obtienen los mismos valores (medias) en cuanto a los porcentajes de identificación del receptor SV2A tanto en glándula (15%) como en estroma de las biopsias de pacientes con CaMa (31.89%).
Tabla 4. Prueba de Kolmogorov-Smirnov para una muestra
GLÁNDULA ESTROMA
N 12 12
Parámetros normales(a,b) Media 31,8927 15,0043
Desviación típica 15,99344 11,17885
Diferencias más extremas Absoluta ,210 ,200
Positiva ,163 ,200
Negativa -,210 -,161
Z de Kolmogorov-Smirnov ,729 ,695
Sig. asintót. (p) ,663 ,720
a La distribución de contraste es la Normal.
b Se han calculado a partir de los datos.
Tabla 5. Medias del porcentaje de identificación del receptor SV2A en Glándula y Estroma de biopsias de pacientes con Cáncer de Mama.
Estadísticos de muestras relacionadas
Media N Desviación
típ.
Error típ. de la media
p
Par 1 GLÀNDULA 31,8927 12 15,99344 4,61691 0.001
ESTROMA 15,0043 12 11,17885 3,22706 0.001
52 En el análisis de la prueba de muestras relacionadas (véase Tabla 6), se puede observar que la diferencia entre el porcentaje del receptor SV2A identificado en la glándula y en el estroma de las biopsias de pacientes con CaMa, es significativo (p=0.001).
Tabla 6. Medias de identificación del receptor SV2A en Glándula y Estroma de biopsias pacientes con Cáncer de Mama
Prueba de muestras relacionadas
Diferencias relacionadas T gl Sig.
(bilateral)
Media Desviación
típ.
Error típ.
de la media
95% Intervalo de confianza para la
diferencia
Media Des.
típ.
Error típ.
de la media Inferior Superior Inferior Superior Inferior Superior Inferior Superior
GLÀNDULA -
ESTROMA
16,88 12,84 3,70 8,72 25,04 4,55 11 ,001
Por otro lado, en el análisis de correlación de muestras relacionadas ( glándula y estroma) se obtuvo un coeficiente de 0.603 y una p= 0.038 (Véase tabla 7).
Los resultados de este análisis nos indican que a mayor porcentaje de identificación del receptor SV2A en tejido glandular de las biopsias de cáncer de mama, mayor es la identificación del mismo receptor en tejido estromal tal y como se muestra en el gráfico 9, donde podemos observar un coeficiente de determinación de 36%.
Tabla 7. Correlación de identificación del receptor SV2A entre tejido glandular y estroma de las biopsias de pacientes con Cáncer de Mama.
Correlaciones de muestras relacionadas
N Correlación Sig.
Par 1 GLÀNDULA y ESTROMA
12 ,603 ,038
53 Gráfica 9. Correlación de identificación del receptor SV2A entre tejido glandular y estromal de las biopsias de pacientes con Cáncer de Mama.
GLÀNDULA30,0040,0050,0060,00 20,00 10,00 0,00
ESTROMA
40,00 30,00 20,00 10,00 0,00
Sq r lineal = 0,364
54 DISCUSION
Es preocupante el incremento que han presentado los casos de CaMa en la población mundial. En nuestro país, también se ha presentado este incremento, probablemente se deba a las modificaciones en nuestra alimentación y al sedentarismo, así como la falta de medidas preventivas y de detección eficaces, sin embargo, debemos de enfocar nuestro esfuerzo para disminuir su prevalencia y su mortalidad.
Los resultados obtenidos en este trabajo, sugieren que las líneas celulares de CaMa estudiadas son susceptibles de cambios en cuanto a su morfología, Este aspecto morfológico, es semejante a una célula neuronal, inclusive, presentan prolongaciones, las mismas que aparentemente utilizan para formar uniones con células cercanas. El cambio de aspecto en dichas células, sugiere que podrían presentar marcadores de tipo neuronal/glial, tal y como se ha demostrado en otras líneas celulares de la mama (3), así como en biopsias humanas de cáncer de colon (39).
Este cambio en la morfología se ha denominado Transdiferenciacion o infildelidad de linaje (3) y es un fenómeno que todavía no se ha explicado en cuanto al propósito de la célula tumoral de modificar su fenotipo, ya que como se demostró en el estudio del Dr Zhang (3), las células no tumorales no expresan estos marcadores de fenotipo neuronal. En este mismo estudio, en la línea no tumoral MCF-10A, no se observaron cambios en la morfología celular.
Este proceso es de reciente hallazgo, por lo que resulta importante continuar con la búsqueda de marcadores neuronales en diferentes tipos de cáncer y posteriormente buscar una posible explicación a este fenómeno, ya que es necesario conocer más acerca del comportamiento de las células tumorales,