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Efecto preventivo de los flavonoides del frijol negro (phaseolus vulgaris) germinado sobre el cáncer de mama inducido en un modelo animal

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Academic year: 2020

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(1)INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY DIVISION DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERIA. Efecto preventivo de los flavonoides del frijol negro (Phaseolus vulgaris) germinado sobre el cáncer de mama inducido en un modelo animal. TESIS PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO ACADEMICO DE: MAESTRA EN CIENCIAS ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGIA. POR: JUDITH ZAVALA ARCOS. MONTERREY, N. L.. DICIEMBRE DE 2005.

(2) INSTITUTO TECNOLOGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY CAMPUS MONTERREY DIVISION DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERIA Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesis presentado por la Q.C.B. Judith Zavala Arcos sea aceptado como requisito parcial para obtener el grado académico de: Maestra en Ciencias con especialidad en Biotecnología. Comité de tesis:. __________________________ Sergio O. Serna Saldívar, Ph.D. Asesor. ________________________ Jorge Moreno Cuevas, Ph.D. Sinodal. ____________________________ Ma. Teresa González Garza, Ph.D. Sinodal. Aprobado:. _____________________ Federico Viramontes Brown, Ph.D. Director del Programa de Graduados en Ingeniería Diciembre 2005.

(3) Dedicada a Martha B. Arcos Gro. (QEPD), con todo mi cariño tía..

(4) AGRADECIMIENTOS. A Dios, por permitirme vivir. A mi familia: mamá y mis hermanos Gabriel y Aby. Por apoyarme y creer en mí, por sobrellevar mis ausencias en casa. A toda la familia Arcos: mis abuelos, tíos y primos, por estar pendientes de mí y compartir conmigo este logro. A mis asesores, por su apoyo en la elaboración de este proyecto, al Dr. Serna y al Dr. Jorge por guiarme y compartirme sus conocimientos. Al Dr. Jose Luis Vázquez, por ayudarme y enseñarme en la parte del trabajo con las ratas en el bioterio, a la Dra. Ana C. Pruneda por su apoyo en la interpretación de los cortes y su paciencia a la hora de explicarme. A la Dra. Tere, por aceptar ser sinodal y sus valiosas contribuciones en la revisión del documento. A mis compañeros, por compartir momentos en clase y en el laboratorio conmigo y dejarme aprender de ellos. En especial a Janet, por su paciencia, su ayuda y por ser mi asesora las 24 horas, estoy en deuda contigo mil gracias; a Esther, gracias por aceptarme como compañera de cuarto esos meses en los cuales adquirí un gran aprendizaje; Raquel, Gaby, Irasema, Fer y Columba, por ser parte del bean-team, ayudarme en el bioterio y por brindarme su amistad. A Verónica, Yajaira y Yadira, con quien compartí grandes momentos, las quiero mucho. A Jorge por ser un gran compañero y Alex por ponerle el toque de humor negro al laboratorio, muy importante☺. A mis ratitas, por ser buenas niñas y contribuir al avance de la ciencia..

(5) ÍNDICE GENERAL Índice de figuras Índice de tablas Lista de abreviaturas 1. Introducción 2. Antecedentes 2.1. Flavonoides 2.2 Actividad estrogénica 2.3. Metabolismo de los flavonoides 2.4. Carcinogénesis química 3. Materiales y métodos 3.1. Germinación del frijol 3.2. Obtención de la harina y extractos de compuestos fenólicos del frijol 3.3. Análisis de compuestos fenólicos 3.4. Ensayos con ratas de laboratorio 3.5. Asignación de dietas al modelo experimental y estudio metabólico 3.6. Inducción de cáncer 3.7. Sacrificio de modelos animales 3.8. Recolección de sangre 3.9. Análisis histopatológicos 3.10. Análisis estadístico 4. Resultados y discusión 4.1. Germinación del frijol y análisis de compuestos fenólicos 4.2. Estudio metabólico 4.3. Sacrificio de modelos animales 4.4. Estudios histopatológicos 5. Conclusiones 6. Resumen 7. Referencias 8. Vita. i ii iii 1 4 6 8 9 13 13 15 16 17 19 20 20 21 21 22 26 29 30 37 39 40 45.

(6) ÍNDICE DE FIGURAS Figura 2.1. Reacción de condensación entre el ácido cinámico y el malonil coenzima A de la que se desprenden todos los flavonoides.. 4. Figura 2.2. Estructura química del núcleo flavan, común en los flavonoides.. 5. Figura 2.3. Distribución de los recpetores de estrógeno alfa (ERα) y los receptores de estrógeno beta (ERβ) en el organismo humano (Gustafsson, 1999).. 7. Figura 2.4. Forma aglicona (izquierda) y glicosilada (derecha) de los flavonoides (Izumi et al, 2000).. 9. Figura 2.5. Tasa de absorción de las formas agliconas y glicosiladas de los flavonoides (Izumi et al, 2000).. 9. Figura 2.6. Estructura química del 7,12-Dimetilbenzantraceno (Sigma Aldrich).. 10. Figura 3.1. A la izquierda, sistema Soxhlet utilizado en la extracción de compuestos fenólicos de la harina de frijol. A la derecha, matraz de extracción.. 14. Figura 3.2. Representación de los bloques experimentales de los modelos animales.. 17. Figura 3.3. Inducción de cáncer aplicando el DMBA diluído en aceite comestible de maíz por vía intragástrica con el uso de sonda.. 19. Figura 3.4. Palpación y medición de tumor.. 20. Figura 4.1. Efecto del tiempo de germinación del frijol negro en la concentración de compuestos fenólicos totales.. 22. Figura 4.2. Cromatogramas obtenidos del frijol crudo (A), frijol después del remojo (B) y después de la germinación (C).. 24. i.

(7) ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 3.1. Composición de las dietas usadas para realizar los ensayos anticancerígenos con ratas de laboratorio.. 16. Tabla 4.1. Tiempos de retención y λ de máxima absorción de los grupos de compuestos observados en las muestras de frijol crudo, frijol después del remojo y frijol germinado.. 25. Tabla 4.2. Comparación entre los grupos de compuestos expresados en tiempos de retención obtenidos por análisis en HPLC en las muestras de extracto de frijol negro germinado, dietas, heces, orinas y suero.. 27. Tabla 4.3. Peso, hemoglobina y hematocrito de las ratas al momento del sacrificio.. 29. Tabla 4.4. Efecto de la harina y extracto de frijol negro germinado en la incidencia, número, localización, tamaño, peso y tipo de tumor cancerígeno.. 31. Tabla 4.5. Relación de hígados sanos e hígados con esteatosis observados por grupo experimental.. 34. ii.

(8) LISTA DE ABREVIATURAS Kg …………………………………………………….. Kilogramo DMBA ………………………………………………... Dimetilbenzantraceno mL ……………………………………………………. Mililitro ppm …………………………………………………… Partes por millón ° C ……………………………………………………. Grados Celsius cm …………………………………………………….. Centrímetro L ………………………………………………………. Litro mm ……………………………………………………. Milímetro h ………………………………………………………. Hora rpm ……………………………………………………. Revoluciones por minuto min ……………………………………………………. Minuto HPLC …………………………………………………. Cromatografía Líquida de Alta Presión UV …………………………………………………….. Ultravioleta C18 …………………………………………………….. Carbono activado µL ……………………………………………………... Microlitro nm …………………………………………………….. Nanómetro g ………………………………………………………. Gramos. iii.

(9) Introducción. 1. INTRODUCCIÓN El papel de los compuestos fenólicos en la prevención de enfermedades degenerativas tales como el cáncer y padecimientos cardiovasculares, ha emergido en los últimos años debido al descubrimiento de sus propiedades antioxidantes. El efecto preventivo de los flavonoides sobre el cáncer y otras enfermedades como procesos inflamatorios, virales y alergénicos, entre otros, ha sido estudiado extensamente, especialmente de los flavonoides provenientes de la soya (Baggott, 1990). La baja incidencia de varios tipos de cáncer (de próstata, colon y mama) en la población del sur de Asia comparada con la de América del Norte y Oeste de Europa se ha atribuido, en gran parte, al consumo de isoflavonas, un tipo de flavonoides, en la dieta provenientes de la soya en dicha región (Barnes, 1995). La comparación entre la incidencia de cáncer de mama en países orientales (Japón y China) y occidentales (México y Estados Unidos) muestra una marcada diferencia con mayor prevalencia de este padecimiento en Estados Unidos. El mismo comportamiento es observado cuando se comparan las tasas de mortalidad en estos países (según datos de mortalidad de la Organización Mundial de la Salud y GLOBOCAN, 2000). El cáncer de mama representa en México el 9.9% de la mortalidad en mujeres y se sitúa dentro de las primeras veinte enfermedades causantes de muerte en mujeres ocupando el lugar decimosegundo, según datos de la Secretaría de Salud en el año 2001. Sin embargo, dentro del país se logra apreciar diferencia en la incidencia de cáncer de mama entre regiones del norte y del sur, donde se consume mayor cantidad de frijol negro. En 1997, el promedio de la tasa de mortalidad en mujeres mayores de 25 años de edad debido a cáncer de mama fue de 14.8 por 100,000 mujeres mientras que en los estados donde se observa mayor consumo de frijol negro, la tasa fue de 8.2 (CONAPO, 2004). Los estrógenos del organismo promueven la proliferación celular aumentando la propensión al cáncer de mama, mientras que los fitoestrógenos inhiben a las células. 1.

