1,2,3,4,5
Docentes del Departamento de Ciencias Biológicas-Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Nacional de Cajamarca. Av. Atahualpa 1050. Cajamarca – Perú.
Efecto del fotoperiodo y temperatura en el crecimiento poblacional y producción de biomasa, proteínas y lípidos de Scenedesmus acutus
Palabras claves: Scenedesmus acutus, Luz/oscuridad, temperatura, fotobiorreactor, producción, proteína
El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el crecimiento poblacional y la producción de biomasa, proteínas y lípidos de Scenedesmus acutus, mediante la aplicación de diferentes horas de luz de 12:12 y 16:8 luz/oscuridad y temperatura de 23°C y 28°C, en condiciones controladas de nutrientes y VVM, empleando sistemas cerrados de fotobiorreactores, con la finalidad de establecer cuál de los tratamientos es el más eficiente en favorecer el crecimiento de la microalga. Los resultados obtenidos indicaron que el tratamiento T2 de 12/12 horas luz/oscuridad y a 28 °C, presenta un mayor crecimiento poblacional con
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25.4 x 10 números de células/ml y mayor cantidad de biomasa con 2.2 g/L y proteínas 36.3 %, mientras tanto los tratamientos T3 y T4 de 16/8 horas luz/oscuridad, presentan inconveniente pues las condiciones de Luz provocan una fotoinhibición del microalga obteniendo menores crecimientos poblacionales de 11.3
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x 10 y 11.5 x 10 números de células/ml respectivamente, en el T4 se observa una producción deficiente de biomasa con 1.1 g/L y proteína de 25.1 . En cambio, los resultados demuestran que en el T3 y T4 de 16/8 horas luz/oscuridad la producción de lípidos es mayor que en los T1 y T2 con fotoperiodo de 12/12 horas luz/oscuridad. Se concluyó que el Tratamiento T2 es el más adecuado en horas de luz/oscuridad y temperatura para la obtención significativa de biomasa, proteínas.
Effect of photoperiod and temperature on population growth and production of biomass, proteins and lipids from Scenedesmus acutus
Resumen
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Edgar Marino Valle, Walter Grau Chávez, José Guevara Barreto, John López Orbegoso, Juan Tirado Sarmiento
Recibido: 24-05-19 Aceptado: 20-09-19
The present The present study aimed to evaluate the populatión growth and production of biomass, proteins and lipids of Scenedesmus acutus, by applying different hours of light 12:12 and 16:8 light/dark and temperature of 23 °C y 28°C, in controlled conditions of nutrients and VVM, using closed systems of photobioreactors, in order to establish which of the treatments is the most efficient in favoring the growth of microalgae. The results obtained indicated that the treatment T2 of 12/12 hours light/dark and at 28 °C,
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presents a higher population growth with 25.4 x 10 number of cellls/mL and greater amount of biomass with 2.2 g/L and proteins 36.3%, meanwhile the treatment T3 and T4 of 16/8 hours light/dark, presents drawback as the light conditions cause a photoinhibitión of the microalgae obtaining lower population
6 6
growth of 11.3 x 10 and 11.5 10 cell number/mL respectively, in T4, a deficient production of biomass with 1.1 g/L and protein of 25.1 is observed. In constrast, the results show that in T3 and T4 of 16/8 hours light/dark lipid production is greater tan in T1 and T2 with photoperiod of 12/12 hours light/dark. It was
Keywords: Scenedesmus acutus, Light/dark, temperature, photobioreactor, production, protein
concluded that the treatment T2 the most suitable in hours of light/dark and temperature for the significant obtaining of biomass, proteínas.
FACULTAD DE CIENCIAS
DE LA SALUD
Cada especie y subespecie de microalga presenta sus características propias respecto a condiciones óptimas de crecimiento, tanto la composición de las microalgas como su p r o d u c t i v i d a d e s t á n d e t e r m i n a d a s , principalmente, por la alcalinidad del medio, el pH, la temperatura, la disponibilidad y
concentración de nutrientes, la intensidad y tipo de luz, la densidad celular del cultivo y la contaminación o depredación por otros organismos. En promedio, las microalgas doblan su biomasa en 24 horas. Sin embargo, en fase exponencial algunas algas pueden doblar su biomasa en tiempos tan cortos como 3,5 horas (Brenan, 2010).
