Métodos de determinación de G 1 en plasma humano

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(1)UNIVERSIDAD CENTRAL “MARTA ABREU” DE LAS VILLAS Facultad de Química- Farmacia. Trabajo de Diploma. Métodos de determinación de G-1 en plasma humano.. Diplomantes: Geidy Arbona García Migdacelys Arboláez Estrada. Tutores: Dra. Leisy Nieto Reyes Dr. Sergio Morales Fernández. Curso 2003-2004 “Año del 45 Aniversario del triunfo de la Revolución”.

(2) Resumen. Se validaron los métodos Espectrofotométrico y de Cromatografía de gases para la cuantificación del G-1 y resultaron ser fiables ya que cumplieron con los criterios de linealidad y sensibilidad. Con el estudio de las técnicas de extracción, utilizando la técnica espectrofotométrica, se demostró que tanto la extracción líquido-líquido como en la fase sólida se obtienen valores de recuperación de G-1 desde plasma humano alrededor del 50% en lo que influye la baja estabilidad del fármaco en medio acuoso..

(3) INTRODUCCION. Los compuestos de base furánica son un grupo de sustancias que son empleados por la industria químico- farmacéutica desde 1944, y se utilizan para combatir diversas enfermedades tanto en animales como en el hombre. El 1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno, conocido como G-1 es un principio activo de base furánica, sintetizado en el Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central de las Villas. Se ha comprobado que posee una potente actividad como bactericida- fungicida de amplio espectro, demostrada frente a microorganismos Gram positivos y Gram negativos, hongos y levaduras, siendo un buen candidato a formular como medicamento antimicrobiano. La obtención de formulaciones para uso sistémico a partir de este principio activo es un reto en el que se trabaja actualmente. Es conocido que para el registro de un medicamento es requisito indispensable, entre otros, la realización de ensayos que definan las propiedades y parámetros farmacocinéticos, que caractericen la absorción, biodistribución y excreción del fármaco, así como sus posibilidades para llegar al sitio de acción. En los estudios de biodisponibilidad, bioequivalencia y farmacocinética, las matrices biológicas son generalmente muy complejas y, en la mayoría de los casos, contienen a los analitos de interés a concentraciones muy bajas además, pueden presentarse interferencias. Por estas razones, a la determinación analítica frecuentemente le antecede procesos de extracción y concentración. Los métodos de cuantificación más empleados para este tipo de estudio son los cromatográficos, y en menor medida los espectrofotométricos. Para elegir el método específico es necesario demostrar con anterioridad su adecuado funcionamiento y fiabilidad, es decir, debe cumplir con los requerimientos de validación correspondientes..

(4) INTRODUCCIÓN. 4. En consecuencia, los objetivos de este trabajo son: Objetivo General: − Disponer de una metodología apropiada de extracción y cuantificación de G-1 con vistas a hacer las determinaciones en plasma, que pueda ser utilizada en los estudios farmacocinéticos. Objetivos Específicos: − Determinar algunos parámetros de desempeño para la técnica espectrofotométrica de cuantificación de G-1. − Evaluar comparativamente la utilidad de los métodos de extracción líquido-líquido y en fase sólida para extraer G-1 desde el plasma, a través de la técnica espectrofotométrica. − Determinar algunos parámetros de desempeño para la técnica por cromatografía de gases para la cuantificación de G-1..

(5) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Generalidades de la molécula de G-1: El 1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno, conocido como G-1, es un principio activo sintetizado en el Centro de Bioactivos Químicos de la Universidad Central de Las Villas. Su estructura química ha sido corroborada por diferentes técnicas como la espectrofotometría de masa, espectrofotometría infrarroja en estado sólido, espectrofotometría ultravioleta – visible y espectroscopía de resonancia magnético nuclear (RNM- 1 H) [Estrada, E., 1993] La fórmula estructural se muestra en la Figura 1: H H. H NO2. Br. O. Br. Figura 1: Estructura química del 1-(5-bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno. Actividad biológica y toxicidad del G-1: El G-1 ha mostrado potencial actividad in vitro como bactericida- fungicida de amplio espectro; comprobándose su efectividad frente a 908 cepas de bacterias Gram negativas y 119 cepas Gram positivas. Otros trabajos refieren su actividad frente a Enterobacter sp, Klebsiella y Pseudomona aeruginosa. Por otra parte González y col. en 1993 obtuvieron resultados similares frente a 293 cepas de hongos gemantes del género Candida. [González, O., 1993 A; González, O., 1993 B]. sido demostrada también frente a hongos dermatofitos y filamentosos.. . Esta actividad ha. [Estrada, E., 1993; González, O., 1993]. Estudios realizados por Blondeau y col. en 1997, amplían y corroboran estos resultados de actividad in vitro frente a 2702 microorganismos multi-resistentes. [Boldeau J.M., 1997] Como resultado de un estudio de toxicidad aguda por las vías oral y percutánea, en ratas Spragüe Dawley machos y hembras, el G-1 ha sido clasificado como ligeramente tóxico, con valores de dosis letal media de 1856.3 – 1506.2 y 2370 – 2205 mg/Kg de masa corporal, respectivamente. [Cortes, R.R., 1997; II]. Los estudios subcrónicos y crónicos por vía tópica, no registran manifestaciones clínicas.

(6) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 6. relacionadas con daños orgánicos de interés toxicológico por lo cual permiten su utilización por esta vía de administración. [Cortes, R.R., 1997; I,. II]. En cuanto al criterio del riesgo genotóxico se han tomado en cuenta los resultados de diez pruebas de mutagénesis y/o genotoxicidad realizadas a este principio activo, incluidos estudios teóricos [Estrada, E., 1998]. , estudios in vitro [Pant, K.J., 1996; Pérez, G., 1996; Xu J., 1996] y estudios in vivo [Carballo, N., 1997; I, II, III, IV ;. Rasbasco, A.M., 1991]. ; de las cuales los tests de Ames y Aberraciones cromosómicas en CHO fueron. positivos. En general, los resultados de las pruebas de mutagénesis sugieren que el G-1 se puede utilizar de forma segura como medicamento tópico en enfermedades infecciosas. [Pant, K.J., 1996] En relación con los resultados de la actividad biológica y toxicidad de este principio activo, el G-1 constituye una molécula tentativamente favorecida como alternativa terapéutica en la línea de los antiinfecciosos. En la actualidad se amplían los estudios de toxicidad y de preformulación, que permitan la diversificación de este principio activo en cuanto a formas farmacéuticas para su posible empleo en el tratamiento de numerosas afecciones a través de las distintas vías de administración de fármacos. [Szejtli J., 1988] Solubilidad y Estabilidad del G-1: Diversos estudios han evaluado la solubilidad y estabilidad del G-1, en estado sólido, disuelto en varios solventes y en presencia de algunos excipientes de uso tradicional en formulaciones farmacéuticas. El G-1 es muy fácilmente soluble en dimetilformamida, fácilmente soluble en éter etílico, cloroformo, dimetilsulfóxido y benceno; soluble en tetracloruro de carbono, poco soluble en metanol absoluto y etanol 90o, difícilmente soluble en etanol 70o, y muy difícilmente soluble en agua. [Jorge, E., 1993] Jorge y col.[ Jorge, E., 1993] realizaron un estudio de estabilidad del G-1 materia prima, donde se obtuvo que no sufrió degradación a una exposición de 35 días a condiciones de humedad de 100, 95, 86 y 76%, además, no se presentaron variaciones significativas en ninguno de los parámetros evaluados en muestras expuestas durante 91 días a la luz. Los estudios del comportamiento en disolución, evidencian que el G-1 es inestable en aceite de girasol, etanol absoluto; etanol comercial y 2–propanol, mostrando una mayor estabilidad en alcohol bencílico. [Jorge, E., 1993; Landry, F., 1990] Se ha comprobado que es estable en acetonitrilo y en mezcla de acetonitrilo/agua (80/20 % v/v), durante, al menos, una semana. Existe una fuerte acción de las luz sobre la degradación del G-1 en disolución, lo cual se le atribuye a una interacción específica solvente/G-1catalizada por la luz. [Ravin, L.J.] Molina y Rosado en 1995 en un estudio sobre productos de degradación del G-1 en mezclas de agua y diferentes solventes a pH ácido, básico y neutro demostraron la rápida degradación del mismo en estas condiciones, con la formación de 5-bromofurfural..