(10) Introducción. cancerosas en concentraciones altas (20-100 µmol/L) (Brownson et al, 2002), además de poseer los efectos deseados de la terapia con estrógenos. Las isoflavonas, se encuentran dentro de las sustancias que poseen la capacidad de comportarse como estrógenos (Auroma, 2002), por lo que representan hoy en día una alternativa en la terapia de reemplazo hormonal para la postmenopausia. Son las formas agliconas, como la daidzeína y genisteína, de los flavonoides las que han sido reportadas como eficientes en la reversión de la proliferación de células cancerosas (Messina, 1999). El frijol negro (Phaseolus vulgaris) a mostrado un perfil de agliconas con actividad anticancerígena in vitro cuando ha sido germinado (Gutiérrez, 2003). Dichas observaciones prometen dar un provecho mayor al alto consumo de frijol en México (22 Kg./habitante/año) como fuente importante de flavonoides (Franke et al, 1994) similar al consumo de soya en los países orientales. Por otra parte, dieron la pauta a seguir con experimentaciones in vivo, donde se pudo evidenciar los efectos en la salud y posteriormente identificar cuál compuesto provee la mayor protección. Una vez alcanzados estos objetivos, es de importancia primordial determinar la naturaleza y distribución de éstos compuestos en nuestra dieta, para obtener entendimiento de la relación entre el consumo de los flavonoides y compuestos fenólicos y el riesgo de desarrollo de enfermedades severas (Manach et al, 2004). A su vez, la identificación y análisis del metabolismo de dichos compuestos, ofrece la oportunidad de desarrollar suplementos alimenticios con la matriz que los contiene o sin ella. Dentro de los modelos animales que pueden ser utilizados para este tipo de investigación, la rata de laboratorio ofrece la ventaja de compartir características morfológicas en los tumores malignos de glándula mamaria, esto es debido a la mayor similitud que existe con la histología de la glándula mamaria humana (Liska et al, 2000). Para los modelos animales se conocen diversos métodos de carcinogénesis química, uno de los más utilizados para la generación de tumores en tejido mamario es la dosificación intragástrica del dimetilbenzantraceno (DMBA), que es un carcinógeno potente y órgano-específico, que se conoce que induce tumores en glándula mamaria. 2.

(11) Introducción. cuando se expone a ratas hembras en una dosis única (Manjanatha et al, 2000), además de ofrecer una incidencia de tumor del 94 al 100% cuando es administrado entre los 30 y 55 días de edad (Cabello et al, 2001). Por otra parte, a pesar de que los tumores no son idénticos entre las especies, la similitud en la hormono-dependencia es importante entre los tumores mamarios humanos y los inducidos por DMBA en ratas (Qin et al, 2004). El objetivo principal de la presente investigación ha sido comprobar el efecto inhibitorio preventivo de flavonoides del frijol negro germinado sobre la proliferación in vivo de cáncer de mama inducido. Para este fin, se plantearon como objetivos específicos: reevaluar el efecto de la germinación sobre los compuestos fenólicos en el frijol negro, determinar qué grupos experimentales presentan menor daño a glándulas mamarias por la acción preventiva de los compuestos, comparar el efecto entre los compuestos fenólicos administrados en extracto y en su matriz original, así como el efecto de la dosis; y estudiar la tasa de absorción de los compuestos fenólicos de las dietas en muestras biológicas de los modelos animales.. 3.

(12) Antecedentes. 2. ANTECEDENTES 2.1. Flavonoides Los flavonoides son compuestos fenólicos y una clase de metabolitos secundarios de las plantas derivados de la condensación del ácido cinámico con tres grupos malonilCoA (Figura 2.1). Todos los flavonoides se desprenden de esta reacción inicial, que es catalizada por la enzima chalcona sintasa. La chalcona es convertida rápidamente en fenilbenzopirano, y las siguientes modificaciones dan lugar a las flavonas, isoflavonas, flavonoles y antocianinas. La elaboración estructural adicional, principalmente por glicosilación, alquilación y acilación, proporciona la gran variedad de estructuras flavonoides presentes en el reino vegetal (Bloor, 2001).. OH. COOH OH. HO. Chalcona sintetasa Ácido cinámico. OH. Malonil Coenzima A. O Chalcona. OH O. OH. Flavanona OH. O. Figura 2.1. Reacción de condensación entre el ácido cinámico y el malonil coenzima A de la que se desprenden todos los flavonoides.. Para propósitos de análisis, los flavonoides pueden clasificarse en tres tipos: 1)flavonoides glicósidos, 2)flavonoides no polares (agliconas, flavonoides metilados o alquilados) y 3)antocianinas.. 4.

(13) Antecedentes. Los flavonoides tienen el esqueleto del núcleo flavan en común (Pietta et al, 2001) (Figura 2.2) y se involucran en mecanismos como pigmentación, fijación de nitrógeno y defensa química. Además de ser componentes de la dieta humana, los flavonoides han ganado interés debido a su actividad farmacológica. Han sido reportados como efectivos para el tratamiento de desórdenes de circulación periférica entre otros. Además, las medicinas herbales de isoflavonas están disponibles en diferentes países como antiinflamatorios, antiespasmódicos, antialergénicos y remedios antivirales.. Figura 2.2. Estructura química del núcleo flavan, común en los flavonoides.. Se piensa que los efectos farmacoquímicos de los flavonoides son debidos a sus funciones como secuestradores de radicales y de metales, reductantes y funciones noantioxidantes alternativas, incluyendo la interacción con diferentes enzimas, la inhibición del flujo del ión calcio en las células y la regulación de la señalización celular y la expresión génica (Yamamoto et al, 2003). La genisteína y daidzeína inhiben la proliferación de diferentes tipos de células cancerosas, células 3T3 normales y mucosa colónica normal en cultivo. El mecanismo exacto de este efecto no ha sido elucidado, pero se han sugerido muchas hipótesis. Las isoflavonas de soya activan los receptores de estrógeno, inhiben la actividad de hormonas tiroideas promotoras del crecimiento por medio de la inhibición de las enzimas progesterona-5α-reductasa y 17β-hidroxiesteroidedeshidrogenasa, tienen actividad antioxidante, inhiben la transducción de señal mediada por proteínas tirosina-quinasa así como la angiogénesis (Busby et al, 2001). Sin embargo, las propiedades benéficas para la salud de la mayoría de las plantas medicinales con alto contenido de flavonoides no pueden ser atribuidas exclusivamente a estos compuestos, ya que otros compuestos presentes en el fitocomplejo pueden contribuir 5.

