CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
ALTERACIONES EN LAS CARACTERÍSTICAS DE LAS CHISPAS DE Ca
2+EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE ARTERIAS CEREBRALES EN LA CONDICIÓN
DE SÍNDROME METABÓLICO
Tesis que presenta:
IBT. Mireille León Martínez
Para obtener el grado de Maestra en Ciencias
En la especialidad de BIOQUÍMICA
Directora de Tesis: Dra. Angélica Rueda y Sánchez de la Vega
Ciudad de México. Enero, 2017
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Bioquímica Cardiovascular del Departamento de Bioquímica, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, bajo dirección de la Dra. Angélica
Rueda y Sánchez de la Vega.
Durante este trabajo conté con la beca proporcionada por CONACYT #631955
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ÍNDICE
ÍNDICE...1
ABRE VIAT URAS...3
RESUMEN...5
ABSTRACT...6
1. INTRODUCCIÓN ... 7
1.1. El Síndrome Metabólico... 7
1.2. Estructura y función de las arterias cerebrales ... 8
1.3. Mecanismo de regulación del tono miogénico y respuesta miogénica en arterias de resistencia ...14
1.4. Características de las chispas de Ca2+ en CMLVs ...20
1.5. Expresión y distribución de los receptores de rianodina en CMLVs de arterias cerebrales ...21
1.6. Modulación de la frecuencia de las chispas de Ca2+ por nucleótidos cíclicos ...23
1.7. Los eventos cerebrovasculares ...26
2. ANTECEDENTES ...28
2.1. Alteraciones en las características de las chispas de Ca2+ en CMLVs de arterias cerebrales de ratones diabéticos ...29
2.2. La frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLVs de arterias cerebrales se incrementa en un modelo experimental de DM-1 ...31
3. JUSTIFICACIÓN ...33
4. HIPÓTESIS ...34
5. OBJETIVO GENERAL ...35
5.1. Objetivos Específicos ...35
6. MATERIALES y MÉTODOS ...36
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6.1. Tratamiento de los animales ...36
6.2. Determinación de los parámetros séricos ...36
6.3. Aislamiento de las arterias cerebrales ...36
6.4. Agentes vasodilatadores que incrementan la frecuencia de las chispas de Ca2+ vía cAMP/PKA y cGMP/PKG...37
6.5. Adquisición de imágenes en el microscopio confocal ...38
6.6. Análisis de Imágenes ...38
6.7. Análisis Estadístico ...41
7. RESULTADOS ...41
7.1. Características generales del modelo experimental ...41
7.2. Características espacio-temporales de las chispas de Ca2+ ...42
7.3. La activación de la vía cAMP/PKA incrementa la frecuencia de las chispas de Ca2+en CMLV...45
7.4. Efecto de la activación de la vía de cGMP/PKG en las características de las chispas de Ca2+ en CMLVs ...52
8. DISCUSIÓN ...58
9. CONCLUSIONES ...65
10. REFERENCIAS ...66
3
ABREVIATURAS [Ca2+]i – Concentración de Ca2+ intracelular
AC- Adenilato ciclasa
ACA- Arteria cerebral anterior ACM- Arteria cerebral media ACP- Arteria cerebral posterior AM- Acetoximetil ester
ATP- Adult treatment panel
BKCa-Canales de K+ activados por Ca2+ de alta conductancia cAMP- Adenosina monofosfato cíclico
CCDV- Canales de Ca2+ dependientes de voltaje cGMP- Guanosina monofosfato cíclico
CMLVs- Células de músculo liso vascular Ctl- Control
DM- Diabetes Mellitus DMSO- Dimetil sulfóxido
ECVs- Eventos cerebrovasculares F- Forskolina
F/F0 Máximo de la fluorescencia entre la fluorescencia basal FS- Flujo sanguíneo
HDL- Lipoproteínas de alta densidad NO- Óxido nítrico
NPS-Nitroprusiato de sodio P- Papaverina
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PKA- Cinasa de proteínas dependientes de cAMP PKG- Cinasa de proteínas dependientes de cGMP RS- Retículo sarcoplásmico
RyR- Canal de Ca2+/receptor de Rianodina
SCICR- Liberación de Ca2+ inducida por Ca2+ luminal (en inglés stored Ca2+-induced Ca2+ release)
SERCA- Bomba ATPasa de Ca2+ del retículo sarco/endoplásmico SM- Síndrome metabólico
SOICR- Liberación de Ca2+ inducida por una sobrecarga del compartimento (en inglés store-overload induced Ca2+ release)
SSN- Solución salina normal
STOCs- Corrientes salientes transitorias y espontáneas TRPs- Canales/receptores a potencial transitorio.
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RESUMEN
El síndrome metabólico (SM) constituye un problema de salud pública debido a su asociación con enfermedades del corazón y accidentes cerebrovasculares. Los canales de Ca2+/receptores de rianodina (RyRs) que se expresan en las células de músculo liso vascular (CMLVs) de las arterias de resistencia, generan liberaciones locales de Ca2+ conocidas como chispas de Ca2+ que promueven la vaso-relajación y cuyas características espacio-temporales se pueden modular a través de la activación de las vías de transducción de cAMP/PKA y cGMP/PKG. Las características de las chispas de Ca2+ se han encontrado alteradas en modelos experimentales de diabetes mellitus tipo I y II; sin embargo, en el SM, poco se sabe de las modificaciones en la actividad in situ de los RyRs vasculares y fue nuestro interés estudiarlo, mediante la caracterización de las chispas de Ca2+ en las CMLVs de las arterias cerebrales.
Se utilizaron Ratas Wistar macho recién destetadas que recibieron agua con sacarosa al 30 % como agua de bebida (grupo SM) o solamente agua (grupo Ctl) con acceso a alimento para roedores ad libitum, durante 4 meses. Se evaluaron las características espacio-temporales de las chispas de Ca2+ mediante microscopia confocal, en CMLVs de arterias cerebrales, cargadas con el indicador de Ca2+ Fluo- 4, en condiciones basales y en presencia de los vasodilatadores: nitroprusiato de sodio (NPS, 10 µM) que activa la vía de cGMP/PKG; o de Forskolina (F, 1 µM) más Papaverina (P, 10 µM) que activan la vía de cAMP/PKA.
La frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLV de arterias cerebrales en condiciones basales se encuentra disminuida en ratas SM (35%), sin cambios significativos en las otras propiedades de las mismas, lo que sugiere un compromiso en la relación expresión/función del RyR2.
La incubación de arterias cerebrales con los vasodilatadores F+P no incrementó la frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLVs de animales con SM, pero si incrementó la frecuencia de chispas en CMLVs control en 1.3 veces, aunque no de forma significativa. Sin embargo, en CMLVs de ratas SM se observó un incremento en la amplitud de las chispas atribuido posiblemente a una sobrecarga de Ca2+ del RS como efecto compensatorio a la posible disminución de la expresión de los RyRs. Lo que sugiere que la vía cAMP/PKA no se encuentra comprometida en CMLVs de arterias cerebrales en la condición de SM.
