Quito - Ecuador
NORMA TÉCNICA ECUATORIANA NTE INEN 0275:2012
Primera revisión
ACEITES Y GRASAS DE ORIGEN ANIMAL Y VEGETAL.
MARGARINA.
DETERMINACIÓN
DEL
CONTENIDO
DE
VITAMINA A.
Primera Edición
Animal and vegetable fats and oils — Margarine. Determination of Vitamin A Content.
First Edition DESCRIPTORES: AL: 02.07-301 CDU: 665 CIIU: ICS:
Norma Técnica Ecuatoriana
Voluntaria
ACEITES Y GRASAS DE ORIGEN ANIMAL Y VEGETAL. MARGARINA. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE
VITAMINA A
NTE INEN 0275:2012 Primera revisión
1. OBJETO
Esta norma describe dos métodos, uno colorimétrico y otro por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), para la determinación de vitamina A en margarina, la cual contenga como mínimo 10 UI de vitamina A/g.
2. NORMATIVA DE REFERENCIA
ISO 661 − Aceites y grasas de origen animal y vegetal. Preparación de la muestra para ensayo.
3. MÉTODO COLORIMÉTRICO
3.1 PRINCIPIO
La muestra para ensayo se saponifica y se extrae la materia insaponificable, la que se hace reaccionar con ácido trifluoroacético. Se mide la absorbancia a 620 nm.
3.2 REACTIVOS
Se deben usar sólo reactivos de grado analítico conocido, a menos que se especifique de otra forma, y agua destilada o desmineralizada o de pureza equivalente.
3.2.1 Etanol (CH3CH2OH), 95 % (en volumen), libre de aldehído.
3.2.2 Solución de ascorbato de sodio, 200 g/l. Si no está disponible o lista para su uso, se prepara disolviendo 3,5 g de ácido ascórbico (C6H8O6) en 20 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH), de
1 mol/L y se mezcla. Se prepara esta solución fresca diariamente.
3.2.3 Solución acuosa de hidróxido de potasio (KOH), 50 % (en peso). Disolver 50 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua. Mezclar y dejar enfriar la solución. Preparar esta solución fresca antes de usarla.
3.2.4 Solución de hidróxido de potasio en agua-alcohol, Disolver 3 g de hidróxido de potasio (KOH) en agua y adicionar 10 ml de etanol en un matraz aforado de 100 ml. Diluir con agua hasta los 100 ml y mezclar. Preparar esta solución fresca antes de usarla.
3.2.5 Éter de petróleo, con un rango de ebullición preferiblemente entre 40 °C y 60 °C, o el de rango de ebullición entre 60 °C y 80 °C.
3.2.6 Cloroformo (CHCl3), grado analítico.
3.2.7 Ácido trifluoroacético (CF3COOH), grado analítico.
ADVERTENCIA. EL CLOROFORMO Y EL ÁCIDO TRIFLUOROACÉTICO SON CARCINÓGENICOS. SE DEBEN TOMAR TODAS LAS PRECAUCIONES NECESARIAS.
3.2.8 Reactivo de color. Mezclar 1 parte en volumen de ácido trifluoroacético puro y 2 partes en volumen de cloroformo.
(Continúa)
3.2.9 Solución patrón de vitamina A. Se usa la solución de referencia de vitamina A, de la US Pharmacopeia1) de “todo-trans-retinil acetato” cristalino, en aceite de semilla de algodón, equivalente a 30 mg de retinol (vitamina A - base alcohol, C20H30O) por gramo de aceite, o como se establezca al
momento de la compra.
Nota. Se sugiere una solución de referencia no inferior a 35 UI.
Se puede usar una solución patrón secundaria, si se normaliza contra la solución patrón primario o mediante la medición de la absorbancia en la región UV. Se corta la punta de la cápsula de la solución patrón de referencia de vitamina A y se vierte el aceite en un matraz aforado de 100 ml, de color ámbar. Se pesa el contenido, con una precisión de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo hasta la marca de 100 ml. Se usa la solución patrón de vitamina A, tan pronto como sea posible. Se desecha la solución patrón después de 8 h.