(14) Antecedentes. directamente o desarrollar un papel permisivo que realce los efectos de los flavonoides (Pietta et al, 2001). Investigaciones recientes han demostrado que la compleja mezcla de fitoquímicos en los alimentos provee de mejor efecto protector hacia la salud que los fitoquímicos solos. Este efecto se lleva a cabo a través de la combinación de los efectos aditivos o sinérgicos entre dichos compuestos. Por ello, es recomendable el consumo de fitoquímicos en suficientes cantidades de una variedad de fuentes como frutas, vegetales y granos (Adom y Liu, 2002). 2.2. Actividad estrogénica Cuando la cantidad de estrógeno endógeno disminuye durante la menopausia, se producen diversos malestares, incluyendo: sofocos, fatiga, sudoración y cambios de estado de ánimo. Se prescriben hormonas para reemplazar las que han dejado de producirse; sin embargo, niveles elevados de estrógeno se asocian con aumento en la propensión de contraer cáncer de mama, ya que estimula el desarrollo celular y osteoporosis (Messina, 1999). El estrógeno actúa uniéndose a receptores celulares que estimulan el crecimiento celular y la mitosis. Existen dos tipos de receptores: los receptores alfa se asocian a riesgo de cánceres relacionados con estrógeno, mientras que los receptores beta se asocian solamente a efectos favorables. La distribución de estos dos tipos de receptores en el organismo es diferente (Figura 2.3). Los receptores alfa se encuentran principalmente en tejido fino de glándula mamaria, útero, ovarios, testículos e hígado. Los receptores beta se localizan principalmente en tejido hemático, pulmón, próstata, vejiga, huesos y timo (DeVita et al, 1997). Las isoflavonas se encuentran dentro de las sustancias que poseen la capacidad de comportarse como estrógenos (Auroma, 2002). Esto es debido a su similitud en su estructura química, por ello también son llamadas fitoestrógenos. Sin embargo, también presentan actividad anti-estrogénica y ello es motivo por el cual representan una opción en la terapia de reemplazo hormonal, ya que al poseer estructura muy similar al estrógeno, pueden unirse a los mismos receptores (Setchell et al, 1999). Las isoflavonas presentan una acción estrogénica débil, 1/1000 a 1/100,000 de la del estradiol. Cuando los niveles 6.

(15) Antecedentes. naturales de estrógenos son bajos, los isoflavonas pueden ayudar a los estrógenos activando los receptores beta. Cuando los niveles naturales del estrógeno son altos, por ejemplo durante adolescencia, los isoflavonas se unen a los alfa receptores y evitan que los estrógenos naturales se unan con estos receptores. De esta forma, elimina los efectos no deseados y favorecen los efectos deseables como la atenuación de los síntomas de la menopausia.. Figura 2.3. Distribución de los recpetores de estrógeno alfa (ERα) y los receptores de estrógeno beta (ERβ) en el organismo humano (Gustafsson, 1999).. La evidencia disponible sobre la etiología hormonal del cáncer de mama es más consistente con la hipótesis de que el estrógeno, principalmente el estradiol, es el estimulante primario de la proliferación celular. La presencia simultánea de progesterona probablemente incrementa la tasa de proliferación. Esta última conclusión se basa principalmente en el hecho de que la actividad mitótica en mama alcanza su pico durante la fase lútea del ciclo menstrual. Los factores de riesgo al cáncer mamario tienen qué ver con la exposición prolongada al estrógeno o progesterona, como la menarquia temprana, menopausia tardía, obesidad (en mujeres post-menopáusicas) y la terapia de reemplazo hormonal. Mientras que los factores protectores son lo opuesto: lactancia, edad temprana de embarazo (llevado a término) y actividad físisca (DeVita et al, 1997). Se ha reportado que 7.

(16) Antecedentes. la administración de dosis únicas de isoflavonas no conjugadas que contienen genisteína, daidzeína y gliciteína en mujeres posmenopáusicas en cantidades que exceden la ingesta normal, posee un efecto de toxicidad clínica mínima (Blodeon et al, 2002). También se ha comprobado que el consumo de genisteína y estradiol antes de la pubertad reduce el riesgo posterior de desarrollar cáncer mamario inducido con DMBA en ratas (Cabanes et al 2004). Se han considerado también mecanismos bioquímicos antiinflamatorios de los polifenoles obtenidos del té verde y vino tinto, tales como inhibición del Factor Necrótico Tumoral alfa e inhibición de la activación del plasminógeno, los cuales tienen como blanco común la angiogénesis (Brigati et al, 2002). Cabe mencionar que las preparaciones de flavonoides están siendo comercializadas como medicinas herbales o suplementos dietéticos para una variedad de efectos terapéuticos presuntamente no tóxicos. Sin embargo, aún deben experimentar ensayos clínicos controlados para su eficacia. Además su potencial tóxico es un campo aún desconocido, en especial sus interacciones con enzimas metabolizantes de drogas (Giuseppe y O’Brien, 2004). 2.3. Metabolismo de los flavonoides Se ha observado en experimentos realizados con vainas de habas, que existen diferencias significativas en el contenido de las formas de flavonoides con la maduración de las vainas, desarrollándose las formas agliconas en una proporción considerable (Tomás-Barberán et al, 1991). Las formas glicosilada y aglicona, o no glicosilada, de los flavonoides se muestra en la Figura 2.4.. 8.

(17) Antecedentes. Figura 2.4. Forma aglicona (izquierda) y glicosilada (derecha) de los flavonoides (Izumi et al, 2000).. Se conoce que después de la ingestión, las isoflavonas del frijol soya son hidrolizadas por glucosidasas intestinales, liberando las agliconas daidzeína, genisteína y gliciteína. Éstas pueden ser absorbidas o metabolizadas a compuestos específicos como el equol (7-hidroxiisoflavan), el cual posee un orden de magnitud más de potencia estrogénica que su precursor, la daidzeína. Sin embargo, debido a las diferencias en la microflora intestinal, la producción de equol ocurre sólo en 1 de cada 3 individuos que consumen alimentos de soya. También se ha encontrado que las isoflavonas glucosidadas presentan menor tasa de absorción que las agliconas (Figura 2.5). Estos datos permiten anticipar los efectos hormonales de los fitoestrógenos.. Figura 2.5. Tasa de absorción de las formas agliconas y glicosiladas de los flavonoides (Izumi et al, 2000).. 9.

(18) Antecedentes. 2.4. Carcinogénesis química Para llevar a cabo el estudio del efecto de los flavonoides in vivo, se cuenta con modelos. de. carcinogénesis. química. ya. establecidos.. Uno. de. ellos. es. el. dimetilbenzantraceno (DMBA), que es un hidrocarburo policíclico aromático (Figura 2.6) que participa en la etapa de iniciación dentro del proceso de progresión tumoral. Esta etapa se caracteriza por la activación metabólica de los procarcinógenos y su unión covalente con el ADN (aductos) lo que resulta en mutaciones específicas de genes susceptibles. Durante esta fase, los tejidos permanecen normales y estos cambios son a nivel molecular, sin que puedan ser detectados por los métodos habituales de observación macroscópica (KleinSzanto, 1998).. Figura 2.6. Estructura química del 7,12-Dimetilbenzantraceno (Sigma Aldrich). Como se ha observado en modelos animales, las vías enzimáticas del metabolismo de agentes carcinogénicos incluyen a las peroxidasas, glutatión-S-transferasas, Nacetiltransferasas, reductasas y el citocromo P-450. El DMBA, como otros hidrocarburos policíclicos aromáticos, requiere activación metabólica por el grupo de enzimas conocidas como citocromo P450 (CYP) para desarrollar su efecto tóxico. Su metabolito 3,4-diol, parece ser su metabolito catalogado como precarcinógeno, el cual al ser metabolizado por el citocromo P450 produce el verdadero carcinógeno, el 1,2-epóxido-3,4-diol-DMBA. Este último es de naturaleza altamente electrofílica y forma aductos con el ADN que dan lugar a mutaciones, las cuales a su vez representan el prerrequisito en la formación de tumores (Buters et al, 2003). Por otra parte, el DMBA está involucrado en la activación de la respuesta inmune, inhibiendo la expresión del receptor de interleucina 2 (IL-2) en los 10.

(19) Antecedentes. linfocitos T. Este mecanismo reduce la habilidad de los timocitos y esplenocitos para disminuir el efecto del carcinógeno (Ben-Hur et al, 2002). Existen ensayos para determinar la formación de uniones covalentes del DMBA con el ADN. La importancia de estos ensayos radica en que el efecto protector de diversos nutracéuticos contra el cáncer, se lleva a cabo desde la prevención en la formación de los aductos DMBA-ADN y ello representa un marcador biológico temprano de riesgo (Song and Milner, 1999). Estos ensayos han demostrado que existe dependencia entre la dosis administrada de DMBA y la cantidad de aductos formados con el ADN (Izzoti et al, 1999). Debido a que la estructura histológica de los tumores de glándula mamaria de las ratas es muy semejante al de humanos, la inducción de cáncer mamario por medio de la aplicación de DMBA en ratas hembras es uno de los modelos más utilizados para la investigación de la carcinogénesis en mama y el tratamiento de este tipo de tumores (Cabello et al, 2001). Se había tenido una considerable atención a los modelos en ratones, a pesar del hecho de que la mayoría de las lesiones en ratones son alveolares, mientras que en humanos y en ratas son predominantemente ductales (Liska et al, 2000). El epitelio de la glándula mamaria de la rata consiste en ductos continuos que emanan del pezón y dan lugar a ductos pequeños, llamados dúctulos, que terminan en brotes, y terminaciones alveolares. Durante el desarrollo, los ductos crecen ramificándose del ducto primario a múltiples ductos secundarios; con el tiempo, el número y longitud de éstas ramificaciones aumentan progresivamente. Los brotes terminales (TEB's por sus siglas en inglés: Terminal End Buds) son grupos alveolares sólidos o semisólidos de células epiteliales inmaduras al final de los ductos. Los TEB's son notorios después de dos semanas de edad y alcanzan su número máximo a los 21-28 días de edad en la rata. Los TEB's son sitios importantes de proliferación celular epitelial durante la pubertad, resultando en elongación ductal y ramificación. Son de importancia clínica porque se cree que son blancos susceptibles de la carcinogénesis química. Alrededor de los días 35-55 de edad de la rata, existen patrones cíclicos de mitosis en los TEB's, migración celular y remodelación de la matriz extracelular que contribuye a la elongación y ramificación de los ductos, resultando en invasión progresiva a la porción de grasa. Los TEB's involucionan durante 11.