(7) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 7. La farmacocinética es la ciencia que estudia la evolución de los fármacos y sus metabolitos en el organismo a través del análisis cinético de las curvas obtenidas a partir de los fluidos biológicos, en función de la dosis administrada. La dinámica de un fármaco en el organismo, el tiempo de contacto con los receptores que le son específicos, la intensidad y la velocidad de sus transformaciones metabólicas condicionan, en gran parte, las modalidades de su acción farmacológica [Doménech J., 1997]. Evolución de los fármacos en el organismo. (LADME): La administración de un fármaco en una forma farmacéutica a un organismo humano o animal somete a las moléculas del fármaco a una serie de procesos: Liberación (L), Absorción (A), Distribución (D), Metabolismo (M) y Excreción (E). La farmacocinética de los principios activos aparece esquematizada en la Figura 2. [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech, J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es]. Metabolismo Forma Farmacéutica. Liberación L. Absorción A. M. Distribución D. Excreción Biofase E. Respuesta. Fig. 2: Esquema de los procesos cinéticos de los fármacos en el organismo. Cinética LADME.. [Doménech J., 1997]. Respuesta farmacológica: [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech J., 1997; www.icf.uab.es] La respuesta farmacológica viene determinada en general por la cantidad de fármaco que se fija en el lugar de acción. No es posible determinar la medida directa de dicha cantidad de fármaco, sin embargo, varios autores han sugerido que el concepto de actividad de un fármaco (y, por tanto la respuesta) depende de su concentración plasmática. Actualmente, se acepta de modo general que, para muchos fármacos, existe una relación entre la respuesta y su concentración plasmática. Los cambios de la concentración plasmática de la mayoría de los fármacos van acompañados de variaciones similares de su concentración en el lugar de acción, y en el número de complejos que se forman entre fármaco y receptor. Esto se cumple sólo para fármacos cuya acción dura mientras prevalece su presencia en el receptor. La gran mayoría de los fármacos están dentro de este grupo. Estudios farmacocinéticos. [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es] El estudio de la cinética LADME de un fármaco puede efectuarse en animales de experimentación y en humanos. Los estudios en animales permiten mayor número de posibilidades, pudiéndose tomar muestras de prácticamente todos los tejidos con el fin de caracterizar la distribución del fármaco,.

(8) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 8. pero el sustrato ideal para este estudio es la especie humana ya que, en general es la destinataria de los fármacos. Evidentemente, las posibilidades de muestreo en la especie humana son considerablemente menores que en las especies empleadas en los laboratorios. De hecho, el estudio de LADME se aborda mediante dos tipos de datos: 1. Las curvas de nivel plasmático: que se obtienen al representar en ejes cartesianos la concentración de fármacos en el plano de muestras de sangre obtenidas a tiempos prefijados. También se obtienen tomando muestra a intervalos regulares, centrifugando y en el sobrenadante (plasma) se determina la concentración del fármaco.. En ocasiones, se. emplean niveles séricos en lugar de plasmáticos. 2. Las curvas de excreción urinaria: que pueden representarse de forma distributiva o acumulativa y que nos dan criterio de la velocidad de excreción de los fármacos. Análisis compartimental: [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es;. www.icf.uab.es]. Los seres vivos son sistemas complejos en los que establecer relaciones cuantitativas entre la dosis de fármaco, la vía de administración empleada y la cantidad o concentración de fármaco en distintas zonas anatómicas y el tiempo transcurrido resulta difícil. Para lograr una adecuada descripción de la evolución temporal de los niveles del fármaco, se recurre a modelos en los que se expresan matemáticamente las velocidades de los procesos de absorción, distribución y eliminación, que finalmente llevan a ecuaciones que permiten describir y predecir las cantidades o concentraciones de fármacos en el cuerpo en función del tiempo. Los modelos compartimentales son los más usados en la Farmacocinética. Un compartimiento se define como una fracción de material biológico en la que el fármaco se supone uniformemente distribuido y en la que presenta las mismas propiedades cinéticas. Por lo tanto, un compartimiento tiende a agrupar zonas orgánicas afines, aunque en realidad se trata de un concepto meramente cinético, cuya entidad no es necesariamente fisiológica en sentido estricto, aunque si abarca zonas con constantes cinéticas semejantes. [Doménech J., 1997; www.icf.uab.es] Un compartimiento viene definido por sectores acuosos que ocupan un volumen determinado (V) y que contienen una cantidad determinada de fármaco (Q). Por tanto, la concentración de fármaco (C) en el compartimiento vendrá dada por el cociente entre Q y V:. C =Q. V. (1).. La cinética de entrada y salida del compartimiento puede ser, en principio, de orden cero, uno o de Michaelis Menten..

(9) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 9. En la elaboración de un modelo farmacocinético constituye un aspecto importante a tener en cuenta el saber si se trata de un modelo cinético lineal o no lineal. Puede definirse la linealidad cinética como una proporcionalidad directa entre velocidades de transferencias y concentraciones (o diferencia de concentraciones), por tanto, un modelo farmacocinético lineal es aquel en que los procesos cinéticos responden a una cinética de primer orden (proporcionalidad directa entre velocidad y concentración, o velocidad y cantidad si no hay variación de volumen). Modelo monocompartimental: [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es] Es el más sencillo, y representa al organismo, a efectos de la distribución, como un solo compartimiento. Su principal característica es que considera instantánea la distribución del fármaco, una vez administrado por vía intravenosa o extravasal. La representación esquemática del modelo aparece reflejada en la Figura 4. siendo:. DIV. Cc: Concentración de fármaco en el Compartimento. Div la dosis administrada por vía intravenosa.. QA. ka. Cc. ke. QA: dosis aplicada por vía extravasal. ka: constante de velocidad de absorción. ke: constante de velocidad de eliminación.. Fig. 4: Representación esquemática del modelo monocompartimental, administración intravenosa o extravasal.. Modelo bicompartimental: [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es] La mayoría de los fármacos requieren de un modelo algo más complejo, el bicompartimental, este pretende reflejar el hecho de que la distribución del fármaco en el organismo no es un proceso instantáneo.Aquellos tejidos con mayor aporte sanguíneo relativo, recibirán en los momentos inmediatamente posteriores a la administración (intravenosa o extravasal) del fármaco, un mayor aporte relativo de este, que se concretará en el hecho de que el equilibrio de la distribución del fármaco entre dichos tejidos y el plasma se alcanzará rápidamente, al contrario de lo que sucederá con aquellos tejidos con un menor aporte sanguíneo relativo. El primer compartimiento reseñado recibe el nombre de compartimiento central y el segundo es el compartimiento periférico (Figura 5). Los procesos de absorción, distribución y eliminación de los fármacos no son siempre estrictamente de primer orden, sino que en ocasiones se trata de procesos saturables. La absorción puede producirse mediante un proceso activo de transporte. La distribución puede estar afectada por la naturaleza saturable de la unión del fármaco a las proteínas plasmáticas, la unión saturable de los tejidos o, incluso el transporte saturable a través de las membranas celulares. La eliminación también puede verse afectada por la unión saturable a las proteínas plasmáticas o por la naturaleza de los mecanismos propios de la eliminación que responden a cinéticas de Michaelis Menten, como.

(10) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 10. la secreción tubular activa y el metabolismo. En estos casos podrían manifestarse modelos cinéticos no lineales. siendo:. QA. Cc: Concentración de fármaco en el Compartimento central.. DIV ka. Cp. k12. Cc. Cp: Concentración de Compartimento periférico. ke. fármaco. en. el. Div la dosis administrada por vía intravenosa.. k21. QA: dosis aplicada por vía extravasal. ka: constante de velocidad de absorción. k12: constante de velocidad de distribución. k21: constante de velocidad de retorno. ke: constante de velocidad de eliminación.. Fig. 5: Representación esquemática del modelo bicompartimental, administración intravenosa o extravasal.. Parámetros farmacocinéticos compartimentales: [Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es] Volumen de distribución aparente: Volumen acuoso que se requiere para contener la cantidad de fármaco que está en el cuerpo, si este estuviera uniformemente distribuido. Es llamado aparente porque se reconoce que todos los compartimentos en los cuales el fármaco esta distribuido pueden no tener la misma concentración, de hecho el volumen de distribución no es un volumen real. No obstante, es un parámetro farmacocinético útil.. Vd =. Qf Cp. (2). siendo Q f la cantidad de fármaco en el organismo y C p la concentración plasmática. Constantes de velocidad: Caracterizan el cambio de la concentración de fármaco en una región de referencia particular. -. La constante de velocidad de eliminación ( k e ) representa la eliminación total del fármaco desde el cuerpo; incluyendo la eliminación por excreción urinaria, biliar, por biotransformación y todos los mecanismos posibles de reacción del fármaco desde el organismo.. -. La constante de velocidad de absorción ( k a ) caracteriza la absorción, debe ser una constante para el fármaco y una ruta de administración en particular.. -. Las constantes de distribución intercompartimentales de distribución ( k12 ) y retorno ( k 21 ): caracterizan la facilidad del fármaco para viajar del compartimento central hacia los tejidos y su retorno..

