EVALUACIÓN DE LA MONOFÍLIA DE DICOTILEDÓNEAS CON BASE EN CARACTERES MORFOLÓGICOS Y SEIS GENES: MITOCONDRIALES, CLOROPLÁSTICOS Y NUCLEARES

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EVALUACIÓN DE LA MONOFÍLIA DE DICOTILEDÓNEAS CON BASE EN CARACTERES MORFOLÓGICOS Y SEIS GENES: MITOCONDRIALES,

CLOROPLÁSTICOS Y NUCLEARES

Diana Avellaneda-Maldonado, Laura Jaimes-Rodríguez, Ingrid Pérez-Parada

RESUMEN

Se realizó un análisis filogenético utilizando seis genes (mitocondriales: matR y atp1, cloroplásticos: atpB y rbcL, nucleares: 18S y 26S) y una matriz morfológica de 235 caracteres para 39 taxa de Angiospermas como in-group y 3 taxa (Cycadales, Ginkgoales y Coniferales) como out-groups. Se emplearon los métodos Parsimonia, ML y análisis Bayesiano. Con los tres análisis se evidenció la no-monofília de dicotiledóneas; con ML y Bayes se obtuvieron topologías que mostraban una clara división de angiospermas basales conformadas por Nymphaeales, Chlorantales, Ceratophyllales, el clado de Magnolidae y Monocotiledóneas; hacia el final del árbol se recuperó el clado de las Eudicotiledóneas con un soporte alto.

INTRODUCCIÓN

La reconstrucción filogenética de las angiospermas se remonta a finales del siglo XX, cuando se publicaron los primeros trabajos en el tema

1,2

, de los cuales ninguno sostiene la división de las angiospermas en monocotiledóneas y dicotiledóneas, anterior clasificación basada en caracteres morfológicos

3,4

. Actualmente se reconoce que las dicotiledóneas se encuentran divididas en dicotiledóneas basales o Magnoliidae y Eudicotiledóneas, mientras que las monocotiledóneas son derivadas de las Magnoliidae

5

.

Las estimaciones filogenéticas de las plantas se hacen más confiables cuando las

topologías obtenidas por los distintos métodos son congruentes, utilizando los genomas

mitocondriales, plastídicos y nucleares

6

. De acuerdo a lo anterior y con el objetivo de evaluar

la monofília de las dicotiledóneas, se reunieron secuencias de ADN para dos genes

nucleares, dos cloroplásticos y dos mitocondriales, además de caracteres morfológicos,

empleando los métodos de Máxima Parsimonia, Máxima Verosimilitud y análisis Bayesiano.

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2 MATERIALES Y MÉTODOS

Se evaluaron 39 taxa de la división Angiospermae como in-group y 3 taxa (Cycadales, Ginkgoales y Coniferales) como out-groups. Se usó una matriz de 235 caracteres morfológicos

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modificada. Además, se utilizaron 2 genes mitocondriales (matR y atp1), 2 genes rDNA (18s y 26s) y dos cloroplásticos (atpB y rbcL). Los códigos fueron tomados de Qui et al, 2005

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y las secuencias faltantes del GenBank.

En el software POY 4.1.2.1

a

, se realizó un alineamiento mediante optimización directa y un análisis de sensibilidad con tres sets de costos (1:1:1, 1:2:2, 1:2:4), para transiciones:

transversiones: gap y un peso para la morfología equivalente al valor del gap. Para evaluar el mejor costo se hizo una búsqueda con build de 25 y de acuerdo con el ILD

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se seleccionó el mejor costo. Para el análisis de evidencia total se implementó build de 80 y bootstrap de 50.

Para los análisis Bayesiano y Máxima verosimilitud (ML), los modelos de evolución óptimos fueron escogidos usando JModelTest 0.1.1

b

, bajo el criterio Akaike (AIC). El alineamiento de las secuencias nucleotídicas se hizo tipo Muscle en el programa SeaView 4

c

.