(20) Antecedentes. ciclos sucesivos para dar lugar a los brotes alveolares, o pueden cavitar para formar un ducto con luz amplia llamado dúctulo terminal (Cabello, 2001). Los tumores desarrollados con DMBA son órgano-específicos, generan tumores de origen ductal de baja sensibilidad a variaciones hormonales. Además, éste carcinógeno proporciona la posibilidad de examinar la iniciación del tumor y el proceso de desarrollo. Se ha observado inducción de tumor con una incidencia del 94-100% cuando se administra el DMBA en ratas de entre 30 y 55 días de edad, y en donde el período de latencia es de 86 días aproximadamente (Cabello et al, 2001). La dosis del dicho carcinógeno se administra en ratas de 50 días de edad, debido a la actividad proliferativa de los brotes terminales del tercio distal de la glándula mamaria. Histológicamente, los brotes terminales se componen de tres a seis capas de células epiteliales de tamaño mediano. La diferenciación de la glándula induce una disminución progresiva en el número de brotes terminales y un aumento concomitante de brotes alveolares. El estudio de la patogénesis del cáncer de mama en modelos experimentales revela que la susceptibilidad de las glándulas mamarias a la carcinogénesis química está directamente relacionada con la tasa de proliferación celular del epitelio glandular en el momento de la exposición al carcinógeno (Masso-Welch et al, 2000). Los tumores inducidos pueden ser clasificados en tres grupos principales: papilomas intraductales, compuestos por epitelio hiperplásico; carcinomas papilares, que pueden componerse por células epiteliales con diversos grados de citología atípica que crecen con patrones de papilomas adenomatosos sólidos; y carcinomas ductales de patrón cribiforme.. 12.

(21) Materiales y Métodos. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Germinación del frijol Se utilizaron 5 kilogramos de frijol negro variedad perla, cultivados en el campo experimental del ITESM en el ciclo primavera-verano del año 2004. El frijol fue pesado, limpiado y lavado con agua corriente. Se prepararon 700 mililitros de solución de formaldehído 0.1% para después diluir y obtener una concentración de 0.01% para el proceso de remojo del frijol. Esta solución se preparó con el fin de prevenir el crecimiento de hongos durante el remojo y germinación del grano. El frijol se remojó en una palangana con aireación producida por dos bombas de pecera (Elite 800. Mansfield, Ma) en 5 litros de solución de formaldehído 0.01% por un período de 18 horas, según el método descrito por Gutiérrez (2003). La solución remanente del remojo fue colectada para analizar su contenido de compuestos fenólicos. Posteriormente el frijol fue enjuagado con solución de 150ppm cloro. Se colocaron toallas de papel humedecidas con la solución de cloro sobre 5 charolas de peltre y en ellas se extendió el frijol. Las charolas con el frijol se colocaron en la cámara de germinación regulada a 20° C por cuatro días, durante los cuales fueron humedecidos los frijoles con la solución de cloro por medio de un atomizador dos veces al día. También fueron colectadas muestras de frijol cada día para el análisis del contenido de compuestos fenólicos. El promedio en la longitud del germinado al cuarto día fue de 2.33cm en una muestra de 10 frijoles de cada charola. El frijol fue secado en un horno de convección Electrolux a 60° C para la posterior obtención de harina. 3.2. Obtención de la harina y extractos de compuestos fenólicos del frijol El frijol germinado y seco fue molido en un molino de cuchillas (Wiley Mill) equipado con una malla de 2mm. Se registró el peso de la harina obtenida para obtener el rendimiento de la cantidad de frijol germinado. La harina fue almacenada a 4° C.. 13.

(22) Materiales y Métodos. En la extracción de compuestos fenólicos para la elaboración de las dietas, se utilizó en primera instancia el sistema Soxhlet (Figura 3.1, izquierda). Éste método no ofreció la eficacia esperada en cuanto al tiempo y cantidad de extracto obtenido debido a que la harina con finamente molida se compactó dentro de la columna, minimizando por lo tanto el paso del solvente. Se observó una baja extracción de compuestos fenólicos cuando se operó por 18 horas continuas.. Figura 3.1. A la izquierda, sistema Soxhlet utilizado en la extracción de compuestos fenólicos de la harina de frijol. A la derecha, matraz de extracción.. Por consiguiente, el método fue modificado. Las extracciones se realizaron en matraces Erlenmeyer de dos litros como contenedores de la mezcla de harina de frijol y metanol 80% en relación 1:10 (Figura 3.1, derecha). Los matraces fueron sometidos a agitación en una incubadora con agitación (Innova 4000 Incubator Shaker, New Brunswick Scientific. Edison, N.J.) a 21° C y 250rpm, por un período de tres horas. Se dejó sedimentar la harina suspendida y se centrifugó el líquido sobrenadante a 7000rpm por 15 minutos en tubos cónicos de plástico de 50mL para obtener el extracto metanólico. El extracto se sometió a evaporación al vacío a 45° C utilizando un rotavapor (Büchi, Scientific Glass Apparatus, Inc., Bloomfield, N.J.) para la eliminación del metanol y posteriormente resuspender en agua. Los extractos se analizaron para la determinación de compuestos fenólicos utilizando para éstos una curva de calibración elaborada con 14.

(23) Materiales y Métodos. estándares de ácido gálico en agua mediante la técnica de Folin (Vinson et al, 2001). Los extractos fueron etiquetados con la concentración en miligramos equivalentes de ácido gálico y almacenados a 4° C hasta por dos semanas. 3.3. Análisis de compuestos fenólicos La determinación de compuestos fenólicos en las muestras colectadas de cada día de germinación se llevó a cabo extrayéndolos del frijol seco con metanol al 80% (Gutiérrez, 2003). Las muestras se pulverizaron con una picadora eléctrica (Moulinex DPA1, México, D.F.). Se utilizaron 2 gramos de la harina resultante de cada muestra. Cada muestra fue mezclada con 50mL de metanol 80% utilizando un vórtex (Fischer Scientific. Bohemia, N.Y.) y se extrajo por 3 horas a temperatura ambiente. Concluido el tiempo de extracción, se separó el extracto por centrifugación en tubos cónicos de 50mL por 15 minutos a 7000rpm para la posterior determinación de compuestos fenólicos. Se utilizó el método de Folin para determinar de compuestos fenólicos totales (espectrofotómetro DU 650, Beckman. Fullerton, CA). Se realizó una curva de calibración de compuestos fenólicos utilizando como estándares soluciones de ácido gálico para expresar las concentraciones resultantes en miligramos equivalentes. Las soluciones estándar se elaboraron por triplicado y de las absorbancias obtenidas se tomó el promedio para obtener la ecuación de la línea de regresión. Posteriormente se llevaron a cabo las determinaciones de compuestos fenólicos por el mismo método en los extractos metanólicos de las muestras de frijol de cada día del proceso de germinación, del frijol crudo, del frijol después del romojo y de la solución remanente del remojo. Para verificar la producción de formas agliconas en el proceso de germinación, los extractos metanólicos de todas las muestras fueron analizadas por HPLC con detector UV (HP serie 1100. Waldbronn, Alemania) y un paquete computacional Chemstation. Se utilizó para la separación una columna Nova-Pak C18 (150 x 3.9mm i.d.; 4µm), utilizando metanol 60% (fase A), agua (fase B) y metanol 100% (fase C). Las condiciones de la fase móvil 15.

