I.
BÚSQUEDA DE CEPAS NATIVAS DE Lactobacillus spp
CON POTENCIAL EN BIOCONSERVACIÓN DE
ALIMENTOS
Maria Consuelo Vanegas1*, Aida Juliana Martínez2 y Lina María González3
1,2,3 Laboratorio de Ecología Microbiana y Alimentos,
Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia. Dirección: Cra 1ª #18A-70 Edificio J 209
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue aislar e identificar cepas nativas de Lactobacillus sp. aisladas de alimentos, flora de niños recién nacidos y terneros por microbiología clásica y PCR para evaluar su efecto inhibitorio contra Salmonella sp, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Algunas cepas presentaron actividad inhibitoria contra todos los microorganismos evaluados de las cuales fueron seleccionadas cuatro para evaluar sus extractos con catalasa, proteinasa K, temperatura y pH. Este estudio permitió identificar ocho cepas con amplio rango de inhibición de patógenos, de las cuales una genera inhibición por una sustancia de carácter proteico, lo que sugiere su potencial uso en bioconservación.
Palabras claves: bioconservación, cepas nativas, Lactobacillus sp, flora en niños.
I. INTRODUCCIÓN
Lactobacillus sp es uno de los géneros más importantes perteneciente al grupo de bacterias ácido lácticas (BAL) debido al especial uso que se le ha dado en la industria alimentaria tanto para desarrollar alimentos funcionales como en bioconservación. Muchos reportes han indicado sus beneficios que van desde prevención y control de enfermedades, incluyendo el balance de la flora intestinal y absorción de nutrientes, (Heyman, 2000) hasta tratamientos para contrarrestar el efecto de microorganismos patógenos, producción de enzimas anticancerígenas y mecanismos de inmunoregulación. (Cross, 2001; Strus, 2005). Por otro lado su uso en bioconservación se debe a que
algunas cepas de Lactobacillus sp producen sustancias antimicrobianas como bacteriocinas que actúan inhibiendo el crecimiento de bacterias que pueden ser patógenas. (Asahara, 2001; Mahoney, 2003)
Se ha reportado que existe gran variabilidad de especies de Lactobacillus sp circulando en alimentos fermentados y como flora normal de animales y humanos. (Aquilanti, 2007; Zhong, 1998).
embargo esta colonización va cambiando a lo largo del tiempo y es beneficiada con factores tales como tipo de alimentación y estado de salud del hospedero, por lo que es más común encontrar recuentos altos de estos microorganismos en niños recién nacidos y en terneros de poco tiempo de vida que aún están alimentándose con leche materna generando el mantenimiento de la flora benéfica en el organismo. (Biagi, 2007; Lin, 2007) Algunos reportes indican que también hacen parte de la flora presente en el tracto urogenital femenino (Martin, 2005; Strus, 2005).
En nuestro país, dentro de los principales microorganismos involucrados en enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) se encuentran Staphylococcus aureus, Salmonella sp y Escherichia coli; y pesar de la falta de reportes debido a que no es de notificación obligatoria, se sabe que también Listeria monocytogenes se halla con frecuencia en maquinaria y superficies en la industria alimentaria por su habilidad de producir Biopelículas. (Mahoney, 2003) El control de estos microorganismos en la industria de alimentos se realiza con la implementación de Buenas Prácticas de Manufactura y sistemas de calidad que garantizan la inocuidad de los alimentos.
Sin embargo con el objetivo de evitar que los alimentos en almacenamiento sean atacados por microorganismos que originan su descomposición y/o que eventualmente pueden ser patógenos para el consumidor, se implementan técnicas como el almacenamiento a bajas temperaturas y uso de aditivos químicos. (Anónimo, 2007)
Las bacteriocinas comprenden un gran grupo de proteínas o pépticos que son producidas por varios microorganismos. Sin embargo las que provienen de bacterias ácido lácticas han sido estudiadas de modo especial en los últimos años debido a su potencial aplicación en la industria de alimentos como biopreservantes. (Arbogast, 1975). La mayoría de las bacteriocinas producidas por BAL son aisladas de alimentos fermentados y estos microorganismos se han usado en la industria de alimentos por años. (Stern, 1973) Muchos autores han reportado diferentes bacteriocinas producidas por en Lactobacillus sp, en las que se incluyen plantaricina C, W, C19, 423 (van Reenen, 1998) entre muchas otras, con un rango de inhibición de microorganismos que está relacionado con un mismo nicho ecológico. (Silva, 1987)
Actualmente, la tendencia por el consumo de alimentos funcionales hace que muchas empresas se interesen por introducir en sus alimentos cepas de Lactobacillus spp por sus características probióticas y en bioconservación. (Gómez-Treviño, 2001; Martín, 2007).