Por otra parte, la incubación de arterias cerebrales con el vasodilatador NPS tampoco incremento la frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLV de arterias cerebrales de ratas SM, pero si lo hizo de forma significativa con la frecuencia de las chipas de CMLVs de arterias control (1.6 veces). Adicionalmente también se observó un incremento en la amplitud de las chispas en CMLVs de animales con SM, lo cual puede explicarse de forma similar a lo observado con F+P. Estas evidencias nos permiten sugerir que tal vez existe una disminución en la biodisponibilidad de NO debido posiblemente a la interacción con ROS lo que comprometería la vía cGMP/PKG afectando de forma negativa el tono miogénico.
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ABSTRACT
The metabolic syndrome (MS) is a public health problem due to its close association with heart disease and cerebrovascular accidents. The intracellular Ca2+
channels/ryanodine receptors expressed in vascular smooth muscle cells (VSMCs) of resistance arteries, produce local Ca2+ releases known as Ca2+ sparks that promote relaxation and whose spatial-temporal properties are modulated via cAMP/PKA and cGMP/PKG transduction pathways. The characteristics of Ca2+
sparks have been found altered in VSMCs of experimental models of Diabetes Mellitus type I and II. However, in the MS, little is known about modifications in the in situ activity of vascular RyRs and it was our aim of study, through the Ca2+spark characterization in VSMCs of cerebral arteries.
Recently weaned male Wistar rats received 30% sucrose as drinking water (MS group) or just tap water (Ctl group), and rodent chow ad libitum, during 4 months. The spatial and temporal characteristics of Ca2+ sparks were assessed with confocal microscopy, in VSMCs loaded with the Ca2+ indicator, Fluo-4; under basal conditions and in the presence of the vasodilators, sodium nitroprusside (SNP, 10M), a cGMP/PKG transduction pathway activator; or forskolin (F, 1 M) plus papaverine (P, 10 M), activators of the cAMP/PKA transduction pathway.
Under basal conditions, the frequency of Ca2+ sparks in VSMCs of MS animals was diminished 35 % respect to controls, without significant changes in the other spark properties, suggesting an impairment in the RyR expression/function relationship.
The incubation of cerebral arteries with the vasodilators F+P did not rise Ca2+
spark frequency in VSMCs of MS rats; but it rose Ca2+ spark frequency in control VSMCs by 1.3 times, though it didn’t reach statistical significance. However, in VSMCs under MS condition an increase in the Ca2+ spark amplitude was observed, probably attributed to the SR Ca2+ overload. The latter as a compensatory mechanism due to a diminished RyR expression level. Our data suggest that the cAMP/PKA transduction pathway is not compromised in VSMCs of cerebral arteries under the MS condition.
On the other hand, the incubation of cerebral arteries with the vasodilators SNP did not rise the Ca2+ spark frequency in VSMCs of MS rats; but it rose Ca2+
spark frequency significantly in control VSMCs by 1.6 times. Additionally, an increase in the Ca2+ spark amplitude was observed in VSMCs of MS rats;
comparable with those effects of F+P. These evidences suggest a decrease in the NO bioavailability probably due to an interaction with ROS that is compromising the cGMP/PKG transduction pathway and the regulation of the miogenic tone.
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INTRODUCCIÓN
1.1 EL SINDROME METABÓLICO
El síndrome metabólico (SM) se define como el conjunto de trastornos fisiológicos y bioquímicos que incluyen la insulinorresistencia, la hiperglicemia, la hipertrigliceridemia, la obesidad abdominal, la hipertensión arterial, así como la presencia de factores protrombóticos y de marcadores proinflamatorios que son determinantes para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares y/o Diabetes Mellitus tipo 2 (DM-2).A través de los años, el SM ha recibido varios nombres incluyendo, síndrome X, síndrome de Reaven, síndrome de resistencia a la insulina, cuarteto de la muerte, síndrome dismetabólico y síndrome X plus. (Daskalopoulou et al., 2006). El SM fue descrito a principio de 1920 por Kylin, tomando al siguiente conjunto de parámetros para definirlo; hipertensión, hiperglicemia y gota. En 1947, Vague destacó a la obesidad abdominal como otra característica del SM, comúnmente asociada a anormalidades metabólicas que fueron encontradas en enfermedades cardiovasculares y DM-2 (Vague et al., 1947). Cuarenta años más tarde, Reaven describió la importancia clínica del “Síndrome X”, destacando los siguientes parámetros para describirlo, resistencia a la insulina, hiperglicemia, hipertensión, disminución de las lipoproteínas de alta densidad e incremento en los niveles de triglicéridos (Reaven, 1988).
En las últimas décadas ha ocurrido un marcado incremento en la prevalencia del SM en todo el mundo, probablemente ligado a la obesidad y la DM-2 como epidemia.
La patogénesis del SM aun es desconocida; sin embargo, en ésta participan la obesidad, el sedentarismo como estilo de vida, así como la interacción con la dieta, factores genéticos y probablemente otras características aún desconocidas.
El SM se caracteriza por la presencia de tres o más de los siguientes factores de riesgo (Tabla 1):
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El SM está asociado con el incremento de aproximadamente tres veces el riesgo de morir por enfermedades cardiovasculares (Grundy et al., 2006) y un 50% de sufrir un evento cerebrovascular (Boden et al., 2008), de ahí la importancia de estudiar los cambios moleculares que ocurren en las arterias cerebrales en la condición de SM.
1.2 ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS ARTERIAS CEREBRALES
En mamíferos, la sangre llega al cerebro a través de dos principales arterias:
la carótida interna y la arteria vertebral. La arteria carótida suministra principalmente al cerebelo juntándose con la arteria basilar la cual suministra al resto del cerebro y parte del cerebelo. La carótida interna y la arteria basilar están conectadas a través del polígono de Willis, el cual muestra una considerable variación en la distribución de patrones específicos incluso dentro de la misma especie de una población (Lee et al., 1995). En humanos el polígono de Willis está formado mayoritariamente por arterias cerebrales anteriores, arterias comunicantes posteriores y arterias
Tabla 1. Última actualización de la definición de SM (Grundy et al., 2005)
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cerebrales posteriores (Figura 1A). En ratas, la arteria carótida interna se ha convertido en una parte integral del polígono de Willis (Fig. 1B).
Figura 1. Diagramas que muestran la organización de arterias cerebrales de humanos (A) y ratas (B). Figura tomada de Lee et al., 1995.
En humanos, las arterias cerebrales posteriores están unidas por las arterias comunicantes posteriores a partir del polígono de Willis (Fig. 1A En ratas la controversia se refiere al nombre de las arterias que se unen en el extremo terminal de la arteria basilar para formar el polígono de Willis (Moffat, 1961). En ratas adultas la arteria cerebral posterior (ACP) deriva de una parte de la arteria comunicante posterior así que en realidad consiste de dos porciones (Fig. 1B). Una de ellas es un segmento de vaso pequeño que conecta la basilar a la arteria comunicante posterior. El otro es un segmento distal después de esta unión que se expande con diámetro igual de la arteria comunicante posterior (Fig. 1B), así que esto parece ser un vaso continuo largo de tamaño uniforme que se extiende a partir de la arteria carótida interna hacia la región caudal del hemisferio y este arreglo parece ser característico de las ratas albinas (Lee et al., 1995).
10 El Polígono de Willis
En la base del cerebro, las arterias carótidas y vertebro-basilar forman un círculo de arterias comunicante conocido como polígono de Willis. Desde este círculo, otras arterias - la arteria cerebral anterior (ACA), la arteria cerebral media (ACM), y la ACP emergen y viajan a otras partes del cerebro. Debido a que la carótida y las arterias vertebro-basilares forman un círculo, si una de las arterias principales es ocluida, las arterias distales pequeñas pueden recibir sangre de las otras arterias (circulación colateral). Tomado de strokecenter.org., 1999.
La arteria cerebral anterior
En humanos la ACA surge por debajo de la substancia perforada anterior y pasa sobre el nervio óptico y el quiasma para alcanzar la fisura del interhemisferio (Stephens y Stiwell, 1969). Siendo la más pequeña de las dos bifurcaciones de la carótida interna (la otra bifurcación es la ACM) y consiste de dos segmentos. El punto de división es el origen de la arteria comunicante anterior (Fig. 1A).
En ratas, generalmente los segmentos distales de las arterias anteriores están unidos al frente a partir de un tronco cerebral anterior común (Fig. 1B), el cual entra a la fisura del interhemisferio cerebral y se divide a lo largo de y dentro de las bifurcaciones izquierda y derecha para cada hemisferio cerebral (Lee et al., 1995).
La diferencia que existe en ratas con respecto a humanos es que no tienen una arteria comunicante anterior.
La ACA es una ramificación importante terminal de la arteria carótida interna (ICA). Forma el componente anterior del polígono de Willis junto con la arteria comunicante anterior (ACoA). La ACA suministra sangre a las porciones hemisféricas orbito-frontal y media del cerebro. Se curva alrededor y sobre el cuerpo
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calloso hasta el esplenium con ramificaciones centrales y corticales. (Gunnal et al., 2013).
Los infartos de ACA son poco comunes, pero los principales factores de riesgo para que se presenten estos eventos son: la hipertensión, diabetes mellitus, hipercolesterolemia, fumadores, fibrilación auricular e infarto al corazón (Kumral, et al., 2002).
La arteria carótida interna
En humanos cada arteria carótida entra por la cavidad intracraneal a través del canal carótida y aparece apenas lateral e inferior al quiasma óptico (Stephens y Stiwell, 1969), bifurcando dentro de las arterias cerebrales media y anterior.
En ratas la arteria carótida interna se ha convertido en parte integral del círculo de Willis antes de bifurcar dentro de las arterias media y carótida (Fig. 1B).
La arteria cerebral media
En humanos es la bifurcación más larga de la arteria carótida interna además de ser la arteria más ocluida (Stephens y Stiwell, 1969). Esta arteria accesoria surge de la arteria carótida interna o la arteria cerebral anterior.
En ratas la ACM es también la bifurcación más larga de la arteria carótida interna (Zeman e Innes, 1963; Greene, 1935), irrigando en gran parte al hemisferio cerebral, ramificándose sobre superficies laterales y dorsales.
La superficie de las ACM incluye la mayor parte de la superficie lateral del hemisferio cerebral. Esta arteria comúnmente es obstruida provocando infartos, el más frecuente en la patología cerebrovascular isquémica de ACM. La sintomatología clínica depende de la arteria afectada (cambios en la personalidad, discernimiento o trastornos de sincronización motora, desorientación y hemianopía), adicionalmente se presentan con frecuencia infartos arteriales al dañarse estas
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arterias (síndrome insular y trastornos sensitivos, motores y lingüísticos) (González y Boqousslavsky., 2012).
La arteria cerebral posterior
La ACP en humanos se origina a partir de la bifurcación de la arteria basilar (Stephens y Stiwell, 1969). Esta unida por la arteria comunicante posterior, formando el borde posterior del polígono de Willis.
En ratas existen dos segmentos: un segmento pequeño proximal, el cual conecta la arteria basilar con la arteria comunicante posterior y un segmento largo distal el cual es una continuación de la arteria comunicante posterior. Es poco común que las arterias posteriores exhiban simetría (Fig. 1B).
Estas arterias suministran a los lóbulos occipital y temporal del hemisferio cerebral izquierdo y derecho. Cuando ocurre un daño en la ACP, éste probablemente es secundario a la oclusión de los segmentos más bajos del sistema vertebral basilar o el corazón.
La arteria basilar
El sistema vertebral-basilar consiste de dos arterias vertebrales, el tronco basilar y dos arterias cerebrales posteriores (Figuras 1A y B). En humanos un tercio de la sangre que irriga al cerebro es suministrado por este sistema y se caracteriza anatómicamente por su alto grado de variabilidad en la distribución arterial (Stephens y Stiwell, 1969). Esta variabilidad ha causado cierta confusión en la clínica en donde un síndrome similar y/o área de daño puede ser producida por la oclusión de arterias diferentes.
La arteria basilar en humanos difícilmente recorre un curso recto. La curvatura que se forma aparece durante el desarrollo del individuo. El diámetro de
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la arteria basilar es usualmente más grande que las arterias vertebral e interna carótida.
La arteria basilar en ratas, en contraste es generalmente recta, ocasionalmente con una ligera desviación hacia un lado. Es también la arteria más larga conectada al polígono de Willis (Figuras 1A y 1B).
Las arterias anterolaterales
Son arterias pequeñas que se ramifican a partir la ACM y penetran lateralmente el cerebro. Oclusiones en estos vasos o de ramificaciones penetrantes del polígono de Willis, de la arteria vertebral o de la basilar son conocidas como infartos lacunares. Cerca del 20% de los infartos cerebrales son lacunares y su incidencia es alta en pacientes con hipertensión crónica. Por lo que estas arterias pequeñas son de nuestro particular interés. (strokecenter.org., 1999)
Independientemente de su localización, las arterias se encuentran formadas por tres capas, una interna o túnica íntima, la túnica media y la túnica externa o adventicia (Figura 2C). La zona central por la que fluye la sangre se denomina lumen o luz. La túnica íntima está formada por una capa de endotelio en contacto con la sangre, una membrana basal y una capa de tejido elástico (lámina elástica interna). La túnica media suele ser la más gruesa, está formada por fibras elástica y células de músculo liso (Figura 2D), las cuales le dan al vaso sus propiedades mecánicas y la fuerza contráctil, por consiguiente, el tono miogénico. La túnica externa o adventicia está formada principalmente por fibras elásticas y colágeno.
Una lámina elástica externa la separa de la capa media (Lee et al., 1995).
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Figura 2. A. Localización de las arterias cerebrales. B. Anastomosis de las arterias cerebrales (adam.com). C. Estructura de una arteria cerebral (Suárez, 2001). D. Célula de músculo liso de arteria cerebral (cortesía de Camacho-Concha N.A. Tesis de Maestría, 2012).
1.3 MECANISMO DE REGULACIÓN DEL TONO MIOGÉNICO Y RESPUESTA MIOGÉNICA EN ARTERIAS DE RESISTENCIA
Un incremento o disminución de la presión intraluminal dentro del rango fisiológico provocan contracción o dilatación arterial respectivamente; esta reacción arterial fue descrita inicialmente por Bayliss y se conoce como respuesta miogénica (Bayliss, 1902). La respuesta miogénica se considera importante en la autorregulación del flujo sanguíneo y la protección de la microcirculación distal (capilares y vénulas) a partir de cambios en la presión arterial (Davis et al., 1999).