A pesar de que gran variedad de microalgas son capaces de desarrollarse en un amplio rango de Las microalga son aquellos microorganismos s
unicelulares capaces de llevar a cabo la fotosíntesis. En esta categoría quedan agrupadas las cianobacterias junto con algas e u c a r i o t a s , e n g e n e r a l o r g a n i s m o s fotoautótrofos, es decir, obtienen la energía de la luz proveniente del Sol y se desarrollan a partir de materia inorgánica. Sin embargo, algunas especies son capaces de crecer empleando materia orgánica como fuente de energía o de carbono (Ruiz, 2011).
Las clorofitas o algas verdes son un grupo (división) importante de microalgas, que deben su color a la clorofila (sobre todo clorofila a y b), carotenoides y xantofilas presentes en su estructura. La clase más destacada de clorofitas son las clorofíceas, entre las que a su vez destacan las órdenes de las volvocales (organismos de agua dulce provistos de flagelos) y las clorococales (microorganismos desprovistos de flagelos), destacando de estas Scenedesmus, que han recibido especial atención en los últimos años, debido a su potencial para producir compuestos de alto interés biotecnológico como las vitaminas. proteínas, cosmética y alimentos saludables (Ruiz, 2011 y Harun, 2010).
Introducción
Reactivación y verificación de la pureza de
Scenedesmus acutus:La cepa otorgada por el laboratorio de acuicultura de la UNS, fue conservada en un Hatchery a 20°C, en un matraz de 250 ml, en agitación con aire estéril, se realizó o b s e r v a c i o n e s d e s u s c a r a c t e r í s t i c a s macroscópicas y características microscópicas mediante observación en fresco y coloración de Gram.
Se empleó una cepa de Scenedesmus acutus, otorgada por el laboratorio de acuicultura de la Universidad Nacional del Santa.
temperaturas (Chlorella destaca por ejemplo en este aspecto, ya que puede crecer entre 5 y 42ºC), todas ellas presentan un rango fuera del cual se ven inhibidas o incluso mueren. Por lo que, la temperatura es un factor muy sensible para el crecimiento de las microalgas y las actividades metabólicas, además de ser un factor de fácil control en el funcionamiento del cultivo, existiendo una relación entre la temperatura del cultivo y la tasa de crecimiento y biomasa de microalga y producción de lípidos, en respuesta a las diversas tensiones ambientales que pueden causar estrés provocando la muerte celular (Ruiz, 2011; Converti, 2009; Hu Hong, 2011).
Materiales y método
Establecimiento del diseño experimental: En la presente investigación se utilizó el diseño factorial para dos variables, en dos niveles con 4 repeticiones por unidad experimental
Preparación del inóculo y estandarización del cultivo de Scenedesmus acutus: El cultivo fue sembrado en biorreactores de 300 ml, conteniendo el medio HM e incubado a 20 °C durante 15 días. El medio de cultivo HM fue sometido previamente a control de esterilidad. Después del cultivo se colecto en condiciones de estricta asepsia, las muestras con especímenes más jóvenes (sobrenadante) uno 100 mL y se procedió a repetir el mismo proceso en biorreactores de 1000 mL, hasta obtener el inóculo suficiente para el diseño experimental.
Preparación del medio de cultivo: El medio de cultivo fue preparado tomando como referencia el medio HM, del Dr. Fernando Merino Moya, el volumen de trabajo para cada reactor fue de 800 mL por unidad experimental.
Esterilización y acondicionamiento de los biorreactores: Se acondicionó 12 biorreactores de 1 L de capacidad los cuales fueron previamente lavados con detergente, sumergidos en hipoclorito de sodio al 2% y detergente durante 24 horas y enjuagados en agua destilada, hasta que desaparezca el olor característico del hipoclorito de sodio. Los recipientes fueron esterilizados con el medio HM en autoclave a 121 °C por 15 minutos. El sistema de aireación se reguló a 0.5 VVM, el aire fue procedente de un aireador de acuario, el aire fue esterilizado mediante pasaje de un filtro de venteo 0.22 um.
Tabla 1a: Medio HM – Heussler-Merino
Nutriente mg/L
Urea 206.0
KCl 19.0
H3PO4 35.0
Inoculación de los biorreactores: Del cultivo
de Scenedesmus acutus estandarizado
previamente se adicionaron 10% (V/V) en cada uno de los biorreactores necesarios en el diseño experimental.