Nota. El procedimiento anterior de preparación de la solución patrón de referencia es equivalente al siguiente: en un matraz aforado de 100 ml de color ámbar se pesan 34,4 mg de retinil acetato cristalizado, con una precisión de 0,1 mg. Se diluye con cloroformo hasta la marca de 100 ml. Esta solución contiene una concentración de 1 000 UI/mL y es estable por 2 d si se mantiene a 4 °C después de lo cual debe verificarse su concentración.
3.2.10 Hidroxitolueno butilado (BHT), grado analítico.
3.3 EQUIPOS
Se usan los materiales y equipos de laboratorio usuales y en particular los siguientes:
3.3.1 Colorímetro o espectrofotómetro, con mecanismo óptico o filtro para longitud de onda de 620 nm (derivado de la vitamina A).Se deben usar celdas de absorción pareadas, de vidrio y de 1 cm. Es preferible un instrumento que provea linealidad entre la absorbancia y la concentración.
3.3.2 Vaso de precipitación, de 250 ml de capacidad.
3.3.3 Matraz de fondo redondo, de aproximadamente 250 ml de capacidad, conectado a un condensador de reflujo.
3.3.4Matraz aforado, de 100 ml y de 200 ml de capacidad.
3.3.5 Pipetas aforadas, de 2 ml, 10 ml, 25 ml y 50 ml de capacidad.
3.3.6 Pipetas automáticas, apropiadas para solventes orgánicos, o una pipeta que entregue10 ml.
3.3.7 Baño de vapor, baño de agua hirviente o plancha de calentamiento eléctrico.
3.3.8 Baño de agua, capaz de operar a una temperatura de hasta 40 °C.
3.3.9 Embudo de separación, de 500 ml de capacidad, preferiblemente con tapón de politetrafluoetileno.
3.3.10 Baño ultrasónico.
3.3.11 Papel filtro, de 9 cm de diámetro.
3.4 TOMA DE MUESTRAS
Se debería enviar una muestra representativa al laboratorio. Ésta no debería haber sufrido daño o transformación durante el transporte o almacenamiento. La toma de muestras no constituye una parte del método descrito en esta norma. En la Norma NTE INEN ISO 5555 se indica el método de toma de muestras recomendado.
(Continúa)
____________________
1) La solución de referencia de vitamina A, de la United States Pharmacopeia Convention, Inc. 12601Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, USA, es un ejemplo de un producto apropiado, disponible comercialmente. Esta información se da para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la norma y no constituye una garantía para este producto.
3.4 TOMA DE MUESTRAS
Se debería enviar una muestra representativa al laboratorio. Ésta no debería haber sufrido daño o transformación durante el transporte o almacenamiento.
La toma de muestras no constituye una parte del método descrito en esta norma. En la Norma NTE INEN ISO 5555 se indica el método de toma de muestras recomendado.
3.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO
Mezclar completamente la muestra para ensayo rotando e invirtiendo repetidamente, el recipiente. Si es necesario, transferir toda la muestra para ensayo a un recipiente de suficiente capacidad, con tapa hermética.
3.6 PROCEDIMIENTO
3.6.1 Generalidades
Nota. Si se requiere verificar el cumplimiento del límite de repetitividad se deben realizar dos determinaciones sencillas.
Para todas las operaciones se debe trabajar con luz suave o usar recipientes de vidrio antiactínico de baja transmisión de la luz.
3.6.2 Solución para ensayo
Pesar 20 g de la muestra para ensayo, con aproximación de 0,001 g, en un vaso de precipitado o matraz y disolverlo en 50 ml de agua a una temperatura de al menos 80 °C. Deshacer cualquier grumo presente, con una espátula, o usando un baño ultrasónico. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Diluir con agua hasta completar el aforo de 100 ml.
3.6.3 Saponificación y extracción
3.6.3.1 Transferir, por medio de una pipeta, 25 ml de la solución para ensayo preparada, a un matraz de fondo redondo. Adicionar 20 ml de solución de hidróxido de potasio y 10 ml de solución de ascorbato de sodio. Adicionar 50 ml de etanol y mezclar bien.
3.6.3.2 Mantener en reflujo por 30 min en un baño de vapor a 85 °C , agitando de vez en cuando. Poner a enfriar inmediatamente bajo un chorro de agua.