(24) Materiales y Métodos. fueron: inicio con un 40% de B, que se fue disminuyendo hasta alcanzar un 100% de A, a los 20min manteniendo este solvente hasta los 34min de la corrida y luego se lavó la columna aumentando gradualmente la concentración de C de 0 a 10% para finalizar la corrida a los 38min. Después de la corrida se dejó equilibrar la columna durante 7min con las condiciones iniciales. El volumen de inyección fue de 20µL y el flujo de la fase móvil fue de 0.4mL/min. La detección de los flavonoides se llevó a cabo a 262nm. 3.4. Ensayos con ratas de laboratorio Se diseñaron cinco tipos de dietas que variaron en la matriz y concentración en que contenían los compuestos fenólicos. Las dietas se balancearon isocalóricas, isoproteicas, isograsosas e isofibrosas. Se elaboraron a base de almidón, caseína, aceite, azúcar y celulosa (Tabla 3.1). Todas las dietas fueron suplementadas con las vitaminas y minerales esenciales para el crecimiento óptimo de las ratas. La DL metionina fue suplementada para asegurar que las dietas no fueran deficientes en aminoácidos azufrados. Tabla 3.1. Composición de las dietas usadas para realizar los ensayos anticancerígenos con ratas de laboratorio. Las dietas que contuvieron harina fueron ajustadas en el contenido de los ingredientes para mantenerlas isoproteicas, isofibrosas y isograsosas. Las dietas que contuvieron extracto no fueron ajustadas. Tipo de Dieta Ingrediente. Control. Harina baja. Harina alta. Extracto bajo. Extracto alto. Almidón. 50.0. 49.24. 46.92. 50.0. 50.0. Caseína. 20.0. 19.62. 18.50. 20.0. 20.0. Azúcar. 15.2. 15.20. 15.20. 15.2. 15.2. Aceite vegetal. 5.0. 4.93. 4.73. 5.0. 5.0. Celulosa. 5.0. 4.96. 4.85. 5.0. 5.0. Mezcla mineral. 3.5. 3.50. 3.50. 3.5. 3.5. Mezcla de vitaminas. 1.0. 1.0. 1.0. 1.0. 1.0. DL-Metionina. 0.3. 0.3. 0.3. 0.3. 0.3. Harina de frijol. -. 1.25. 5.0. -. -. Extracto de frijol. -. -. -. 0.00135. 0.0055. 16.

(25) Materiales y Métodos % Total. 100. 100. 100. 100. 100. Las concentraciones de compuestos fenólicos que se utilizaron se calcularon partiendo de un consumo deseado de harina de frijol en la dieta, quedando en 1.25 y 5%. Se llevó a cabo un análisis bromatológico a la harina del frijol para ajustar los porcentajes de los ingredientes de la dieta en las que la llevaron como fuente de compuestos fenólicos. Se realizaron los cálculos pertinentes para conocer la cantidad de extracto, según su concentración, y de harina de frijol adecuados para añadir a la mezcla de ingredientes y de esta forma obtener las dietas: control, harina en baja concentración, harina en alta concentración, extracto en baja concentración y extracto en alta concentración. 3.5. Asignación de dietas al modelo experimental y estudio metabólico Se utilizaron ratas Wistar de 27 días de edad proveídas por el Bioterio del ITESM. Se contó con sesenta ratas hembra que fueron bloqueadas por peso inicial en jaulas metabólicas (Nalgene, N.Y., USA) para los cinco tratamientos, que se asignaron de manera aleatoria (Figura 3.2). El promedio de peso inicial de las ratas fue de 44 g. Las dietas y agua fueron proveídas ad libitum. El bioterio cuenta con un sistema de control de temperatura y horas de luz, de tal manera que contaran con ciclos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y la temperatura se mantuviera a 21° C.. 17.

(26) Materiales y Métodos Figura 3.2. Representación de los bloques experimentales de los modelos animales.. Después de una semana de experimentación, se colectaron heces y orina por un período de dos semanas. Las muestras se. recolectaron diariamente. Para evitar. contaminación microbiana, a los recolectores de orina se les añadió 1mL de HCl al 1% en cada colección y una vez obtenida la orina de dos semanas, se almacenó a -20° C hasta su análisis. Las heces se pesaron en cápsulas taradas previamente y secaron en un horno a 60° C (Electrolux), posteriormente se pesaron en las mismas cápsulas y se trituraron con mortero y almacenaron a -20 ° C hasta su análisis. El peso de las ratas se registró antes y después de la colección de las muestras. La cantidad de alimento consumido fue registrado durante todo el estudio. Las muestras de heces y orina se prepararon para el análisis como sigue: se llevó a cabo una extracción de compuestos fenólicos con metanol al 80% de las heces tomando un gramo de cada muestra triturada y mezclándola con 10 mililitros del solvente con ayuda de un vórtex Genie 2 (Fisher Scientific), la extracción se dejó por un período de tres horas y posteriormente se separó el extracto por centrifugación 10 minutos a 7000rpm. Las muestras de orina se centrifugaron a 5000rpm por 10 minutos para eliminar el sedimento y fueron llevadas a un mismo volumen con agua destilada. La determinación de compuestos fenólicos se llevó a cabo por el método de Folin sólo en los extractos de heces, debido a que en la orina se esperaban concentraciones mínimas. Tanto los extractos de heces como los de orina, se analizaron en el HPLC para observar el perfil de flavonoides. La preparación de las muestras se describe a continuación: para los extractos de las heces, se tomaron 2 mililitros del extracto y se llevaron a un volumen de 10 mililitros con agua destilada, éste volumen se pasó por un cartucho Sep-Pak C18 de 1cc marca Waters (Milford, Massachussets) (previamente activado con 2mL de metanol y 2mL de agua) y se desecharon. Se retiró el exceso de líquido del C18 con vacío, se pasaron por el C18 2mL de metanol al 30% (fase 1 que fue guardada por separado) y finalmente 1mL de metanol y 1mL de agua ambos grado HPLC. Estos últimos dos se recuperaron en un vial y se filtraron (Gelman, Acrodisc 13 CR PTFE 0.45um). Para las muestras de orina, se siguió la misma preparación modificando los volúmenes de 18.

(27) Materiales y Métodos. muestra: 5mL más 500µL de flavona (2-fenil-4H-1-benzopirano-4-ona, Sigma-Aldrich) 100ppm como estándar interno y de recuperación con metanol y agua grado HPLC a 0.5mL obteniendo un volumen final en el vial de 1mL. 3.6. Inducción de cáncer El químico utilizado para la inducción de cáncer fue el 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA, Sigma Aldrich) en una dosis única de 20 miligramos por rata según el método descrito por Schilkaitis (2000) y Hyun (2001). El DMBA fue disuelto en aceite de maíz comestible y aplicado mediante una sonda intragástrica a los 50 días de edad, período en el cual las ratas se encontraban con un promedio de peso de 150g (Figura 3.3).. Figura 3.3. Inducción de cáncer aplicando el DMBA diluído en aceite comestible de maíz por vía intragástrica con el uso de sonda.. Para este objetivo las ratas fueron sometidas a un ayuno de 12 horas. Se esperaba un tiempo. de aparición de tumores de 86 días post-administración de DMBA. 19.

(28) Materiales y Métodos. aproximadamente. Las ratas continuaron con las dietas y fueron sometidas a palpación periódica a partir del día 28 post-administración del DMBA (Figura 3.4).. Figura 3.4. Palpación y medición de tumor.. 3.7. Sacrificio de los modelos animales Las ratas que presentaban tumores más severos fueron sacrificadas primero al día 92 post-inducción y aquellas que presentaron tumoraciones pequeñas (menores a 1cm) o no presentaban, fueron sacrificadas posteriormente (al día 118 post-inducción). El método de sacrificio fue sedación en una cámara con éter con la posterior punción intracardiaca. Posteriormente, se colectaron los órganos de cada modelo animal (hígado, bazo y pulmón) y fueron fijados en frascos con formaldehído al 10% amortiguado, debidamente etiquetados. Los tumores extraídos fueron medidos, pesados y fijados de la misma forma. Dichos datos fueron registrados, así como localización de cada tumor. 3.8. Recolección de sangre Se colectaron muestras de sangre en el momento del sacrificio de las ratas en tubos con EDTA y sin anticoagulante para obtener datos de hemoglobina y hematocrito. El suero 20.

(29) Materiales y Métodos. obtenido también fue analizado por HPLC, para preparar estas muestras se utilizaron 500µL de suero, 500µL de estándar interno y 4mL de agua destilada; los volúmenes de recuperación fueron de 0.5mL de metanol y 0.5mL de agua grado HPLC. 3.9. Análisis Histopatológicos Los órganos y tumores se procesaron en el Laboratorio de Histología, Facultad de Medicina, U.A.N.L. para la obtención de laminillas con cortes histológicos incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina y eosina, las cuales fueron interpretadas evaluando parámetros de diferenciación (glandular, escamoso o indiferenciado), metástasis y grado histológico de malignidad. Los datos sobre tamaño y localización de la masa tumoral, fueron anexados a los anteriores. 3.10 Análisis Estadístico El paquete estadístico utilizado para el análisis de datos fue el JMP 5.1.2 (The Statistical Discovery Softweare, SAS México), con el cual se llevó a cabo el análisis de varianza y comparación de medias por el método de Tukey. Las variables analizadas fueron hemoglobina, hematocrito, peso inicial, peso final y ganancia de peso.. 21.

(30) Resultados y Discusión. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Germinación del frijol y análisis de compuestos fenólicos El efecto de la germinación del frijol por cuatro días produjo el aumento en la concentración de los compuestos fenólicos extraídos con metanol, como se muestra en la figura 4.1.. Fenólicos Totales (mg/g). Concentración de Compuestos Fenólicos en el Proceso de Germinación 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0. 1. 2. 3. 4. 5. Día de Germinación. Figura 4.1. Efecto del tiempo de germinación del frijol negro en la concentración de compuestos fenólicos totales. La concentración de fenólicos totales está dada en equivalentes de ácido gálico.. Se observó que el incremento en la cantidad de compuestos fenólicos totales ocurrió entre el segundo y el tercer día de germinación. La cuantificación fue realizada por el método de Folin, el cual no distingue entre los tipos de fenólicos (Salunkhe, 1989). Dentro de los compuestos fenólicos se encuentran los ácidos fenólicos, flavonoides, estibenos, cumarinas y taninos (Liu, 2004); y de éste grupo de compuestos se conoce que existen los que están libres o no ligados y los que están ligados a la pared celular. Durante la germinación son producidas enzimas clasificadas como degradadotas de la pared 22.

(31) Resultados y Discusión. celular, las cuales actúan liberando una parte de los flavonoides que se encuentran ligados a la pared celular (Kigel, 1995). Es probable que el incremento pronunciado en los fenólicos observado del segundo al tercer día de germinación no sea igual para los compuestos fenólicos ligados. Las frutas y vegetales tienen la mayoría de sus fitoquímicos en forma libre o conjugada soluble como glucósidos. Por otra parte, los fitoquímicos de los granos se encuentran tanto en forma libre como en forma unida a la pared celular o insoluble. La mayoría son insolubles, cerca del 74% y 69% de los fenólicos totales presentes en el arroz y maíz respectivamente, están en la forma insoluble, con el ácido ferúlico como mayor componente fenólico presente. El material unido a la pared celular es difícil de digerir y puede sobrevivir la digestión gastrointestinal para alcanzar el colon. La digestión colónica de dicho material libera la porción de fitoquímicos unidos. Así, los fitoquímicos no digeridos o unidos pueden tener sus beneficios a la salud únicamente después de su absorción en el colon. Muchos estudios han reportado la extracción de compuestos fenólicos solubles por medio de metanol, sin embargo la cantidad de compuestos fenólicos fue subestimada, ya que no se determinaron los compuestos fenólicos unidos (Adom y Liu, 2002). Para conocer la cantidad real de compuestos fenólicos totales, es necesario hidrolizar aquellos que se encuentran ligados y después llevar a cabo la determinación. Al compararse el perfil de los compuestos en las mismas muestras por medio de HPLC se puede apreciar que la germinación produce agliconas, correspondientes a los picos del extremo derecho del cromatograma, los cuales por la metodología son eluídos por el metanol (Figura 4.2).. 23.

(32) Resultados y Discusión. A). Flavonoles. B). Flavonoles Isoflavonas agliconas. C). Flavonoles. Isoflavonas agliconas. Figura 4.2. Cromatogramas obtenidos del frijol crudo (A), frijol después del remojo (B) y después de la germinación (C).. 24.

(33) Resultados y Discusión. De los espectros obtenidos de las muestras de frijol crudo, después del remojo y frijol germinado, se obtuvieron los siguientes datos: Tabla 4.1. Tiempos de retención y λ de máxima absorción de los grupos de compuestos observados en las muestras de frijol crudo, frijol después del remojo y frijol germinado.. Muestra Frijol crudo. Frijol después del remojo. Frijol germinado. Tiempo de retención (min) 24.22 29.79 34.96 29.92 35.07 36.92 39.40 40.39 29.87 35.02 35.57 40.35 41.83 42.37. λ de máxima absorción (nm) 259.2, 358.7 254.5, 354.3 263.9, 349.5 254.5, 354.3 263.9, 349.5 263.9, 349.5 269.9, 349.5 221.5, 278.1 254.5, 354.3 263.9, 349.5 287.6 216.8, 278.1 292.4 259.2. Los flavonoides poseen dos bandas de absorción en la región ultravioleta características. La banda II tiene máximos en el rango de 240 a 285nm, se cree que surge del anillo A. La banda I con máximos en el rango de 300 a 550nm, proviene del anillo B (Hurst, 2002). De los datos de la Tabla 4.1 se concluye que los picos que absorben entre las longitudes de onda de 328 y 357nm con una banda de absorción pequeña a menor longitud, corresponden al grupo de los flavonoles cuyo grupo 3-hidroxil ha sido sustituido. Los picos que se absorben entre las longitudes de 240 a 280nm corresponden a compuestos del grupo de las isoflavonas agliconas (Wildman, 2000). El aumento en la concentración de fenólicos totales en el frijol negro asociado a la germinación, va acorde a los resultados obtenidos por Gutiérrez (2003). Tomás-Barberán (1991) describió los cambios en la concentración de los flavonoides presentes en vainas de habas a través de los estadios de madurez por medio de HPLC. Su trabajo concluye en que tanto las formas glucosidadas como las agliconas de los flavonoides, aumentaron conforme las vainas maduraron, a diferencia de lo observado en nuestro caso, donde se 25.

(34) Resultados y Discusión. observa aumento en las formas agliconas solamente. La germinación desencadena la producción de enzimas, las cuales hidrolizan el almidón a oligosacáridos (Uriyo, 2000). Las formas glucosidadas de los flavonoides son hidrolizadas a agliconas durante la germinación, y éstas últimas son de especial interés ya que poseen mayor bioactividad. Al ser ingeridas, las isoflavonas glucosidadas presentan menor tasa de absorción que las agliconas. Las glucosiladas como el daidzeina y genisteina, alcanzan una concentración máxima en plasma después de 9 horas de su ingestión y las segundas a las 5 horas (Setchell et al 2001). 4.2 Estudio metabólico Se llevó a cabo el análisis por HPLC de las muestras de heces, orina, sueros, dietas y extracto de frijol negro germinado. Los datos obtenidos se analizaron para obtener al final aquellos picos que se observaron en la mayoría de las muestras dentro del mismo tipo. La Tabla 4.2 muestra los resultados de dicho análisis.. 26.

(35) Muestra Extracto de frijol negro 3.08 3.70 germinado 2.66 Dieta control 2.66 Dieta en harina baja 3.62 Dieta en harina alta 3.62 Dieta con extracto bajo 2.66 3.62 Dieta con extracto alto Heces dieta control 3.25 3.83 Heces dieta harina baja Heces dieta harina alta Heces dieta extracto bajo Heces dieta extracto alto Orina dieta control Orina dieta harina baja Orina dieta harina alta Orina dieta extracto bajo Orina dieta extracto alto Suero dieta harina control 3.20 Suero dieta harina baja 3.20 Suero dieta harina alta 3.20 3.60 Suero dieta extracto bajo 3.20 3.60 Suero dieta extracto alto 7.29. 10.9 10.9 10.9 10.9 10.9. 13.67 25.84 13.67 14.64 17.44 25.84 13.67 15.87 25.84 13.67 25.84 13.67 25.84. 4.81 7.10 8.17 15.67 4.81 7.10 15.67 4.81 5.53 15.67 4.81 5.53 4.81 5.47 9.22 13.66 14.83 26.35. 34.69 34.69. 37.26 39.24 36.66 36.66. 36.58. 36.64. 36.53 36.64 36.64 36.64. 40.71. 27. 25.84 26.67 29.88 35.60 37.17 39.03 40.36 41.86 45.20. Tiempos de retención. Tabla 4.2. Comparación entre los grupos de compuestos expresados en tiempos de retención obtenidos por análisis en HPLC en las muestras de extracto de frijol negro germinado, dietas, heces, orinas y suero.. Resultados y Discusión.