La autorregulación del flujo sanguíneo asociada al diámetro arterial es descrita por la relación flujo-presión (Figura 3), donde el mantenimiento de un flujo sanguíneo constante en un rango amplio de presiones arteriales depende de que el diámetro arterial cambie. Esta capacidad de la vasculatura se presenta en órganos como el cerebro y el corazón que mantienen un flujo sanguíneo constante a través de un amplio intervalo de presiones arteriales (Classen y Zhang, 2011).
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El mantenimiento del tono miogénico arterial in vivo involucra múltiples mecanismos, y para conocerlos a detalle se ha recurrido a estudios de la respuesta miogénica in vitro, para lo cual se utilizan segmentos de arterias/arteriolas presurizadas (Kuo et al., 1988; Osol et al., 2002). En tales estudios el tono miogénico usualmente se refiere al grado de contracción arterial espontáneo en respuesta a una presión intraluminal determinada. Por otra parte, la respuesta miogénica se refiere a la reacción activa de la arteria a un cambio súbito en la presión intraluminal. Colectivamente el tono miogénico arterial, la respuesta miogénica y la capacidad de distensión arterial se conocen como propiedades miogénicas de las arterias (Kuo et al, 1988; Izzard et al., 2003; Osol y Halpern., 1985; Sun et al., 1992).
Varias investigaciones concernientes a estudiar los mecanismos involucrados en la regulación de las propiedades miogénicas de las arterias cerebrales pequeñas han establecido el papel fundamental de la despolarización de la membrana y la entrada de calcio (Ca2+) vía los canales de Ca2+dependientes de voltaje (CCDVs) (Knot y Nelson, 1995 y 1998; McCarron et al, 1997). La activación de los CCDVs incrementa la concentración de Ca2+ intracelular ([Ca2+]i) en las células de músculo liso vascular (CMLVs) lo que favorece la formación del complejo Ca2+-Calmodulina que activa a la cinasa de la cadena ligera de la miosina y provoca la formación de puentes cruzados actina-miosina y la subsecuente contracción. En condiciones de presiones intraluminales bajas (~ 0-50 mmHg) los niveles de tono miogénico arterial son bajos o ausentes, el tono miogénico se presenta en presiones intraluminales de 60 a 100 mmHg y está asociado con la despolarización de las CMLVs y a un incremento en la [Ca2+]i. Por otra parte, la remoción de Ca2+
extracelular con ayuda de un quelante de Ca2+,o bien, el uso de antagonistas de los CCDVs da como resultado una completa inhibición del tono miogénico de las arterias cerebrales (Knot y Nelson, 1995 y 1998; McCarron et al, 1997). La respuesta miogénica también es una consecuencia del incremento de la [Ca2+]i
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debido a un influjo de Ca2+ a través de los CCDVs (Knot y Nelson, 1998; McCarron et al., 1997).
La respuesta miogénica de las arterias cerebrales a cambios súbitos en la presión arterial también tiene una importante función en la autorregulación del flujo sanguíneo cerebral. Esto es importante cuando la presión se eleva ya que las arterias se contraen manteniendo el flujo sanguíneo constante (Figura 3). En condiciones de presión intraluminal superior a 150 mmHg, las arterias pierden la capacidad de autoregulación ya que el estrés tangencial que se ejerce en la pared es excesivo y supera la capacidad de las CMLVs de contraerse resultando en una dilatación forzada (Figura 3).
Figura 3. Autoregulación del flujo sanguíneo cerebral en un rango variable de presiones arteriales. Las líneas punteadas representan el límite inferior (50 mmHg) y superior (150 mmHg) de presiones arteriales en la cuales se presenta la autorregulación del flujo sanguíneo cerebral. Los círculos rojos representan los cambios en el diámetro de las arterias cerebrales que se registran respecto al cambio en la presión sanguínea, y las líneas azules representan el flujo sanguíneo cerebral con respecto a la presión sanguínea.
Figura de Pires et al., 2013.
La respuesta miogénica también se presenta cuando las arterias cerebrales son parcialmente contraídas con soluciones de alta concentración de K+ (>5 mM), lo cual induce la despolarización de la membrana plasmática y la activación de los
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CCDVs, incrementando la [Ca2+]i e induciendo la contracción, en estas condiciones la repolarización y relajación arterial depende de la diminución del K+ extracelular (Lagaud et al., 2002; McCarron et al., 1997).
Respecto a los canales iónicos de la membrana plasmática que se activan por el incremento en la presión intravascular y que favorecen la despolarización, se encuentran los canales/receptores de potencial transitorio TRPC6 y TRPM4, y se ha propuesto que regulan la respuesta miogénica (Brayden et al., 2008; Toth, et al., 2013). Ambos canales receptores se encuentran en arterias cerebrales de ratas (Toth, et al., 2013). En ratones hipertensos se ha evidenciado un incremento en la expresión de TRPC6 en la vasculatura cerebral y la activación de TRPC6 mediada predominantemente por el incremento del ácido 20-hidroxieicosatetraenoico (20- HETE) induce incrementos en los niveles de Ca2+ intracelular en CMLV, por lo que el TRPC6 contribuye a la respuesta miogénica en las arterias cerebrales (Toth, et al., 2013; Welsh et al., 2002). Por otro lado, existe evidencia que los canales TRPV4 regulan negativamente el tono miogénico (Bagher et al., 2012; Brayden et al., 2008).
La contracción en respuesta a cambios de presión es bloqueada por inhibidores de CCDV tipo L. A una presión constante, el diámetro arterial es muy sensible al potencial de la membrana plasmática y la hiperpolarización de la misma provoca vasodilatación, un mecanismo activado por muchos compuestos endógenos y vasodilatadores sintéticos que activan a las canales de K+ sensibles a Ca2+ y voltaje de alta conductancia (canales BKCa) (Figura 4A) (Nelson et al, 1995).
Por otra parte, los vasoconstrictores han demostrado que despolarizan a las CMLVs al inhibir a los canales BKCa (Figura 4B). La despolarización incrementa la [Ca2+]i
vía la activación de los CCDV y puede generar una vasoconstricción del 30 al 40%
(Brayden et al, 1991).
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Figura 4. La regulación del diámetro arterial depende de la activación de los CCDV y los canales BKCa. A. Cromakalim, un agonista de los canales BKCa tiene un efecto vasodilatador en las arterias cerebrales presurizadas (Nelson et al., 1995). B. La inhibición de los canales BKCa con caribdotoxina (CTX) despolariza y contrae a las arterias cerebrales (Brayden et al., 1991).
El incremento en la [Ca2+]i trae como consecuencia el aumento de la actividad de la bomba/ATPasa de Ca2+ del RS (o bomba SERCA) encargada de bombear el Ca2+ del citoplasma hacia los depósitos intracelulares. El incremento momentáneo en el nivel de Ca2+ del lumen del RS, activa a los RyRs de una forma rápida y espontánea generando liberaciones locales de Ca2+ conocidas como chispas de Ca2+, las cuales a su vez activan directamente a los canales BKCa y estos generan corrientes salientes transitorias espontáneas de K+ (o STOCs por sus siglas en inglés) que provocan una disminución en la probabilidad de apertura de los CCDVs, dando como resultado la relajación del músculo liso (Figura 5) (Essin y Gollasch, 2009; Nelson et al., 1995).
