1 Departamento de Ciencias Biológicas. Universidad Técnica Particular de Loja. Ecuador
2 MS2E Microbial Systems Ecology and Evolution / Ecología y Evolución de Sistemas Microbianos. Departamento de Ciencias Biológicas. Universidad Técnica Particular de Loja. Ecuador
Autor de correspondencia: [email protected]
Introducción
En Ecuador la actividad minera desorganizada y artesanal genera un alto grado de contaminación am-biental, sobre todo la relacionada con la extracción de oro produciendo un vertimiento muy elevado de mercurio al suelo y riachuelos cercanos a las áreas de extracción1. En la actualidad los ecosistemas
contami-nados están en el centro de atención tanto de gober-nantes como de la comunidad científica y la creación de estrategias para recuperar y disminuir el impacto de la elevada contaminación por metales pesados es un
activo campo de investigación2.
El empleo de especies vegetales de por sí no es una estrategia de biorremediación con un balance cos-to/beneficio favorable3. Una alternativa para mejorar
estrategias de remediación basadas en plantas acumu-ladoras de metales pesados consiste en asociar las plan-tas con microorganismos del suelo4. Estos
microorga-nismos tienen la capacidad de facilitar el proceso de extracción de metales pesados por parte de la rizósfera de las plantas5. La rizósfera es considerada como un
“punto caliente” de las actividades microbianas, en donde las interacciones entre las raíces y los
microor-Caracterización molecular y criopreservación de hongos
y bacterias asociados a la rizósfera de especies vegetales
acumuladoras de metales pesados en suelos
contamina-dos por minería.
Molecular characterization and cryopreservation of fungi and bacteria
asso-ciated to the rhizosphere of heavy metal accumulation vegetable species in
soils contaminated by mining.
José Francisco Ochoa1. Aminael Sánchez-Rodríguez2.
DOI. 10.21931/RB/2017.02.02.3
RESUMENLos microorganismos son un claro ejemplo de la enorme biodiversidad que contiene el suelo. Se procedió al ais-lamiento in vitro, caracterización molecular e identificación de microorganismos de suelo de rizósfera asociados a
Miconia zamorensis y Erato polymnoides, considerados como acumuladores de metales pesados en la zona minera de Chinapintza - Zamora Chinchipe. Las cepas se identificaron mediante la secuenciación del gen 16S ARN riboso-mal en bacterias, y se identificó la presencia de géneros como Bacillus, Lysinibacillus y Serratia. En hongos se utilizó la secuencia del gen ITS ARN ribosomal y se identificaron los géneros Aspergillus, Talaromyces, Penicillium, Trichoderma, Nodulisporium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Umbelopsis e Hypochnicium. Tales géneros forman parte del suelo y se consideran como tolerantes a ecosistemas con elevada contaminación de metales pesados. Nuestros resultados serán el punto de partida de información sobre la potencialidad que brindan estos microorganismos para desa-rrollar estrategias de biorremediación en la zona de estudio. Debido a la gran demanda de elaborar colecciones de microorganismos con fines de biorremediación, se planteó la criopreservacion de los cultivos puros bacterianos y fúngicos. Se obtuvo una viabilidad efectiva en la reactivación de los cultivos bacterianos, mientras que en hongos la mayoría de cultivos fueron reactivados con éxito.
Palabras clave: Microorganismos de suelo, aislamiento in vitro, criopreservación, caracterización molecular, 16S ARN ribosomal, ITS ARN ribosomal.
ABSTRACT
Microorganisms are a clear example of the enormous biodiversity contained in the soil. It proceeded to the in vitro isolation, molecular characterization and identification of microorganism’s rhizosphere soil associated with Miconia zamorensis and Erato polymnoides, regarded as accumulators of heavy metals in the mining area of Chinapintza - Zamora Chinchipe. The strains were identified by sequencing the 16S ribosomal RNA gene in bacteria, and it was identified the presence of genera such as Bacillus, Serratia and Lysinibacillus. In fungi was used the sequence of ITS ribosomal RNA gene and it was identified the genres Aspergillus, Talaromyces, Penicillium, Trichoderma, Nodulispo-rium, FusaNodulispo-rium, Rhizopus, Mucor, Hypochnicium and Umbelopsis. Such genres form part of the soil and are considered as tolerant to ecosystems with heavy metals contamination. Our results will be the starting point of information on the potentiality of these microorganisms to develop bioremediation strategies in the study area. Due to the high demand to elaborate collections of microorganisms for bioremediation purposes, it was proposed the cryopreser-vation of bacterial and fungal pure cultures. It was obtained an effective viability in the reacticryopreser-vation of bacterial cultures, while in fungi most cultures were reactivated successfully.
Keywords: Soil microorganisms, in vitro isolation, cryopreservation, molecular characterization, 16S ribosomal RNA, ITS ribosomal RNA.
ganismos constituyentes del suelo (minerales y materia orgánica) tienen lugar5. En general, los microorganismos sirven como
in-termediarios entre la planta que requiere nutrientes o minerales solubles, y el suelo, que contiene los nutrientes necesarios pero a menudo en bajas concentraciones y formas inaccesibles para las plantas 6. De este modo los microorganismos de la rizósfera
proporcionan un enlace crítico entre las plantas y el suelo7. Por lo
tanto, los microorganismos han desarrollado estrategias diversas que han propiciado el florecimiento de una serie de interacciones sinérgicas, tanto entre sí como con la planta7.
Los microorganismos consumen metales pesados de forma activa (bioacumulación) o pasivamente (adsorción)3. Por ello
tie-nen la capacidad de inmovilizar metales por medio del secuestro o acumulación celular o a través de procesos de precipitación ex-tracelular8. Los efectos de los metales pesados sobre las
comu-nidades microbianas pueden tener consecuencias dramáticas para el funcionamiento de todo el ecosistema9. Si los metales se
encuentran en concentraciones suficientemente altas pueden re-ducir el tamaño de las poblaciones microbianas, destruyendo sus estructuras y reduciendo sus actividades biológicas10. Por
consi-guiente la estrecha interacción entre los microorganismos de la rizósfera y las plantas conducen a un aumento en las actividades relacionadas con la recuperación de suelos contaminados11.
Basados en estos antecedentes, en el presente proyecto se decidió explorar la diversidad de comunidades microbianas aso-ciadas a la rizósfera de especies vegetales acumuladoras de meta-les pesados en suelos contaminados, así como estrategias para su conservación en condiciones in vitro para facilitar aplicaciones de fitoremediación.
Métodos
Aislamiento
in vitro
de cultivos microbianos.
Se realizó el aislamiento de microorganismos de suelo de rizósfera de Miconia zamorensis y Erato polymnoides identifica-das como especies acumuladoras de metales pesados en la zona minera de Chinapintza – Zamora Chinchipe (Ecuador). Se esta-blecieron dos transectos de 50m2, ubicados en las coordenadas4°02’16.6”S 78°34’14.9”W. Transecto A: suelo contaminado al margen de un caudal de agua que sirve de vertedero de residuales de la actividad minera. Transecto C: área ubicada 300m al norte del transecto A.
Las cepas se aislaron utilizando la técnica de dilución en serie y fueron cultivadas en cajas Petri con medios de cultivo específicos para bacterias (BBL™ Trypticase™ Soy Agar -TSA) y hongos (BD Difco™ Potato Dextrose Agar - PDA).
Criopreservación y viabilidad de cepas bacterianas
y fúngicas.
Los cultivos bacterianos y fúngicos puros fueron conserva-dos en criotubos de almacenamiento y como crioprotectante se empleó el glicerol. Finalmente se procedió a colocar los criotu-bos en congelación a -80°C. Posteriormente fueron reactivadas al cabo de un periodo de tiempo en congelación. En bacterias fue después de 8 semanas mientras que en hongos fue en el lapso de 12 semanas. Tal proceso se realizó para medir la viabilidad del método de criopreservación empleado.
Caracterización molecular de cepas bacterianas y
fúngicas.
Los cultivos bacterianos y fúngicos puros fueron conserva-dos en criotubos de almacenamiento y como crioprotectante se empleó el glicerol. Finalmente se procedió a colocar los criotu-bos en congelación a -80°C. Posteriormente fueron reactivadas al cabo de un periodo de tiempo en congelación. En bacterias fue después de 8 semanas mientras que en hongos fue en el lapso de 12 semanas. Tal proceso se realizó para medir la viabilidad del método de criopreservación empleado.
Caracterización molecular de cepas bacterianas y fúngicas. Se procedió a la obtención de ADN genómico de las cepas bacterianas y fúngicas reactivadas empleando el kit de extrac-ción UltraClean Microbial DNA Isolation kit (MoBio) siguiendo el protocolo del fabricante. Posteriormente se amplifico el ADN genómico mediante la técnica de Reacción en cadena de la poli-merasa (PCR).
Las cepas bacterianas se identificaron utilizando las secuen-cias del gen 16S ARN ribosomal. Las muestras de ADN fueron obtenidas para cada colonia individual de cada cepa y la ampli-ficación del gen 16S ARN ribosomal se llevó a cabo por PCR. La amplificación del ADN se realizó utilizando el GoTaq PCR Kit (PROMEGA) utilizando las condiciones propuestas por12.
La amplificación se realizó mediante el empleo de los siguien-tes primers: EUB338 (ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG) y EUB518 (ATT ACC GCG GCT GCT GG)12. Se empleó el
termo-ciclador (Applied Biosystem) y las condiciones fueron 94°C-9min por 1 ciclo; 94°C-45seg, 55°C-45seg, 72°C-45seg por 30 ciclos; 72°C-7min por 1 ciclo.
Las cepas fúngicas se identificaron utilizando las secuencias del gen ITS ARN ribosomal. La amplificación por PCR del ADN se realizó utilizando el GoTaq Pcr Kit (PROMEGA). La amplifi-cación se realizó utilizando los primers ITS1F (TCC GTA GGT GAA CCT GCG G) y 5.8S (CGC TGC GTT CTT CAT CG)12. Se
empleó el termociclador (ProFlex™ PCR System) con las siguien-tes condiciones: 95°C-2min por 1 ciclo; 95°C-1min, 50°C-30seg, 72°C-30seg por 40 ciclos; 72°C-5min por 1 ciclo.
Los productos de PCR amplificados se separaron por elec-troforesis en geles de agarosa al 1%. Las muestras que obtuvieron resultados positivos en relación a la observación de bandas fue-ron purificadas empleando el protocolo Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System siguiendo el protocolo del fabricante. Se obtuvo un volumen final de 30 µl por cada muestra que fue utilizada para la secuenciación.
Secuenciación y análisis bioinformático de los
frag-mentos amplificados de los microorganismos.
Las muestras purificadas de productos de PCR se secuen-ciaron empleando el servicio de la compañía Macrogen, Korea (http://www.macrogen.com/kor/). Las secuencias bacterianas y fúngicas fueron analizadas utilizando la herramienta BLAST en la base de datos del NCBI GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/) para encontrar secuencias estrechamente relacionadas. So-bre la base de máxima identidad fueron seleccionadas las prime-ras cinco secuencias y alineadas conjuntamente con las secuen-cias de bacterias y de igual manera para los hongos, para ello se empleó la herramienta MAFFT (Versión 7, estrategia G-INS-i). Para la construcción de árboles filogenéticos se utilizó el mé-todo de Máxima Verosimilitud con 1000 réplicas de bootstrap, empleando el software de análisis genéticos MEGA6. Por medio de este análisis fue posible la identificación molecular de los mi-croorganismos presentes en la rizósfera de las especies vegetales asociados a las muestras de suelo.
Resultados
Criopreservación y viabilidad de microorganismos
aislados.
Para realizar un congelamiento efectivo es necesario man-tener los microorganismos bajo ausencia de agua, lo que resul-tara en un estado de latencia de las células vivas para inhibir sus actividades bioquímicas13, proporcionando las condiciones
ne-cesarias para estabilizar a los microorganismos preservados in-movilizando o reduciendo el contenido de agua de las muestras almacenadas14. Esto concuerda con los resultados obtenidos en
cabo del periodo en congelación. Entre los principales factores que permitieron tal recuperación se encuentra que se aplicó como crioprotectante al glicerol. Según15 el glicerol mediante el
aumento de la concentración total de solutos reduce la cantidad de hielo formada, que es la causa del daño al momento de someter a microorganismos a extremas temperaturas de congelación, y el glicerol protege a las células contra este daño. La eficacia del gli-cerol como crioprotectante depende de una serie de propiedades: (a) es un compuesto soluble en agua y puede permanecer así a bajas temperaturas con el fin de producir una profunda depresión del punto de congelación; (b) capacidad de penetración celular; y (c) posee una baja toxicidad de modo que se puede utilizar a elevadas concentraciones16.
En hongos de las 100 aislados sometidos a criopreserva-ción únicamente fueron reactivados con éxito 90 muestras. Pue-de existir el caso que múltiples factores afecten la eficacia Pue-de la criopreservación que van desde procedimientos pre y post tra-tamiento. Estos incluyen, concentración del crioprotectante, fuentes de carbono y las intensidades de luz17. Durante la fase de
congelación, la formación de cristales de hielo se produce, y es letal cuando se forma intracelularmente, por lo tanto la preven-ción de dicha formapreven-ción es altamente deseable18. En el caso de
hongos la criopreservacion fue efectiva porque un alto porcentaje de muestras fueron viables, pero hubo el caso de muestras que no lo hicieron. Por ello se pudo dar el caso de que varios de los factores mencionados afectaron los cultivos y no permitieron una viabilidad efectiva.
En el caso de hongos y bacterias se empleó para la criopre-servación diferentes concentraciones de glicerol. Para hongos fue empleado al 10% y se obtuvo resultados satisfactorios en la con-gelación y posterior reactivación de las colonias fúngicas. A una concentración del 10%, el glicerol permite que la solución conge-lada sea bastante sólida a -80°C19 y los hongos fueron cultivados
en medio de agar previamente a ser almacenados, a esta concen-tración el glicerol cumple su función de evitar daños de congela-ción, tales como la formación de cristales de hielo20. Por otro lado
las colonias bacterianas fueron sometidas a concentraciones más altas de glicerol (80%), ya que a concentraciones mayores al 50% el cultivo puede permanecer parcialmente líquido21 y las bacterias
fueron criopreservadas en medio de cultivo líquido.
Identificación molecular bacteriana basado en la
secuencia del gen 16S ARN ribosomal.
Un total de 27 secuencias de las muestras bacterianas fueron analizadas, las cuales fueron utilizadas para el análisis bioinfor-mático. Se determinó que la mayoría de las secuencias presen-taban una similitud mayor al 90% con las secuencias homologas más cercanas en las bases de datos del GenBank. La identificación filogenética de los aislados bacterianos basados en la secuencia parcial del gen 16S de ARN ribosomal se muestran en la Tabla 1. El análisis de las secuencias del gen 16S ARN ribosomal per-mitió identificar los siguientes géneros: Bacillus, Lysinibacillus y
Serratia.
Identificación molecular fúngica basado en la
se-cuencia (ITS) de la región de ARN ribosomal.
Un total de 41 secuencias de las muestras fúngicas fueron analizadas, las cuales fueron utilizadas para el análisis bioinfor-mático. Se determinó que la mayoría presentaban una similitud mayor al 90% con las secuencias homologas más cercanas en las bases de datos del GenBank. La identificación filogenética de los aislados fúngicos basados en la secuencia parcial del gen ITS de ARN ribosomal se muestran en la Tabla 2. El análisis de las secuencias del gen ITS ARN ribosomal permitió identificar los siguientes géneros: Aspergillus, Talaromyces, Penicillium, Tricho-derma, Nodulisporium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Umbelopsis, e Hypochnicium.
Tabla 1: Identificación molecular de aislados bacterianos.
Análisis filogenético de Bacterias.
La Figura 1 revela un árbol filogenético entre las cepas aisla-das y las secuencias de varias especies de referencia del GenBank. Lo que ha permitido conocer las poblaciones de bacterias cultiva-bles pertenecientes a las diferentes fuentes de asilamiento.
Se ha evidenciado la presencia de los géneros Bacillus, lysi-nibacillus y Serratia en los transectos A y C. Tal patrón de agre-gación se puede explicar porque que ambos transectos se en-cuentran en un área con un alto deterioro del medio ambiente. El transecto C pertenece a una zona minera abandonada, donde las actividades mineras se detuvieron cinco años antes del pre-sente estudio. Por otro lado el transecto A es una zona intensiva de minería, en donde se están llevando a cabo una gran cantidad de actividades de minería de oro a pequeña escala. Otro de los motivos es que se determinó que en los tejidos (raíz, tallo y ho-jas) de Miconia Zamorensis y Erato polymnoides se encontraban considerables cantidad de Hg. En el transecto C una media de concentración de Hg de (0.4 ± 0.2 - mg kg-1), mientras que en el transecto A una media de concentración de Hg de (2.1 ± 1.8 - mg kg-1). Por lo tanto no existe gran diferencia en la concentración de Hg entre los transectos, lo que evidencia las similares condi-ciones de contaminación entre ambos sitios.
Es interesante indicar que los géneros dominantes detec-tados en las muestras de cada transecto se relacionan con cepas degradantes y resistentes a metales pesados, tales como Baci-llus, Lysinibacillus y Serratia.22 informaron que Bacillus es una
cre-Tabla 2: Identificación molecular de aislados fúngicos.
cimiento de Bacillus bajo condiciones de estrés. Además23
indi-caron que bacterias formadoras de esporas resistentes a metales pesados como Bacillus pueden emplearse en sitios contaminados que permitan la biorremediación de ambientes tóxicos.
Las cepas del genero Lysinibacillus es ampliamente aplicada en la biorremediación de metales pesados24, tales como Co, Cu,
Cr y Pb25. Otra de las cepas bacterianas identificadas pertenecen
al género Serratia la cual ha sido identificada de naturaleza tole-rante a metales26. En un estudio realizado por27 reportaron que Serratia posee un amplio rango de resistencia a múltiples metales pesados como Mn, Hg, Pb, Zn, Cr, Ni, Co.
Análisis filogenético de Hongos.
En la Figura 2 se muestra un árbol filogenético de las mues-tras fúngicas y las secuencias de varias especies de referencia del GenBank. Lo que ha permitido conocer las poblaciones de
hongos cultivables pertenecientes a las diferentes fuentes de asi-lamiento.
En los transectos A y C se ha evidenciado que las concentra-ciones de Hg en el suelo se encuentran en cantidades significati-vas, por ello la mayoría de los géneros identificados en el presente estudio se encuentran tanto en los transectos A y C.
Los hongos son habitantes naturales del suelo y tienen una elevada potencialidad para la remediación en virtud de su enor-me crecimiento, mayor biomasa, producción y extenso alcance de las hifas en el suelo28. Son un grupo versátil, ya que pueden
adaptarse y crecer en diversas condiciones extremas de pH, tem-peratura y disponibilidad de nutrientes, así como en ambientes con elevadas concentraciones de metales29, como es el caso del
material en la pared celular que muestra excelentes propiedades de unión a los metales30. Al describir la capacidad de crecer en
altas concentraciones de metales, distinguimos hongos tolerantes a metales pesados los cuales se describen a continuación.
Especies del genero Aspergillus, Penicillium, Rhizopus y Tri-choderma son únicos por su elevada tolerancia a metales y por su potencial de biosorción a diferentes metales pesados, además pertenecen a los microorganismos que son muy eficaces en la eli-minación de metales pesados de ambientes contaminados31. Por
ello se han convertido en microorganismos dominantes en hábi-tats contaminados32.
Otro de los géneros identificados fue Talaromyces el cual es tolerante a elevados niveles de Hg, Cu, Co, Pb y Cd33. La
adapta-ción a dichos metales fue el resultado de mecanismos fisiológicos y por procesos bioquímicos activados que confieren resistencia a varios metales pesados34. También entre los géneros identificados
se encuentran Nodulisporium el cual es un hongo endófito35 y es
eficaz como agente de control biológico contra una variedad de hongos patógenos36; Mucor que ha sido aislado de suelos
conta-minados por metales pesados y se ha descrito una fuerte resisten-cia a Cd y Pb37; Umbelopsis que es tolerante a elevadas
concentra-ciones de Hg38 e Hypochnicium que posee una elevada resistencia
a Hg, As, Cd, Cu y Pb respectivamente39. Finalmente entre los
ais-lados se encontraron muestras pertenecientes al género Fusarium
el cual puede desarrollarse en ambientes con presencia de Cr40.
CONCLUSIONES
El presente estudio representa un primer avance en el reco-nocimiento de la microflora asociada a la rizósfera de las especies identificadas como acumuladoras, Miconia zamorensis y Erato polymnoides en la zona minera de Chinapintza. Se pudo obtener un alto nivel de diversidad con respecto a los géneros y especies de hongos y bacterias identificados, que serán el punto de parti-da de información sobre la potencialiparti-dad que brinparti-dan estos mi-croorganismos para desarrollar estrategias de biorremediación en la zona de estudio. Se determinó la presencia de géneros bacteria-nos que pueden emplearse como agentes potenciales de biorre-mediación. Tales géneros bacterianos pueden tolerar ambientes contaminados con metales pesados debido a que poseen varias características metabólicas y catabólicas de resistencia. Por otro lado el conocimiento de la presente investigación proporciona-rá información acerca de los principales géneros fúngicos que se encuentran en la rizósfera de especies vegetales acumuladoras de metales pesados en Chinapintza, y con ello se pretenderá conocer acerca de la enorme diversidad de hongos que existe en el suelo.
La disponibilidad de materiales biológicos proporciona una ventaja significativa para establecer metodologías que permitan almacenar y preservar de forma estable durante determinados periodos de tiempo microorganismos basados en experimenta-ción in vitro, y con ello apoyar programas de conservaexperimenta-ción, re-mediación de áreas contaminadas o el desarrollo de técnicas de preservación eficientes. La congelación a -80°C de las muestras microbianas con la metodología establecida en el estudio posibi-litó el mantenimiento de la actividad enzimática y metabólica al cabo de un periodo de almacenamiento. Por lo tanto el método aplicado en la criopreservación de bacterias y hongos permitió obtener una viabilidad efectiva en la reactivación de las cepas pu-ras.
AGRADECIMIENTOS
Con inmenso placer me gustaría dejar constancia de mi sincero agradecimiento al PhD. Aminael Sánchez, por su orien-tación, observaciones, críticas y estimulo durante el transcurro de este trabajo. También tengo una gratitud especial al Bq. Os-car Vivanco por su colaboración y las intervenciones oportunas en momentos cruciales. Expreso un profundo agradecimiento al
Ing. Hernán Lucero por todos sus comentarios de apoyo y de mo-tivación que extendió hacia mí durante el curso de la investiga-ción. Finalmente a mi amiga y compañera Blga. Xiomara Recalde por su colaboración.
Referencias bibliográficas
1. Lovitz S. B. Scales of responsible gold mining: overcoming barriers to cleaner artisanal mining in southern Ecuador [Doctoral disserta-tion]. The University of Vermont; 2006.
2. Report I. Soil Contamination : Impacts on Human Health. Science for Environmental Policy. 2013; (5):1–29.
3. Dixit R, Wasiullah E, Malaviya D, Pandiyan K, Singh U, Sahu A, Shukla R & Paul, D. Bioremediation of Heavy Metals from Soil and Aquatic Environment: An Overview of Principles and Criteria of Fundamental Processes. Sustainability. 2015;7(2):2189-2212. 4. González Chávez M del C. Remediation of Soils Polluted with Heavy
Metal Using Plants and Rhizospheric Microorganisms. Terra Latino-americana. 2005;23(1):29–37.
5. Lambers H, Mougel C, Jaillard B, Hinsinger P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: an evolutionary perspective. Plant and Soil. 2009;321(1-2):83-115.
6. Ortíz-Castro R, Contreras-Cornejo H, Macías-Rodríguez L, López-Bucio J. The role of microbial signals in plant growth and development. Plant Signaling & Behavior. 2009;4(8):701–12. 7. Mendes R, Garbeva P, Raaijmakers J. The rhizosphere
microbi-ome: significance of plant beneficial, plant pathogenic, and hu-man pathogenic microorganisms. FEMS microbiology reviews. 2013;37(5):634-663.
8. Wang Y, Shi J, Wang H, Lin Q, Chen X, Chen Y. The influence of soil heavy metals pollution on soil microbial biomass, enzyme activity, and community composition near a copper smelter. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2007;67(1):75-81.
9. Turpeinen R. Interactions between metals, microbes and plants – Bioremediation of arsenic and lead contaminated soils. 1st ed. Lahti: University of Helsinki; 2002. 48.
10. Sobolev D, Begonia M. Effects of heavy metal contamination upon soil microbes: Lead-induced changes in general and denitrifying microbial communities as evidenced by molecular markers. In-ternational Journal of Environmental Research and Public Health. 2008;5(5):450–456.
11. Hongbo S, Liye C, Gang X, Kun Y, Lihua Z, Junna S. Progress in Phytoremediating Heavy-Metal Contaminated Soils. Detoxification of Heavy Metals. 2011. p. 73-90.
12. Fierer N, Jackson JA, Vilgalys R, Jackson RB. Assessment of Soil Microbial Community Structure by Use of Taxon-Specific Quan-titative PCR Assays. Applied and environmental microbiology. 2005;71(7):4117–20.
13. Vekeman B, Hoefman S, De Vos P, Spieck E, Heylen K. A generally applicable cryopreservation method for nitrite-oxidizing bacteria. Systematic and Applied Microbiology. 2013;36(8):579–84.
14. Day J., Stacey G. Cryopreservation and freeze-drying protocols. 2da ed. Methods in molecular biology. Humana Press; 2007. 347 p. 15. Criste A, Giuburuncă M, Negrea O, Dan S, Marius Z. Research
Concerning Use of Long-Term Preservation Techniques for Micro-organisms. Animal Science and Biotechnologies. 2014;47(2):73–78. 16. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of
microorgan-isms. Cryobiology. 2003;46(3):205–29.
17. Le Bui T. Cryopreservation, culture recovery and glucose induced programmed cell death in chlorophyte microalgae [Doctoral disser-tation]. The University of Queensland; 2015.
18. Day J. Cryopreservation: Fundamentals, mechanisms of damage on freezing/thawing and application in culture collections. Nova Hed-wigia. 2004;79(1–2):191–205.
19. Homolka L. Methods of Cryopreservation in Fungi. Laboratory Pro-tocols in Fungal Biology. 2013;9–17.
20. Espinel-Ingroff A, Montero D, Martin-Mazuelos E. Long-Term Preservation of Fungal Isolates in Commercially Prepared Cryogenic Microbank Vials. Journal of Clinical Microbiology. 2004;42(3):1257–1259.
22. Khare S, Ahmed N, Pant S, Das R. Characterization and evaluation of heavy metal tolerance of bacterial species from soil of waste area near Riyan steel rolling mills, Muzaffarnagar, India. Journal of Ap-plied Natural Science. 2010;2:88–92.
23. Kumar A, Singh Bisht B, Datt Joshi V. Biosorption of Heavy Metals by four acclimated microbial species, Bacillus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp. and Aspergillus niger. Journal of Biolog-ical and Environmental Sciences. 2010;4(12):97–108
24. Peña-Montenegro T, Dussán J. Genome sequence and description of the heavy metal tolerant bacterium Lysinibacillus sphaericus strain OT4b.31. Standards in Genomic Sciences. 2013;9(1):42–56. 25. Tuzen M, Dogan O, Usta C, Soylak M. Biosorption of copper ( II ),
lead ( II ), iron ( III ) and cobalt ( II ) on Bacillus sphaericus -loaded Diaion SP-850 resin. Analytica Chimica Acta. 2007; 581(2):241-246. 26. Nageswaran N, Ramteke P, Verma O, Pandey A. Antibiotic Suscep-tibility and Heavy Metal Tolerance Pattern of Serratia Marcescens Isolated From Soil and Water. Biorremediation & Biodegradation. 2012;3(7):3–7.
27. Jafarzade M, Mohamad S, Usup G, Ahmad A. Heavy-metal toler-ance and antibiotic susceptibility of red pigmented bacteria isolated from marine environment. Natural Resources. 2012;3(4):171–174. 28. Siddiquee S, Rovina K, Azad S, Naher L, Suryani S, Chaikaew P.
Mi-crobial & Biochemical technology heavy metal contaminants remov-al from wastewater using the potentiremov-al filamentous fungi biomass : A Review. Microbial & Biochemical Technology. 2015;7(6):384–393. 29. Iram S, Zaman A, Iqbal Z, Shabbir R. Heavy metal tolerance of
fungus isolated from soil contaminated with sewage and industrial wastewater. Pol J Environ Stud. 2013;22(3):691–697.
30. Khan A, Sharif M, Ali A, Noor S, Shah M, Mian I, & Ali, N. Potential of AM fungi in phytoremediation of heavy metals and effect on yield of wheat crop. American Journal of Plant Sciences. 2014;1578–1586.
31. Petková K, Jurkovic L, Simonovicova A, Cernansky S. Potential of Aspergilus niger in bioremediation of contaminated soils. Interna-tional Multidisciplinary Scientific GeoConference: SGEM: Survey-ing Geology & MinSurvey-ing Ecology Management. 2013;1:757–762. 32. Iram S, Perveen K, Shuja N, Waqar K, Akhtar I, Ahmad I. Tolerance
potential of different Species of Aspergillus as bioremediation tool - Comparative analysis. Journal of Microbiology. 2013;1(1):1–8. 33. Jaitly A. Mycoremediation : utilization of fungi for reclamation of
heavy metals at their optimum remediation conditions. Biolife. 2015;3(1):77–106
34. Romero M, Reinoso E, Urrutia M, Kiernan A. Biosorption of heavy met-als by Talaromyces helicus: A trained fungus for copper and biphenyl detoxification. Electronic Journal of Biotechnology. 2006;9(3):221–226. 35. Nair D, Padmavathy S. Impact of endophytic microorganisms on
plants, environment and humans. The Scientific World Journal. 2014;2014:11.
36. Porras-Alfaro A, Bayman P. Hidden Fungi , Emergent Properties : Endophytes and Microbiomes. Phytopathology. 2011;49(1):291. 37. Zhu S, Tang J, Zeng X, Wei B, Yang S, Huang B. Isolation of Mucor
circinelloides Z4 and Mucor racemosus Z8 from heavy metal-con-taminated soil and their potential in promoting phytoextraction with Guizhou oilseed rap. Journal of Central South University. 2015;22(1):88–94.
38. Crane S. Mercury effects on axeniclly grown fungal isolates and on pinus rigida and its ectomycorrhizal community [Doctoral disserta-tion]. The State University of New Jersey; 2011.
39. Kim M, Kim J, Kim G. Metal tolerance and sorption potential of in-digenous basidiomycetous fungi. Division of Environmental Science & Ecological Engineering. 2011;88–89.
40. Khurshid S, Shoaib A, Javaid A, Abid K. Bioaccumulation of chro-mium by Fusarium oxysporum. ScienceAsia. 2016; 42(2):92-98.
Recibido: 10 de abril de 2017
Aprobado: 15 de mayo de 2017
