Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
Curso Fitopatología Molecular 2012
Marcadores Moleculares
Marcadores Morfológicos
Fenotipos que resultan de mutaciones en el ADN
¿Qué son los
marcadores
genéticos?
Gregor Mendel
(Moravian Museum, Brno)
• El concepto de marcador surge con
los trabajos de Mendel:
Utilizó los colores de las flores (y otros caracteres
morfológicos) como marcadores que le permitieron
estudiar los patrones de la herencia
Jardín del monasterio donde Mendel realizaba
sus experimentos con las arvejas
• Permiten establecer diferencias
(polimorfismos) entre
dos
individuos
diferentes (genotipos) pertenecientes a la
misma especie (o a especies emparentadas).
• Su herencia suele responder a las leyes de Mendel.
• Los primeros marcadores utilizados fueron los de tipo
morfológico (fenotípicos), por ejemplo, color de la flor.
• Permiten la confección de mapas genéticos
o de
ligamiento.
• Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas.
¿Qué son los
marcadores
genéticos?
Mapa genético de tomate basado en marcadores morfológicos
Para:
• Identificación (genotipificación) de hospedantes o de patógenos
• Mapeo de genes y QTLs
• Selección asistida por marcadores
• Clonado posicional de genes basado en mapa
• Estudios de variabilidad/diversidad genética en distintas
especies (plantas y fitopatógenos), germoplasma, identificación
de cultivares, etc
¿Para qué queremos usar MM en
fitopatología?
TIPOS Y USOS DE MARCADORES
:
RDMs: Random DNA Markers
derivados de cualquier parte del genoma,
fenotípicamente neutros
FMs: Functional Markers
derivan de sitios polimórficos dentro de genes afectando
causalmente la variación del carácter fenotípico.
Surgen marcadores moleculares de las regiones
transcriptas /expresadas del genoma
• Fenotípicos: los polimorfismos de los genes se
detectan a través de sus productos
- Morfológicos: por ejemplo, color de flor
- Bioquímicos: básicamente perfiles electroforéticos de
isoenzimas y de proteínas de reserva
• Genotípicos o moleculares: Los polimorfismos
de genes u otras secuencias no codificantes se
detectan a nivel del ADN
- Restricción + hibridación molecular (ejemplo, RFLP)
- Amplificación por PCR (ejemplo, RAPD y microsatélites)
- Restricción + PCR: (ejemplo, AFLP)
- Conformación del ADN (ejemplo, SSCP)
- Secuenciación directa
Tipos de
marcadores
genéticos
Comparación
entre
marcadores
morfológicos
y moleculares
Marcadores
morfológicos
Influencia del ambiente
Bajo número
Baja cobertura del genoma
Bajo nivel de polimorfismo
Menos informativos
(dominantes o recesivos)
Caracteres de madurez
Entrenamiento y subjetividad
Sin influencia ambiental y neutros
Cantidad ilimitada
Amplia cobertura del genoma
Alto nivel de polimorfismo
Más informativos
(en general codominantes)
Análisis en fases tempranas
Sencillos, rápidos y objetivos
Marcadores
• Isoenzimas
Grupo de múltiples formas moleculares de una misma
enzima presente en una misma especie, como resultado
de la presencia de uno o más genes que codifican cada
una de estas formas.
Las que son relevantes como marcadores genéticos son
las
aloenzimas
(o alozimas) que son variantes alélicas
del mismo gen (o locus) y que presentan una migración
electroforética diferencial.
Marcadores
bioquímicos:
isoenzimas
Ejemplo:
detección de
isoenzimas
de maíz
F isomerasa
Identificación de variantes isoenzimáticas. Se observan genotipos homocigotas y heterocigotas para diferentes alelos en una población de maíz analizada para dos loci isoenzimáticos (MDH y F isomerasa), lo que
revela la existencia de polimorfismos dentro de la misma.
Malato deshidrogenasa (MDH
)
Detección
de proteínas
de reserva
• Se extraen mediante procedimientos sencillos.
• Se separan mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con
detergentes).
• No se requiere detectar actividad enzimática.
• Se visualizan por tinción con Azul de Coomassie.
Perfiles electroforéticos de proteínas de reserva
de distintas variedades argentinas de avena.