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Figura 5. Participación de las chispas de Ca2+ en la relajación del músculo liso.
Diagrama de flujo donde se muestran las respuestas fisiológicas que conducen a la relajación del músculo liso después de un evento de vasoconstricción inducida por el incremento en la presión intravascular (Diagrama modificado a partir de Essin y Gollash, 2009).
En las CMLVs de las arterias de resistencia existen dos tipos principales de señales de Ca2+ intracelulares: las globales y las locales. Las señales globales se refieren a aumentos en la [Ca2+]i en todo el citoplasma y disparan la contracción; las señales locales de Ca2+ se refiere a aumentos discretos en la [Ca2+]i conocidos como chispas de Ca2+ que se originanpor la apertura de clústers de RyRs y que participan en la relajación del músculo liso al favorecer el incremento del diámetro arterial.
Factores que regulan la activación de los RyRs, como su nivel de fosforilación y la [Mg2+] intracelular modulan la frecuencia y características de las chispas (Jaggar, 2001).
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1.4 CARACTERÍSTICAS DE LAS CHISPAS DE Ca2+ EN CMLVs.
Mecanismos de activación de las chispas de Ca2+
En diferentes tipos de CMLVs se ha observado que existen segmentos del retículo sarcoplásmico (RS) que se encuentran en estrecha cercanía (<20 nm) a la cara interna de la membrana plasmática (Devine et al., 1972; Lesh et al., 1998) con RyRs localizados a ~ 100 nm de distancia de ésta membrana (Gollasch et al., 1998; Lesh et al., 1998). La superficie de una chispa de Ca2+ mide de 2-3 m de diámetro y ocupa ~1% del volumen celular que puede afectar ~1% de la membrana celular en la cual residen los canales sensibles a Ca2+ incluyendo los canales BKCa
(Pérez et al., 1999).
Las corrientes salientes y espontáneas de K+ (o STOCs) mediadas por los canales BKCa fueron caracterizadas inicialmente por Benham y Bolton (Benham y Bolton, 1986) quienes propusieron que se originaban a partir de descargas repentinas del RS cercano a la membrana plasmática. Posteriormente, en el trabajo clásico del grupo de Nelson y colaboradores se demostró que las chispas de Ca2+
activan a los canales BKCa que producen los STOCs en CMLVs de arterias cerebrales (Nelson and Quayle, 1995). Adicionalmente, en otro trabajo de este mismo grupo de investigadores en donde realizaron registros simultáneos de STOCs y sparks en un misma CMLVs y se observó que virtualmente todas las chispas de Ca2+ activan STOCs sugiriendo un acoplamiento funcional entre los sparks y los STOCs (Pérez et al., 1999).
Una chispa de Ca2+ se forma a partir de la activación coordinada de un grupo o clúster de RyRs que generan una elevación local y transitoria de Ca2+ en el citoplasma (10-100 M) con una duración aproximada de 50 ms en CMLVs (Essin y Gollasch, 2009). La frecuencia y características espacio-temporales de las chispas de Ca2+ son reguladas por varios factores, entre los más importantes, la [Ca2+]SR. Esto se explica porque la activación de los RyRs varía en función de la [Ca2+]SR y por lo tanto de la actividad de la bomba SERCA (Gyorke y Fill, 1993; Gyorke y
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Gyorke, 1998; Xu et al., 1998), quizás en las regiones cercanas al poro del canal (Xu et al., 1998), actuando directamente sobre los RyRs desde el lado luminal o interactuando con proteínas de unión a Ca2+ como triadina y junctina en la membrana del SR (Gyorke et al., 2002, Gyorke et al., 2007). Este mecanismo de liberación de Ca2+ inducido por Ca2+ luminal(SCICR) debe estar involucrado en las CMLVs bajo condiciones fisiológicas (Burdyga y Wray, 2005; Collier et al., 2000;
Essin et al., 2007). También se ha observado que la frecuencia y la amplitud de las chispas de Ca2+ aumentan con una elevación en el Ca2+ extracelular(Satoh et al., 1997). Adicionalmente, existe evidencia que muestra que la velocidad de las chispas de Ca2+ puede incrementar o disminuir debido a la aplicación de fármacos que incrementan o disminuyen la actividad de los RyRs (Cheng et al., 2008).
1.5 EXPRESIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE LOS RECEPTORES DE RIANODINA EN CMLVs DE ARTERIAS CEREBRALES.
En las CMLVs de arterias cerebrales se han encontrado las 3 isoformas de los RyRs (RyR1, RyR2, RyR3), presentando una expresión y distribución espacial particular, siendo el más abundante el RyR2 (Knot, 2001). La localización subcelular de las isoformas del RyRs muestra también diferencias (Figura 6); la isoforma RyR1 se encuentra en mayor proporción en la región extra perinuclear, la abundancia de RyR2 es mayor en la región subplasmalemal (Fig. 6) siendo clave esta localización ya que de manera interesante esta isoforma del RyR es la que participa en la generación de las chispas de Ca2+ (Essin y Gollasch, 2009). Por último, los RyR3 se encuentran en mayor abundancia en la región extra-perinuclear y en la región perinuclear (Fig. 6); sin embargo, se ha encontrado que la disminución en la expresión del RyR3 en CMLVs incrementa la frecuencia de las chispas de Ca2+, estos hallazgos permiten sugerir que el RyR3 puede modular negativamente a RyR1 y/o RyR2 (Knot, 2001; Vaithianathan et al., 2010).
.
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Figura 6. Localización subcelular de las tres isoformas de RyRs en miocitos de arterias cerebrales. A) En la parte superior se observan imágenes representativas de miocitos de arterias cerebrales que muestran la localización diferencial de los subtipos de RyRs. De lado derecho se muestra un esquema de la célula que muestra las regiones subcelulares donde se localizan éstos canales. B) En la parte inferior se muestran los gráficos de barras que indican la abundancia de cada uno de las isoformas del RyR en las diferentes regiones subcelulares (Vaithianathan et al., 2010).
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1.6. MODULACION DE LA FRECUENCIA DE LAS CHISPAS DE Ca2+ POR NUCLEÓTIDOS CÍCLICOS.
Los nucleótidos cíclicos como el cAMP y el cGMP promueven la vasodilatación y en las arterias se generan por la activación de vías de transducción que involucran factores endógenos y terapéuticos (p. Ej., los receptores - adrenérgicos, los receptores a adenosina, el péptido relacionado con el gen de calcitonina, el óxido nítrico (NO), el factor natriurético atrial, y los nitrovasodilatadores sintéticos). Se han propuesto diversos mecanismos moleculares para explicar el efecto vasodilatador de los nucleótidos cíclicos, incluyendo la estimulación de la recaptura de Ca2+ por la bomba SERCA, la activación de los canales BKCa y los cambios en la sensibilidad por el Ca2+ de la maquinaria contráctil (Billington et al, 2013). La relajación de arterias cerebrales que es mediada por agentes que elevan los niveles intracelulares de cAMP o cGMP es inhibida al bloquear la actividad de los canales BKCa. También se ha observado que el cAMP (vía la activación de la cinasa de proteínas dependiente de cAMP o PKA) y el cGMP (vía la activación de la cinasa de proteínas dependiente de cGMP o PKG) incrementan la frecuencia de las chispas de Ca2+, las cuales a su vez activan a los canales BKCa (Porter et al., 1998).