(36) Resultados y Discusión. En la tabla anterior se observa que los compuestos que son eluyeron en los tiempos de retención obtenidos en el extracto metanólico del frijol negro germinado, no se traslapan con aquellos correspondientes exclusivamente a la dieta control. Puede inferirse que los compuestos encontrados en las muestras biológicas y que no se observan en las dietas ni en el extracto del frijol negro germinado son producto del metabolismo de las dietas. Sin embargo no podemos aseverar que corresponden al metabolismo de los flavonoides solamente. De la misma forma, al encontrar compuestos en las muestras de heces y orina con los mismos tiempos de retención que los hallados en el extracto del frijol, se infiere que éstos son excretados sin metabolizarse. Los grupos de compuestos que se encuentran tanto en muestras de suero como en extracto de frijol, indican que han sido absorbidos al torrente sanguíneo. En las plantas la mayoría de los flavonoides, excepto la catequina, son encontrados en forma de glucósidos. Cuando las ratas son alimentadas con dietas suplementadas con flavonoides, no se encuentran agliconas libres en el plasma. Todas las formas circulantes y las halladas en muestras biológicas son glucurónidos o sulfatos conjugados. Normalmente, la conjugación de moléculas activas biológicamente sirve para facilitar la eliminación y reduce la actividad biológica. Sin embargo, los derivados conjugados de los flavonoides, que constituyen las formas de eliminación, son las únicas que están presentes en plasma. De esta forma, los efectos biológicos atribuidos a los flavonoides deben ser investigados después utilizando los metabolitos que están presentes en fluidos corporales. Las formas circulantes representan mezclas complejas, usualmente no identificadas completamente, por lo que son difíciles de cuantificar. La literatura reporta que para la determinación de niveles totales de metabolitos, se recomienda llevar a cabo una hidrólisis enzimática que libere agliconas (Morand et al, 2001). Dangles (2001) reporta que los conjugados de la quercitina encontrados en plasma de humanos y ratas, se unen a la albúmina sérica y guardan una potente actividad antioxidante. Así mismo, sugiere que la unión de los flavonoides a la albúmina sérica funciona como mecanismo protector de la albúmina hacia la degradación oxidativa. También sugiere que los flavonoides pueden proteger a los ácidos grasos poliinsaturados 28.

(37) Resultados y Discusión. unidos a la albúmina circulante de la degradación oxidativa de la misma forma que la bilirrubina unida a la albúmina, un potente antioxidante plasmático endógeno. 4.3 Sacrificio de los modelos animales La Tabla 4.3 compara los pesos promedio de los grupos animales experimentales, así como los valores de hemoglobina y hematocrito al momento del sacrificio. Tabla 4.3. Peso, hemoglobina y hematocrito de las ratas al momento del sacrificio. Los valores de referencia para los parámetros de hemoglobina y hematocrito en rata son 11.5 a 16mg/dL y 37 a 49% respectivamente.. Grupo Experimental Dieta control Dieta harina baja Dieta harina alta Dieta extracto bajo Dieta extracto alto. Peso inicial (g) 45.5 a 44.7 a 44.6 a 44.6 a 44.4 a. Peso final (g) 292.7 a 267.0 a 259.8 a 262.4 a 266.8 a. ∆ Peso 246.4 a 221.8 a 221.8 a 219.1 a 218.7 a. Hemoglobina (mg/dL) 10.6 a 13.0 ab 12.2 ab 13.3 a 13.0 a. Hematocrito (%) 35 b 43 ab 40 ab 44 a 43 a. Los valores de cada columna con diferentes letras, son estadísticamente diferentes (P>0.05).. No existió diferencia significativa entre los pesos de las ratas al momento del sacrificio. Se observó que el grupo que consumió la dieta control tuvo un peso ligeramente mayor en comparación con los demás grupos y mostró los valores más bajos en hemoglobina y hematocrito. Cabe mencionar que diez días después de la administración del DMBA, los animales de este grupo sufrieron una súbita palidez por un lapso de siete días. Durante este lapso un animal experimental murió y el resto se recuperó para continuar con el experimento. Los grupos experimentales que consumieron harina y extracto metanólico de frijol negro germinado, no mostraron disminución en los valores de hemoglobina y hematocrito. Se ha descrito que la mayoría de los carcinógenos activados se unen de forma covalente tanto a los ácidos nucleicos como a las proteínas, en este caso, la hemoglobina. Se reporta que la reactividad por unidad de peso de hemoglobina hacia carcinógenos activados es de 1.5 a 10 veces mayor que la del ADN. Por lo anterior, la hemoglobina 29.

(38) Resultados y Discusión. sirve como agente quelante para tasar los niveles de carcinógenos activados in vivo. Datos experimentales con ratones muestran que una dosis de 1µg de benzapireno (BaP)/kg de peso del ratón, da de 0.08 a 0.1µg de BaP unido a 1g de hemoglobina (Bjorseth, 1985). El trabajo realizado por Izzotti (1999) comprueba la concordancia entre marcadores biológicos administrados de manera preventiva (butil hidroxianisola, 5,6benzoflavona y 1,2-ditiol-3-tiona) a células de rata tratadas con DMBA y la inhibición de la incidencia de tumores y su multiplicidad. Los marcadores 5,6-benzoflavona y 1,2ditiol-3-tiona previnieron en un 80 y 44% respectivamente la formación de aductos DMBA-hemoglobina. En el caso de la presente investigación, los datos de hemoglobina y hematocrito del grupo control son bajos, mientras que los de los grupos que consumieron harina y extracto de frijol se mantuvieron normales, probablemente debido al efecto preventivo de los flavonoides en la formación de aductos DMBA-hemoglobina. 4.4 Estudios Histopatológicos Al llevar a cabo el sacrificio de las ratas, se calculó la proporción de aquellas que desarrollaron tumores por cada grupo experimental (Tabla 4.4).. De la anterior. información se concluye que el grupo que consumió el extracto metanólico de la harina de frijol en alta concentración fue la que presentó la mayor incidencia de tumoraciones (90%). No obstante de que se esperaba que el grupo control fuera el mayormente afectado, este ocupó el segundo lugar en incidencia (87.5%). Los grupos que consumieron frijol germinado en bajas concentraciones de harina y extracto presentaron incidencias similares de entre el 65 y 70%. Finalmente, el grupo que consumió harina de frijol negro germinado en alta concentración, mostró tener la menor incidencia de cáncer (28%). El porcentaje de cáncer en el grupo control difiere con el reportado por Cabello (2001), quien obtuvo una incidencia del 94-100% en ratas de entre 30 y 55 días de edad. Nuestra información no obstante, concuerda con lo descrito por Huynh (2001) y Qin (2004), quienes reportan alrededor del 75% y 85% de incidencia después de un período de 80 días post-administración del DMBA en una dosis y edad de las ratas similares a las utilizadas en la presente investigación.. 30.

(39) % Ratas con cáncer. 87.5. 66.7. 28.0. 80.0. 90.0. Grupo Experimental. Dieta control. Dieta harina baja. Dieta harina alta. Dieta extracto bajo. Dieta extracto alto (1 – 4). 2.00. (1 – 3). 1.20. (1 – 2). 0.42. (1 – 3). 1.16. (1 – 9). 2.60. Tumores por rata. Abdomen Pelvis Axilar Ingle Cervical Tórax. Cervical Tórax Axilar Pelvis Abdomen. Tórax Abdomen. Tórax Abdomen Axilar Pelvis. Tórax Abdomen Pelvis Cervical Axilar Pulmón Vulvar Extremidad trasera. 30.00 % 20.00 % 15.00 % 15.00 % 10.00 % 10.00 %. 33.33 % 25.00 % 16.67 % 16.67 % 8.33 %. 66.67 % 33.33 %. 42.85 % 28.57 % 14.29 % 14.29 %. 28.57 % 23.81 % 14.30 % 9.52 % 9.52 % 4.76 % 4.76 % 4.76 %. Localización del tumor. (0.3 – 9.5). 2.35. 1.76 (0.9 – 2.8). (0.3 – 3.4). 1.23. 1.60 (0.6 – 4.0). (0.3 – 1.6). 0.77. (1.0 – 1.7). 1.26. (0.3 – 3.3). 1.14. 1.05 (0.7 – 1.7). (0.2 – 11.8). 3.33. Peso del tumor (g). (0.5 – 4.6). Tamaño del tumor (cm) 2.05. Adenocarcinoma ductal infiltrante Carcinoma papilar infiltrante Quistes dermoides benignos Hiperplasia de glándula sebácea Carcinoma folicular infiltrante de tiroides. Adenocarcinoma ductal infiltrante Adenocarcinoma papilar de glándula sudoríapara. Adenocarcinoma ductal infiltrante. Adenocarcinoma ductal infiltrante. Carcinoma papilar infiltrante Adenocarcinoma ductal infiltrante Adenocarcinoma papilar de glándula sudorípra Tumor de glándulas apócrinas. Tipo de tumor. 31. 80.00 % 5.00 % 5.00 % 5.00 % 5.00 %. 91.67 % 8.33 %. 100.00 %. 100.00 %. 10.00 %. 45.00 % 35.00 % 10.00 %. Tabla 4.4. Efecto de la harina y extracto de frijol negro germinado en la incidencia, número, localización, tamaño peso y tipo de tumor cancerígeno.. Resultados y Discusión.