(11) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 11. Aclaramiento: El aclaramiento (Cl) o depuración de un órgano es el volumen del medio de perfusión que es depurado de un fármaco por ese órgano en la unidad de tiempo. El aclaramiento renal se refiere al volumen de plasma que es depurado de un fármaco por ese órgano en una unidad de tiempo. Algunas sustancias son secretadas en alto grado por los túbulos renales, de modo que el plasma es completamente depurado en un sólo paso por el riñón. Tiempo de vida media ( t1 / 2 ): es el tiempo requerido para que la variable (X) decrezca a un medio de su valor inicial El tiempo de vida media de un proceso de primer orden es una constante para un proceso dado de velocidad y se calcula como: t1 / 2 =. 0,693 ke. [3].. Esto ilustra que t1 / 2 es independiente de la concentración inicial. En un proceso de orden cero el t1 / 2 será dependiente de la concentración inicial. Esta diferencia puede ser usada para diferenciar o distinguir los procesos de cinética de orden cero y orden uno, variando la concentración inicial o la dosis y midiendo el t1 / 2 resultante. Área bajo la curva (ABC): El área bajo la curva de perfil sanguíneo es uno de los parámetros farmacocinéticos más útiles pues permite determinar la cantidad de fármaco absorbido Análisis no compartimental: [Carrasco Jiménez, M.S., 2002; Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es] La farmacocinética no compartimental se basa en la aplicación de la cinética estadística al análisis de las curvas de nivel plasmático, de forma que se obtengan parámetros representativos de las mismas sin necesidad de ajustarlos a un modelo determinado. Varios parámetros farmacocinéticos pueden determinarse indistintamente, mediante tratamiento compartimental y no compartimental, otros sólo pueden calcularse mediante el modelo no compartimental, a través de la determinación de los momentos estadísticos. Parámetros farmacocinéticos no compartimentales: [Doménech J., 1997; Alfonso, www.farnaindustria.es] Tiempo de residencia media (MRT): es el tiempo que permanece el fármaco en forma inalterada en el organismo, durante su transito por él. Se estima como el 63 % de t1 / 2 . Área bajo la curva ( AUC0∞ ) o momento 0: equivale al área bajo la curva desde tiempo cero hasta infinito y está relacionada con la cantidad de fármaco absorbido. Área bajo la curva en el momento estadístico ( AUMC0∞ ) o momento 1: es el área del primer momento de la curva concentración desde tiempo 0 hasta infinito con extrapolación en la fase terminal, que posibilita el cálculo del MRT..

(12) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 12. La interpretación de los datos de los estudios farmacocinéticos depende en gran medida de la técnica analítica que se emplee [Calpena Campnamy, A.C., 1990; www.icf.uab.es; Tros De Llarduya, M.C., 1998; Castro Cels, 1989]. Determinación de los parámetros de desempeño de los métodos analíticos Existen parámetros de funcionamiento que definen la aptitud de un método analítico para el uso al que se destina. Dichos parámetros son los siguientes. [Calpena Campnamy, A.C., 1990; Skoog, D., 1994; Castro, 1989] Practicabilidad: son las que deciden si el procedimiento es fácil o difícilmente realizable en la práctica. Los parámetros de practicabilidad se evalúan en la en la fase de desarrollo del método analítico: tiempo, coste, tamaño de la muestra, tipo de equipo e instrumentación, condiciones de seguridad, etc. Idoneidad: son el conjunto de parámetros que garantizan que el sistema responde, en el momento del análisis, a los requisitos fijados en la validación del método. La idoneidad verifica el buen funcionamiento del sistema (instrumento y método) en el momento de su uso. Fiabilidad: son las que demuestran la capacidad de un método analítico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de la validación. Los parámetros que expresan la fiabilidad de los métodos analíticos son: linealidad, precisión, exactitud, sensibilidad y especificidad. Curva patrón: La curva patrón refleja la relación existente entre cantidad/contenido del analito en una solución de muestra y la respuesta de la medición resultante. La respuesta de la medición debe ser determinada utilizando al menos 6 puntos de medición diferentes. Las determinaciones se hacen sobre las muestras de referencia o sobre muestras– blanco a las cuales se les ha añadido el analito en concentraciones exactamente distribuidas cubriendo el rango de trabajo completamente. Las concentraciones deben seleccionarse en ambos lados del rango activo de trabajo. El experimento se repite, al menos una vez. Los resultados pueden presentarse gráficamente, se debe dar la ecuación de la regresión lineal, así como el coeficiente de correlación como una medida de la distribución (r>0.999). [NC, 2001] Los parámetros que expresan la fiabilidad de un método analítico son:. [Calpena Campnamy, A.C., 1990; Díaz. Polanco, I., 2000; Castro Cels, 1989]. 1. Linealidad: Es la capacidad de un método analítico de obtener resultados linealmente proporcionales a la concentración de analito en la muestra dentro de un intervalo determinado. En muchos casos se considera la linealidad como criterio inicial de validación. [Calpena Campnamy, A.C., 1990; Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989].

(13) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 13. Dentro de este término se incluye la proporcionalidad entre la concentración del analito y la respuesta, así como los intervalos o rango de concentraciones del analito para los cuales el método es satisfactorio. La linealidad se relaciona además, con la sensibilidad de calibrado o coeficiente diferencial entre la señal medida y la concentración del analito. Debe definirse la linealidad para concentraciones que cubran el ámbito total de interés. [Calpena Campnamy, A.C., 1990; Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989]. El ensayo de linealidad puede efectuarse tanto sobre soluciones patrón del analito como sobre muestras problemas que contengan concentraciones crecientes del analito. Se debe efectuar un tanteo previo con varios patrones que abarquen un rango de concentraciones más amplio que el intervalo de concentraciones a establecer, para así asegurar que el intervalo lineal dinámico del sistema instrumental sea más amplio que el intervalo de concentraciones a estudiar. Posteriormente se preparan una serie de patrones de analito de concentraciones crecientes. El número de soluciones patrón pueden ser de 3 a 10 y el intervalo de concentraciones se selecciona de acuerdo con las cantidades esperadas de analito en la muestra. [Calpena Campnamy, A.C., 1990; Fernández Serret, A., 1996; Castro. Cels, 1989].. Tratamiento estadístico de los datos obtenidos: Se debe efectuar una interpretación estadística de regresión: a) Coeficiente de correlación (r): refleja el grado de relación entre las variables X (concentración), y Y (la respuesta). Su valor máximo es 1. Si r es cercano a 0, el ajuste es pobre y la relación es débil y no existe; si r es cercano a la unidad, el ajuste es bueno y esto es indicativo de una fuerte relación entre X e Y, es decir, existe correlación con una probabilidad elevada. _. r=. _. ∑ ( X − X )(Y − Y ) _. _. ∑ ( X − X ) ∑ (Y − Y ) 2. = 2. ⎛ ⎜ X2 ⎜∑ ⎝. ∑ X ∑Y ∑ XY − n (∑ X ) ⎞ ⎛ ( Y) ⎟ −⎜ Y − ∑ − ∑ ⎟ ⎜ n n 2. 2. ⎠ ⎝. 2. ⎞ ⎟ ⎟ ⎠. (4). En análisis químico se obtienen valores de r elevados, iguales o superiores a 0.999, si bien el análisis de trazas se aceptan valores más bajos (iguales o superiores a 0.990). [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989].. b) Ensayos de linealidad: Existen varios procedimientos para verificar la linealidad: I.Coeficiente de variación de los factores respuesta. El factor de respuesta es la relación existente entre la lectura y la concentración. En una calibración lineal los factores de respuesta deben ser semejantes entre si y cercanos al valor de la pendiente, por lo que el coeficiente de variación de respuesta puede tomarse como una expresión de la.