El análisis Bayesiano fue realizado con MrBayes 3.2

d

, la probabilidad posterior fue hallada implementando el modelo GTR+I+G, 2 cadenas mcmc de 6,500,000 de generaciones y un burnin del 25%.

Los cálculos de ML fueron realizados bajo el modelo GTR+I+G usando PhyML 3.0

e

. Para el soporte se hizo bootstrap de 50 réplicas y se optimizó la topología, la longitud de las ramas y las tasas de substitución.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El análisis de sensibilidad de acuerdo con el índice de incongruencia de Farris (ILD)

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mostró que la iteración de costos óptima fue 1:1:1 (Ts/Tv/Gaps), con un ILD de 0.142 (Tabla 1).

Para el análisis de evidencia total (Fig. 1) de los seis genes más morfología se obtuvo una topología de longitud de 35,949 pasos. El árbol consenso aunque presenta buenos soportes de bootstrap no recupera la mayoría de los nodos de acuerdo al APGIII

10

, únicamente recupera las core Eudicotiledóneas. Teniendo en cuenta que Angiospermas es un grupo muy amplio, uno de los principales problemas para poder resolver las relaciones entre el grupo es obtener un muestreo significativo

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; Nuestro muestreo solo incluyó órdenes lo que pudo contribuir a una topología poco resuelta.

Para ML, el modelo evolutivo obtenido según el criterio de AIC de los genes 18s, 26s, atpB y rbcL fue GTR+ I+G y de los genes atp1 y matR fue GTR+G.

Las topologías obtenidas con los 6 genes fueron muy distintas entre sí, sin embargo, los genes 26s, atpB, rbcL y matR lograron recuperar el clado de las Eudicotiledóneas con un soporte de 34, 48, 48 y 15 respectivamente. Los anteriores genes junto con el gen atp1 recuperaron las core Eudicotiledóneas.

La topología de atpB (Fig.2) fue la que obtuvo un mayor número de clados soportados con

un bootstrap mayor a 25, es decir >50% (Tabla 2). Al comparar esta topología con la

publicada en APG III

10

, es posible observar que estas no difieren mucho en los clados

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principales: Eudicotiledóneas, Core Eudicotiledóneas, Magnolidae y las angiospermas más basales. La escogencia de atpB está respaldada bajo la idea de que las tasas de sustitución de los genes del cloroplasto son más lentas que las de genes nucleares,

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esto permite que aunque se comparen ordenes se pueda recuperar gran parte de las relaciones.

En análisis bayesiano se reconocen dos clados con alta probabilidad a posteriori: las Eudicotiledóneas y Magnolidae + Monocotiledóneas con probabilidades de 1 y 0,5 respectivamente. Las relaciones internas de Eudicotiledóneas son similares a las del APGIII

10

, con probabilidad de 1 para las core Eudicotiledóneas, Rosidae y Asteridae (Fig.3).

Tanto en ML como en análisis Bayesiano se obtuvieron topologías con ramas largas, principalmente para Monocotiledóneas. La selección de Acorus sp. como representante de este grupo genera la aparición de dichas ramas debido a que tiene secuencias altamente divergentes

8

. Lo anterior puede afectar la relación de Monocotiledóneas con el resto de angiospermas. Por ejemplo, en la topología del gen atp1 aparece Monocotiledóneas como grupo hermano de Buxales; y es posible que la posición de Monocotiledóneas como grupo hermano de Austrobaileyales en Máxima Parsimonia (MP) se esté dando por este mismo efecto, ya que este método es muy sensible a ramas largas

13

.

En todas las publicaciones y análisis cladísticos las dicotiledóneas forman un complejo parafilético y sus características de diagnóstico son principalmente plesiomórficas para Angiospermas

14

. La característica de dos o más cotiledones también está presente en Coniferales, Gnetales, Cycadales y grupos basales de Angiospermas de donde derivan las Monocotiledóneas y Eudicotiledóneas

15

.