Proceso del cultivo en fotobiorreactor: Los biorreactores debidamente acondicionados e inoculados fueron incubados a 28°C y 23°C y de fotoperiodos de 12:12 y 16:8 horas luz/oscuridad según el diseño experimental.
Evaluación del cultivo en fotobiorreactor:
a) Medición del crecimiento de Scenedesmus acutus: El crecimiento poblacional de los cultivos de Scenedesmus acutus se determinó mediante conteos cada 48 horas durante 15 días, del número de células utilizando cámara de Neubauer y microscopio binocular marca Olympus, las observaciones fueron realizadas a 40X de aumento, se controló que la temperatura esté en los niveles establecidos en cada biorreactor. La fórmula para determinar el número de células/ml es la siguiente:
Con los datos obtenidos se graficaron las curvas de crecimiento poblacional, determinando la
velocidad de crecimiento poblacional aplicando formulas polinómicas de grado dos:
b) Cuantificación de la biomasa de
Scenedesmus acutus: La biomasa microalgal fue determinada gravimétricamente, filtrando unos 10 mL del cultivo en papel filtro de 0.2 um, cuyos filtrados fueron secados en estufa
durante 4 horas a 80°C, y se procedió a pesar cada uno de los filtrados, y los datos obtenidos se reemplazaron en la siguiente formula:
d) Cuantificación del contenido de lípidos:
Los lípidos totales se extrajeron durante la noche a partir de células secas usando cloroformo/metanol (1:2 vol/vol) de acuerdo con el método Bligh y Dyer, es u aparato Soxhlet. La masa de lípidos fue medida gravimétricamente después de la eliminación del solvente usando un evaporador rotativo.
c) Cuantificación del contenido proteico: La concentración de proteínas se determinó de aproximadamente 35 mg de biomasa seca utilizando el ensayo de BCA. Las células se molieron con polvo de cuarzo en tampón de lisis (1,5 ml Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, hidrocloruro de guanidina al 20% 10 mM, EDTA, DTT 10 mM, PMSF 0.4 uM) y después de ka adición de Triton X-100 al 0.05%, se centrifugó a 10,000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se usó para la determinación de proteínas por el ensayo
Resultados y discusión
L o s v a l o r e s d e r e c u e n t o c e l u l a r d e Scenedesmus acutus, se obtuvieron mediante el recuento de células en camara neubauer como se observa en la fig 1, y se muestran en el tabla 1 y son expresados en número de células
6
de alga por 10 por mililitro de cultivo. Se observan los cuatro tratamientos, con sus cuatro repeticiones respectivas. Con respecto al cuadro 1, se evidencia que luego de la inserción
del inóculo y de un periodo de adaptación las poblaciones de cada tratamiento empiezan a inDatcrementar, pero notándose que las con fotoperiodo de 12/12 horas luz/oscuridad presentan un mayor número de células de
6
alga/ml llegando a 25.4 x 10 a los 15 días en el T2, a diferencia de las de los tratamientos con fotoperiodos 16/8 horas luz/oscuridad con un número menor de células/mL, llegando a 11.3 x
6
10 a los 15 días en el T3, esto es debido a la fotoinhibición reportada por Ruiz (2011), los sistemas fotosintéticos receptores se ven dañados y la fotosíntesis se ve inhibida, por lo que el crecimiento disminuye.
Datos del crecimiento de Scenedesmus acutus en diferentes tratamientos:
Figura 1: Recuento de número de células en cámara Neubauer.
T ratam i en to
R ecu en to C elu lar R ecu en to C elu lar
D ía 0 D ía 1 D ía 2 D ía 4 D ía 6 D ía 8 D ía 10 D ía 12 D ía 14 D ía 15 D ía 0 D ía 1 D ía 2 D ía 4 D ía 6 D ía 8 D ía 10 D ía 12 D ía 14 D ía 15 12/12
28°C 1.8 0.6 1.1 3.8 3.5 8.8 14.4 15.7 21.3 20.3
1.8 1.0 1.1 3.4 5.0 8.6 14.6 16.2 21.3 23.0 12/12
28°C 1.8 0.6 0.6 2.5 5.5
10.