3.6.3.3 Transferir el líquido a un embudo de separación, usando dos porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol y dos porciones de 40 ml de éter de petróleo. Agitar vigorosamente durante 30 s y permitir que permanezca en reposo hasta que las dos capas sean claras. Transferir la fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separación y agitar con una mezcla de 10 ml de etanol y 40 ml de éter de petróleo. Dejar separar.
3.6.3.4 Transferir la fase acuosa a un tercer embudo de separación y la fase que contiene éter de petróleo al primer embudo de separación. Lavar el segundo embudo de separación con dos porciones de 10 ml de éter de petróleo. Adicionar el líquido de lavado al primer embudo de separación.
3.6.3.5 Agitar la fase acuosa con 40 ml de éter de petróleo y 10 ml de etanol. Adicionar la fase que contiene éter de petróleo al primer embudo de separación. Lavar los extractos combinados de éter de petróleo con tres porciones de 40 ml de solución alcohólica de hidróxido de potasio, agitando vigorosamente. Enseguida lavar, con porciones de 40 ml de agua, hasta que el último lavado sea neutro a la fenolftaleína. Dejar escurrir las últimas gotas de agua, y adicionar al embudo de separación dos hojas de papel filtro cortadas en tiras y agitar.
Nota. En lugar de usar papel de filtro cortado en tiras, se sugiere hacer pasar los extractos etéreos por un papel filtro conteniendo sulfato de sodio anhidro; después de pasar todo el extracto, este papel filtro se lava dos veces con porciones de 10 ml de éter para recuperar algo de vitamina retenida en el filtro.
3.6.3.6 Transferir el extracto que contiene éter de petróleo, el cual se ha secado como se describe en el acápite anterior a un matraz aforado de 200 ml. Enjuagar el embudo de separación y el papel con éter de petróleo, adicionar los enjuagues al matraz, y en seguida agregar de 10 mg a 20 mg de BHT. Diluir con éter de petróleo hasta el aforo de 200 ml y mezclar bien.
3.7 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN COLORIMÉTRICA PARA ENSAYO
Pipetar una alícuota del extracto diluido en un matraz de fondo redondo. Evaporar hasta sequedad, en vacío, con agitación, en un baño de agua hasta una temperatura que no exceda de 40 °C. Dejar enfriar bajo un chorro de agua y restablecer la presión atmosférica, preferiblemente con nitrógeno. Inmediatamente disolver el residuo en 10,0 ml de cloroformo.
Nota. Una concentración típica de la solución de ensayo es de 10 UI de vitamina A por mililitro de cloroformo. La cantidad de alícuota se puede ajustar dependiendo del tamaño y sensibilidad de la celda espectrométrica.
3.8 DETERMINACIÓN
Marcar dos celdas colorimétricas pareadas, como 1 y 2. Pipetar 2 ml de la solución colorimétrica de ensayo en la celda 1. Pipetear 2 ml de la solución patrón diluida de vitamina en la celda 2. Adicionar rápidamente, a cada celda, usando preferiblemente una pipeta automática 10,0 ml del reactivo de color y mezclar. Medir la absorbancia de las soluciones a 620 nm, con el espectrofotómetro o el colorímetro fotoeléctrico medido contra el blanco de 2 ml de cloroformo y 10 ml de reactivo color hasta que la absorbancia alcance su máximo. Graficar las absorbancias obtenidas contra el contenido de vitamina A. Los volúmenes y proporciones usados deben ajustarse de acuerdo con la capacidad de las celdas colorimétricas usadas.
3.9 PREPARACIÓN DE LA GRÁFICA DE CALIBRACIÓN
Preparar cinco diluciones, o más, en concentraciones diferentes de solución patrón de vitamina A con cloroformo de manera que las alícuotas de 2 ml tratadas en la determinación colorimétrica, den absorbancias en un rango de 0,07 a 0,7, a una longitud de onda de 620 nm. Graficar las absorbancias contra el contenido de vitamina A en microgramos. Si la curva es una línea recta, se debe calcular un factor para el contenido de vitamina A en las muestras.