Países como Japón, Estados Unidos y algunos de la Unión Europea identifican y caracterizan cepas de bacterias ácido lácticas con el objetivo de introducirlas en el mercado de alimentos. (Cai, 1998) Sin embargo en Sur América el consumo de estos productos es reciente y los primeros probióticos son importados desde Europa en yogurt, leches fermentadas, quesos, fórmulas infantiles, bebidas de jugos, entre otros. (Martín, 2007)
técnicas moleculares. Las técnicas clásicas incluyen coloración de Gram, actividad de catalasa y oxidasa, movilidad, crecimiento en agar Man Rogosa y Sharp (MRS), utilización de azúcares por kits comerciales o pruebas independientes de laboratorio. (Castillo, 2007)
En cuanto a la caracterización de Lactobacillus spp por técnicas moleculares, la mayoría de estudios sugieren PCR para búsqueda de algunas especies de Lactobacillus spp y sólo algunos autores reportan esta técnica para caracterizar este microorganismo a nivel de género (Aquilanti, 2007). Lo último es importante debido a que son muchas las especies de Lactobacillus spp reportadas con potenciales efectos benéficos en la industria de alimentos, lo que hace que desarrollar técnicas moleculares que permitan la caracterización de todo el género de Lactobacillus spp y no sólo de una o algunas especies en particular sea de mayor utilidad.
En Colombia, pocos estudios han reportado especies de Lactobacillus sp productoras de sustancias inhibitorias, (Leon P, 2006) sin embargo no se ha estudiado cepas que provengan de flora normal de humanos y animales por técnicas moleculares. Lo anterior sugiere que el aislamiento y la caracterización de cepas de Lactobacillus sp provenientes de dichas fuentes con potencial en bioconservación, pueden ser una herramienta importante para la industria de alimentos colombiana al poder utilizar cepas nativas en conservación de alimentos que permitan sustituir, al menos parcialmente, el uso de aditivos químicos para asegurar que el alimento está exento de microorganismos patógenos o que se
encuentran dentro de los rangos permitidos por la legislación nacional.
Estudios en esta área permitirán que la industria de alimentos se vea favorecida al disponer de cepas nativas útiles en bioconservación.
El objetivo de este estudio fue aislar e identificar cepas nativas de Lactobacillus sp. provenientes de alimentos, flora normal de niños recién nacidos y terneros utilizando microbiología clásica y PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) y evaluar su efecto inhibitorio contra las principales bacterias causantes de ETAs en nuestro país.
II. MATERIALES Y MÉTODOS.
2.1 Aislamiento y Mantenimiento de Cepas.
60 muestras de diferentes alimentos artesanales, vegetales, heces de niños recién nacidos (Donadas por el Laboratorio de Bioimagen con la colaboración de SaludCoop) y terneros del departamento de Cundinamarca, fueron utilizadas para el aislamiento de Lactobacillus sp. Se realizó siembra directa en agar Man Rogosa y Sharp (MRS) por 72 horas a 30 ºC. Se seleccionaron las cepas que presentaron morfología típica tanto al microscopio como en medio de cultivo y pruebas de oxidasa y catalasa. Las cepas fueron almacenadas a -70 ºC en glicerol para los demás análisis.