4 13.9 15.8 21.7 22.2 12/12
28°C 1.8 1.3 1.1 4.7 8.1 9.5 18.3 17.5 22.4 24.7
12/12
28°C 1.8 1.3 1.6 2.6 2.9 5.6 11.9 15.7 19.8 24.8
12/12
23°C 1.8 2.2 2.3 5.0
10. 9
10.
9 14.1 20.7 21.8 27.6
2.8 2.3 2.3 5.1 5.1 11.
4 14.9 17.3 19.7 25.4 12/12
23°C 1.8 1.6 1.7 4.2 7.3
11.
3 14.0 13.2 19.2 28.4 12/12
23°C 1.8 2.7 3.0 5.6
10. 9
11.
3 16.1 19.0 20.2 22.6 12/12
23°C 1.8 2.5 2.2 5.6
11. 3
12.
0 15.6 16.3 17.5 22.9 16/8
28°C 1.8 0.8 0.8 1.4 2.0 5.1 5.7 6.8 8.8 11.0
3.8 0.9 0.9 1.3 2.0 5.2 5.30 6.50 8.40 11.3 16/8
28°C 1.8 0.8 0.9 1.2 1.8 5.1 5.2 6.3 7.8 10.1
16/8
28°C 1.8 1.0 1.0 1.4 2.1 5.4 5.0 6.5 9.0 13.3
16/8
28°C 1.8 0.9 1.0 1.2 2.0 5.3 5.4 6.4 7.9 10.9
16/8
23°C 1.8 1.3 2.2 2.3 3.9 7.3 6.8 7.8 10.4 10.4
4.8 1.5 2.1 2.5 4.1 7.0 6.90 7.90 10.1 11.5 16/8
23°C 1.8 1.3 1.8 2.5 4.1 6.5 7.1 8.3 11.2 12.9
16/8
23°C 1.8 1.9 1.9 2.6 4.0 7.1 6.8 8.0 10.2 11.8
16/8
23°C 1.8 1.7 2.5 2.4 4.3 7.2 6.6 7.5 8.4 10.8
Curvas de Crecimiento con los diferentes tratamientos:
Los resultados presentados anteriormente se visualizan también a través de las figuras 2,3,4 y 5 presentados en los siguientes:
Respecto a los gráficos de curva de crecimiento se puede observar, que, en el T1, presenta una menor velocidad de crecimiento respecto a los demás, al hacer los cálculos de la regresión lineal de la curva de crecimiento se obtuvo un
2
valor de R = 0.9797, bastante similar a los obtenidos por Ruiz (2011), donde reporta valores
2
de R entre 0.98 y 0.99, cuya tendencia se mantuvieron sostenidas en el tiempo y con un nivel de tendencia al incremento, cabe indicar que para determinar la velocidad de crecimiento se utilizó ecuaciones polinómicas de segundo grado.
Respecto a los resultados mostrados en el tabla 2, corresponde a los valores medios de la
biomasa, lípidos y proteínas respecto a las horas luz y temperatura, se contempla que en el tratamiento 2, cuyo fotoperiodo es de 12/12 horas luz/oscuridad a una temperatura de 23°C, es este sentido funcionó mejor dado a que la población de Scenedesmus acutus evaluada presenta una biomasa media superior de 2,16 g/L, y porcentaje de alto de proteínas de 36.29% respecto a los otros tratamientos.
Corroborando que, manipulando las condiciones del cultivo como los nutrientes, el fotoperiodo y/o la temperatura se puede alterar el porcentaje de proteínas.
Se observa un número de células/mL menor que en el T1 y T2.
Producción de biomasa, lípidos y proteínas:
Estos porcentajes fueron similares a los reportados por Quevedo O. et al (2008), quien evaluó el crecimiento de Scenedesmus sp. en diferentes medios de cultivo reportando porcentajes de proteína en la biomasa seca que variaron entre 24,9 y 35,2%.