(40) Resultados y Discusión. En lo referente a la alta incidencia de cáncer hallada en los grupos que consumieron harina de frijol germinado en baja concentración, extracto en baja concentración y extracto en alta concentración, existen trabajos que reportan efectos opuestos a la prevención de desarrollo de tumores, esto debido a la interacción entre concentraciones altas de flavonoides y compuestos carcinogénicos. El autor Day (2001), sugiere un efecto promotor de la genisteína en el desarrollo de tumores de mama inducidos con DMBA cuando ésta se consume en altas dosis (1g de genisteína / kg dieta). En su trabajo, 5 de 9 ratones que consumieron dieta adicionada con genisteína desarrollaron tumores de mama malignos y los 4 restantes desarrollaron tumores benignos. Para explicar estos hallazgos, el autor sugirió un mecanismo estrógeno-independiente de la genisteína, ya que se conoce que funciona como inhibidor de la tirosina quinasa y de la fosforilación de tirosina, específicamente del factor de crecimiento epidermal (EGF, por sus siglas en inglés). Además de hallazgos reportados donde la genisteína no inhibe a la tirosina quinasa involucrada con las vías del EGF, aún cuando se piensa que inhibe el crecimiento de células MCF-7 estimuladas con EGF. Debido al papel crítico de la fosforilación de la tirosina en la regulación mitogénica de las células por factores de crecimiento y el papel del receptor del EGF en el cáncer de mama, la genisteína puede afectar la tumorigénesis a través de la alteración de la proliferación celular. Galati (2004) comenta en su revisión que se han reportado interacciones tóxicas entre flavonoides, drogas y carcinógenos. Estas interacciones pueden resultar en fallas hepáticas, dermatitis por contacto, anemia hemolítica así como cáncer de mama. El principal mecanismo de acción de los flavonoides como preventores de la carcinogénesis, es a través de la inhibición del grupo de enzimas llamadas citocromo P-450 (CYP), las cuales activan los procarcinógenos a intermediarios reactivos que se unen con el ADN y provocan la carcinogénesis. Dicho mecanismo se basa en la interacción de los flavonoides que poseen grupos hidroxilo con el receptor aril-hidrocarbono (AhR), un factor de trascripción ligando-activo. De esta manera, puede deducirse que aquellos flavonoides que contengan grupos hidroxilo inhiben la actividad del CYP, mientras que los que carecen de este grupo podrían inducir la enzima. Los flavonoides pueden actuar como agonistas de los AhR e inducir la actividad de CYP1A1 (tipo de citocromo P-450 que activa los 32.

(41) Resultados y Discusión. carcinógenos del tipo de los hidrocarburos policíclicos aromáticos, como el DMBA) y CYP1A2 (citocromo que activa los carcinógenos del tipo de aminas aromáticas). Los flavonoides pueden entonces inhibir o inducir los CYP humanos, dependiendo de su estructura, concentración o condiciones experimentales. La galagnina, quercitina, diosmina y diosmetina, son ejemplos de flavonoides que incrementan la trascripción del gen CYP1A1. El trabajo de Gutiérrez (2003) reporta que no se encontró daidzeína en el frijol negro germinado, sin embargo, describe aumento en la concentración de genistina y la detección de gliciteína a los dos días de germinación con posterior incremento en la concentración de ambas. Se han reportado otras clases de compuestos en leguminosas que juegan un papel importante en la prevención de la carcinogénesis. Los terpenos son compuestos isoprenoides (Wildman, 2001) que han sido reportados como inhibidores del cáncer presentes en la soya y granos de café verde (Shukla, 2004). Entre los mecanismos de acción sugeridos para estos compuestos, se encuentra la inhibición de las vías de señalización de la fosfatidilinositol-3-quinasa para inducir apoptosis de células mutadas (Hanausek, 2001). Es muy probable que estos compuestos estén participando en las reacciones observadas tanto en las ratas que consumieron extracto como harina de frijol negro germinado en altas concentraciones. Por otra parte, al analizar la localización promedio de los tumores por grupo, se observó que se produjeron masas que antes de analizarlos microscópicamente fueron catalogados como tumoraciones ectópicas, en el grupo control, de extracto bajo y extracto alto. En el caso del grupo control, se observó que existieron cuatro tipos de tumoraciones. El adenocarcinoma ductal infiltrante corresponde al tipo de cáncer mamario más común, su nombre indica que se origina en los ductos de la glándula mamaria y que invade el tejido estromal que lo rodea y es el tipo que es producido por el DMBA principalmente. Cabanes (2004) describe que más del 75% de los tumores producidos por DMBA en dosis de 10mg son adenocarcinomas. El carcinoma papilar infiltrante, corresponde a un grado de malignidad mayor al adenocarcinoma, y se manifestó en los tumores que registraron mayor tamaño y que se dejaron desarrollar por más tiempo. Los adenocarcinomas de glándulas. 33.

(42) Resultados y Discusión. sudoríparas, tumores de glándulas apócrinas, quistes dermoides benignos, hiperplasias de glándula sebáceas y carcinoma folicular de tiroides, correspondieron a tumores ectópicos, que pudieron originarse en respuesta al DMBA, al ser este de especificidad para glándula mamaria en un 90% y al ser ésta última una glándula sudorípara modificada (Rusai, 1996). Los animales que consumieron harina de frijol, presentaron uniformidad en el tipo celular de los tumores generados, de lo que puede inferirse que la harina de frijol negro germinado tiene también un papel protector ante el desarrollo de tumores ectópicos y metástasis. Los grupos que consumieron extracto metanólico del frijol negro germinado en la dieta, presentaron también tumoraciones ectópicas. El grupo con la dieta de extracto en baja concentración. desarrolló. adenocarcinoma. ductal. infiltrante. en. un. 91.67%. y. adenocarcinoma papilar de glándula sudorípara en 8.33%, mientras que el grupo con dieta de extracto alto desarrolló quistes dermoides benignos, hiperplasias de glándula sebáceas y carcinoma folicular de tiroides como tumoraciones ectópicas (5% cada una) además de adenocarcinoma ductalinfiltrante y carcinoma papilar infiltrante en 80% y 5% respectivamente. El análisis histológico de los órganos recolectados arrojó resultados de normalidad en los cortes de bazo y pulmón en la mayoría de los animales; una rata del grupo de extracto alto presentó vasculitis crónica pulmonar y en otra del grupo de extracto bajo se mostró muy poca pulpa blanca en bazo lo cual indica un mal desarrollo de éste órgano. El análisis de los cortes hepáticos resultó en casos de esteatosis grado I y II en algunos elementos (Tabla 4.5), que corresponde a la infiltración grasosa en el tejido como reacción a varios estímulos como obesidad, drogas, alcohol, etc.. Tabla 4.5. Relación de hígados sanos e hígados con esteatosis observados por grupo experimental.. % Hígado normal % Hígado con esteatosis Grupo control 57 43 Grupo harina baja 87 17 Grupo harina alta 100 0 Grupo extracto bajo 60 40 Grupo extracto alto 70 30. 34.

Figure

Figura 2.1. Reacción de condensación entre el ácido cinámico y el malonil coenzima A de la que se  desprenden todos los flavonoides
Figura 2.2. Estructura química del núcleo flavan, común en los flavonoides.
Figura 2.3. Distribución de los recpetores de estrógeno alfa (ERα) y los  receptores de estrógeno beta (ERβ) en el organismo humano (Gustafsson,  1999)
Figura 2.5.    Tasa de absorción de las formas agliconas y glicosiladas de los flavonoides   (Izumi et al, 2000)
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