La forskolina, el nitroprusiato de Na+ y el nicorandil incrementan la frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLVs.
La forskolina (F) es un activador de la adenilciclasa (AC) que eleva los niveles intracelulares de cAMP (Porter et al., 1998). Por otra parte, el nitroprusiato de Na+ (NPS) y el nicorandil son donadores de NO los cuales elevan los niveles de cGMP (Porter et al., 1998). Se ha observado que la forskolina incrementa significativamente la frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLVs (Figuras 7A y 7B). Por otra parte, los nitrovasodilatadores, NPS y nicorandil también incrementan
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la frecuencia de las chispas de Ca2+ (Fig. 7C). Tanto la forskolina, como el H-89 o el NPS no causan cambios significativos en la amplitud de las chispas de Ca2+ o en la velocidad de decaimiento de las mismas. Solo nicorandil causó un incremento significativo en la amplitud de las chispas de Ca2+ (del 8%). Debido a que las chispas de Ca2+ pueden activar a los canales BKCa entonces forskolina, NPS y nicorandil incrementan la frecuencia de los STOCs (Porter et al.,1998).
Figura 7. Incremento de las chispas de Ca2+ en CMLVs de arterias cerebrales y coronarias mediante el uso de agentes vasodilatadores (forskolina, nitroprusiato de sodio y nicorandil). A. Imágenes representativas de registros de chispas de Ca2+ donde se observa que el tratamiento de las CMLVs con forskolina (10 µM) incrementa la frecuencia de las chispas y un inhibidor de PKA, el H-89 (1µM), previene los efectos de forskolina. B y C. Gráficos de barras de los promedios ± ESM de la frecuencia de chispas de Ca2+ en CMLVs que se registraron después de los tratamientos con forskolina (10 µM), nitroprusiato de Na+ (SNP; 10 µM) y nicorandil (100 µM). Tomada de Porter et al., 1998.
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Se ha propuesto que la forskolina incrementa la frecuencia de las chispas de Ca2+ a través de la vía de cAMP/PKA, mediante la fosforilación del RyR y/o indirectamente a través de una elevación en el contenido de Ca2+ del SR (Porter et al., 1998). Por otro lado, se ha mostrado un incremento en la probabilidad de apertura de los RyRs en músculo esquelético y cardiaco a través de las vías de cAMP/PKA y cGMP/PKG observándose un aumento en la cantidad de Ca2+ del SR debido a una mayor actividad de la bomba SERCA por la fosforilación de fosfolamban (Marx et al., 2000). El incremento en la frecuencia de las chispas de Ca2+ promueve a su vez el aumento en la frecuencia y amplitud de los STOCs, los cuáles provocan una hiperpolarización de la membrana plasmática disminuyendo el influjo de Ca2+ vía los CCDVs y la contracción. Se ha sugerido que la modulación de la frecuencia de las chispas de Ca2+ por las vías de cAMP/cGMP también regula la entrada de Ca2+ plasmalemal y el contenido de Ca2+ en los depósitos intracelulares a través de la modulación del potencial de membrana de las células (Figura 8).
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Figura 8. Mecanismo propuesto por la acción de la forskolina y los nitrovasodilatadores en las chispas de Ca2+ y los STOCs en CMLVs de arterias cerebrales. La adenilato ciclasa (AC) produce cAMP por la aplicación de forskolina o por la activación del receptor de adenosina, lo cual activa a la PKA. La activación de PKA tiene un efecto directo en los RyRs y en los canales BKCa incrementando su probabilidad de apertura y la frecuencia de las chispas de Ca2+. Por otra parte el NPS produce NO que activa a la guanilato ciclasa (GC) generando cGMP que permite la activación de PKG. El RyR también posee sitios susceptibles de ser fosforilados por PKG, aumentando su probabilidad de apertura y por lo tanto la frecuencia de las chispas de Ca2+, lo que favorece la vasorelajación. (Imagen modificada de Porter et al., 1998.).
1.7 LOS EVENTOS CEREBROVASCULARES
Las arterias cerebrales representan una porción significativa de la resistencia cerebrovascular y determinan la presión vascular local (Kulik et al., 2008). Para mantener la integridad funcional del cerebro es crucial mantener una buena regulación del suministro sanguíneo. Por esta razón, alteraciones en la vasculatura
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cerebral como se ha observado en el SM, tiene un profundo impacto en la función cognitiva (Yates et al., 2012). Un compromiso o falla del influjo principal de los vasos debido a una oclusión es compensado por la circulación colateral en el cerebro.
Alteraciones estructurales y funcionales en los vasos sanguíneos asociadas al SM dañan las arterias pequeñas cerebrales resultando en microsangrados, lesiones en la materia blanca y atrofia cerebral (Sala et al., 2014). Entre los componentes del SM, la obesidad y la hipertrigliceridemia están asociados a una disminución en el volumen del tejido cerebral, y la hipertensión está asociada con una alta tasa de infartos (Tiehuis et al., 2014).
Estudios recientes sugieren que el SM daña la reactividad de las arterias cerebrales de resistencia en ratas Zucker obesas (Brooks et al., 2015). El SM también está asociado con el riesgo a desarrollar enfermedades cerebrovasculares.
En el estudio mencionado determinaron los cambios estructurales y funcionales en arterias cerebrales medias (ACM) durante la progresión del SM y los efectos crónicos de intervenciones farmacéuticas para el tratamiento de las alteraciones vasculares en ratas obesas Zucker, observando también que en ratas de mayor edad la biodisponibilidad del NO disminuye, existe daño en la capacidad de dilatación, incremento en las propiedades miogénicas, y rigidez de la pared vascular comparadas con ratas Zucker lean (Brooks et al., 2015); sin embargo, no se estudiaron los cambios en la regulación del Ca2+ intracelular en las CMVLs de este modelo experimental.
Los eventos cerebrovasculares (ECVs) están asociados con la disfunción endotelial, pero también se tiene evidencia que la capa muscular de las arterias de resistencia puede verse afectada, lo cual provoca que los mecanismos de contracción y relajación puedan verse comprometidos (Brooks et al 2015); sin embargo, las modificaciones que se pueden presentar en la actividad y expresión de los RyRs en las CMLVs en la condición de SM no se ha estudiado a detalle.