Producción Horas Luz temperatura Media Desviación estándar N
Biomasa
12,00 23,00 2.1625 0.39238 4
28,00 1.8500 0.52122 4
Total 2.0063 0.45860 8
16,00 23,00 1.6000 0.14720 4
28,00 1.1125 0.34731 4
Total 1.3563 0.35900 8
Total 23,00 1.8813 0.40703 8
28,00 1.4813 0.56879 8
Total 1.6813 0.52054 16
Lípidos
12,00 23,00 23.2475 0.26349 4
28,00 23.8800 0.43871 4
Total 23.5638 0.47596 8
16,00 23,00 24.5925 0.42937 4
28,00 24.1100 0.72829 4
Total 24.3513 0.61061 8
Total 23,00 23.9200 0.79097 8
28,00 23.9950 0.57001 8
Total 23.9575 0.66715 16
proteína
12,00 23,00 36.2950 0.79969 4
28,00 33.1550 0.34780 4
Total 34.7250 1.77283 8
16,00 23,00 32.0500 1.28960 4
28,00 25.1100 1.13007 4
Total 28.5800 3.87570 8
Total 23,00 34.1725 2.47697 8
28,00 29.1325 4.36934 8
Total 31.6525 4.30652 16
Se observa, sin embargo, en la tabla 2, con respecto al porcentaje de lípidos es mayor en el tratamiento 4 cuyo fotoperiodo 16/8 horas luz/oscuridad a una temperatura de 23°C, por lo que esta población de Scenedesmus acutus evaluada presenta un 24.59% de lípidos de biomasa seca.
Respecto a los resultados mostrados en la tabla
3, correspondiente a las pruebas de efectos entre las horas luz y temperatura.
En la tabla 3, se puede contemplar la relación que existe entre la luz y la temperatura, donde se observa La luz es significativa sobre biomasa, proteínas y lípidos (p valor menores a 0.05). La temperatura es significativa solamente para proteína.
Tabla 3: Pruebas de efectos las horas luz y la temperatura.
Origen Variable dependiente Tipo III de suma
de cuadrados gl
Cuadrático
promedio F Sig.
Horas Luz
biomasa 1,690 1 1,690 11,903 0,005
lípidos 2,481 1 2,481 10,160 0,008
proteína 151,044 1 151,044 163,264 0,000
temperatura
biomasa 0,640 1 0,640 4,508 0,055
lípidos 0,023 1 0,023 0,092 0,767
proteína 101,606 1 101,606 109,827 0,000
Horas luz * temperatura
biomasa 0,031 1 0,031 0,216 0,651
lípidos 1,243 1 1,243 5,092 0,043
proteína 14,440 1 14,440 15,608 0,002
Error
biomasa 1,704 12 0,142
lípidos 2,930 12 0,244
proteína 11,102 12 0,925
Total corregido
biomasa 4,064 15
lípidos 6,676 15
proteína 278,192 15
a. R al cuadrado = 0,581 (R al cuadrado ajustada = ,476) b. R al cuadrado = 0,561 (R al cuadrado ajustada = ,451) c. R al cuadrado = 0,960 (R al cuadrado ajustada = ,950)
1. El tratamiento T2 de 12/12 horas luz/oscuridad y a 28 °C, presenta un mayor
6
crecimiento poblacional con 25.4 x 10
,
números de células/ml mayor cantidad de biomasa con 2.2 g/L y proteínas 36.3 %.
2. Los tratamientos T3 y T4 de 16/8 horas luz/oscuridad, presentan inconveniente pues las condiciones de Luz provocan una fotoinhibición del microalga obteniendo menores crecimientos poblacionales de
6 6
11.3 x 10 y 11.5 x 10 números de células/ml respectivamente
3. En el T4 se observa una producción deficiente de biomasa con 1.1 g/L y proteína de 25.1 %
.
Conclusiones
4. En cambio, los resultados demuestran que en el T3 y T4 de 16/8 horas luz/oscuridad la producción de lípidos es mayor que en los T1 y T2 con fotoperiodo de 12/12 horas luz/oscuridad.
5. Se concluyó que el Tratamiento T2 es el más adecuado en horas de luz/oscuridad y temperatura para la obtención significativa de biomasa, proteínas.
6. La luz es significativa sobre la producción biomasa, proteínas y lípidos.
Gómez C., Rodriguez J., 2013. Efecto del estrés inducido por deficiencia de sales nutritivas en un sistema de cultivo raceway awl de las m i c r o a l g a s Ch l o r e l l a v u l g a r i s y Scenedesmus dimorphus en la obtención de aceite. [Tesis de grado].Universidad Católica de Santa María. facultad de ciencias farmacéuticas y bioquímicas y biotecnológicas.
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