3.10 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Calcular el contenido de vitamina A, w, en microgramos de retinol por gramo (o la actividad de la vitamina A, expresada en Unidades Internacionales por gramo), usando la siguiente ecuación:
en donde:
c es la concentración, en microgramos de retinol por mililitro (o actividad de vitamina A en UI / ml) en el ensayo de la solución colorimétrica de ensayo (véase el numeral 4.7), calculada a partir de la curva de calibración (véase el numeral 4.9);
V1 es el volumen total en mililitros de extracto de éter de petróleo (V1= 200 ml);
V2 es el volumen en mililitros de la alícuota tomada de V1 (véase el numeral 4.7);
V3 es el volumen en mililitros de cloroformo en el cual se disuelve el residuo (V3= 10 ml);
V4 es el volumen total en mililitros de la solución de ensayo (véase el numeral 4.6.2) (V4 = 100 ml);
V5 es el volumen en mililitros de la parte de alícuota de la solución de ensayo (véase el numeral
4.6.3.1) (V5= 25 ml);
m es la masa de la muestra de ensayo en gramos.
3.11 PRECISIÓN
3.11.1 ENSAYOS INTERLABORATORIOS
Se han publicado detalles sobre la precisión del método en una prueba interlaboratorios llevada a cabo, de acuerdo con la ISO 5725-1:1994 e ISO 5725-2:1994. Los valores derivados de la prueba interlaboratorios pueden no ser aplicables a los rangos de concentración y matrices diferentes a los dados.
3.11.2 REPETIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas usando el mismo método sobre muestras idénticas en el mismo laboratorio con el mismo operario, usando el mismo equipo dentro de un intervalo de tiempo corto, no será mayor del 14% del promedio aritmético de los dos resultados, en el 5% de los casos.
3.11.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas sencillas e independientes, obtenidas usando el mismo método sobre muestras idénticas en diferentes laboratorios con diferentes operarios, usando diferentes equipos no será mayor del 42% del promedio aritmético de los resultados en el 5% de los casos.
3.12 INFORME DEL ENSAYO
El informe del ensayo debe especificar lo siguiente:- Toda la información necesaria para la identificación de la muestra;- El método de muestreo usado, si se conoce;- El método de ensayo usado, junto con la referencia a esta norma;- Todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualquier incidente que pueda haber influenciado el (los) resultado(s) del ensayo;- El (Los) resultado(s) obtenidos del ensayo, o, si se ha verificado la repetitividad, el resultado final obtenido.
4. MÉTODO USANDO CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
4.1 PRINCIPIO
La muestra para ensayo se saponifica y se extrae. La vitamina A se separa de las impurezas por HPLC. El contenido se determina usando un detector ultravioleta o con un detector fluorescente.
4.2 REACTIVOS
Sólo se deben emplear reactivos de grado analítico, a menos que se especifique de otra manera y agua destilada o desmineralizada o agua de pureza equivalente.
4.2.1 Etanol, (CH3CH2OH), de 95 % (en volumen), libre de aldehído.
4.2.2 Solución de ascorbato de sodio, 200 g/l. Si no se encuentra disponible ya elaborada, se puede preparar disolviendo 3,5 g de ácido ascórbico (C6H8O6) en 20 ml de solución de hidróxido de
sodio, 1 mol/l y se mezcla. Se prepara esta solución fresca diariamente.
4.2.3 Solución acuosa de hidróxido de potasio, 50 % (en masa). Disolver 50 g de hidróxido de potasio, (KOH) en 50 ml de agua. Mezclar y dejar enfriar, la solución obtenida, hasta temperatura ambiente. Preparar la solución fresca antes de usarse.
4.2.4 Solución alcohólica acuosa de hidróxido de potasio, 30 g/l. Disolver 3 g de hidróxido de potasio (KOH), en agua, adicionar 10 ml de etanol y diluir hasta 100 ml con agua, en un matraz volumétrico. Preparar una solución fresca antes de usarse.
4.2.5 Éter de petróleo, preferiblemente con intervalo de ebullición de 40 ºC a 60 ºC, ó de 60 ºC a 80 ºC de intervalo de ebullición.