(14) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 14. linealidad. Se considera que coeficientes de variación superiores al 5% indican falta de linealidad [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989]. .. Factores de respuesta: f i = _. Media de fi: f =. ∑f. Y X. (5). (6). i. n. Desviación estándar de f : Sf =. ∑( f. _. i. − f )2. n −1. Coeficiente de variación de f: CVf =. Sf _. (7). ,. (8). 100. f. II. Significación estadística de la varianza de la pendiente b de la recta de regresión. La pendiente b se llama también coeficiente de regresión. A mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de concentración del analito). [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989].. La varianza de la pendiente Sb se utiliza como expresión matemática de la linealidad: a menor varianza mejor linealidad. Se determina según: Sb 2 =. S 2Y , X. ∑. _. S 2Y , X. =. ( X − X )2. ∑X. (9). ( X) − ∑. 2. 2. n. Siendo S2Y,X la varianza del error experimental total, varianza residual o varianza de regresión de Y sobre X. El valor de S2Y,X se obtiene mediante las ecuaciones siguientes: _ _ ⎞ ⎛ ∑(Y − Y ) − ⎜⎝ ∑( X − X )(Y − Y )⎟⎠ _. 2. 2. S 2Y , X =. n−2. _. ∑( X − X ) = ∑Y 2. 2. − a∑Y − b∑ XY n−2. _. ∑(Y − Y ) = n−2. 2. (1 − r 2 ). (10). La desviación estándar o error estándar de la pendiente Sb y la desviación estándar relativa Sbrel. (%), también pueden ser empleadas para expresar la linealidad. Sb = Sb 2. Sbrel (%) =. (11). Sb 100 b. (12).

(15) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 15. Criterio de aceptación Sbrel (%) ≤ 2%. Los límites de confianza de la pendiente se hallan a partir de la expresión: b ± tSb siendo t el valor de Student para n-2 grados de libertad a la probabilidad escogida (p = 0.05) Otro test estadístico de b se deduce de la expresión: t exp =. b Sb. (13). .. En la tabla de t se halla el grado de significación para n-2 grados de libertad. Hipótesis nula: b=0 Si texp>ttab significa que la probabilidad de ser b≠0 es muy elevada. [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989]. III.Análisis de la varianza de la regresión. Este método sólo puede aplicarse si existen réplicas para cada concentración. El valor de Fexp es la relación entre la varianza no lineal (debida a la falta de ajuste entre la recta de regresión y los datos experimentales) y la varianza dentro de las series (debido al error experimental dentro de las series) si Fexp < Ftab (Fn1-1/n2-1, p=0,05) para un grado de significación determinado implica que la linealidad es correcta. [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989] c. Por test de proporcionalidad. En el caso ideal el valor de la intercepción con el eje de las ordenadas el origen (a) debe ser cero pues indica el error sistemático del método. La varianza del término independiente se calcula según: Sa = Sb 2. 2. ∑X n. 2. S 2Y , X. =. (∑ X ) −. 2. ∑X. 2. n. ∑X n. 2. ∑X. S 2Y , X. =. ∑. − ⎞ ⎛ ⎜X − X⎟ ⎠ ⎝. 2. 2. (14). n. La desviación o error estándar es: Sa = Sa 2. Sa rel (%) =. (15). Sa 100 a. (16). Los límites de confianza del término independiente son: a ± tSa siendo t el valor de la distribución de student para n-2 grados de libertad a la probabilidad escogida, generalmente p= 0,05. Si los límites incluyen el cero, se cumple la condición de proporcionalidad [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989]. La significación estadística de a se puede deducir de la expresión: t exp =. a Sa. (17).

(16) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 16. En la tabla se t se halla el grado de significación para n-2 grados de libertad. Hipótesis nula a=0. [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989]. 1.1 Sensibilidad de calibrado: La sensibilidad de calibrado o coeficiente diferencial entre la señal medida y la concentración del analito es igual al valor de la pendiente de la curva de calibrado a una concentración determinada. En el caso de una calibración lineal, la pendiente b de la recta de regresión coincide con la sensibilidad de calibrado y con el factor respuesta. [Fernández Serret, A., 1996; NC, 2001; Castro Cels, 1989] La sensibilidad indica la capacidad de respuesta del método analítico a pequeñas variaciones de la concentración del analito. En un método analítico sensible, ligeros incrementos de concentración conducen a incrementos notables de señal o respuesta. Valores aceptables de los parámetros de linealidad. [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989] a. Expresión de la recta de regresión: Y = bX + a b. Coeficiente de correlación: r ≥ 0,99 c.. Prueba de linealidad: CV f ≤ 5% , Sbrel ≤ 2%. d. Prueba de proporcionalidad: a ± t.Sa debe incluir al cero para p = 0,05 2. Determinación de los límites de detección y de cuantificación El límite de detección es un parámetro analítico de gran interés en ensayos límites. Es la menor concentración o cantidad de analito que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las condiciones experimentales establecidas. El límite de cuantificación es un término cuantitativo, es la menor cantidad medible. 3. Precisión: Es el grado de concordancia entre resultados analíticos independientemente obtenidos bajo condiciones específicas. La precisión depende solamente de la distribución de los errores aleatorios, y no está asociada con el valor verdadero. Se expresa generalmente como la desviación típica de los resultados analíticos. Una baja precisión produce una elevada desviación típica. La precisión es una característica importante en la elevación de todos los métodos cuantitativos. Este aspecto depende mucho de las condiciones bajo las cuales ha sido estimado. Las condiciones de repetibilidad y reproducibilidad representan evidentemente condiciones diferentes mientras que la reproducibilidad interna cae dentro de estos dos extremos. - Repetibilidad: Una estimación de repetibilidad de un método se obtienen cuando los resultados analíticos provienen de idénticas porciones de ensayo, en el mismo laboratorio, obtenidos por el mismo analista, utilizando el mismo equipo y dentro de un corto intervalo de tiempo..

(17) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 17. Precisión intermedia o Reproducibilidad: puede estimarse sobre la base de los resultados. -. obtenidos cuando el método se utiliza para analizar idénticas porciones de un ensayo en diferentes laboratorios empleando diferentes equipos. Se entiende por reproducibilidad interna, la concordancia de resultados cuando los análisis se llevan a cabo en el mismo laboratorio, utilizando el mismo método, pero ejecutado en diferentes momentos por diferentes analistas empleando por ejemplo diferentes lotes o reactivos. Para este tipo de estudio se recomienda realizar al menos 10 determinaciones (óptimo 30) sobre el _. mismo material de muestra y calcular la media aritmética ( X ), desviación estándar ( S ) y desviación estándar relativa o coeficiente de variación ( CV ), donde se toma como criterio que CV ≤ 2% para HPLC y CV ≤ 3% para otros tipos de métodos [PMA/USA, 1986; NC, 2001] Expresión de la precisión de un método analítico: a. Desviación estándar y coeficiente de variación: el valor aceptable de precisión de un método analítico depende de la concentración del analito y del número de repeticiones del análisis. [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989]. _. Media aritmética: X =. ∑X. desviación estándar: S =. (18). i. n. ∑. _ ⎞ ⎛ ⎜Xi − X ⎟ ⎠ ⎝ n. Coeficiente de variación: CV =. S _. 2. (19). (20). 100%. X. La relación entre el coeficiente de variación del método y el coeficiente de variación del sistema es aproximadamente la siguiente: CVmétodo=CVsistema 2 b. Límites de confianza: [Fernández Serret, A., 1996; Castro Cels, 1989] I.De los resultados individuales: media ± desviación estándar multiplicada por la t de student _. X = tS. (21). siendo t el valor de t student tabulada para n-1 grados de libertad y una significación, generalmente, del 95 %. I. De los resultados promedio: los límites de confianza de la media de una serie de resultados son: _. X = tS x. (22).

(18) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 18. ⎛ S ⎞ ⎟⎟ siendo S x la desviación estándar de la media ⎜⎜ ⎝ n⎠. Determinación de la reproducibilidad: Para evaluar estadísticamente estos resultados debe desarrollarse: Parámetros. Analista 1. Analista 2. Media. _. _. X1. X2. Desviación estándar número de muestras. S1. S2. n1. n2. a) Prueba de significación de Fischer: se utiliza para determinar si existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos para el mismo método para analistas diferentes. Se desarrollará un ensayo de Fischer con alternativa bilateral, ya que se pretende conocer si existe diferencia en cualquier dirección.. Determinándose: F =. S 12. (23). S 22. S 1 : Desviación estándar del analista 1. S 2 : Desviación estándar del analista 2.. El valor crítico de Ftab se debe consultar en las tablas estadísticas, para lo cual debe hallarse el número de muestras para un analista individual. Si Fexp< Ftab (Fn1-1, n2-1, p=0,05) no existen diferencias significativas entre la precisión alcanzada por los analistas. [Fernández Serret, A., 1996; NC, 2001] b) Prueba de significación de student: esta prueba permite determinar si existen diferencias entre las medias que sean estadísticamente significativas. _. Cálculo de t: t =. _. X 1− X 2. (24). 1 1 + S n1 n 2. donde S 2 =. (n1 − 1)S12 + (n 2 − 1)S 22 (n1 + n 2 ) − 2. (25). Si texp<ttab (p=0,05), grados de libertad igual a ( n1 + n 2 − 2 ) no existen diferencias significativas entre las medias obtenidas..

(19) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 19. Si se concluye que no hay diferencias significativas, entonces el estimado promedio de los analistas Fernández Serret, A.,. puede ser usado para calcular los límites de confianza para un 95 % de la media. [ 1996]. 3. Intervalo de concentración: Es el intervalo de concentración de un analito que reúne los requisitos de calidad del método, experimentalmente demostrado. Todos los métodos tienen una sensibilidad limitada que restringe el intervalo de concentración para el cual el método es apacible.. Fundamento teórico de la técnica analítica Espectrofotometría UV-Visible. [Calpena Campnamy, A.C., 1990; Skoog, D., 1994; www.ferber.hpg.ig.com; web2.senasica.sagarpa.gob.mx]. Es conocido que al hacer incidir energía radiante sobre una especie molecular, esta absorbe energía de la radiación sólo en regiones específicas del espectro, donde la radiación tiene la energía requerida para provocar cambios en los niveles electrónicos para los electrones de valencia, trayendo como resultado una transición electrónica. Esta energía puede ser cuantificada, lo que conduce a una banda de absorción a la longitud de onda de la energía involucrada. Este fenómeno, de forma general, constituye el basamento de la espectroscopía ultravioleta-visible. Las principales características de una banda de absorción son: posición, intensidad y forma. La posición viene dada por la longitud de onda de la radiación cuya energía es la requerida para la transición electrónica. La intensidad de absorción de una banda puede expresarse como la absortividad molar en el máximo (E max) y depende de la probabilidad de interacción entre los fotones de la radiación y el sistema electrónico de la molécula. La forma de la banda depende del número e intensidad relativa de los componentes vibracionales de una transición electrónica. [Pérez, C., 1985; Silverstein, R.M.] Los solventes utilizados en técnicas analíticas que aplican la espectroscopía ultravioleta deben ser los apropiados tanto por su alto nivel de pureza, como por su transparencia en la zona de trabajo y sus posibles efectos en el sistema absorbente. La naturaleza del solvente influye en la posición de los máximos de absorción. Es necesario emplear solventes idénticos cuando se comparan espectros de absorción para fines de identificación. [Castaño, F.; Pina, G.] El cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, es la base de los métodos de análisis cuantitativo, la cual establece que la fracción de la luz incidente que se absorbe por una muestra, es proporcional al número de moléculas encontradas en su camino, o sea, si la sustancia está disuelta en un disolvente, la absorción de la solución será proporcional a la concentración molar del soluto, siempre que el disolvente no presente absorción en la misma zona. [Castaño, F.; Pérez, C., 1985; Pina, G] A = log(I 0 I ) = ε .c.l. (28).

(20) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 20. Donde:. ε :Coeficiente de absorción (absortividad). c: Concentración. l: Espesor de la cubeta. Si c se expresa en g mol/L y l en cm, el coeficiente de absorción se convierte en coeficiente de extinción molar (absortividad molar). La intensidad de absorción se expresa generalmente en función de ε y la mayoría de las aplicaciones en espectrofotometría se basan en la ecuación antes mencionada. El comportamiento de una sustancia respecto a la ley de Lambert-Beer debe comprobarse construyendo un gráfico de concentración contra absorbancia. En ocasiones muchos sistemas varían su absorbancia en forma no lineal a altas concentraciones, ocurriendo desviaciones positivas y negativas de la ley; no es imprescindible que el sistema cumpla estrictamente la ley para poder usarse en el análisis, pues puede utilizarse sólo en el intervalo de concentración en que se cumpla. Hoy en día no se acepta como regla espectrofotométrica la validez de esta ley para ningún sistema, si no ha sido previamente comprobada. Cuando se desarrolla un método espectrofotométrico para la determinación cuantitativa de una sustancia se debe comprobar la validez de dicha ley para el disolvente empleado y en el intervalo completo de concentraciones en el que se va a trabajar. [Castaño Almendra, F.] La espectroscopía UV-VIS es una extensión de la colorimetría ya que permite determinar la absorción de luz en una muestra, en el intervalo de longitudes de onda comprendido entre 190 y 700 nm. Para la determinación en la región ultravioleta es necesario emplear portamuestras de cuarzo que no absorbe en esta zona del espectro. [www.chemendia.com.; ]. Fundamento teórico de la técnica analítica Cromatografía Gaseosa [Cela R., 2002; Rubinson, K.A., 2000]. La cromatografía de gases es un método físico de separación en el que la fase móvil es un gas; comúnmente se emplean el Helio y Nitrógeno mientras que la fase estacionaria, contenida en una columna, es un sólido o un líquido impregnado en un soporte sólido inerte, o una película líquida que recubre uniformemente las paredes de la columna, en ella se produce la separación de los solutos. Cuando la fase estacionaria es de baja polaridad la separación se produce en base a la volatilidad relativa de los compuestos, la cual está en función de la temperatura de ebullición y ésta a su vez está en correspondencia con la masa molecular y la distribución espacial de la molécula. Para la obtención del cromatograma se hace indispensable la utilización de detectores, uno de los más.

(21) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 21. utilizados es el de ionización por llama. Este detector es considerado universal, y la respuesta depende del factor carbono: cuantos más carbonos tenga la molécula, más sensible será el detector a ese compuesto. El detector da una respuesta proporcional a la concentración, lo que se traduce en una mayor o menor altura del pico la cual puede ser utilizada para la cuantificación. La Cromatografía de Gases es el método de elección para la separación de sustancias volátiles y térmicamente estables. Este campo de aplicación involucra un enorme número de sustancias orgánicas y organometálicas, así como gases permanentes, lo cual convierte a la técnica en una de las más versátiles y potentes en el laboratorio analítico. Ninguna otra técnica de separación es capaz de proporcionar una resolución equivalente y a la vez, una sensibilidad tan elevada. Esto significa que, en realidad, la principal limitación de la técnica está en la estabilidad térmica de los componentes de la mezcla o de la propia matriz. En la práctica, el límite de temperatura de trabajo se sitúa en torno a los 450º C. La disponibilidad de detectores versátiles y específicos, y la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectrómetro de masas o a un espectrofotómetro infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la Cromatografía de Gases. La Cromatografía de gases ha sido ampliamente utilizada para la cuantificación de principios activos, tal es el caso, del 1-(5-bromofur-2-il)- 2- bromo-2-nitroeteno(G-1). [Bravo, L., 1999]. ; el cual puede. ser cuantificado por Cromatografía de Gases usando nitrógeno como gas portador, columna de vidrio de 1metro de longitud y 4 mm de diámetro interno, relleno de 6% de silicona GE SE-30 sobre Chromosorb W/HMDS de 80 a 100 mallas y detector de ionización por llamas.. Métodos de Extracción de fármacos La determinación de los fármacos directamente en los fluidos biológicos es muy compleja por lo que se hace necesario técnicas de separación, tales como: 1. Extracción líquido – líquido: Pretende la separación de los analitos de sus interferentes mediante el reparto de la muestra entre dos fases líquidas inmiscibles, generalmente una de ellas es acuosa y la otra orgánica. La selección de estas fases así como el uso de aditivos que modifican los procesos de equilibrio determinaran la selectividad y eficacia del proceso de extracción. [Majors, R.E., 1997] La ley de distribución de Nernst [Thurman, E. M., 1998] establece que cualquier especie distribuirá entre dos disolventes inmiscibles, de tal manera, que la razón de concentración permanezca constante. Kd =. C0. C ac. (29).