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2. ANTECEDENTES
Existen antecedentes que muestran que más del 65% de las personas con DM mueren de enfermedades cardiovasculares o infartos (Centers for Disease Control and Prevention. National diabetes, 2011). Considerando la incidencia - ajustada por cohortes de edad- de enfermedades cerebrovasculares o infartos en pacientes con DM-2, se ha observado que son de 2 a 5 veces más propensos de presentar estas alteraciones que los pacientes no diabéticos(Jorgense et al, 1994;
Mankovsky et al, 1996), esto puede deberse a una disfunción del tejido arterial cerebral. Se han reportado anormalidades en el flujo sanguíneo, daños en la reactividad vascular cerebral, ataques isquémicos transitorios y daño oxidativo de las arterias cerebrales en pacientes con DM-2 y modelos experimentales (Liao et al, 2008); sin embargo, los mecanismos moleculares involucrados en la disfunción de las arterias cerebrales no han sido dilucidados por completo.
Los ratones db/db, un modelo genético de DM-2 exhiben disfunción vascular cerebral, exacerbando el daño cerebral, edema e inflamación, después de inducir un infarto experimental (Tureyen et al., 2011). Además, las alteraciones reportadas en arterias cerebrales también se encuentran presentes en arterias mesentéricas (Pannirselvam et al., 2005), arteriolas coronarias (Bagi et al., 2003), arteriolas del músculo gracilis y aorta de ratones db/db(Miike et al, 2008).
Las arteriolas cerebrales de ratones db/db muestran daño en respuesta a vasodilatadores y una reducción en el diámetro arteriolar (Didion et al, 2005).
Por otra parte, otros investigadores han demostrado una incapacidad de dilatación que es independiente del endotelio en presencia de donadores de NO en arteriolas coronarias y aorta de ratones db/db y en arterias de pacientes con DM-2 después de la administración de trinitrato de glicerina (Williams et al, 1996). Todos estos datos sugieren que la parte de la función arterial que depende de músculo liso también se afecta en la DM-2. Además, parece que en la DM-2 se altera la respuesta
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funcional de las arterias de resistencia a los cambios súbitos de presión, no únicamente a nivel endotelial sino también en las capas activas del músculo liso.
2.1. Alteraciones en las características de las chispas de Ca2+ en CMLVs de arterias cerebrales de ratones diabéticos.
Las chispas de Ca2+ en las CMLVs representan la apertura coordinada de un número indefinido de RyRs dentro de un clúster. Su frecuencia y propiedades espaciales (p. ej. amplitud, duración y tamaño) se usan como indicadores de la actividad in situ de los RyR (Rueda et al., 2013). En CMLVs de arterias cerebrales de ratones db/db se reportó una frecuencia de las chispas de Ca2+ similar a la que se presenta en células control (Figura 9), sin modificaciones en el número de sitios con chispas por célula, su probabilidad de disparo o el número máximo de chispas por sitio (Rueda et al., 2013). Sin embargo, en estas mismas células se encontró una reducción significativa en la amplitud de las chispas de Ca2+ (Fig. 9C), su duración (Fig. 9D) y su tamaño (Fig. 9E), asociado a un decremento en la frecuencia, amplitud y área de las STOCs, lo cual se encontró que se podía explicar por una disminución en la expresión de los RyRs en tejido vascular de ratones db/db (Figura 10). La reducción en el tamaño duración y amplitud de las chispas, aunado a la disminución en las características de los STOCs pueden favorecer el aumento en el tono miogénico y la vasoconstricción de las arterias cerebrales.
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Figura 9. Disminución en la amplitud, duración y tamaño de las chispas de Ca2+ en CMLV de arterias cerebrales de ratones diabéticos. A. Imágenes obtenidas del confocal de CMLV cargadas con Fluo-3 (izquierda) y las imágenes line-scan representativas normalizadas (1.92/línea, derecha) mostrando chispas de Ca2+ en células control y de ratones db/db. B. Gráfico de barras que representa la frecuencia de las chispas de Ca2+C.
Amplitud (F/F0). D. Duración (Full Duration at Half Maximum, o FDHM en ms). E. Tamaño (Full Width at Half Maximum o FWHM, en m). Imagen tomada de Rueda et al., 2013.
Figura 10. Disminución en la expresión del receptor de rianodina en homogenados de tejido vascular de ratones db/db. A. Western Blot representativo del RyR obtenido de homogenados de tejido vascular. 30 g de proteína se sometieron a SDS-Page en geles de acrilamida al 15%, la proteína se transfirió a una membrana de PVDF y se probó con un anticuerpo anti-RyR (1:5000) y anti-actina (1:8000). B. Gráfica de barras normalizada de la expresión del RyR en tejido vascular de animales diabéticos (db/db) y sus controles (N=3 para cada grupo). Imagen tomada de Rueda et al., 2013.
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Por otro lado, también existen evidencias de alteraciones en las características espacio-temporales de las chispas de Ca2+ en modelos experimentales de DM-1 (Dong et al., 2008). Los pacientes con DM-1 son 9 veces más propensos a morir por infartos y otras enfermedades cardiovasculares (Brands et al, 2004). Al parecer, hay evidencias de que los eventos vasoconstrictores están relacionados con un influjo de Ca2+ exacerbado (Agrawal and McNeill, 1987) vía los CCDVs lo que contribuye a un incremento anormal en la [Ca2+]i en CMLV de pacientes con DM-1. Probablemente la DM-1 puede dañar a los canales BKCa lo cual resulta en un incremento en el influjo de Ca2+ y la vasocontracción, contribuyendo a la disfunción vascular.
2.2 La frecuencia de las chispas de Ca2+ en CMLVs de arterias cerebrales se incrementa en un modelo experimental de DM-1.
En el trabajo de Dong y colaboradores (2008) también se reportó una disminución en la actividad de los STOCs y en principio se propuso que esto se debía a una reducción en las características de las chispas de Ca2+. En la Figura 11A se muestran las chispas de Ca2+ de CMLVs de ratones control y de ratones con DM-1 inducida por estreptozotocina. En estos registros se observó un incremento significativo en la frecuencia y amplitud de las chispas de Ca2+ en miocitos DM-1 con respecto a los controles (Fig. 11B). Estos resultados permitieron concluir que la disminución en la actividad de los canales BKCa no necesariamente estaba relacionada con la actividad in situ de los RyRs (Dong et al., 2008) por lo que las modificaciones que se presentan en las características de las chispas de Ca2+ y STOCs en CMLVs en la condición de DM-2 no necesariamente son las mismas que en la DM-1. Sin embargo, en ambas patologías se coincide con que la regulación de las señales locales de Ca2+, la actividad de los canales BKCa y la función vascular están alteradas por los cambios metabólicos que se presentan en la Diabetes. Por lo que es de importancia fundamental determinar si estas alteraciones comienzan a presentarse desde el estado pre-diabético o surgen de forma posterior.