4.2.6 Metanol, (CH3OH), grado HPLC.
4.2.7 Fase móvil, Mezcla de metanol y agua, por ejemplo, en relación 90:10 (por volumen).
4.2.8 Solución patrón de vitamina A, Se usa una solución de referencia de vitamina A, de la US Pharmacopeia1), elaborada a partir de todo-trans- retinil acetato cristalino en aceite de semilla de algodón, equivalente a 30 mg de retinol (vitamina A - base alcohol, C20H30O) por gramo de aceite, o
como se establezca al momento de la compra. Se corta la punta de la cápsula de la solución patrón de referencia de vitamina A y se pesan aproximadamente 20 mg de la solución patrón en el matraz de fondo redondo, con una precisión de 0,1 mg. Se adicionan 40 ml de etanol , 10 ml de solución de ascorbato de sodio y 10 ml de solución de hidróxido de sodio. Se saponifica y se extrae el contenido del matraz de saponificación, como se describe en los numerales 4.7.2 al 4.7.5. Preparar una solución de referencia para ensayo como se indica en el numeral 4.8.
4.2.9 Butil hidroxitolueno (BHT), grado analítico.
4.3 EQUIPOS
Equipo usual de laboratorio y, en particular, el siguiente.
4.3.1 Cromatógrafo líquido
Adaptado con un detector ultravioleta. Las condiciones de operación típicas son:
- Detector UV variable que vigile la absorción a 325 nm, o un detector de longitud de onda fija que vigile, con sensibilidad de 0,128 AUFS (unidades de absorción, escala completa), a una longitud de onda entre 300 nm y 360 nm.
- Velocidad de flujo del efluente de 2 ml/min (a aproximadamente 10,13 MPa (100 atm)); - Temperatura ambiente;- Volumen de inyección de 20 µl;
- Gráfico de velocidad de 10 mm/min
Cuando se usa un detector fluorescente, se ajusta a 325 nm para la excitación y a 450 nm para la emisión.
4.3.2 Columna cromatográfica, de acero inoxidable, 250 mm x 4,6 mm (di), empacada con C8 o C18, de 10µm de tamaño de partícula, ligada químicamente a partículas de microsilicio o una columna de desempeño equivalente.
4.3.3 Vaso de precipitado o matraz cónico, de 250 ml de capacidad.
4.3.4 Matraz de saponificación, de aproximadamente 200 ml de capacidad, adaptado con un condensador de reflujo.
4.3.5 Matraces volumétricos aforados, de 100 ml y 200 ml de capacidad.
4.3.6 Pipetas aforadas, de 10 ml, 25 ml y 50 ml.
4.3.7 Baño de vapor, baño de agua hirviendo o plancha de calentamiento eléctrica
4.3.8 Baño de agua, capaz de operar a una temperatura hasta de 40 ºC ± 1 ºC.
(Continúa)
____________________
La solución de referencia de vitamina A, de la United States Pharmacopeia Convention, Inc. 12601Twinbrook Parkway, Rockville, Maryland 20852, USA, es un ejemplo de un producto apropiado, disponible comercialmente. Esta información se da para la conveniencia de los usuarios de esta parte de la norma y no constituye una garantía para este producto
4.3.9 Embudo de separación, de 500 ml de capacidad, adaptado preferiblemente con un tapón de politetrafluoetileno, (PTFE).
4.3.10 Baño ultrasónico
4.3.11 Papel de filtro, de 9 cm de diámetro.
4.4 TOMA DE MUESTRAS
Se debería enviar una muestra representativa al laboratorio. Ésta no debería haber sufrido daño o transformación durante el transporte o almacenamiento.
La toma de muestras no constituye una parte del método descrito en esta Norma Internacional. En la Norma ISO 5555 se indica el método de toma de muestras recomendado.
4.5 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO
Se mezcla por completo la muestra para ensayo, rotándola varias veces, e invirtiendo el recipiente con la muestra. Si para esto es necesario, se transfiere toda la muestra para ensayo a un recipiente hermético, de suficiente capacidad, para permitir la realización de esta operación.
4.6 PROCEDIMIENTO
4.6.1 Generalidades
Nota. Si se requiere verificar el límite de repetitividad encontrado se hacen dos corridas de dos determinaciones simples.
Para todas las operaciones, se trabaja con luz atenuada y se emplea material de vidrio antiactínico de baja transmisión de la luz.
