ANÀLISI DEL PAPER DE LES FUCOSILTRANSFERASES I SIALILTRANSFERASES EN EL COMPORTAMENT METASTÀTIC DE LES CÈL LULES

ANÀLISI DEL PAPER DE LES FUCOSILTRANSFERASES I

SIALILTRANSFERASES EN EL COMPORTAMENT

Investigadors principals: Dra. Carme de Bolós Pí IMIM - Hospital del Mar Dr. Pere Clapés Saborit

Institut d’Investigacions Químiques I Ambientals de Barcelona. CSIC Dra. Rosa Peracaula Miró

Facultat de Ciències Universitat de Girona Durada: 3 anys

3

1. Resum

Els antígens Lewis, sialil-Lewis A/sialil-Lewis X, són estructures glucídiques terminals que s’uneixen a les selectines involucrades en processos d’adhesió cel·lular. La síntesi d’aquests carbohidrats és catalitzada per fucosil- i sialil-transferases específiques presents en cada tipus cel·lular. En cèl·lules tumorals, s’hi ha detectat una expressió anòmala que es relaciona amb la seva capacitat metastàtica.

Ens vam proposar analitzar els mecanismes que controlen l’expressió i l’activitat d’aquests enzims i la capacitat d’inhibir-los mitjançant molècules de tipus iminociclitols.

Hem analitzat en un panel de línies cel·lulars de càncer d’estómac i

pàncrees, el patró d’expressió de l’mRNA, per RT-PCR a temps real, de les fucosil- i sialiltransferases implicades en la síntesi dels antígens sialil-Lewis A/sialil-Lewis X; i la detecció d’aquests antígens a la membrana cel·lular per citometria de flux. S’han generat línies de cèl·lules transfectades amb els cDNA de fucosil- i sialiltransferases i s’ha avaluat la implicació directa en processos d’adhesió e invasió in vitro i in vivo. Hem sintetitzat noves

molècules tipus iminociclitols i avaluat, in vitro, la seva capacitat d’inhibir l’activitat de glicosiltransferases i glicosidases específiques.

Ens hem plantejat si citocines proinflamatòries del tipus IL-1

β

, TNF-

α

i IL-6 poden estar involucrades en la regulació de les glicosiltransferases, i ho hem estudiat en línies cel·lulars amb patrons específics d’expressió dels enzims, en presència de citocines. També hem determinat, per immunohistoquímica, la relació entre l’expressió dels antígens Lewis i el component inflamatori de tumors d’estómac.

La implicació de les citocines inflamatòries en la regulació d’altres gens implicats en la carcinogènesi gàstrica, com les mucines intestinals MUC2 i MUC4, també ha estat avaluada.

2. Resultats

La síntesi de nous iminosucres s’ha dut a terme seguint una nova estratègia quimioenzimàtica desenvolupada al nostre laboratori i que s’ha demostrat útil per a la preparació efectiva d’aquest productes i els seus anàlegs, concretament, la síntesi d’una nova col·lecció de molècules amb propietats inhibidores de glicosidases. L’etapa principal de l’esquema sintètic és

l’addició aldòlica estereoselectiva del fosfat de la dihidroxiacetona (DHAP) a un aminoaldehid o un equivalent sintètic d’un aminoaldehid. La reacció aldòlica és catalitzada per aldolases DHAP o dihidroxiacetona (DHA)

dependents amb una elevada estereoselectivitat, i és per aquest motiu que la utilització d’aquests enzims és crucial en aquest pas. Un cop obtinguts els reactius de partida i els biocatalitzadors (aldolases) corresponents es va passar a la síntesi dels diversos derivats d’iminosucres: Els N-alquil derivats de les piperidines de tipus piridines i pirrolidines polihidroxilades i

N-alquilades, així com derivats bicíclics. D’aquests productes, se n’ha provat la capacitat inhibitòria in vitro respecte de diferents glicosidases i

posteriorment s’han seleccionat per avaluar-ne la citotoxicitat i activitat inhibidora en línies cel·lulars de càncer d’estómac i pàncrees. Els resultats ens indiquen que la longitud de la cadena alquilada lligada al iminosucre determina la seva citotoxicitat i també l’efecte inhibidor de l’activitat enzimàtica de les corresponents glicosidases específiques. Aquest efecte inhibidor ha estat suggerit com una eina terapèutica útil per inhibir la metàstasi.

Per tal d’avaluar el paper específic de les sialiltransferases (ST) i

fucosiltransferases (FUT), enzims involucrats en la biosíntesi dels antígens Lewis, en el comportament metastàtic de les cèl·lules, en primer lloc vam demostrar que l’expressió del cDNA de FUT1 indueix canvis en la capacitat metastàtica de les cèl·lules HT-29/M3, com a conseqüència de l’alteració en el patró d’expressió dels antígens Lewis de tipus 2. També es van obtenir transfectants de les línies cel·lulars de càncer de pàncrees Capan-1 i

5

MDAPanc-28, amb els gens d’ST3Gal III i ST3Gal IV. Els resultats obtinguts indiquen que la major expressió d’ST3Gal III i/o Gal IV contribueix a un augment de sialil-Lewis X en la membrana cel·lular i, en conseqüència, aporta una major capacitat adhesiva i migratòria a les cèl·lules.