El clado de las Eudicotiledóneas se encuentra altamente soportado en nuestro análisis Bayesiano y ML, varios estudios también corroboran su monofília

16,17

. Este grupo es reconocido por la sinapomorfía de polen tricolpado

15,18

y en nuestro análisis morfológico se encontró que los órdenes incluidos en este clado presentan dicho carácter.

Por otro parte, Ranunculales presenta una posición cambiante con respecto a las Eudicotiledóneas

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, en nuestro análisis de MP este orden se ubica como grupo hermano de Proteales fuera de las Eudicotiledóneas. Las Eudicotiledóneas son seguidas por el clado de las core Eudicotiledóneas

7,19

, encontrándose este clado bien soportado con los métodos implementados en este estudio.

Por último, se observó que las topologías de las angiospermas basales (Amborellales, Nymphaeales, Austrobaileyales, Cloranthales, Magnolidae, Ceratophyllales y monocotiledóneas) no fueron congruentes en los tres análisis. Sin embargo, con el gen atpB se presentó una topología similar a la del APGIII. Diversos trabajos siguen mostrando el conflicto existente para la resolución de estos grupos

8,18,20

.

CONCLUSIÓN

La monofília de las dicotiledóneas no fue corroborada por ninguno de los métodos empleados; en lugar de esto, se encontró que están divididas en la base y al final del árbol representado como el clado de Eudicotiledóneas.

El clado más interno de las Eudicotiledóneas (core Eudicotiledóneas) fue congruente en los

tres análisis, presentando un soporte alto en ML y MP, y una probabilidad a posteriori alta

en Bayes.

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Al observar que las topologías para cada gen fueron distintas en ML y que se encontraron ramas largas (principalmente para Monocotiledóneas), se reconoce que existen diferencias en la información que porta cada gen y que esta puede variar entre linajes. Es necesario tener en cuenta estos factores que pueden generar relaciones no congruentes en las topologías.

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comparison and combination with molecular data. International Journal of Plant Sciences 161, S121–S153 (2000).

PROGRAMAS

a. Varón,A., Vinh,L.S., Wheeler,W.C. POY version 4: phylogenetic analysis using dynamic homologies. Cladistics. 26: in press. (2010).

b. Posada,D. In press. jModelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and Evolution. (2008).

c. Gouy,M., Guindon,S., Gascuel,O. SeaView version 4 : a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building. Molecular Biology and Evolution 27(2), 221-224. (2010).

d. Huelsenbeck,J.P. & Ronquist,F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogeny.

Bioinformatics 17, 754-755. (2001).

e. Guindon,S. & Gascuel,O.A “A simple, fast and accurate algorithm to estimate large

phylogenies by maximum likelihood”. Systematic Biology 52(5), 696-704. (2003).

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6 FIGURAS Y TABLAS

Fig. 1 Análisis de Máxima Parsimonia, evidencia total con Bootstrap. Los taxa señalados son reconocidos por APG III como pertenecientes al clado Core Eudicotiledóneas.

Fig. 2 Topología del gen matB basada en Máxima verosimilitud. Los valores en los nodos

corresponden al soporte dado por un bootstrap de 50 réplicas.

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Fig. 3 Consenso de la mayoría, inferencia Bayesiana.

atpB atp1 rbcL 18s 26s matR Morfología ∑Genes Ev.Total ILD

costo 1:1:1

3239 1880 3215 1806 6981 3700 973 21794 25409 0,14227242

costo 1:2:2

4833 3182 4928 2679 10570 6321 1948 34461 41812 0,17581077

costo 1:2:4

6558 4761 6933 3521 14467 9062 3912 49214 64489 0,2368621

Tabla 1 Longitud de los arboles con tres costos evaluados para datos individuales y

evidencia total, y valores del índice de Incongruencia de Farris (ILD) para cada costo. Se

resalta el ILD óptimo (0,1422742).

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Tabla 2 Comparación de bootstrap para algunos grupos basados en APGIII (2009). En

análisis separados por gen en ML. Los valores van de 0-50, los guiones indican que el

clado no está presente en la topología del gen.

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