(22) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 22. donde: K d : es la constante de distribución. C 0 : es la concentración del analito de la fase orgánica. C ac : es la concentración del analito de la fase acuosa.. De otra forma la fracción del analito extraída: E = C 0V 0 (C 0V 0 + C acV ac ) = K d V (1 + K d V ). (30). donde: V0 : es el volumen orgánico. V ac : es el volumen acuoso. V : es la razón entre los volúmenes, es decir, V0. V ac. .. Para que en un sólo paso de extracción, el analito pueda concentrase cuantitativamente en una de las fases, será necesario que el valor de K d fuera suficientemente grande (superior a 10). Por eso en la mayoría de los casos, los procesos de extracción líquido – líquido necesitan de dos o más pasos de extracción. A partir de la ecuación anterior, conociendo K d y V puede llegarse a la expresión para predecir el número de pasos de extracción (n) que serian necesarios para obtener una recuperación cuantitativa del analito.. E = 1 − [1 (1 + K d V ]. n. (31). En su forma más simple la extracción líquido – líquido se lleva a cabo en embudos separadores en los que se puede realizar uno o varios pasos de extracción. También se han desarrollado variantes como la extracción continua y la distribución contracorriente, que han demostrado ser útiles en la manipulación de muestras que contienen analitos con bajas constantes de distribución, la microextracción líquido – líquido con la que puede obtenerse mayor sensibilidad empleando menores volúmenes de disolventes, y los sistemas de extracción “on line” que permiten trabajar a un tiempo con un gran número de muestras. Los sistemas de extracción pueden ser de modo off line u on line y se explican de la siguiente manera: On line: es ventajoso en términos de seguridad, costo, precisión (minimiza errores de operación y perdidas de analito) y tiempo, mientras que las pequeñas dimensiones de la columna conducen a disminuir los valores de costo..

(23) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 23. Off line: permiten usar cantidades mayores de adsorbentes, lo que puede ser útil para mejorar los límites de detección. Brindan mayor flexibilidad en el análisis de las mezclas complejas al poder analizarse el extracto por varias técnicas y minimizar las interferencias de los componentes de la matriz. Las desventajas de este último son un mayor consumo de tiempo y la pérdida de analito que puede tener lugar durante la concentración del extracto. 2. Extracción por fase sólida: Es un método de separación de muestras que permite concentrar y purificar analitos en disolución mediante su retención en una fase sólida y posterior elección con un disolvente apropiado. [www.eurojai.com; www.idrc.ca; www.imbiomed.com; www.unne.edu]. Los mecanismos de retención incluyen interacciones (dipolo – dipolo), formación de puentes de Hidrogeno, fuerzas de dispersión hidrófoba e interacciones electrostáticas (iónicas), lo cual dependerá de la composición de la fase sólida utilizada. Los materiales utilizados en la extracción por fase sólida se encuentran en tres formatos básicos: discos, cartuchos y jeringas (Figura 6). A. B. C. Fig. 6: Formatos de los materiales para SPE: discos (A), cartucho (B) y jeringa (C). [www.tecnoquim.es; Thurman, E. 1998]. Los cartuchos y las jeringas suelen construirse de polipropileno, el material absorbente estará contenido entre dos fibras de polipropileno o polietileno. Los discos se construyen introduciendo pequeñas partículas de absorbentes (8 a 12 μm de diámetro), en una matriz inerte de fibras de politetrafluoroetileno (PTEE) o de fibra de vidrio. Los discos están disponibles en diferentes diámetros, desde 4 hasta 90 mm, el tamaño considerado “estándar” es de 47 mm. En las jeringas el volumen varia entre 1 y 25 mL y esto puede contener de 50 mg a 10 g de absorbente. [www.tecnoquim.es; Thurman, E. M., 1998].

(24) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 24. 2.1 Etapas del uso de la extracción por fase sólida: (Figura 7). [www.eurojai.com; www.idrc.ca;www.imbiomed.com; www.unne.edu]. Pretratamiento de la muestra (si es necesario): consiste en una simple dilución para reducir la viscosidad, o ajustar pH para favorecer uno u otro mecanismo de retención, someter la muestra a un proceso de filtración para eliminar partículas sólidas. Acondicionamiento de la fase sólida: es importante especialmente cuando usamos fases apolares, acondicionar el material antes de aplicar la muestra. El acondicionamiento consiste en humedecer la fase sólida con un disolvente orgánico, para crear una interfase que facilite la interacción de los analitos, contenidos en una matriz polar con el absorbente. Para el acondicionamiento se recomienda utilizar alrededor de 1 mL de disolvente por cada 100 mg de absorbente. Paso de la muestra a través de la fase sólida: Puede hacerse por gravedad, aplicando presión o vacío, o por centrifugación, esto depende del tiempo y del volumen de la muestra. La magnitud del flujo de muestra a través del absorbente condiciona el tiempo de interacción entre este y el analito por lo tanto el flujo tiene una marcada influencia sobre la eficiencia de la extracción, lo que deberá ser tenido en cuenta durante el desarrollo del método. Lavado (elección de interferencias): consiste en lavar la fase con agua o con otro disolvente apropiado, para eliminar selectivamente componentes de la matriz que pudieran interferir en el análisis posterior. Elección de los analitos: una vez determinado el disolvente óptimo para eluir a los analitos, los puntos importantes a controlar son el flujo y el volumen de elección. Ambos deberán ser optimizados durante el desarrollo del método, teniendo en cuenta el mecanismo de retención. Por ejemplo, se conoce que con fase de intercambio iónico debe usarse flujos más bajos que con otras fases. Respecto al volumen de elección deberá utilizarse una cantidad mínima de disolvente con el objetivo de alcanzar la máxima sensibilidad. En muchas ocasiones resulta más eficiente eluir en dos pasos con X/2 mL de disolvente que en uno con X mL..

(25) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. 25. Acondicionamiento. 1. Introducción de la muestra. 2. Eliminación de interferencias. 3. Elución de los analitos. 4. = Analitos = Interferencias. Fig. 7. Proceso de extracción en fase sólida. (Reproducido del catálogo de International Sorbent Technology, Ltd.).

(26) MATERIALES Y MÉTODOS Equipamiento: *Balanza analítica Sartorius BP121S, max 120g, d = 0.1mg. *Centrífuga MLW T60. *Cromatógrafo de gases.PYE UNICAM SERIE 304 PHILIPS (Holanda). * Espectrofotómetro UV-VIS Ultrospec III. (Pharmacia).. Reactivos: -G-1 muestra de referencia, Lote # 03- 3- 21. Suministrado por el laboratorio de Control de la Calidad del Centro de Bioactivos Químicos (CBQ) de la Universidad Central de las Villas. - Plasma humano, Código PB-4AG456AG1, suministrado por el Banco Provincial de Sangre de Villa Clara. -Ácido tricloroacético (FLUKA). -Acetona p.a. -Cloroformo p.a. -Benzoato de bencilo p.a. - Acetonitrilo p.a. (MERCK). -Agua destilada. Materiales e Instrumental: Material de vidrio de uso habitual en el laboratorio. Cartuchos SupelcleanTM LC-18 3 mL, lote Sp2403J, de SUPELCO. Tubos de ensayos vidrio de 3,5 mL, con tapa de teflón. Frascos de vidrio de 3,5 mL con tapa de teflón. Jeringuillas de vidrio de 1,0 mL. Agujas 20G despuntadas. Microjeringuilla Hamilton de 10 µL.