En aquestes cèl·lules, també es va avaluar el nivell d’expressió d’ST3Gal III i de sialil-Lewis X a diferents graus de confluència cel·lular, tot observant que ambdós factors es correlacionen i augmenten a mesura que s’assoleix la confluència. D’altra banda, els nivells de ROS i glutatió s’associen amb els nivells d’ST3Gal III i sialil-Lewis X segons el grau de confluència. La

correlació per a ROS era positiva, com més nivell d’ST3Gal III i sialil-Lewis X, estat oxidatiu més elevat, mentre que la correlació per a glutatió era negativa. L’expressió d’ST3Gal III també indueix un descens d’un 50% en la secreció del factor VEGF. No obstant això, quan aquestes cèl·lules es tracten amb E-selectina, els nivells de VEGF s’incrementen. Aquests resultats

semblen suggerir un paper de l’E-selectina en la producció de VEGF, que s’incrementa com més alt és el nivell de sialil-Lewis X de la cèl·lula. Aquests resultats encara preliminars descriuen per primer cop una nova funció de l’E-selectina en el procés tumoral.

S’ha postulat que la inflamació pot tenir un paper important en l’inici de la transformació neoplàstica. Concretament, en la mucosa gàstrica, la infecció per Helicobacter pylori desencadena un procés inflamatori que implica la presència de citocines inflamatòries com TNF-

α

, IL-1β i IL-6. Hem analitzat la implicació d’aquestes citocines en l’activació de fucosil- i sialiltransferases i els resultats indiquen que IL-1β indueix una baixada de FUT5 i un

increment ST3Gal IV associats a un nivells més baixos de sialil-Lewis X; mentre que IL-6 produeix increments de FUT1 i d’ST3Gal III i ST3Gal IV. En tumors gàstrics humans, sialil-Lewis X es detecta a nivells més alts en els tumors de malalts que han desenvolupat metàstasi i també en els

tumors que presenten inflamació crònica, que s’associa a nivells més alts de TNF-

α

i IL-1β. Aquests resultats ens indiquen que la presència de

determinades citocines inflamatòries en els tumors gàstrics poden modular l’expressió de glicosiltransferases específiques involucrades en la síntesi d’antígens Lewis implicats en el desenvolupament de metàstasi.

També hem observat que TNF-

α

i IL-1β poden activar gens intestinals

implicats en la carcinogènesi gàstrica com la mucina MUC2 a través de la via d’NF-

κ

B. També en cèl·lules de càncer d’estómac, IL-6 activa l’expressió de MUC4 a través de la via de gp130/STAT3. Aquestes dades han estat

corroborades en tumors gàstrics humans del tipus intestinal en els quals el tipus de inflamació present, aguda o crònica, que està associada a diferents patrons d’expressió de citocines, pot modular el procés de transdiferenciació regulant vies d’activació implicades en l’expressió de gens involucrats en el procés de la carcinogènesis gàstrica.

3. Rellevància i possibles implicacions clíniques dels resultats finals obtinguts

Determinats iminosucres con el miglustat i miglitol han esdevingut principis actius en medicaments per al tractament de la diabetis tipus II o per a la malaltia de Gaucher. Creiem que alguns d’aquests derivats podrien ser emprats per reduir l’activitat metastàtica de les cèl·lules canceroses o fins i tot la reducció de tumors malignes. Per arribar a aquest estadi cal, però, més recerca i nous assajos en diferents fases de complexitat: toxicitat, animals d’experimentació i proves clíniques.

L’estudi també ha permès descriure la implicació de l‘antigen Lewis sialilat, sialil-Lewis X, en diferents etapes del procés tumoral. Com a lligand d’E-selectina en el procés d’extravasació cel·lular de les cèl·lules tumorals a través de l’endoteli capil·lar durant la metàstasi, el seu augment pot conferir a les cèl·lules tumorals una major capacitat adhesiva a E-selectina,

7

migratòria, estimuladora de factors prometastàtics i possiblement amb més potencial metastàtic. Alguns dels enzims responsables de la seva síntesi, com FUT3 i ST3Gal III, es podrien considerar, doncs, una bona diana terapèutica per aturar la disseminació tumoral.

Les citocines proinflamatòries podrien tenir un paper clau en la regulació de l’expressió de sialil-Lewis X de les cèl·lules de càncer d’estómac i de

pàncrees. Així doncs, el component inflamatori estaria involucrat en la

progressió tumoral, tot posant de manifest la importància d’aprofundir en la utilització de molècules específiques per al tractament i la teràpia d’aquests tipus de càncer.

Els nostres estudis també indiquen un paper important de la inflamació en l’activació de diferents gens associats amb el procés de transdiferenciació intestinal que té lloc durant la carcinogènesi gàstrica. La caracterització de les vies d’activació que determinen l’expressió de gens implicats en aquest procés de transformació neoplàstica pot ser útil en l’establiment de noves dianes terapèutiques per als adenocarcinomes d’estómac. L’eradicació

d’Helicobacter pylori i de la gastritis associada són l’estratègia més útil en la prevenció del càncer gàstric, per bé que en patologies avançades i en els carcinomes gàstrics, l’actuació en les vies de senyalització activades per citocines inflamatòries en les etapes que precedeixen al desenvolupament del tumor és, sens dubte, important per generar noves eines terapèutiques per al càncer d’estómac.

4. Publicacions

Castillo J A, Calveras J, Casas J, Mitjans M, Vinardell M P, Parella T, Inoue T, Sprenger G A, Joglar J, Clapes P.

Fructose-6-phosphate Aldolase in Organic Synthesis: Preparation of D-Fagomine, N-Alkylated Derivatives, and Preliminary Biological Assays.

Org. Lett. 2006, 8, (26), 6067-6070.

Mejías-Luque R, López-Ferrer A, Garrido M, Fabra A, de Bolós C.

Changes in the invasive and metastasic capacities of HT-29/M3 cells induced by the expression of FUT1.

Cancer Sci. 2007, 98:1000-1005.

Calveras J, Casas J, Parella T, Joglar J, Clapés P.

Chemoenzymatic Synthesis and Inhibitory Activities of Hyacinthacines A1 and A2 Stereoisomers.

Adv. Synth. Catal. 2007, 349, (10), 1661-1666.

Gutierrez M L, Garrabou X, Agosta E, Servi S, Parella T, Joglar J, Clapés P.

Serine Hydroxymethyl Transferase from Streptococcus thermophilus and L-threonine Aldolase from Escherichia coli as Stereocomplementary

Biocatalysts for the Synthesis of beta-Hydroxy-alfa,omega-diamino Acid Derivatives.

Chem. Eur. J. 2008, 14, (15), 4647-4656.

Mejías-Luque R, Peiró S, Vincent A, Van Seuningen I, de Bolós C.

IL-6 induces MUC4 expression through gp130/STAT3 pathway in gastric cancer cell lines.

BBA-Molecular Cell Research. 2008; 1783: 1728-1736.

Concia A L, Lozano C, Castillo J A, Parella T, Joglar J, Clapés P.

D-Fructose-6-phosphate Aldolase in Organic Synthesis (II): Cascade chemical-enzymatic preparation of sugar related polyhydroxylated compounds.

Chem. Eur. J. 2009, 15, 3808-3816.

Garrabou X, Castillo J A, Guérard-Hélaine C, Parella T, Joglar J, Lemaire M, Clapés P.

9 Asymmetric self- and cross-aldol reaction of glycolaldehyde catalyzed by D-fructose-6-phosphate aldolase.

Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 5521-5525.

Calveras J, Egido-Gabás M, Gómez L, Casas J, Parella T, Joglar J, Bujons J, Clapés P.

Dihydroxyacetone phosphate aldolase-catalyzed synthesis of structurally diverse polyhydroxylated pyrrolidine derivatives and evaluation of their glycosidase inhibitory properties.

Chem. Eur. J. 2009, 15, 7310-7328.

Mejías-Luque R, de Bolós C.

Inflammatory cytokines pathways as potential therapeutic target for gastric cancer.

Current Cancer Therapy Reviews. 2009; 5: 178-187.

Padró M, Castillo J, Gómez L, Joglar J, Clapés P, de Bolós C.

Cytotoxicity and enzymatic activity inhibition in cell lines treated with novel iminosugar derivatives.

Glycoconjugate J. 2010 http://dx.doi.org/10.1007/s10719-009-9276-3 Mejias-Luque R, Lindén SK, Garrido M, Tye H, Najdovska M, Jenkins BJ, Iglesias M, Ernst M, de Bolós C.

Inflammation modulates the expression of the intestinal mucins MUC2 and MUC4 in gastric tumors.

Oncogene, 2010, http://dx.doi:10.1038/onc.2009.467

Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de Bolòs C, Vidal-Vanaclocha F, Peracaula R.

Alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal III overexpression contributes to pancreatic cancer metastasis by increasing E-Selectin adhesion and cell motility.

Glycobiology (sotmès a publicació).

Mejías-Luque R, Padró M, Cobler L, Garrido M, Pérez-Garay M, Puig S, Iglesias M, Peracaula R, de Bolós C.

Regulation of glycosyltransferases and Lewis antigens expression by pro-inflammatory cytokines in human gastric cancer cells.

PloS ONE (en revisió).

Pérez-Garay M, de Llorens R, Vidal-Vanaclocha F, Peracaula R.

Reactive Oxygen Species as alpha 2,3-sialyltransferase ST3Gal III and sialyl-Lewisx _{expression regulators in pancreatic adenocarcinoma cell lines.}

Int J Biochem Cell Biol. (en preparació).

Pérez-Garay M, Arteta B, Pagès L, de Llorens R, de Bolòs C, Vidal-Vanaclocha F, Peracaula R.

Role of alpha-2,3-sialyltransferase ST3Gal IV in pancreatic cancer cell motility, adhesion and metastasis.