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Figura 11. Incremento de la frecuencia y amplitud de las chispas de Ca2+ en CMLV de arterias cerebrales de ratones con DM-1. A los ratones utilizados en este estudio se les indujo DM-1 con estreptozotocina. A. Imágenes representativas obtenidas por microscopia confocal en modalidad line-scan que muestran las chispas de Ca2+ que se registraron en CMLVs. Se muestra la frecuencia y amplitud de las chispas de Ca2+ en CMLV de controles y DM-1. B. Gráfico de barras de la frecuencia (sparks/s/m) y la amplitud (F/F0) de las chispas de Ca2+ en 109 miocitos controles y 99 miocitos diabéticos. *P<0.05 comparado con el control. (Dong et al., 2008)
acti vi ty of STOCs w as due to a reducti on i n Ca2 + sparks. Fi gure 2A show s Ca2 + sparks i n a control and di abeti c CA SM C, i ndi cati ng that the frequency and ampl i tude of Ca2 + sparks w ere both hi gher i n a di abeti c than control myocyte. A s summari zed i n Fi gure 2B, the mean frequency w as i ncreased from 0.127 0.01 sparks/ sec per mm i n control cel l s (n = 109 from seven mi ce) to 0.157 0.01 sparks/ sec
per mm i n di abeti c cel l s (n = 99 from seven mi ce, P < 0.05), w hereas the mean ampl i tude w as 0.407 0.01 DF/ F0 i n control cel l s and 0.477 0.01 DF/ F0 i n di abeti c cel l s (P < 0.05). These data suggest that the i nhi bi ted acti vi ty of STOCs i n di abeti c CA SM Cs i s not attri buted to the changes i n Ca2 + sparks.
Whol e-Cel l bi g-Conductance, Ca2 +-A cti vated K+ Channel Cur r ents ar e I nhi bi ted i n Type-1 Di abeti c M ouse Cer ebr al A r ter y Smooth M uscl e Cel l s
Whol e-cel l BK channel s currents w ere i nduced by depol ari zati on pul ses from 20 to 60 mV w i th 10-mV
2 s
A
B
C
250 pA
Control Diabetic
Frequency (Hz)
0 1 2 3 4 5 6
0 25 50 75 100 125 150
Amplitude (pA)
Week
Control
Diabetic (18)
(17)
(10)
(16)
(19)
(10) (15)
(17)
* *
*
* *
*
0 2 4 6 8 10
0 2 4 6 8 10
0 30 60 90 120 150
Amplitude (pA)
Test potential (mV)
Frequency (Hz)
Control Diabetic
0 1 2 3 4 5 6
(16)(15)
*
(16) (15)*
(16)
(15)* (16)
(15)* (16)
(15)*
-40 -20 0 20 40
* * *
* *
Figure 1 Frequency and amplitude of STOCs are decreased in freshly isolated CASMCs from streptozotocin-induced type-1 diabetic mice. (A) Representative recordings show STOCs recorded in a CASMC from a mouse without (control) or with diabetes for 5 weeks. Both cells were held at + 40 mV by means of the nystatin-perforated patch-clamp technique. (B) The mean frequency and amplitude of STOCs recorded at + 40 mV in CASMCs from mice without (control) and with diabetes for 1, 3, 5, and 10 weeks. The number in parentheses indicates the number of cells from at least five different mice in each group. * P < 0.05 compared with control. (C) Summary of the amplitude and frequency of STOCs at different membrane potentials from 40 to + 40 mV in control cells (n = 16 from seven mice) and 5-week diabetic cells (n = 15 from six mice).
* P < 0.05 compared with control.
0.00 0.04 0.08 0.12 0.16
Frequency (sparks/s/mm)
(109)
Control
(99)*
Diabetic
(99)*
Diabetic 0.0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
(109)
Control Amplitude (DF/F0)
10mm0.6DF/F0
Control
1s A
B
Diabetic
Figure 2 Frequency and amplitude Ca2 + sparks are increased in freshly isolated CASMCs from mice with streptozotocin- induced type-1 diabetes for 5 weeks. (A) Line-scan confocal images show Ca2 + sparks in a control and diabetic CASMC.
The images were taken with a Leica TCS SP2 laser-scanning confocal microscope. (B) Bar graph summarizes the frequency and amplitude of Ca2 + sparks in 109 control myocytes and 99 diabetic myocytes. Each group was consisted of seven mice.
* P < 0.05 compared with control.
Impaired BK channels in type-1 diabetic vascular myocytes L Dong et al 380
Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2008) 28, 377–386
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3. JUSTIFICACIÓN
El síndrome metabólico (SM) es altamente prevalente en la población y se considera un problema serio de salud debido a las complicaciones cardiovasculares asociadas, particularmente los accidentes vasculares cerebrales.
Diversos estudios realizados en CMLVs de arterias cerebrales en modelos animales en condición de DM-1 y DM-2 han mostrado alteraciones en las características espacio-temporales de las chispas de Ca2+ que son diferentes según el modelo.
Sin embargo, en CMVLs de arterias cerebrales en la condición de SM, no se han caracterizado los cambios que se pueden presentar en las propiedades de las chispas de Ca2+ ni en la expresión y regulación de los RyRs vasculares.
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4. HIPÓTESIS
En la condición de SM, la frecuencia de las chispas de Ca2+ se encuentra disminuida debido a modificaciones en la expresión/función de los receptores de rianodina que se expresan en las células de músculo liso vascular de arterias cerebrales.
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5. OBJETIVO GENERAL
Evaluar las características espacio-temporales (frecuencia, amplitud, duración y tamaño) de las chispas de Ca2+ en células de músculo liso de arterias cerebrales de ratas en condición de SM y sus controles, así como la modulación de la actividad in situ de los RyRs por efecto de vasodilatadores.
5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
En células de musculo liso vascular de arterias cerebrales de animales con SM y controles:
Evaluar las características espacio-temporales de las chispas de Ca2+ en condiciones basales.
Determinar el efecto de la activación de la vía de cAMP/PKA en la actividad in situ de los RyRs.
Determinar el efecto de la activación de la vía de cGMP/PKG en la actividad in situ de los RyRs.
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6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1 Tratamiento de los animales
El protocolo de tratamiento (100-14) fue autorizado por el Comité Interno para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (CICUAL) del Cinvestav, de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999.
Se utilizaron ratas Wistar macho recién destetadas las cuales se dividieron al azar en dos grupos: síndrome metabólico (SM), que recibió una solución de sacarosa al 30% como agua de bebida; y control (Ctl) que recibió agua sin sacarosa. Durante los 4 meses que duró el tratamiento permanecieron en jaulas One Cage 2100TM en condiciones de esterilidad, con temperatura (24°C) y ciclo luz-oscuridad (12h/12h) controlados. Ambos grupos fueron alimentados con alimento para rata Lab Diet 5001, ad libitum.
6.2 Determinación de los parámetros séricos
Después de los 4 meses de tratamiento, los animales se mantuvieron en ayuno durante 8 horas antes del sacrificio. Los animales se anestesiaron con pentobarbital (100 mg/kg) y se les inyectó heparina como anticoagulante (500U).
Todos los animales fueron pesados el mismo día antes del sacrificio. Posteriormente las ratas se sacrificaron tomándose sangre de la cavidad torácica para determinar los siguientes parámetros séricos: glucosa (mg/dL), triglicéridos (mg/dL) y colesterol-HDL (mg/dL) utilizando el dispositivo CardioCheckTM y las tiras correspondientes para cada parámetro. Como control de crecimiento se midió la longitud de la tibia.
6.3 Aislamiento de las arterias cerebrales
Las ratas fueron decapitadas y se extrajo el cerebro el cual fue colocado en una caja de Petri que contenía solución de disección (en mM: Ácido glutámico 80, NaOH 80, NaCl 55, KCl 6, MgCl2 2, Glucosa 10 y HEPES 10, pH 7.4).