(27) MATERIALES Y MÉTODOS. 27. 1. Determinación de algunos parámetros de desempeño de la técnica espectrofotométrica: 1.1. Evaluación de la Linealidad: Para construir la curva de calibración, se pesó exactamente, en una balanza analítica (Sartorius BP121S), alrededor de 0,1 g de G-1. Esta cantidad exactamente pesada de G-1 se diluyó en acetona calidad analítica en un matraz aforado de 10 mL, obteniéndose una disolución de concentración 0,01g/mL (Disolución 1). Se tomó de la Disolución 1 un volumen de 0,5 mL, que se diluyó con acetona calidad analítica en un matraz aforado de 50 mL, obteniéndose una disolución de concentración 0,1 mg/mL (Disolución 2). Luego, de la Disolución 2 se tomaron 0,3; 0,5; 0,8; 1,0; 1,2; 1,5; 1,8 y 2,0 mL, que se llevaron a matraces de 10 mL, se completó el volumen con una mezcla de acetonitrilo (ACN)/agua en una proporción 80/20 %, obteniéndose disoluciones de concentraciones de 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18 y 20 µg/mL, respectivamente. A las disoluciones así obtenidas se determinó la absorbancia en un Espectrofotómetro Ultravioleta Visible, a una longitud de onda de 381 nm. Este ensayo se repitió hasta obtener dos curvas de calibración. Teniendo en cuenta todos los valores experimentales se calcula el coeficiente de correlación lineal (r), el coeficiente de variación de los factores de respuesta (CVf), la desviación estándar relativa de la pendiente [Sbrel (%)], el intervalo de confianza del intercepto (i). Se realiza también una prueba de t de student, para evaluar la sensibilidad del calibrado, donde se plantea como hipótesis nula que la pendiente es igual a cero (b = 0) y como alternativa (b ≠ 0). Criterios de aceptación:. −. Coeficiente de correlación lineal: r ≥ 0.99.. −. Pendiente: b ≠ 0.. −. Coeficiente de variación de los factores de respuesta: CVf ≤ 5%.. −. Desviación estándar relativa de la pendiente: Sbrel (%) ≤ 2%.. −. Intervalo de confianza del intercepto: i (que contenga al cero).. Teniendo en cuenta los datos de las dos curvas individuales se determina el intervalo de confianza de la pendiente y del intercepto para una de ellas con el objetivo de demostrar la similitud entre las mismas, tomando como criterio de semejanza el hecho de que el valor de la pendiente y del intercepto de la curva restante quede incluido en los intervalos hallados para la primera. 1.1.1. Evaluación de la Sensibilidad del calibrado: La sensibilidad es la relación existente entre la variación de la concentración del analito y la respuesta obtenida. Se expresa en términos de la pendiente en la curva de calibración..

(28) MATERIALES Y MÉTODOS. 28. 2. Determinación de algunos parámetros de desempeño de la técnica de cromatografía de gases: 2.1. Establecimiento de los parámetros cromatográficos: Teniendo en cuenta la técnica descrita por Bravo Sánchez, L y col. 1999, se realiza el análisis del comportamiento cromatográfico a una disolución patrón de G-1 en acetona de concentración 40 µg/mL, a partir del cual se adecuan los parámetros de cromatografía de gases: volumen de inyección, flujo, longitud de la columna, atenuación y rango, para las condiciones de nuestras muestras. 2.2. Evaluación de la Linealidad: Para la realización de la curva de calibración por Cromatografía de gases, se pesó exactamente, en una balanza analítica (Sartorius BP121S), alrededor de 0,1 g de G-1. La cantidad exactamente pesada de G-1 se diluyó en acetona calidad analítica en un matraz aforado de 10 mL, obteniéndose una disolución de concentración 10 mg/mL (Disolución 1). Se tomó de la Disolución 1 un volumen de 0,25 mL, que se diluyó con acetona calidad analítica en un matraz aforado de 25 mL, obteniéndose una disolución de concentración 100 µg/mL (Disolución 2). Luego, de la Disolución 2 se tomaron alícuotas de 0,5, 1, 2, 3, 4 y 5mL, que se llevaron a matraces de 10 mL, a cada una de ellas se le añadió 20 µl del estándar interno con una concentración de 0,0000312 mol/L y se completó el volumen con acetona. obteniéndose. disoluciones de concentraciones de 5, 10, 20, 30, 40 y 50µg/mL, respectivamente. De cada disolución se tomaron 4μl y se inyectaron en el cromatógrafo de gases Se construyen dos curvas de calibración en el rango de masas de 0,0016 hasta 0,02μg con puntos intermedios en 0,0033, 0,004, 0,0066, 0,008, 0,0100, 0,0120, 0,1338 y 0,1600μg Teniendo en cuenta todos los valores experimentales se calcula el coeficiente de correlación lineal (r), el coeficiente de variación de los factores de respuesta (CVf), la desviación estándar relativa de la pendiente [Sbrel (%)], el intervalo de confianza del intercepto (i). Se realiza también una prueba de t de student, para evaluar la sensibilidad del calibrado, donde se plantea como hipótesis nula que la pendiente es igual a cero (b = 0) y como alternativa (b ≠ 0). Criterios de aceptación: -Coeficiente de correlación lineal: r ≥ 0.99. -Pendiente: b ≠ 0. -Coeficiente de variación de los factores de respuesta: CVf ≤ 5%. -Desviación estándar relativa de la pendiente: Sbrel (%) ≤ 2%. -Intervalo de confianza del intercepto: i (que contenga al cero)..

(29) MATERIALES Y MÉTODOS. 29. Con los datos obtenidos de las dos curvas individuales se determina el intervalo de confianza de la pendiente y del intercepto para una de ellas con el objetivo de demostrar la similitud entre las mismas, tomando como criterio de semejanza el hecho de que el valor de la pendiente y del intercepto de la curva restante quede incluido en los intervalos hallados para la primera. 2.3. Determinación de los límites de detección y cuantificación: Se calculó el límite de detección (LOD) como X + 3SD , según el criterio de la IUPAC 1999; ICH, 1995]. [Thompson, 1995 y. bajo las condiciones experimentales óptimas, siendo X es la altura media de la mínima. señal detectable y. SD es la desviación estándar. El límite de detección sería por tanto, aquella. concentración que genera una señal. 3SD superior a la mínima señal detectable.. El límite de cuantificación (LOQ) se calculó como X + 5SD , según el criterio de la IUPAC 1995A, Eurachem, 1998]. [Thompson,. bajo las condiciones experimentales óptimas. El límite de cuantificación sería por. tanto, aquella concentración que genera una señal. 5SD superior a la mínima señal detectable.. 3. Técnica de Recuperación de G-1 a partir de Plasma humano. 3.1. Preparación de las disoluciones: Se pesó con exactitud, en una balanza analítica (Sartorius BP121S), alrededor de 0,1000 g de G-1, que se disolvió en acetona calidad analítica en un matraz aforado de 10 mL (Disolución A, concentración 0,01g/mL). Posteriormente, se tomó una alícuota de 0.1 mL de la Disolución A y se disolvió hasta 10 mL en matraz aforado con acetona, obteniéndose una disolución de concentración de 0.1 µg/mL (Disolución B). 3.2. Preparación de las muestras: 3.2.1. Preparación de las muestras en agua destilada: Se toman 0,4; 0,3 y 0,2 mL de la Disolución B y se adicionan a 0,6; 0,7 y 0,8 mL de agua destilada, respectivamente, contenidos en tubos de ensayo independientes de 3,5 mL, obteniéndose muestras con concentraciones de 40; 30 y 20 µg/mL de G-1. Los tubos se agitan vigorosamente, de forma manual, durante un minuto para homogeneizar el contenido. Posteriormente, se añade a cada muestra 0,2 mL de Ácido tricloacético (25 %). Los tubos de ensayo con las muestras desproteinizadas fueron centrifugados durante 5 minutos a una velocidad de 2000 rpm en Centrífuga MLW T 60. Se obtuvo el sobrenadante y se desechó el precipitado. Este proceso se repitió 8 veces para cada concentración..