Ejemplo:
detección
de proteínas
de reserva
de avena
Marcadores
genotípicos o
moleculares
basados en
la restricción
enzimática
del ADN
Marcadores moleculares RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
(polimorfismo de longitud de fragmentos
de restricción)
Extracción de ADN: Generación de marcadores de ADN
1- Recolección muestra material vegetal y almacenamiento temporario en hielo
5- Extracción del ADN utilizando solventes orgánicos.
2- Almacenamiento en ultrafreezer (– 80 °C).
3- Macerado del tejido vegetal empleando nitrógeno líquido.
4- Pasaje de la muestra a tubos eppendorf y pesado de la misma.
6- Muestras con buffer de extracción en baño
termostático.
7- Centrifugado para separación de la fase
líquida de la sólida. 8- Purificación final del ADN extraído (lavados con alcohol y resuspensión final del mismo en agua estéril.
Herencia de
los RFLPs
Análisis utilizando RFLPs de los bulks resistente (R) y susceptble (S) al virus PVX de Solanum commersonii empleando las enzimas de restricción HinfI, DdeI, HindIII, DraI, EcoRI, XbaI y StyI (1 al 7).
Autoradiografía de los perfiles de RFLP obtenidos empleanado la sonda s1+A/as1+T(584) marcada con radioactividad.
Perfiles de
RFLPs de
Solanum
Mutaciones puntuales:
Ocurren en sitios de restricción.
Mutaciones estructurales:
Ocurren mediante inserciones, deleciones y rearreglos.
Origen del
polimorfismo
de los RFLPs
Southern blot analysis of EcoRI-digested genomic DNA from Xam
strains probed with a-32P-labeled pthB. The 26 haplotypes detected in Colombia are in the following order. (A) Lane 1, C1; lane 2, C2; lane 3, C17; lane 4, C3; lanes 5 and 6, C4; lane 7, C22; lane 8, C5; lane 9, C6; lane 10, C7; lane 11, C8; lane 12, C9; lane 13, C10; lane 14, C11; lane 15, C12. (B) Lanes 1 and 6, C13; lane 2, C14; lane 3, C15; lane 4, C16; lane 5, C18; lanes 7 and 13, C19; lane 8, C20; lane 9, C21; lane 10, C23; lane 11, C24; lane 12, C25; lane 14, C26. Lanes R,
Geographical
Differentiation of
the Population of
Xanthomonas
axonopodis pv.
manihotis in
Colombia.
Appl. Environ.
Microbiol. 1997.
63:4478-4486
•
Comprenden un número potencialmente ilimitado
de loci (alta cobertura genómica).
•
Son codominantes, por lo tanto más informativos.
•
Permiten una mayor cobertura del genoma que las
isoenzimas.
•
Son altamente reproducibles intra- e inter-
laboratorios.
•
Permiten homologar mapas de ligamiento
diferentes.
•
Se pueden usar las mismas sondas en especies
relacionadas (sondas heterólogas).
•
Al igual que todos los marcadores moleculares,
tienen mayor grado de polimorfismo que las
isoenzimas, no son influidos por el ambiente y son
selectivamente neutros.
Ventajas de
los RFLPs
•
Algunas especies presentan bajo nivel de
polimorfismo (en comparación con otros
marcadores moleculares).
•
Se requiere disponer de sondas específicas
para la especie en estudio.
•
La utilización de radiactividad introduce altos
costos y problemas de bioseguridad.
•
Requieren alta cantidad de DNA.
El procedimiento es laborioso y lento.
Desventajas
de los RFLPs
Marcadores
moleculares
basados en la
amplificación
arbitraria
(o
semi-arbitraria)
del ADN
Random Amplified Polymorphic DNAs
(polimorfismo de ADN amplificado al azar)
Características
del análisis
de RAPDs
- Consiste en la amplificación mediante PCR
de ADN, utilizando un único iniciador de
secuencia arbitraria.
- Normalmente se usa un sólo iniciador,
de 10 nucleótidos de longitud (más corto
que el de una PCR común) y con un alto
contenido en G+C.
- Ejemplo: OP-A01
RAPDs
Amplificación de ADN anónimo
con iniciadores de secuencia arbitraria
No permiten distinguir el heterocigota del homocigota dominante
Los RAPDs son marcadores genéticos dominantes
Puede deberse a: inserciones (2), deleciones (3),
mutaciones de punto que impiden la unión del
iniciador (4), o que crean un nuevo sitio de unión
del iniciador (5).