2.2 Identificación por PCR
La reacción tuvo lugar en un volumen final de 50 ul que contenía: 25 ul del Kit PCR Master Mix (Roche®), 5 ul de cada Primer, 5 ul de ADN y 10 ul de agua libre de nucleasas. Con el siguiente ciclo para la amplificación: 95 °C por 5 minutos, 30 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 42 °C por 1 minuto, 68 °C por 1 minuto y 68 °C por 7 minutos
Después de la amplificación los productos fueron visualizados por electroforésis en gel de agarosa al 2% y observados en el transiluminador. Para la validación de la técnica se utilizó la cepa control de Lactobacillus plantarum donada por el Instituto Ziel de Alemania y como control negativo Listeria monocytogenes. (Dubernet, 2002. et al.)
2.3 Evaluación de la actividad antimicrobiana
Se evaluó el efecto de inhibición de todas las cepas aisladas contra los siguientes microorganismos indicadores: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Salmonella sp. Staphylococcus aureus y Escherichia coli. La prueba se realizó en un medio sólido utilizando el método de botón (Lewus, 1991). Cada cepa de Lactobacillus sp se inoculó en caldo MRS a 30 °C por 18 horas. En una caja de petri se colocó aproximadamente 10 mL de Plate Count Agar (SPC), se dejó secar y se colocó por gotas (aproximadamente 2
μL) cultivos de cada cepa de Lactobacillus sp. Después fueron incubadas a temperatura ambiente durante 8 h. Posteriormente 9 mL del mismo medio se colocaron con 10 μL del microorganismo indicador (107 ufc/mL).
Las cajas se incubaron a la temperatura óptima de crecimiento de los indicadores durante 18 h. El efecto antibacteriano se detectó por la presencia de halos de
inhibición alrededor de las cepas de Lactobacillus sp.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se identificaron 56 cepas de Lactobacillus spp (36 aisladas de alimentos, 5 de terneros y 15 de niños recién nacidos) por microbiología clásica mediante morfología típica en agar MRS y en lámina, catalasa (-) oxidasa (-) y por biología molecular mediante PCR con el método antes descrito.
Se evaluó el espectro de inhibición contra cepas de bacterias patógenas tanto Gram positivas como Gram negativas. De las 34 cepas de Lactobacillus sp aisladas de alimentos: 9 mostraron actividad inhibitoria contra Listeria monocytogenes, 5 mostraron actividad inhibitoria contra Salmonella Enteritidies, 25 mostraron actividad inhibitoria contra S. aureus y E. coli y 28 actividad inhibitoria contra L ivanovii. Así mismo de las 19 cepas provenientes de niños recién nacidos y de terneros 10 mostraron actividad inhibitoria contra L. monocytogenes, 7 mostraron actividad inhibitoria contra Salmonella Enteritidies, 10 actividad inhibitoria contra S aureus, 12 de ellas actividad inhibitoria contra E. coli y 8 actividad inhibitoria contra L. ivanovii.
contra cuatro de cinco microorganismos indicadores evaluados. 15 cepas (26.78%) 8 aisladas de alimentos y 7 de niños y terneros mostraron actividad inhibitoria tanto para L. monocytogenes como para L. ivanovii. Sin embargo del total de cepas que inhibían el crecimiento de Listeria monocytogenes el 26.66% (1 cepa aislada de alimentos y 3 aisladas de niños y terneros) no inhibían el crecimiento de L ivanovii.
Del total de cepas utilizadas en el estudio, cuatro (LAC111 y LAC096 provenientes de alimentos, LAC134 proveniente del niño recién nacido y LAC150 de flora de ternero) fueron seleccionadas debido a que presentaron un amplio rango de inhibición con respecto a los microorganismos indicadores evaluados.
El 78.87% de las cepas identificadas como Lactobacillus sp por técnicas tradicionales de microbiología también lo fueron por PCR, mientras que el 21.12% fueron identificadas en este género por microbiología tradicional pero no por PCR. Según lo reportado por otros autores las secuencias de los primeras utilizadas en este estudio permiten caracterizar Lactobacillus sp mediante la región terminal del 16S rRNA que amplifican una región conservada para la mayoría de especies de Lactobacillus sp.