(30) MATERIALES Y MÉTODOS. 30. 3.2.2. Preparación de las muestras en plasma humano: Se toman 0,4; 0,3 y 0,2 mL de la Disolución B y se adicionan a 0,6; 0,7 y 0,8 mL de plasma humano, respectivamente, contenidos en tubos de ensayo independientes de 3,5 mL, obteniéndose muestras con concentraciones de 40; 30 y 20 µg/mL de G-1. Los tubos que contienen las muestras se agitan vigorosamente, de forma manual, durante un minuto para homogeneizar el contenido. Posteriormente, se añade a cada muestra 0,2 mL de Ácido tricloacético (25 %) para desproteinizar el Plasma. Los tubos de ensayo con las muestras desproteinizadas fueron centrifugados durante 5 minutos a una velocidad de 2000 r.p.m. en Centrífuga MLW T 60. Se obtuvo el sobrenadante y se desechó el precipitado. Este proceso se repitió 8 veces para cada concentración. 3.3 Proceso de extracción: Para ambas técnicas los sobrenadantes obtenidos en el tratamiento de las muestras, como se describe en 3.2, se someten paralelamente a procesos de extracción líquido-líquido (L-L) y en fase sólida (EFS). 3.3.1. Extracción líquido – líquido: Los sobrenadantes se vierten en un tubo de ensayo de vidrio de 3,5 mL de capacidad, con rosca y tapa de teflón. Se añade 1 mL de cloroformo, se agita manualmente de forma vigorosa y se centrifuga por 1 minuto a 2 000 r.p.m. en Centrífuga MLW T 60, de esta manera se logra la separación de los solventes en dos fases inmiscibles. Mediante una jeringuilla de cristal 1 mL y aguja 20G despuntada, se extrae la fase clorofórmica que contiene al principio activo y se vierte en un frasco de cristal de 3.5 mL, con tapa de teflón, protegido de la luz. Este proceso de extracción se repite tres veces para cada muestra. Finalmente, se volatiliza el disolvente de extracción (cloroformo) mediante corriente de nitrógeno, para almacenar las muestras secas, refrigeradas, hasta el momento de la cuantificación. 3.3.2. Extracción en fase sólida: Se utilizan cartuchos SupelcleanTM LC-18 3 mL, lote Sp2403J, de SUPELCO. 3.3.2.1. Acondicionamiento del Cartucho: Antes de la utilización de cada cartucho, es necesario someterlo a un proceso de acondicionamiento para solvatar y equilibrar el material absorbente a fin de crear una interfase apropiada entre este y la muestra, lo cual facilita la transferencia de los analitos y favorece su retención. A los cartuchos se les hicieron pasar 3 mL de agua destilada para el acondicionamiento, este proceso se realiza gota a gota, acoplando jeringuillas de polietileno al extremo superior del cartucho mediante un adaptador diseñado al efecto (Figura 8). Una vez acondicionado el cartucho se utiliza sin dejarlo secar..

(31) MATERIALES Y MÉTODOS. 31. Fig. 8: Montaje para el acondicionamiento del cartucho. Acoplamiento de la jeringa a la parte superior del cartucho. 3.3.2.2. Extracción de las muestras: Los sobrenadantes se hacen pasar por gravedad a través de los cartuchos de extracción, que a continuación se secan con corriente de nitrógeno, durante 1 hora. Finalmente, el fármaco retenido en el cartucho se eluye con 2 mL de cloroformo. El eluato se recoge en un recipiente de cristal de 3.5 mL, con tapa de teflón, protegido de la luz. Finalmente, se volatiliza el disolvente de extracción (cloroformo) mediante corriente de nitrógeno, para almacenar las muestras secas, refrigeradas, hasta el momento de la cuantificación. 3.4. Evaluación de la Precisión de los métodos de extracción: 3.4.1. Repetibilidad. Se realizan 6 mediciones a una muestra de G-1 en plasma de concentración de 40 µg/mL, en condiciones homogéneas. Se calcula el coeficiente de variación (CV) a los 6 resultados. Este procedimiento se realizó para los procedimientos de extracción líquido líquido y en fase sólida. Criterio de aceptación:. −. CV ≤ 1.5%..

(32) MATERIALES Y MÉTODOS. 32. 3.4.2. Precisión intermedia. Se repite el experimento anterior, otro día y por un analista diferente. Se calcula el coeficiente de variación (CV) de todos los datos. También se realiza la prueba de t de student y F de Fischer para _. comparar los conjuntos de datos en cuanto a media ( X ) y varianza ( S ). Criterios de aceptación:. −. Coeficiente de variación: CV ≤ 3%.. −. Medias: X 1 = X 2. −. Desviación estándar:. _. _. S12 = S 22. 3.5. Determinación del factor de recuperación: El factor de recuperación para cada uno de los métodos de separación de G-1 a partir de las muestras, a los tres niveles de concentración, fue determinado mediante el cálculo de los porcentajes obtenidos a partir de la concentración inicial.. 4. Tratamiento estadístico de los resultados. Los datos obtenidos fueron procesados mediante los programas MICROSOFT EXCEL 2002 y MICROCAL ORIGIN versión 5.0..

(33) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para la realización de los ensayos farmacocinéticos constituye un aspecto de gran importancia la selección y desarrollo de métodos analíticos. Es por ello, que a la hora de adoptar un método para este tipo de estudio, es necesario demostrar que el mismo puede aplicarse con buenos resultados y que además, funciona en todo momento de acuerdo con las demandas y requerimientos en cuanto a su exactitud, uso, aplicación y fuentes de error. [Artau, C., 1998; Díaz Polanco, I., 2000; Padrón, A.S., 1998]. Determinación de algunos parámetros de desempeño de la técnica espectrofotométrica para la determinación de G-1. El espectro del G-1 obtenido mediante la técnica espectrofotométrica se muestra en el Anexo 2. Estudio de Linealidad. Los valores experimentales que corresponden con las curvas de calibración de G-1 se muestran en la Figura 9 y la Tabla 1. La evaluación de la linealidad incluyó la determinación del coeficiente de correlación lineal, el coeficiente de variación de los factores de respuesta, la desviación estándar relativa de la pendiente, la sensibilidad del calibrado y el intervalo de confianza del término independiente. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2. Los parámetros de linealidad calculados cumplen con los criterios de aceptación correspondiente, según se expone en la Tabla 2, lo que indica que esta técnica de determinación de G-1, principio activo, por Espectrofotometría Ultravioleta - Visible es lineal para el rango de concentraciones comprendidas entre 3 µg/mL y 20 µg/mL..

(34) RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 34 Tabla 1: Valores experimentales obtenidos para las curvas de calibración de G-1 en ACN/agua (80:20 %). Método Espectrofotométrico.. 1.4 1.2. X (Conc µg/mL). Y (Absorbancia). 3 3 5 5 8 8 10 10 12 12 15 15 18 18 20 20. 0,169 0,172 0,3 0,297 0,487 0,504 0,59 0,635 0,795 0,732 0,922 0,936 1,097 1,112 1,23 1,233. Absorbancia. 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16. 18. 20. 22. Concentración (µg/mL). f=Y/X (Factor de respuesta) 0.05633 0.05733 0.06000 0,05944 0,06087 0,06300 0,05900 0,06350 0,06625 0,06100 0,06147 0,06240 0,06094 0,06178 0,06150 0,06165. Fig. 9: Curva de Calibración para el G-1 en ACN/agua (80:20 %), n = 15. Método Espectrofotométrico. Tabla 2: Parámetros de la recta de regresión de G-1 en acetonitrilo/agua (80:20 %), n=15. Método Espectrofotométrico. Parámetro Número de datos (n) Intervalo de linealidad (µg/mL). Valor experimental. Criterio de aceptación. 16. -. 3-20. -. Coeficiente de correlación (r). 0,9989. r ≥0,99. Pendiente (b). 0,06229. -. 1,26. Sbrel ≤ 2,00 %. Ordenada en el origen (a). -0,00786. -. Intervalo de confianza de a. -0,013 ≤ a ≤ 0,028. que contenga el cero. 3,88. CVf ≤ 5 %. 7.97. texp ≥ 2,145. Desviación estándar relativa de la pendiente (Sbrel (%)).. Coeficiente de variación de los factores respuesta (CVf (%)). Test estadístico de b (t tab 14, p=0,05). Los resultados obtenidos demuestran que la sensibilidad de la técnica es adecuada. Con el análisis de estos resultados podemos concluir que la técnica analítica de cuantificación de G-1 por espectrofotometría UV-vis en el intervalo de concentración de 3-20 µg/mL es Lineal y Sensible.. Estudio de la Precisión. Se estudia en paralelo la precisión de dos métodos para la cuantificación de G-1 en plasma humano. El primero combina un proceso de extracción líquido. líquido. y. posterior ccuantificación. por.