Origen del
polimorfismo
de los RAPDs
Ejemplo: RAPDs en sorgo
Segregación de un marcador RAPD en una población segregante de sorgo para el carácter
de resistencia a brotado precosecha. DNAs de IS, B2 (parentales), F1 y F2 amplificados con
el primer OP H02. Productos de PCR corridos en un gel de agarosa (1,5 %, TBE 1x) teñido
con bromuro de etidio.
Problemas
en la
Interpretación
de bandas
de RAPDs
• Problemas de subjetividad del operador:
- ¿Qué bandas se incluyen en el análisis
y cuáles no?
• Problemas de la co-migración:
-
Una banda no contiene necesariamente
un único fragmento de ADN.
- Una banda del mismo tamaño en dos
individuos no representa necesariamente
el mismo fragmento de ADN.
Ventajas de
los RAPDs
• No requieren conocimiento previo del
genoma (anónimos).
• El ensayo es rápido, simple y económico.
• Se dispone de un número ilimitado de
marcadores.
• El polimorfismo es elevado.
• Proveen una amplia cobertura del
genoma.
• La herencia es dominante (menor información
genotípica).
• Poseen problemas de reproducibilidad.
• La interpretación de bandas presenta
dificultades.
• A medida que la distancia filogenética
aumenta, también aumenta la probabilidad de
que dos fragmentos de ADN diferentes
comigren y se cometan errores de cómputo
(no son confiables para comparación entre
especies distintas).
• Sólo se puede computar presencia compartida
de bandas y no la ausencia.
Desventajas
Amplified Fragment Length Polymorphism
(polimorfismo de longitud de fragmentos
amplificados)
Marcadores moleculares AFLP
Marcadores
moleculares
basados en la
amplificación
arbitraria
(o
semi-arbitraria)
del ADN
Etapas para la obtención de marcadores AFLP
tomate
4.000.000
2.800
200.000
tomate
4.000.000
2.800
200.000
detección
digestión con Mse I (4pb) y Eco RI (6pb)
Mse I
Mse I
Eco RI
Eco RI
Mse I
Eco RI
Eco RI
Mse I
ligación de adaptadores
“pre”amplificación con oligos complementarios
amplificación con oligos selectivos
ACT
AGC
amplificación con oligos selectivos
ACT
AGC
Procedimiento
para la
obtención
de AFLPs
Ejemplo: AFLPs en Solanum commersonii
FIG. 2. Section of autoradiograph showing AFLP DNA fingerprints of P. infestans A1 isolate 80029 (A1), A2 isolate 88133 (A2), and 24 of their sexual F1 progeny (F1 progeny). The AFLP DNA fingerprints were generated with the primer
combination E1AC/M1CA. Markers segregating in the F1 progeny are indicated on the left. For nomenclature of AFLP markers see text. Approximately 20% of the total length of the lanes is shown.
AFLP Linkage Map of the Oomycete Phytophthora infestans. Theo Van der Lee, Ijfke De Witte, Andre´
Drenth, Carlos Alfonso and Francine Govers.
AFLP fluorescentes
Detección de AFLPs usando durante la última etapa
de amplificación iniciadores fluorescentes,
resolviendo los fragmentos en un secuenciador
ABI3130XL
Origen del
polimorfismo
de los AFLPs
• Resulta de mutaciones de punto, inversiones,
deleciones e inserciones que llevan a:
- Pérdida o ganancia de un sitio de
restricción.
- Alteración de la secuencia reconocida
por los iniciadores.
• Son marcadores dominantes: no es posible
distinguir fácilmente si una banda en un gel es
el resultado de la amplificación de 1 ó 2 alelos.
- Anónimos: no requieren
conocimiento previo del genoma.
- Número ilimitado de marcadores.
- Polimorfismo elevado.
- Analizan todo el genoma.
- Altamente reproducibles.
- Versátiles: distintas enzimas e
iniciadores selectivos.
Ventajas
de los
AFLP
• Herencia dominante.
• Bajo contenido de información
genética por locus.
• Procedimiento medianamente
laborioso.
• Costo medio.
Desventajas
de los
AFLP
Microsatélites
Repeticiones en tándem de secuencias cortas de
DNA de 1 a 10 pb de longitud
Ejemplos:
(GA)
14...GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA...
(GAT)
10...GATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT...
(CATC)
8...CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATC..
Sinónimos: SSLP, SSRP, SSR o STMS
Microsatélites
5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’
3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’
16 repeticiones
5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’
3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’
5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGC 3’ 3’ CACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCG 5’
105 pb
iniciador
CTGCGATCAGCCCATCATCG 5’
5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAG
iniciador
PCR con iniciadores específicos
Producto de amplificación obtenido
Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante
Microsatélites en diploides
1
2
3
1 2
3
(+)
Ejemplo: variedades de soja (Glycine max)
analizadas mediante SSR
Patrones obtenidos para 43 variedades de soja. Gel de poliacrilamida teñido con plata.
Métodos de separación / detección
Agarosa/bromuro de etidio
Poliacrilamida / nitrato de plata
Gentileza Lic. V. Nishinakamasu y Dra. N. Paniego
Gentileza Lic. P. Talia y Dra. N. Paniego
Radiactividad
Gentileza Lic. V. Nishinakamasu y Dra. N. Paniego
Fluorescencia
Empleo de
secuenciador
automático
Homocigota alelo 1
Pico 147-149 pb
Homocigota alelo 2
Pico 153-155 pb
Heterocigota:
ambos alelos
Electroferogramas para 3 genotipos de sorgo Gentileza Téc. L. Fernández
Síndrome del X - frágil
FMRP: factor de
transcripción
relacionado con el
aprendizaje
VARIANTES DE SSR
ISSR (Inter-SSR amplification):
se basan en la amplificación por PCR empleando iniciadores que contienen en su
secuencia repeticiones de di o trinucleótidos junto con 4 bases nucleotídicas
determinadas en uno de sus extremos. Al tener en el iniciador esas 4 bases extras,
a este tipo de marcador se lo conoce también como microsatélite anclado
(AMP-PCR, Anchored microsatellite-primed PCR).
•
Polimorfismo muy elevado (multialélicos)
•
Enorme número de loci
•
Herencia mendeliana codominante
•
Interpretación sencilla de los resultados
•
Reproducibilidad muy alta
•
Resultados transferibles entre laboratorios
•
Automatización
Ventajas
de los
•
Requerimiento de conocimientos previos sobre el
genoma de la especie en cuestión:
- Inicialmente lentos
- Inicialmente costosos
•
Alto costo para desarrollar los iniciadores
•
Unilocus (aunque pueden hacerse multiplex)
•
Alta tasa de mutación que puede afectar la
reproducibilidad en estudios genealógicos.
Desventajas
de los
Un fragmento polimórfico de interés, puede ser escindido de
un gel, clonado (o no) y secuenciado para diseñar iniciadores
específicos para ese fragmento en particular, permitiendo su
amplificación en condiciones de PCR más rigurosas.
Obtención de
marcadores
basados en
PCR
convencional
(SCAR,
CAPS, etc.)
Fig. 1. RAPD banding patterns generated using the primer P5 (AACGCGCAAC) on 1 ng genomic DNA of B. cinerea, strains B23 (1), B16 (2), B36 (3), B48 (4), B158 (5), B. aclada Bac1 (6), B. fabae Bfa2 (7), B. porri Bpo1 (8), Alternaria sp. H2 (9), Aspergillus sp. A16 (10), Cladosporium sp. C2 (11), Epicoccum purpurascens E5 (12),
Fusarium sp. F8 (13), Hainesia lythri Hl1 (14), Penicillium sp. A12 (15),
Rhizoctonia sp. R6 (16), Rhizopus stolonifer M1 (17), strawberry
(cv. Gorella)(18). Band subsequently cloned and sequenced is indicated by an arrow (approximately 750 bp). Lane 0: negative control (no DNA).Lane M: molecular mass marker (Leon DNA ladder).
Characterization of
molecular markers for
specific and sensitive
detection of Botrytis
cinerea Pers.: Fr. in
strawberry
(Fragaria X ananassa
Duch.) using PCR.
Stefania Rigotti , Katia Gindro, Hannes Richter, Olivier Viret
FEMS Microbiology Letters 209 (2002) 169-174
Fig. 3. Amplification PCR using the primers C729+/3 on 1 ng genomic DNA of B. cinerea, strains B23 (1), B16 (2), B36 (3), B48 (4), B158 (5), B. aclada Bac1 (6), B. fabae Bfa2 (7), B. porri Bpo1 (8),
Alternaria sp. H2 (9), Aspergillus sp. A16 (10), Cladosporium sp. C2 (11), E. purpurascens
E5 (12), Fusarium sp. F8 (13), H. lythri Hl1 (14), Penicillium sp. A12 (15), Rhizoctonia sp. R6 (16), R.
stolonifer M1 (17), strawberry (cv. Gorella) (18). Lane 0: negative control (no DNA). Lane M: molecular
Fig. 4. A: Southern blot hybridization of the RAPD patterns and of (B) the EcoRI-digested genomic DNA extracted from B23 (1), B16 (2), Bac1 (3), Bfa2 (4), F8 (5), R6 (6), strawberry plants cv. Gorella (7) with
Fig. 2. Nucleotide sequence of the 757-bp RAPD fragment from B. cinerea (accession number at the EMBL Data Library: AJ422103), insert of plasmid pSRC1. Primers P5, C729+ and C7293 are underlined. A secondary bindingsite for primer P5 is indicated by an asterisk. The restriction site EcoRI is double-underlined. Mismatches between B.
Development of specific PCR primers for the
detection of Rhizoctonia solani AG 2-2 LP from
the leaf sheaths exhibiting large-patch symptom
on zoysia grass.
Takeshi Toda , Tomoyuki Mushika , Mitsuro
Hyakumachi
SNP
Single Nucleotide
Polymorphism
Propiedades
de los
marcadores
basados en la
amplificación
de fragmentos
de ADN
conocidos
• Su análisis es sencillo (muy útiles en selección
asistida).
• El ensayo es altamente reproducible.
• Son fácilmente transferibles a otros laboratorios.
• Según las características de su diseño, pueden
ser codominantes.
• Pueden separarse en geles multiplex cuando se
analizan varios loci simultáneamente.
• Diversidad nucleotídica: 90% de la variación del genoma en
cualquier organismo
• Cambio en un único nucleótido
• En general son bialélicos, aunque por definición puede haber 4
variantes
• Ubicuos: pueden estar en cualquier región del genoma
• Se encuentran cada 100 a 300 pb
• Estables
• Pueden ser funcionales si están en regiones
• codificantes.
• Relativamente fáciles de procesar
Fig. 1 Example of intraspecies polymorphism of the ITS. The part of sequences of two different clones of
M. bovis (a, b) and Mycoplasma conjunctivae (c, d) are present.
Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71: 680–698. Sequence of the intergenic 16S-23S rRNA spacer (ITS) regionof
Técnicas para la detección de SNPs
Costo
Sensibilidad
Especificidad
Número de muestras a analizar
Posibilidad de automatización
Equipamiento necesario
Dificultad del ensayo
FUNDAMENTO
Consiste en la detección de muestras con afinidades diferentes por la fase móvil
de la HPLC.
LÍNEAS DE GIRASOL PARA ESTUDIAR RESPUESTA A SCLEROTINIA.
CROMATOGRAMAS SUPERPUESTOS DE LAS CORRIDAS INDIVIDUALES PARA EL CONTROL
HETERODUPLEX (
AZUL
) Y LOS CONTROLES HOMODUPLEX (RHA266
ROJO
Y PAC2 VERDE
).
PCR en tiempo real: sistema TaqMan
Detección
de SNPs:
métodos
de análisis
para gran
número de
muestras
Detección
de SNP
empleando
sondas
TaqMan®
para cada
alelo
Química de la discriminación alélica
La sonda sólo hibrida con la secuencia blanco si existe complementariedad perfecta de bases. Así, la sonda marcada con FAM sólo reconoce al alelo 2 (AT)
y la sonda marcada con VIC sólo reconoce al alelo 1 (GC). Ambas sondas se colocan en la misma reacción de PCR y, de acuerdo con el alelo presente, se obtienen señales fluorescentes para uno u otro fluorocromo. En un individuo