Por lo cual se sugiere que las 15 cepas que no amplificaron en la PCR no pertenecen al género Lactobacillus sp pero debido a sus características morfológicas se sugiere que pertenecen al grupo de bacterias ácido-lácticas posiblemente al género Carnobacterium sp. El uso de estos primer basados en la amplificación de una secuencia 16S especifica para Lactobacillus sp también
permitiría diferenciar entre especies. (Cocolin, 2000) Por lo anterior se propone la utilización de estos primer en estudios posteriores para la caracterización a nivel de especie de los Lactobacillus sp identificados en este trabajo mediante electroforésis de gradiente denaturante como DGGE o TGGE debido a que las secuencias que amplifican permiten esta identificación.
Acorde con lo reportado por otros autores (D. Hill, 2005) del total de muestras de niños recién nacidos el 100% contenía cepas de Lactobacillus sp. Al igual que lo sugerido por otros autores (Benkerroum, 2002) E coli, L. ivanovii y S. aureus fueron microorganismos sensibles en un alto porcentaje (66.03, 67.92 y 69.81% respectivamente). Los demás microorganismos indicadores evaluados mostraron también ser sensibles a Lactobacillus sp pero en porcentajes más bajos. Conforme con lo reportado por Ramírez et al., (Socorro Ramírez, 2005) se obtuvo un porcentaje bajo de Lactobacillus sp con actividad antimicrobiana frente a L monocytogenes. En este estudio es mucho mayor el porcentaje de cepas que mostraron actividad inhibitoria contra L. monocytogenes que las reportadas por Ramírez et al., sin embargo el porcentaje fue más el más bajo (35.84%) en comparación con los demás microorganismos indicadores evaluados.
para los cinco microorganismos indicadores se puede decir también que otras sustancias inhibitorias muestran rangos más amplios de inhibición. (Elotmani, 2002)
De las ocho cepas que inhibieron todos los microorganismos indicadores evaluados en este estudio se seleccionaron cuatro para evaluar sus extractos. Las ocho cepas que presentaron inhibición de todos los microorganismos evaluados, pudieron generar el efecto inhibitorio por factores asociados a la producción de peróxido de hidrógeno o pH de los extractos. Por este motivo se seleccionaron cuatro cepas que presentaron los mejores resultados (mayores halos de inhibición)
De los cuatro extractos purificados mediante tratamiento con catalasa, proteinasa K, temperatura de 90 °C, temperatura de 120 °C y pH 6.5, el extracto de la cepa LAC134 de flora normal de niño recién nacido, mostró inhibición contra Listeria monocytogenes y Listera ivanovii. Las pruebas sugieren que la sustancia es de carácter protéico debido que después del tratamiento con catalasa y con el pH ajustado a 6.5 se obtuvo una inhibición de los dos microorganismos que se mencionaron anteriormente. A 90 °C se obtuvo halo de inhibición mientras que a 120 °C lo que indica que la sustancia bactericida es estable a 90 °C. Después del tratamiento de Proteinasa K se sugiere que la inhibición fue dada por la acción de una sustancia de carácter proteico debido a que no hubo halo de inhibición.
IV. CONCLUSIONES
Este estudio permitió crear una colección de cepas de Lactobacillus sp
aisladas de alimentos, niños recién nacidos y terneros, caracterizadas tanto por microbiología tradicional como por PCR da inicio a nuevas investigaciones en el tema de Probióticos y bioconservación. La técnica de la PCR para la identificación a nivel de género de Lactobacillus sp puede ser empleada como una herramienta adicional a la microbiología clásica para la caracterización de las cepas en el laboratorio. Se sugiere continuar esta investigación en la caracterización a nivel de especie de los Lactobacillus sp mediante electroforésis de gradiente denaturante como DGGE o TGGE.
Los resultados muestran que el 92.45% de las muestras analizadas contenían Lactobacillus sp capaces de inhibir microorganismos patógenos lográndose así la compilación de un grupo de cepas que pueden ser usadas en la industria de alimentos colombiana para bioconservacion de alimentos por su actividad contra microorganismos patógenos o deterioradores. Este estudio permitió hallar ocho cepas nativas de Lactobacillus spp. con actividad antimicrobiana frente a los cinco microorganismos evaluados que son de interés en la salud pública en nuestro país.
Adicionalmente permitió identificar un extracto de carácter protéico proveniente de una cepa de orígen humano que inhibe Listeria monocytogenes y Listera ivanovii sugieren su uso potencial en bioconservación.
V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Agradecimientos:
