ADN del cromosoma 21 en el plasma materno se mide directamente;

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Una nueva era en el diagno´stico prenatal:

el uso de ADN fetal de ce´lulas libres en la circulacio´n

materna para la deteccio´n de aneuploidias cromoso´micas

Moderadores: Jennifer L. Shea,1_{y Eleftherios P. Diamandis}1,2,3*

Expertos: Barry Hoffman,1,3_{Y.M. Dennis Lo,}4_{Jacob Canick,}5_{y Dirk van den Boom}6

El examen prenatal para la deteccioń de aneuploidias cromoso´micas es parte fundamental del cuidado obste´trico de rutina en la mayorıá de los paı´ses. Habitualmente, la edad de la madre, el peso, la etnicidad, los biomarcadores se´ricos (incluida la proteıńa A plasma´tica gestacional, gonado-tropina coriońica humana,␣-fetoproteıńa, inhibina A y es-triol) y las caracterı´sticas sonogra´ficas (es decir, translucencia nucal) se incluyen en un algoritmo de riesgo para determinar la probabilidad de que el feto se vea afectado. Las mujeres embarazadas identificadas como de alto riesgo de acuerdo con el examen prenatal pueden someterse a procedimientos invasivos, tales como amniocentesis y biopsia coriońica, para confirmar el diagno´stico. Los me´todos actuales de examen prenatal pueden identificar aproximadamente el 90% de los embarazos afectados por la trisomıá 21 (sıńdrome de Down) con un ıńdice de resultados falso positivos de aproximada-mente el 5%. Teniendo en cuenta que la prevalencia de las aneuploidias cromoso´micas es generalmente bastante redu-cida, un ıńdice de resultados falso positivos de aproximada-mente el 5% significa que un gran nu´mero de mujeres con embarazos no afectados se someten a procedimientos inva-sivos, lo que pone el feto en un riesgo innecesario de aborto espontańeo. La deteccioń de ADN fetal de ce´lulas libres en el plasma de mujeres embarazadas hace 14 anõs abrio´ la posi-bilidad de identificar anomalıás cromoso´micas de forma no invasiva a trave´s de una muestra de sangre uńica. Aproxima-damente un 10% del ADN de ce´lulas libres en la circulacioń materna es de origen fetal y esta propiedad se exploto´ inicial-mente para determinar el estado del rhesus D y el sexo del feto. Sin embargo, la aparicioń de la secuenciacioń de ADN de nueva generacioń ha permitido la deteccioń prenatal de aneuploidias cromoso´micas, incluida la trisomıá 21 de la sangre materna. En resumen, la proporcioń de molećulas de

ADN del cromosoma 21 en el plasma materno se mide di-rectamente; un incremento por encima de un umbral prede-terminado es indicativo de la trisomıá 21. El resultado clıńico deestapruebaprenatalnoinvasivahasidopromisorioycier-tos estudios clıńicos recientes han demostrado una sensibili-dad diagno´stica del 100% y una especificisensibili-dad diagno´stica del 98 al 99% en comparacioń con el cariotipado completo me- diantemediosinvasivos.Cuandoseutilizacomounprocedi-miento de ana´lisis confirmatorio, esta tecnologıá tambień tiene el potencial de reducir de forma notable la cantidad de mujeres que se someten a procedimientos de diagno´stico in-vasivos, lo que genera considerables ahorros en costos. En este artıćulo, 4 lı´deres en el a´rea del diagno´stico prenatal no invasivo brindan su opinioń sobre este fascinante avance. ¿Puede describir brevemente co´mo se ha aplicado la secuenciacioń de nueva generacioń (NGS)7a la de-teccioń de aneuploidias cromoso´micas con el ADN fetal de ce´lulas libres? ¿Existen otras tećnicas de laboratorio que se hayan estudiado con este objetivo? Barry Hoffman: La NGS

detecta de manera no

invasiva aneuploidias

cromoso´micas del feto

de forma previa al

nacimiento mediante la determinacio´n de la pro-porcio´n relativa del ADN del cromosoma afectado en el ADN fragmentado de ce´lulas libres que cir-cula en la sangre

ma-1_{Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto} (Departamento de Medicina de Laboratorio y Patologıá, Universidad de To-ronto), Toronto, Ontario, Canada´;2_{Department of Clinical Biochemistry,} Uni-versity Health Network, Toronto (Departamento de Bioquı´mica Clıńica, Red de Salud Universitaria de Toronto), Ontario, Canada´;3_{Department of Pathology} and Laboratory Medicine, Mount Sinai Hospital (Departamento de Patologıá y Medicina de Laboratorio, Hospital de Mount Sinai), Toronto, Ontario, Canada´; 4_{Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinese University of Hong Kong} (Instituto de Ciencias de la Salud Li Ka Shing, Universidad China de Hong Kong), Hong Kong RAE, China;5_{Division of Medical Screening and Special Testing,} Department of Pathology and Laboratory Medicine, Women and Infants Hos-pital, Alpert Medical School of Brown University (Divisioń de Exa´menes Me´dicos

y Pruebas Especiales, Departamento de Patologı´a y Medicina de Laboratorio, Hospital de Mujeres y Nin˜os, Facultad de Medicina Warren Alpert de la Universidad de Brown, Providence, RI;6_{Sequenom, Inc., San Diego, CA.} * Dirigir correspondencia para estos autores a: Mount Sinai Hospital, 60 Murray

St., 6th Floor, Toronto, Ontario, M5G 1X5 Canada´. Fax 416-586-8628; correo electro´nico: ediamandis@mtsinai.on.ca.

Recibido para la publicacio´n el 31 de enero de 2013; aceptado para la publicacio´n el 5 de febrero de 2013.

7_{Abreviaturas no estańdar: NGS, secuenciacioń de nueva generacioń; MPSS,} secuenciacioń aleatoria masiva en paralelo; PPNI, pruebas prenatales no inva-sivas; TAT, tiempo de obtencioń; ISPD, International Society for Prenatal Diag-nosis (Sociedad Internacional de Diagno´stico Prenatal).

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terna. Se requieren varios millones de cifras de secuen-ciacioń a un nivel de cobertura apropiado para cuantificar de forma confiable el aumento o la dis-minucioń minu´sculos de las dosis cromoso´micas en la circulacioń materna debido a aneuploidias fetales y esto se ha vuelto posible solo con la aparicioń de la tecnologıá NGS. La secuenciacioń de todos los frag-mentos de ADN circulante se realiza sin seleccioń pre-via mediante el uso de la secuenciacioń aleatoria ma-siva en paralelo (MPSS) en un enfoque no dirigido, o bien se seleccionan primero los fragmentos de ADN del objetivo de intere´s, en este caso el cromosoma aneu-ploide junto con el otro, en forma previa a la secuen-ciacioń posterior. El u´ltimo me´todo requiere una secuenciacioń considerablemente menor, lo que me-jora el rendimiento y reduce el costo del reactivo, pero es por consiguiente ma´s complejo ya que requiere una estrategia de seleccioń del ADN de las regiones dirigi-das. Algunos de los me´todos corrigen la fraccioń del ADN de ce´lulas libres en la circulacioń materna que se origina a partir del feto, ya que esta influye en la mag-nitud de la dosis cromoso´mica aneuploide observada respecto del contexto de la contribucioń diso´mica ma-terna mucho mayor. Habitualmente, la fraccioń fetal se encuentra en el orden del 10%; sin embargo, pueden obtenerse resultados lo suficientemente confiables cuando la fraccioń es de tan solo el 3 al 4%. Otro en-foque es el de enriquecer la fraccioń fetal; por ejemplo mediante la explotacioń de las diferencias de meti-lacioń entre el ADN fetal y materno antes de la secuen-ciacioń para aumentar la senãl fetal.

Dennis Lo: La mayorı´a

de los estudios publica-dos sobre el uso de la NGS para la deteccio´n de aneuploidias cromoso´mi-cas se basan en la secuen-ciacio´n aleatoria, o

shot-gun. Cuando se vuelven a

trazar los datos de

secuenciacio´n en

rel-acioń con el genoma hu-mano de referencia, estos aportan una representacioń proporcional de cada cromosoma en el plasma materno. Cuando se utiliza para detectar una trisomıá fetal, el cromosoma aneu-ploide mostrara´ un incremento en la representacioń del plasma materno en presencia de un feto que padece trisomıá. Adema´s de la secuenciacioń aleatoria, dife-rentes investigadores han realizado publicaciones so-bre los enfoques con base en la secuenciacioń dirigida, en la cual las secuencias de los cromosomas de intere´s se capturan de forma selectiva o se multiplican y luego se secuencian. Adema´s de la NGS, ciertos informes han

estudiado el uso del ıńdice ale´lico de marcadores de metilacioń del ADN y ARN en plasma para la deteccioń prenatal no invasiva de aneuploidias cromoso´micas fe-tales. En mi opinioń, estos me´todos no son tan defini-tivos como las estrategias basadas en la NGS, especial-mente en te´rminos de solidez y alcance de la poblacioń.

Jacob Canick: El

distin-tivo hallazgo del profesor Lo en 1997, de que los fragmentos de ADN de origen fetal y materno es-tań presentes en la circu-lacioń de las mujeres em-barazadas, proporciono´ la base biolo´gica para de-sarrollar una estrategia de NGS para la deteccioń de aneuploidias fetales. La secuenciacioń simultańea de millones de tales frag-mentos de ADN permiten la identificacioń computa-rizada del cromosoma de origen para cada fragmento. Por lo tanto, la capacidad de discernir entre una trisomıá fetal en un entorno de ADN de ce´lulas libres y una madre aneuploide es verdaderamente un ejercicio en la imprecisioń analı´tica. Un feto afectado por una trisomıá particular tendra´ un aumento del 50% en la contribucioń de dicho cromosoma al total de fragmen-tos secuenciados, pero el aumento se diluye de acuerdo con la proporcioń del ADN fetal presente en la muestra de plasma materno. El aumento real provocado por el feto triso´mico sera´, en promedio, la mitad del porcen-taje de la contribucioń del ADN fetal, cualquiera sea este, en esa muestra. Otros me´todos moleculares que han sido examinados anteriormente con cierto e´xito involucran diferencias epigene´ticas entre el ADN fetal y materno (p. ej., metilacioń) y el ARN (p. ej., transcrip-cioń fetal especı´fica en comparatranscrip-cioń con la materna especı´fica). Sin embargo, el grado de variacioń epigene´-tica es diferente en las diferentes poblaciones, a tal grado que la llamada cobertura universal que utiliza dichos me´todos es difıćil de obtener.

Dirk van den Boom: Las

principales preguntas

despue´s de la publicacioń de Dennis Lo en 1997 se relacionaron con (A) la seleccioń del analito ma´s apropiado (ADN, ARN) para permitir procedi-mientos de obtencioń de muestras viables comer-cialmente; (B) aprove-chamiento ma´ximo del

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rendimiento del analito seleccionado en los procedi-mientos de extraccioń de aćido nucleico; y (C) identi-ficacioń de la tecnologıá ma´s apropiada para detectar de forma confiable la aneuploidia fetal en el analito seleccionado teniendo en cuenta que la mayor parte de la informacioń en la sangre o el plasma maternos provienen de la madre. Inicialmente, se investigaron una variedad de me´todos, entre ellos me´todos basados en ARN, me´todos que se basan en las diferencias epi-gene´ticas entre el genoma materno y el fetal, y diferen-tes tecnologıás de deteccioń, que incluyen RCP digital, espectometrıá de masas y secuenciacioń. La tecnologıá NGS es actualmente la tecnologıá de deteccioń preferida y predominante ya que proporciona la canti-dad de puntos de datos necesaria para la deteccioń pre-cisa de una trisomıá fetal. En el Sequenom Center of Molecular Medicine (Centro Sequenom de Medicina Molecular), hemos elegido implementar un enfoque hologeno´mico en relacioń con la deteccioń de aneu-ploidia fetal mediante el uso de NGS. El ADN se extrae del plasma materno. La mayor parte del ADN extraı´do es de naturaleza apopto´tico y esta´ altamente fragmen-tado en tramos continuos relativamente cortos (alre-dedor de 150 bp). Luego, se prepara un representante de la genoteca del genoma materno y fetal para estos frag-mentos. Luego de la multiplicacioń, varios millones de fragmentos de ADN de la genoteca se secuencian de forma masiva en paralelo. Para cada componente de la genoteca, el proceso genera 36 bases de informacioń de secuencia continua (cifras de secuenciacioń), sufi-ciente para identificar de forma uńica el origen cromoso´mico de la secuencia o el fragmento. Despue´s de finalizar el proceso de secuenciacioń, todas las cifras de secuenciacioń generadas por muestra de paciente se vuelven a trazar en relacioń con su ubicacioń cromoso´mica en el genoma humano y se realiza el recuento de la frecuencia de fragmentos que se alinean con cada cromosoma. Con estos datos, ahora puede calcularse la representacioń relativa de cada cromo-soma en comparacioń con un grupo de cromocromo-somas de referencia. El valor se correlaciona firmemente con el tamanõ del cromosoma y es una medida muy precisa y estable ya que se basa en un amplio nu´mero de medi-ciones de marcadores independientes (millones de puntos de datos por muestra y praćticamente cada cifra de secuenciacioń es un marcador independiente). En este punto, la deteccioń de una trisomıá fetal, tal como la trisomia 21, se vuelve bastante simple. El ADN de ce´lulas libres extraı´do del plasma de una mujer em-barazada que tiene un feto con trisomıá 21 contendra´ ma´s fragmentos del cromosoma 21 debido a la copia adicional de dicho cromosoma en el genoma fetal y; por tanto, en el ADN fetal de ce´lulas libres presente en el plasma materno. En el proceso de secuenciacioń, esto conducira´ a una representacioń excesiva de

secuencias del cromosoma 21 en relacioń con un grupo de cromosomas de referencia. Por lo tanto, una trisomıá 21 se identifica como un aumento significa-tivo en la representacioń del cromosoma 21 en com-paracioń con el plasma de una mujer embarazada con un feto aneuploide. Este caso especı´fico de trisomıá 21 puede generalizarse a la identificacioń de cambios sig-nificativos (aumentos o reducciones) en la representa-cioń cromoso´mica de cualquier cromosoma. Si bien la prueba de laboratorio MaterniT21™ Plus actualmente comercializada por el centro Sequenom Center of Mo-lecular Medicine se enfoca por el momento en los cromosomas 21, 18 y 13, nuestro enfoque ho-logeno´mico seleccionado puede aplicarse de forma gene´rica, de modo que las aneuploidias fetales adicio-nales pueden detectarse e informarse sin realizar cam-bios en el me´todo de la prueba mientras se realizan las validaciones clıńicas adicionales y demuestran un nivel de desempenõ aceptable. A medida que el costo de la NGS se reduzca, esta tecnologıá eventualmente podrıá conducir a un cariotipado molecular no invasivo con contenido y desempenõ similares a los de la prueba citogene´tica.

¿Se han evaluado diferentes plataformas de NGS a los efectos del diagno´stico prenatal no invasivo? ¿E-xisten diferencias notables?

Barry Hoffman: Se han evaluado diferentes

platafor-mas de NGS para las pruebas prenatales no invasivas (PPNI), que incluyen las de Illumina, Ion Torrent y Applied Biosystems. Las 3 plataformas multiplican por clonacioń los fragmentos de ADN, mediante RCP de emulsioń o RCP de transferencia de fase so´lida, antes de la secuenciacioń, que presenta el inconveniente de la introduccioń del sesgo de adenina-timina (AT) guanina-citosina (GC) que luego debe corregirse. Las primeras 2 plataformas usan secuenciacioń por sıńtesis con la mediacioń de la ADN-polimerasa, mientras que la u´ltima emplea la sıńtesis por ligacioń con la media-cioń de la ADN-ligasa. Los nucleo´tidos agregados de forma secuencial a la plantilla de ADN unicatenario por la polimerasa o ligasa estań identificados por el analizador para producir la secuencia. En el caso del analizador Ion Torrent, los 4 nucleo´tidos se agregan de forma cıćlica uno por vez, y se detecta el ioń de hidro´geno que se libera cuando se incorpora un nucle-o´tido. Las otras 2 plataformas incorporan nucleo´tidos modificados por fluorescencia a la cadena de ADN para determinar la secuencia. A pesar de estas diferencias, los estudios publicados han demostrado que las 3 plataformas pueden diagnosticar de forma precisa la trisomıá 21 de forma no invasiva. Las nuevas tecnologıás en el horizonte pueden eliminar la necesi-dad de multiplicar la plantilla y agregar nucleo´tidos

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para determinar la secuencia. Dichos avances re-ducirań considerablemente los costos de reactivos y el tiempo de obtencioń (TAT) de la prueba y ası´ facili-tarań la aplicacioń de la NGS a la medicina clıńica.

Dennis Lo: Hasta el momento, la mayorı´a de las

pu-blicaciones han informado el uso de la plataforma de secuenciacioń por sıńtesis. Tambień existen un par de publicaciones que informan el uso de la plataforma de secuenciacioń por ligacioń. Los resultados genera-dos mediante el uso de dichas plataformas son gene-ralmente muy semejantes. Sin embargo, los detalles de los protocolos de secuenciacioń y los ana´lisis de bioin-forma´tica afectan la tasa de no llamada (no-call rate) y si los resultados de secuenciacioń requerirań para´me-tros clıńicos adicionales (p. ej., edad gestacional y edad de la madre) para la interpretacioń. Dado que ambas plataformas requieren el uso de la multiplicacioń, se ha observado el sesgo de GC. Para la deteccioń de aneu-ploidias cromoso´micas que involucran cromosomas particularmente proclives a este sesgo (p. ej., cromoso-mas 13 y 18), se requieren algoritmos bioinforma´ticos especiales que corrijan dichos efectos y que han de-mostrado ser muy eficaces. Dos artıćulos recientes han informado el uso de un secuenciador de molećula uńica que no requiere un paso de multiplicacioń para analizar el ADN del plasma materno. Como resultado, el sesgo de GC ya no parece seguir siendo un problema. Serıá interesante probar un nu´mero de plataformas novedosas de secuenciacioń de molećula uńica (p. ej., secuenciacioń de nanoporos) para esta aplicacioń.

Jacob Canick: En mi opinio´n, se han probado 2

plata-formas de NGS y se demostro´ su conveniencia para esta aplicacioń. El trabajo ma´s exhaustivo se ha realizado con el me´todo de secuenciacioń por sıńtesis en la plata-forma Illumina Hi-Seq 2000. Un estudio en 2010, en el cual se realizo´ la secuenciacioń por ligacioń con el sis-tema SOLiD™ 3 System de Applied Biosystems, pro-porciono´ evidencia de que este me´todo tambień serıá eficaz.

Dirk van den Boom: Si bien existen algunas

publica-ciones que describen las evaluapublica-ciones preliminares de otras plataformas de NGS, como el sistema SOLiD™ o el sistema Heliscope (Helicos), elegimos implementar la prueba desarrollada en laboratorio MaterniT21 en la plataforma Illumina HiSeq 2000. Los principales mo-tivos de esta decisioń fueron la alta calidad de los datos y la madurez de la tecnologıá al momento de nuestro estudio de validacioń clıńica. La idoneidad del volu-men de trabajo de laboratorio clıńico, la capacidad de la muestra y las consideraciones sobre costos tambień fueron factores clave en nuestra eleccioń del instru-mental para la comercializacioń inicial.

¿Cua´l es el TAT de este me´todo? ¿Dentro de que´ perıódo de la gestacioń deberıá realizarse esta prueba? ¿De que´ forma se compara esto con las praćticas actuales de deteccioń en suero materno? Barry Hoffman: Los TAT de las pruebas de NGS

dis-ponibles comercialmente que detectan la trisomıá se encuentran habitualmente en el orden de las 1.5 a 2 semanas, ligeramente mayores que los tiempos de no-tificacioń de 2 a 5 dıás que se alcanzan habitualmente mediante los exa´menes de suero materno tradicionales en el primero o segundo trimestre del embarazo. El resultado de la NGS depende de que´ tan bien ha au-tomatizado, simplificado y combinado de forma eficaz e integral el laboratorio de pruebas los pasos discretos requeridos para generar un resultado clıńico (seleccioń de objetivo, construccioń de genoteca, preparacioń de la plantilla, secuenciacioń, procesamiento de datos e interpretacioń). Otros factores interrelacionados que influyen en el resultado incluyen la rapidez inherente de la tecnologıá de secuenciacioń central utilizada, el nu´mero de muestras multiplexadas que pueden com-binarse en una sola serie, y la calidad y duracioń de las cifras de secuenciacioń que a su vez ejercen un impacto en el nivel de cobertura requerido y la alineacioń con el genoma. Si bien la cantidad absoluta y relativa de ADN fetal en el ADN de ce´lulas libres circulante de la madre es menor en las primeras etapas de la gestacioń, ciertos estudios publicados han demostrado que el PPNI puede detectar de forma confiable trisomıás fetales ya en la dećima semana de gestacioń. Dicho muestreo al final del primer trimestre se ajusta perfectamente a los elementos de la praćtica obste´trica actual y el concepto novedoso de la primera visita de rutina al hospital a fines del primer trimestre del embarazo, en la cual se evaluá al feto para detectar anomalıás anato´micas, se realiza una revisioń para detectar trisomıás y se evaluá

la probabilidad de preeclampsia de aparicio´n

temprana.

Dennis Lo: El TAT es de aproximadamente 7 a 10 dı´as.

La prueba puede realizarse desde las 10 semanas de gestacioń en adelante. Este plazo es altamente compati-ble con las praćticas actuales para el suero materno. Por ejemplo, las mujeres embarazadas pueden examinarse primero mediante ultrasonido para realizar la evalu-acioń de la translucencia nucal de sus fetos y las pruebas de suero materno en el primer trimestre. Las mujeres clasificadas como de alto riesgo mediante dichas prue-bas luego pueden derivarse para someterse a una prueba de NGS mediante el uso de ADN de plasma materno. De forma similar, el plazo tambień es com-patible con el examen de suero materno del segundo trimestre y la prueba integrada.

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Jacob Canick: En un estudio en el cual el centro

Seque-nom Center for Molecular Medicine realizo´ pruebas en casi 2000 muestras de pacientes en 9 semanas, dispusi-mos que todas las muestras se prueben en tiempo real y el TAT fue inferior a los 10 dıás para 18 de los u´ltimos 20 grupos de 90 series de muestras. Esto es similar al TAT tı´pico para el ana´lisis de cariotipado completo de las muestras del lı´quido amnio´tico y biopsia coriońica. La mayor parte de dicho tiempo esta´ utilizado por la tecnologıá de NGS y bioinforma´tica, que deberıá poder reducirse dentro de los pro´ximos anõs. Si bien se espera que el examen del suero materno (con o sin ultrasonido fetal) presente un TAT de no ma´s de 2 a 3 dıás ha´biles, en la mayorıá de los casos una vez que la muestra se encuentra en el laboratorio de pruebas, la ejecucioń de los ana´lisis de marcadores mu´ltiples y la notificacioń de los resultados de los exa´menes habitualmente demoran 1 dıá.

Dirk van den Boom: En nuestro centro, actualmente

tenemos un promedio de⬍7 dıás ha´biles tras el ingreso de una muestra. Este TAT se basa en la experiencia del laboratorio con ma´s de 40 000 muestras clıńicas. A trave´s de un estudio clıńico de disenõ y ejecucioń inde-pendientes, validamos la utilidad e imprecisioń de la prueba que abarca el perıódo de 10 a 22 semanas de gestacioń. La deteccioń no invasiva de aneuploidias fe-tales a trave´s del ana´lisis del ADN fetal de ce´lulas libres del plasma materno es una prueba directa y no utiliza marcadores indirectos, que podrıán confundirse con otras variables clıńicas, como etnicidad, tabaquismo, edad gestacional o diabetes mellitus insulino depen-diente. Como resultado, la tecnologıá de esta prueba posibilita la sensibilidad y especificidad diagno´sticas que se ven notablemente mejoradas en las pruebas de deteccioń bioquı´mica en suero empleadas.

¿Esta´ disponible comercialmente esta prueba en la actualidad? De ser ası´, ¿cua´l es su costo?

Barry Hoffman: Actualmente se ofrece

comercial-mente el PPNI del ADN fetal de ce´lulas libres en el plasma materno para detectar la trisomıá 21, 18 y 13 en los EE. UU. a trave´s de ciertos proveedores, incluidos el centro Sequenom Center for Molecular Medicine (MaterniT21 Plus®), Ariosa Diagnostics Inc. (Har-mony Prenatal Test®) y Verinata Health (Verifi®). Es-tas pruebas estań dirigidas a los embarazos de alto riesgo de trisomıá 21 y estań disponibles comercial-mente a peticioń de un me´dico de los EE. UU. En cier-tos casos, se encuentran disponibles pruebas relaciona-das para aneuploidia del cromosoma sexual (XO y, recientemente, XXY, XXX y XYY) como en la asig-nacioń de geńero. El costo de las pruebas de trisomıá varıán de $795 a $2760. En Asia y Europa, se han

for-mulado diferentes acuerdos de comercializacio´n para ofrecer pruebas similares. En Canada´, la prueba prena-tal Harmony Test se lanzo´ en enero de 2013.

Dennis Lo: Esta prueba esta´ comercialmente

dis-ponible ahora. Los costos se han estimado aproxima-damente en $1000 a $3000 por prueba.

Jacob Canick: Sı´. Como se indico´ anteriormente, en los

EE. UU. existen actualmente 3 laboratorios comercia-les que ofrecen las pruebas de aneuploidia en plasma materno basadas en el ADN. LifeCodexx AG de Kon-stanz, Alemania, ofrece ahora pruebas en paı´ses euro-peos donde se habla alemań y en China, Beijing Genomics Institute y Berry Genomics estań aceptando muestras. Natera, Inc., de San Carlos, California, ha anunciado su intencioń de ofrecer pruebas hacia finales de 2012. Los precios de lista para las pruebas ofrecidas en EE. UU. varıán de $795 a $2700, con ciertos progra-mas de seguro de salud vigentes.

En su opinioń, ¿cree que esta prueba eventualmente estara´ disponible en la mayorıá de los laboratorios clıńicos o solo la ofrecerań centros especializados? Barry Hoffman: Actualmente, el PPNI para trisomıá

21 en Norteame´rica solo esta´ disponible a trave´s de laboratorios nacionales o regionales especializados operados por los proveedores comerciales y esto es probable que continué igual en el futuro pro´ximo. Sin embargo, a medida que las pruebas moleculares evolu-cionan y se vuelven ma´s generalizadas, se puede imagi-nar el desarrollo de paquetes completos de pruebas gene´ticas prenatales, automatizadas de forma integral y destinadas a (en constante ampliacioń) grupos de anomalıás seleccionadas que estarıán adecuadamente accesibles para su implementacioń en laboratorios clıńicos que busquen ofrecer un servicio prenatal. La transicioń de las pruebas de proveedores a laboratorios clıńicos requerirıá un modelo de negocios alternativo impulsado por derechos de licencia y la venta de kits registrados (reactivos). Tambień puede debatirse que la difusioń de las pruebas a los centros locales o regio-nales se adapta mejor a la naturaleza sensible al tiempo de las pruebas y la compleja infraestructura especia-lizada existente ma´s alla´ de la prueba misma que se requieren para ofrecer un servicio de deteccioń prena-tal de calidad. Esta infraestructura incluye asesora-miento previo y posterior a la prueba, el seguiasesora-miento de las pruebas invasivas, la amplia comunicacioń con el paciente y el cuidador, y el ana´lisis estadı´stico de la base de datos para determinar el desempenõ clıńico de la prueba en relacioń con los puntos de referencia. El re-querimiento para dicha infraestructura excluye la po-sibilidad de que la mayorıá de los laboratorios de

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ser-vicio clı´nico ofrezcan las pruebas prenatales moleculares no invasivas.

Dennis Lo: Dado que la NGS au´n involucra

instru-mentos bastante costosos y requiere un amplio soporte bioinforma´tico, considero que podrıá hacerse ma´s efi-ciente la oferta a trave´s de centros especializados, cada uno de los cuales responderıá a las necesidades de una regioń geogra´fica particular.

Jacob Canick: El nuevo me´todo entranã la necesidad de plataformas de secuenciacioń avanzadas y costosas, sistemas de recopilacioń de informacioń y almace-namiento, y bioinforma´tica, ası´ como el aporte cientı´fico y tećnico altamente especializado, con re-dundancia incorporada para garantizar la falta de erro-res en la notificacioń de erro-resultados clıńicos. Asimismo, las cuestiones de propiedad intelectual han dado como resultado demandas y contrademandas entre entidades comerciales. Si bien se depende de los resultados de esas demandas, parece poco probable que en el futuro cercano varios de los laboratorios clıńicos validen y o-frezcan esta prueba como un servicio clıńico. Eventu-almente, los avances en la bioingenierıá sin dudas sim-plificarań, acelerarań y reducirań los problemas de costos, de modo que estos e incluso otros me´todos geno´micos ma´s complejos lleguen a estar disponibles para la mayorıá de los laboratorios.

Dirk van den Boom: En este punto, las pruebas de NGS

auń presentan una complejidad bastante alta en el volumen de trabajo ası´ como los en los requisitos de infraestructura informa´tica y bioinforma´tica, y requi-eren una inversioń de capital considerable. La adec-uada validacioń analı´tica y clıńica de las pruebas de NGS para el uso en el diagno´stico prenatal no resulta insignificante y demanda una amplia obtencioń de muestras. Por lo tanto, considero que solo los centros especializados deberıán ofrecer esta tecnologıá hasta que se encuentren disponibles sistemas de pruebas simples de usar y de instalar que no comprometan la precisioń.

Una declaracioń de posicioń publicada reciente-mente por la International Society for Prenatal Di-agnosis (Sociedad Internacional de Diagno´stico Pre-natal, ISPD) en 2011 indicaba que el uso de la NGS para la deteccioń avanzada de la trisomıá 21 deberıá realizarse solo en las poblaciones de alto riesgo. ¿Se han realizado avances en el u´ltimo anõ para respal-dar la deteccioń generalizada tambień en la po-blacioń de bajo riesgo?

Barry Hoffman: Cuando la ISPD emitio´ esta

recomen-dacio´n, estaba siendo prudente en tanto que los

estu-dios clıńicos a la fecha habıán validado la prueba solo en los embarazos de alto riesgo para el sıńdrome de Down. Desde entonces, numerosos estudios en em-barazos de alto riesgo han confirmado que el PPNI del ADN de ce´lulas libres en el plasma materno puede de-tectar⬎99% de los embarazos con trisomıá fetal 21, a un ıńdice de resultados falso positivos de⬍1%, pero el desempenõ en la deteccioń de trisomıás 18 y 13 ha sido menos so´lido. La ISPD tambień reconocio´ que solo de-bido a que la prueba demuestra un rendimiento casi perfecto en las poblaciones de alto riesgo no implica que se alcanzarıá el mismo rendimiento necesaria-mente en una poblacioń con riesgo ordinario. A fines de noviembre de 2012, se publico´ el primer estudio que evaluaba el rendimiento de la deteccioń de la trisomıá 21 y 18 mediante el uso de la secuenciacioń selectiva de cromosomas en una poblacioń ordinaria de 2049 mu-jeres. El estudio concluyo´ que el PPNI del ADN fetal de ce´lulas libres en el plasma materno de una poblacioń de riesgo ordinario fue tan eficaz como se informo´ previa-mente en los grupos de alto riesgo. Se encuentran en curso otros estudios que evaluán el rendimiento de la prueba en una poblacioń ordinaria de mujeres someti-das a exa´menes de deteccioń de aneuploidias y se espe-ran los resultados en los pro´ximos 6 a 12 meses. La validacioń de la prueba para las poblaciones con exa´menes ordinarios simplificarań la decisioń de las mujeres y cuidadores de elegir el PPNI de ADN fetal circulante de ce´lulas libres en la circulacioń materna como el enfoque preferido a realizar para la deteccioń prenatal de aneuploidias.

Dennis Lo: El principal determinante biolo´gico de la

precisioń de las pruebas de aneuploidia fetal que utili-zan la secuenciacioń del ADN en plasma materno es la concentracioń fraccional del ADN fetal en el plasma materno. Seguń tengo entendido, no existe evidencia de que las mujeres clasificadas como de alto riesgo me-diante pruebas de deteccioń convencionales presenten un perfil de concentracioń de ADN fetal fraccional diferente del de las mujeres con bajo riesgo. Por tanto, confıó en que la prueba de NGS deberıá presentar el mismo desempenõ analı´tico en las poblaciones con bajo riesgo. La cuestioń es ma´s bien econo´mica, dado que hay muchas ma´s mujeres con bajo riesgo en com-paracioń con las de alto riesgo. Se espera que con la futura reduccioń en el costo de la secuenciacioń y los procesos relacionados, tal consideracioń econo´mica se vuelva un problema menor. Por lo tanto, soy optimista de que en el mediano a largo plazo las pruebas del ADN en plasma materno para la deteccioń de aneuploidias se convertirań en una prueba de primera lıńea.

Jacob Canick: El problema de ofrecer una prueba de

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deberıá abordarse mediante la formulacioń de 2 pre-guntas: ¿Existe una base biolo´gica o cientı´fica para es-perar un rendimiento diferente en la poblacioń general en comparacioń con la poblacioń de alto riesgo, y ex-isten motivos no cientı´ficos ma´s pragma´ticos para es-perar antes de la implementacioń de exa´menes de de-teccioń de la poblacioń? Hemos examinado si existen covariables para este tipo de pruebas (variables indi-rectas que afectan los resultados), algunas de las cuales estań relacionadas con la cuestioń de las diferencias en los embarazos de bajo y alto riesgo, y la respuesta ha sido que no de forma regular. Por ejemplo, la razoń por la cual se denominan de alto riesgo no cambia la frac-cioń fetal ni el resultado de la prueba (puntuafrac-cioń z) que se asigna a los pacientes euploides o con trisomıá 21. Asimismo, los marcadores fenotı´picos especı´ficos que se utilizan actualmente (es decir, los diferentes marcadores se´ricos y el marcador ecogra´fico fetal, translucencia nucal) no se encuentran relacionados o estań relacionados de forma de´bil con la fraccioń fetal o la puntuacioń z. Actualmente, los motivos ma´s impor-tantes para no usar la NGS a fin de evaluar a la po-blacioń general son praćticos: costo y TAT excesivos, falta de certezas acerca del reembolso del seguro e in-suficientes instalaciones para las pruebas.

Dirk van den Boom: La utilidad de la NGS se ha

vali-dado ampliamente en las mujeres embarazadas con alto riesgo de aneuploidia fetal. Esto incluye a las mu-jeres de edad materna avanzada, con antecedentes fa-miliares de aneuploidia fetal, resultados de deteccioń en suero positivos o hallazgos ecogra´ficos. Adema´s de la ISPD, el American College of Obstetricians and Gy-necologists (Colegio Americano de Obstetras y Gineco´logos) y la Society for Maternal Fetal Medicine (Sociedad de Medicina Materno Fetal) emitieron un dictamen del comite´ conjunto donde recomendaban ofrecer las pruebas de ADN fetal de ce´lulas libres a los pacientes con mayor riesgo de aneuploidias. El Califor-nia Technology Assessment Forum (Foro de Asesora-miento Tecnolo´gico de California) tambień realizo´ recientemente una evaluacioń independiente y re-comendo´ que el uso del ADN fetal de ce´lulas libres como una prueba de deteccioń prenatal avanzada de aneuploidia fetal de trisomıá 21 y 18 en mujeres de alto riesgo cumpla con los 5 criterios de seguridad, eficacia y mejoras en los resultados de salud. Se ha publicado recientemente un estudio inicial con un enfoque di-rigido combinado con NGS para la deteccioń de la trisomıá fetal. Este estudio incluyo´ un grupo de mues-tras algo limitado de mujeres con bajo riesgo y perso-nalmente considero que se necesitara´ mayor validacioń clıńica antes de que dicha prueba pueda aplicarse de forma general en un escenario de deteccioń. En este punto, los enfoques basados en exa´menes se´ricos

ac-tualmente disponibles auń son ma´s rentables para la poblacioń general con bajo riesgo (a pesar de su desem-penõ ma´s deficiente) y pueden identificar las compli-caciones del embarazo que actualmente no se detectan mediante el ADN fetal de ce´lulas libres.

¿Se ha aplicado esta tecnologıá a otras aneuploidias cromoso´micas adema´s de la trisomıá 21? ¿Que´ ocurre con las enfermedades que surgen de mutacio-nes de punto uńico?

Barry Hoffman: Ciertos estudios publicados han

de-mostrado el potencial de la NGS para detectar un am-plio espectro de anomalıás moleculares en el ADN fetal de ce´lulas libres circulante, que incluyen aneuploidias cromoso´micas, eliminaciones, inserciones, polimorfis-mos de nucleo´tido uńico y variaciones en el nu´mero de reproducciones. Se debe optimizar la tecnologıá para identificar cada tipo de anomalıá, con problemas tales como la duracioń de las transcripciones secuenciadas y el desarrollo de algoritmos bioinforma´ticos especiali-zados estrechamente relacionados con la calidad y con-fiabilidad del resultado. Es imaginable que la NGS sus-tituira´ a las matrices basadas en chip en la deteccioń de anomalıás fetales y no hay nada que impida el desarrollo de plataformas de secuenciacioń “multi-modales” capaces de detectar de manera confiable to-dos los tipos de anomalıás moleculares del ADN y las variaciones en una uńica ejecucioń. Actualmente, se ha aplicado comercialmente la tecnologıá a la deteccioń de aneuploidias del cromosoma del sexo, tal como Turner (monosomıá X) y Klinefelter (XXY), y a las pruebas de incompatibilidad Rh.

Dennis Lo: Adema´s de la trisomı´a 21, esta tecnologı´a se

ha aplicado a las trisomıás 13 y 18, ası´ como al sıńdrome de Turner. Tambień existen datos que de-muestran que la prueba de secuenciacioń puede usarse para detectar el sıńdrome de Down causado por una translocacioń robertsoniana, ası´ como microelimina-ciones cromoso´micas. En el u´ltimo caso, se deberıá in-crementar el nivel de la secuenciacioń. Hemos de-mostrado que el enfoque de secuenciacioń puede usarse para el diagno´stico prenatal no invasivo de en-fermedades monogeńicas (p. ej.,␤-talasemia), que in-cluyen casos provocados por mutaciones de punto. Para dichas aplicaciones, un enfoque de secuenciacioń dirigido parece ser ma´s rentable.

Jacob Canick: Es interesante notar que la trisomı´a 21,

la aneuploidia ma´s comuń en el nacimiento, tambień parece ser la ma´s faćil de identificar de las aneuploidias de importancia clıńica mediante la NGS del ADN de plasma materno. Las trisomıás 18 y 13, y la monosomıá X, han sido ma´s difıćiles de identificar con el mismo

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nivel de desempenõ que la trisomıá 21, pero el desem-penõ en dichas aneuploidias es ahora lo suficiente-mente alto para permitir el uso clıńico de la NGS para sus pruebas. Sin embargo, los resultados positivos de la prueba de cualquiera de estas aneuploidias incluida la trisomıá 21, no son suficientes para efectuar un diag-no´stico definitivo. Auń se recomiendan las pruebas de diagno´stico invasivas para todos los resultados de NGS positivos a fin de garantizar la identificacioń de todos los fetos euploides con resultados falso positivos.

Dirk van den Boom: El estudio de validacio´n clı´nica de

la prueba MaterniT21 Plus incluyo´ casos con trisomıá fetal 18 y 13 adema´s de la trisomıá 21. Ambos se de-tectaron con una alta precisioń diagno´stica. Asimismo, nuestra tecnologıá para la deteccioń de aneuploidias fetales utiliza un enfoque que en principio puede reali-zar una evaluacioń hologeno´mica. A medida que se en-cuentren disponibles otras muestras de trisomıás fe-tales, adema´s de la 21, 18 o 13, para la validacioń clıńica, podra´ evaluarse el desempenõ de la prueba actual que utiliza la NGS y se podra´ decidir si deberıán informarse esas otras trisomıás. Por ejemplo, tambień se han pu-blicado recientemente resultados iniciales de aneu-ploidias fetales del sexo mediante NGS. Varios grupos de investigacioń han publicado estudios preliminares de eficacia para la deteccioń dirigida de mutaciones de punto uńico en ADN fetal de ce´lulas libres, particular-mente en los casos indicados por antecedentes fami-liares o estado de portador de los padres. Dennis Lo y su equipo han sido pioneros recientemente en la tarea de evaluar la deteccioń de mutaciones de punto uńico de forma ma´s gene´rica mediante la secuenciacioń de un genoma fetal completo a partir del ADN fetal de ce´lulas libres. Si bien este trabajo es altamente fascinante, la posible implementacioń comercial requerira´ mayores avances en la reduccioń de los costos de secuenciacioń relacionados y, ciertamente, la validacioń analı´tica y clıńica ma´s alla´ de lo que se ha alcanzado hasta la fecha. ¿Puede aplicarse a los gemelos esta tecnologıá? ¿Que´ ocurre con los embarazos de donante de fecundacioń in vitro?

Barry Hoffman: La gestacio´n mu´ltiple es actualmente

una contraindicacioń del PPNI de ADN fetal de ce´lulas libres en plasma materno y esta´ especı´ficamente des-cartado por el examen por ultrasonido antes de solici-tar la prueba. Cuando se detecta la presencia de geme-los, una alternativa es la evaluacioń tradicional mediante biomarcadores bioquı´micos y por ecografıá, aunque esta´ bien establecido que el desempenõ del ex-amen tradicional en la gestacioń mu´ltiple se considera menos eficiente que en los embarazos uńicos. Sin em-bargo, no existe una razoń a priori por la cual el ana´lisis

molecular del ADN fetal de ce´lulas libres circulante para detectar un incremento en la proporcioń de trisomıá 21 fetal en el plasma materno no podrıá apli-carse a las gestaciones mu´ltiples. Sin dudas, la vali-dacioń de la prueba en dichos embarazos se vera´ obs-taculizada por la rareza de los fetos afectados y las complejidades relacionadas con la monocigosidad y la dicigosidad; sin embargo, el ADN fetal relacionado con el entorno materno debera´ ser mayor y ası´ aumenta la fraccioń fetal y la confiabilidad del ana´lisis, particular-mente en el caso de gemelos monocigo´ticos con ADN ideńtico y placentas con pe´rdida. Asimismo, la cigosi-dad de los gemelos sera´ evidente a partir de dichas pruebas. En principio, el ana´lisis del ADN fetal de ce´-lulas libres n la circulacioń materna deberıá realizarse de la misma forma en los embarazos de donante de o´vulos ası´ como en las concepciones espontańeas. Los datos limitados disponibles actualmente del ensayo MELISSA recientemente informado demuestran que esto es verdadero. Los 36 embarazos de reproduccioń asistida que se incluyeron en este ensayo prospectivo sobre la precisioń de la prueba Verifi en una combi-nacioń real de embarazos se evaluaron de forma correcta.

Dennis Lo: La tecnologı´a puede aplicarse en los

geme-los. Hemos demostrado que la tecnologıá tambień puede permitir determinar la cigosidad de los embara-zos gemelares. Adema´s, para los gemelos dicigo´ticos, la secuenciacioń de ADN en plasma materno puede per-mitir la medicioń de la cantidad de ADN liberado por cada gemelo, que podrıá tener interesantes aplicacio-nes clıńicas y de investigacioń. La tecnologıá puede aplicarse a los embarazos de donante de fecundacioń in vitro.

Jacob Canick: Un estudio de nuestro grupo y un

estu-dio del grupo de Diana Bianchi indican que las pruebas de NGS para detectar aneuploidias identificarań los embarazos gemelares en los cuales uno de los fetos o ambos se vean afectados. Si bien estos resultados se basan en menos casos que la documentacioń sobre em-barazos uńicos, parece que los emem-barazos gemelares tienen, en promedio, una mayor fraccioń fetal que los embarazos uńicos, lo que contribuye a un mejor desempenõ de la prueba. Bianchi y colegas han abor-dado brevemente la cuestioń de los embarazos logrados mediante fecundacioń in vitro y no han encontrado diferencias en el desempenõ, aunque no proporciona-ron datos.

Dirk van den Boom: Sı´, el concepto de tecnologı´a

subyacente de la prueba MaterniT21 Plus es adecuado para la aplicacio´n en los embarazos gemelares. La ca-pacidad para detectar una trisomı´a fetal en el plasma

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materno esta´ principalmente impulsada por la relativa cantidad de ADN fetal en comparacioń con el ADN materno. En los estudios de validacioń publicados, la fraccioń fetal presento´ un promedio del 13% y el mayor componente praćticamente siempre fue de naturaleza materno. En los embarazos gemelares donde solo una de las gestaciones es triso´mica, el exceso del cromo-soma respectivo auń puede detectarse siempre que la fraccioń fetal real se encuentre por encima del umbral de deteccioń. El feto no triso´mico anãde solo una

pequen˜a cantidad al componente materno euploide.

Hemos realizado informes de ma´s de 700 gestaciones gemelares. Como en el caso de los gemelos, la prueba MaterniT21 Plus puede aplicarse a los embarazos de donante de fecundacioń in vitro. El ana´lisis de la repre-sentacioń cromoso´mica subyacente a la deteccioń no invasiva de la trisomıá fetal en plasma materno, en principio, no se ve afectado por los o´vulos del donante. En su opinioń, ¿considera que esta prueba eventual-mente se utilizara´ como una prueba de diagno´stico “independiente” para la deteccioń prenatal y reem-plazara´ al examen del suero materno por completo? ¿O sera´ simplemente un complemento de los procedi-mientos de deteccioń actuales?

Barry Hoffman: No hay duda de que el PPNI del ADN

fetal de ce´lulas libres en plasma materno es una prueba muy superior al examen de trisomıá tradicional que usa biomarcadores bioquı´micos y por ecografıá. Sin embargo, el primero tambień es considerablemente ma´s costoso. Es de esperar que los individuos que pueden pagar las pruebas moleculares, ya sea en forma privada o a trave´s el seguro, recurrirań a esta como la prueba inicial. Sin embargo, resulta poco probable que los programas de deteccioń prenatal financiados por el gobierno tengan los fondos para pagar la aplicacioń universal de las pruebas moleculares a todas las mujeres que se someten a una deteccioń prenatal. Una solucioń neutral en te´rminos de costos a este dilema es la prueba de contingencia, por la cual primero se realiza la detec-cioń tradicional y la prueba molecular solo se ofrece a aquellos que tuvieron resultados positivos en la detec-cioń. El desempenõ de dichos enfoques de deteccioń para esa prueba molecular solamente y la demora de un resultado final serıán aceptables si se prestara la aten-cioń debida a acelerar las muestras con resultados posi-tivos en la deteccioń inicial a la segunda etapa de la prueba. En Ontario, los ana´lisis financieros prelimi-nares han demostrado que la deteccioń de contingencia es neutral en te´rminos de costos cuando el ıńdice de resultados positivos de la deteccioń inicial tradicional esta´ fijado en el 5%. El valor de corte del ıńdice de resultados positivos puede aumentarse a medida que disminuye el costo de la prueba molecular.

Dennis Lo: Para la deteccio´n del sı´ndrome de Down en

suero materno, considero que la prueba de secuencia-cioń es definitivamente superior y probablemente reemplace el enfoque tradicional eventualmente. Sin embargo, como se analizo´ anteriormente, en el corto plazo, los gastos relacionados con la prueba de secuen-ciacioń la harıán quiza´s ma´s rentable si primero se re-alizara la deteccioń convencional y luego se derivara a las mujeres clasificadas como de alto riesgo a realizarse las pruebas de secuenciacioń.

Jacob Canick: Espero que la NGS eventualmente se

convierta en una prueba de primera lıńea para todas las mujeres embarazadas. Resulta claro que para las trisomıás comunes, la prueba ya tiene un desempenõ superior a los me´todos actuales de deteccioń prenatal. El ıńdice de deteccioń alcanza el 100% y el ıńdice de resultados falso positivos es considerablemente infe-rior al 1% con ıńdices de error relativamente bajos. Como prueba de primera lıńea, el valor diagno´stico de un resultado positivo para el sıńdrome de Down serıá pro´ximo al 50%. Esto significa que uno de cada 2 pro-cedimientos de diagno´stico invasivos darıá como resul-tado la identificacioń de un feto con sıńdrome de Down. Los valores diagno´sticos serıán inferiores para las dema´s trisomıás, dado que su prevalencia en la po-blacioń es menor. Auń queda la pregunta de las prue-bas no informativas originadas por las muestras que tienen, por ejemplo, una fraccioń fetal muy baja o errores metodolo´gicos, pero a dichos pacientes se les puede ofrecer la deteccioń estańdar como alternativa. Mis expectativas respecto de las pruebas de primera lıńea dependen razonablemente de las mejoras con-tinuas en el rendimiento y el costo que se alcancen du-rante los pro´ximos anõs.

Dirk van den Boom: El uso del ADN fetal de ce´lulas

libres permite la sensibilidad y especificidad de diag-no´stico que pueden superar la deteccioń se´rica actual de aneuploidias fetales. Sin embargo, el examen bioquı´mico en suero materno para detectar indicacio-nes adema´s de la aneuploidia fetal no podrıá, en prin-cipio, reemplazar el examen del suero materno. Por otra parte, tan importante como lo anterior, auń exis-tira´ la necesidad de realizar una evaluacioń para detec-tar anomalıás congeńitas del tubo neural fetal que ac-tualmente la NGS no puede realizar o no realiza. Un artıćulo del anõ 2012 publicado en Nature por Fan y cols. y un artıćulo del anõ 2012 publicado en Science Translational Medicine por Kitzman y cols. describen la determinacioń no invasiva ho-logeno´mica fetal de sangre materna. ¿Que´ implica-ciones preve´ que se desprenderań de este hallazgo?

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¿De que´ forma contribuira´ esto a las pra´cticas clı´nicas actuales?

Barry Hoffman: La manipulacio´n dirigida del ana´lisis

molecular del ADN fetal de ce´lulas libres en la circulacioń materna para una anomalıá especı´fica, o incluso un grupo limitado de anomalıás, es moderadamente directa en te´r-minos de las normas e´ticas y la praćtica clıńica actual. A medida que la cantidad de anomalıás incluidas en las pruebas moleculares aumente, tambień lo hara´ la dificul-tad en la presentacioń coherente de los hallazgos al me´dico que las solicita, el especialista en gene´tica, los pa-dres, el feto (eventualmente) y afines. Sin embargo, la secuenciacioń no invasiva hologeno´mica fetal es la prueba abierta definitiva. Sin lugar a dudas es una fascinante obra maestra de la tećnica, pero sumamente devastadora, en la medida en que la aplicacioń clıńica de la informacioń re-querira´ un marco de ejecucioń completamente nuevo en te´rminos e´ticos, educativos, tećnicos y me´dicos, ninguno de los cuales auń esta´ en praćtica. Implicara´ tiempo, re-cursos, nuevos conocimientos y un arduo trabajo alcan-zar el ma´ximo potencial de la NGS al nivel hologeno´mico en la clıńica.

Dennis Lo: Mediante el uso de un enfoque basado en

genotipificacioń paterna, haploescritura materna y secuenciacioń de ADN en plasma materno, Kitzman y colegas han confirmado nuestro enfoque y demostrado que el me´todo es escalable y so´lido, incluso al aplicarse a un nivel ma´s profundo de secuenciacioń. El artıćulo de Fan y colegas tambień confirmo´ el concepto general pero presento´ la pregunta adicional de si la genotipificacioń del ADN del padre podrıá evitarse y si se podrıán deducir directamente los alelos fetales paternos heredados que no estaban presentes en el genoma de la madre en los datos de secuenciacioń del ADN en plasma materno. Estos artıćulos combinados demuestran la viabilidad de la secuenciacioń no invasiva del genoma fetal. Si bien este desarrollo es muy fascinante en te´rminos tecnolo´gicos y cientı´ficos, podrıá ser mucho ma´s rentable para las apli-caciones clıńicas realizar la secuenciacioń dirigida del lo-cus geno´mico seleccionado involucrado en las enfer-medades monogeńicas comunes en una poblacioń particular, como se realizo´ recientemente. Esto tambień facilitarıá la orientacioń y reducirıá la complejidad e´tica de la introduccioń de dichas pruebas clıńicamente.

Jacob Canick: Ambas publicaciones, que muestran que

los genomas fetales y maternos pueden secuenciarse por completo a partir de las muestras de plasma ma-terno, se basan en un estudio preliminar de Dennis Lo y colegas de 2010, que demuestra que los genomas completos de la madre y el feto estań presentes en los fragmentos de ADN en la circulacioń materna y que dichos fragmentos presentan una proporcioń relativa

constante. La implicacioń de los hallazgos es clara. El potencial aquı´ es identificar varias de las alteraciones gene´ticas uńicas del feto, heredadas y de reciente for-macioń, sin tener que usar tećnicas de muestreo fetal invasivas y riesgosas. El plazo de implementacioń clıńica de estos hallazgos se desconoce actualmente pero 10 anõs es quiza´s una estimacioń razonable.

Dirk van den Boom: En forma comu´n a otras tecnologı´as

posiblemente problema´ticas en la atencioń me´dica, el uso y la implementacioń deben ir acompanãdos de las consi-deraciones e´ticas adecuadas, ası´ como la validacioń clıńica y analı´tica apropiadas. Si bien las pruebas actuales se con-centran en la deteccioń de las trisomıás 21, 18 y 13, un cariotipo no invasivo similar en el nivel de la informacioń a las matrices de hibridacioń geno´micas comparativas re-alizadas en lı´quido amnio´tico estań dentro del alcance a medida que las tecnologıás de secuenciacioń evolucionan. El PPNI es extremadamente poderoso y permitira´ el diag-no´stico de diversas alteraciones que actualmente solo pueden detectarse mediante la obtencioń de muestras con procedimientos invasivos. Es importante que se aplique esta nueva tecnologıá para mejorar los resultados sani-tarios. Serıán de particular intere´s las enfermedades que permiten el tratamiento en el u´tero ası´ como la identifi-cacioń prenatal de enfermedades metabo´licas, que podrıán permitir ajustes alimentarios al momento del nacimiento, en forma previa a la aparicioń de los sıńtomas.

Contribuciones de los autores: Todos los autores confirmaron que han contribuido al contenido intelectual de este documento y han cum-plido con los siguientes 3 requerimientos: (a) contribuciones significati-vas a la concepcioń y el disenõ, la adquisicioń de datos o el ana´lisis e interpretacioń de estos; (b) redaccioń o revisioń del artıćulo en relacioń con su contenido intelectual; y (c) aprobacioń final del artıćulo publicado.

Declaracioń de los autores o posibles conflictos de intere´s: Tras la presentacioń del manuscrito, todos los autores completaron el formu-lario de declaracioń del autor. Declaraciones o posibles conflictos de intere´s:

Empleo o liderazgo: E.P. Diamandis, Clinical Chemistry, AACC; Y.M.D. Lo, Clinical Chemistry, AACC; D. van den Boom, Sequenom. Papel del consultor o asesor: Y.M.D. Lo, Sequenom.

Propiedad de acciones: Y.M.D. Lo, Sequenom; D. van den Boom, Sequenom.

Honorarios: No se declara.

Financiamiento de la investigacio´n: Y.M.D. Lo, Sequenom. Testimonio de expertos: No se declara.

Patentes: Y.M.D. Lo, diversas patentes y aplicaciones de patentes en el a´rea del diagno´stico prenatal no invasivo.

Otras remuneraciones: Y.M.D. Lo, Life Technologies.