4.6.2 Solución para ensayo. Pesar, con aproximación a 0,010 g, cerca de 20 g (m1) muestra para
análisis en un vaso de precipitado o en un matraz cónico y disolver en 50 ml de agua caliente, por lo menos a 80 ºC. Desagregar cualquier grumo con una espátula o usando un baño ultrasónico. Dejar enfriar hasta temperatura ambiente. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, y diluir con agua hasta completar los 100 ml.
4.7 SAPONIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN
4.7.1 Por medio de una pipeta, adicionar al matraz de saponificación, 25 ml de muestra para ensayo preparada. Adicionar 20 ml de solución de hidróxido de potasio, 10 ml de solución de ascorbato de sodio y 50 ml de etanol. Mezclar muy bien.
4.7.2 Someter a reflujo durante 30 min en un baño de vapor a 85 °C, agitando de vez en cuando. Dejar enfriar de inmediato bajo agua corriente.
4.7.3 Transferir el líquido a un embudo de separación, empleando dos porciones de 30 ml de agua, dos porciones de 10 ml de etanol y dos porciones de 40 ml de éter de petróleo. Agitar vigorosamente durante 30 s y permitir que repose hasta que las dos capas se diferencien. Transferir la fase acuosa (inferior) a un segundo embudo de separación y agitar con una mezcla de 10 ml de etanol y 40 ml de éter de petróleo. Permitir que se separen las fases.
4.7.4 Transferir la fase acuosa a un tercer embudo separador y la fase que contiene éter de petróleo al primer embudo separador. Lavar el segundo embudo separador con dos porciones de 10 ml de éter de petróleo. Adicionar los lavados al primer embudo separador.
4.7.5 Agitar la fase acuosa con 40 ml de éter de petróleo y 10 ml de etanol. Adicionar la fase que contiene éter de petróleo al primer embudo separador. Lavar los extractos de éter de petróleo combinada con tres porciones de 40 ml de solución alcohólica de hidróxido de potasio preparada recientemente, agitar vigorosamente. A continuación, lavar con porciones de 40 ml de agua hasta que el último lavado sea neutro a la fenolftaleína. Dejar escurrir las últimas gotas de agua, y adicionar dos hojas de papel de filtro cortadas en tiras al embudo de separación y agitar.
4.7.6 Transferir el extracto de éter de petróleo, secado como se describió anteriormente, aun a matraz volumétrico de 200 ml. Enjuagar el embudo de separación y el papel con éter de petróle, adicionar los enjuagues al matraz volumétrico y agregar de 10 mg a 20 mg de BHT. Diluir con éter de petróleo hasta completar los 200 ml aforados.
4.8 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE REFERENCIA Y DE LA SOLUCIÓN PARA ENSAYO
Adicionar a matraces de fondo redondo separados, alícuotas de los extractos diluidos de la solución para ensayo y la solución patrón de vitamina A. Evaporar hasta sequedad, bajo vacío, mediante agitación con movimientos giratorios en un baño de agua a una temperatura que no exceda de 40 °C. Dejar enfriar bajo agua corriente y restaurar la presión atmosférica, preferiblemente con nitrógeno. Disolver el residuo inmediatamente en 10 ml de metanol.
4.9 DETERMINACIÓN
Inyectar 20 µl de la solución de muestra para ensayo y de la solución de referencia a una columna, y ajustar las condiciones de operación del detector para dar el pico de vitamina A sobre la escala más grande posible. Medir las áreas de los picos de vitamina A.
PRECAUCIÓN.
Los detalles del procedimiento cromatográfico dependen, entre otros, del equipo, el tipo, edad, y el proveedor de la columna, la forma de inyección de la muestra y de la solución de referencia, el tamaño de la muestra y del detector. La relación de metanol a agua variará de acuerdo con estos factores descritos; el incremento del contenido de agua de la fase móvil causa un incremento en el tiempo de retención.
4.10 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Se calcula el contenido de vitamina A, w, en microgramos de retinol por gramo (o la actividad de la vitamina A, expresada en Unidades Internacionales por gramo), usando la siguiente ecuación:
en donde:
c es la concentración, en microgramos de retinol por mililitro (o actividad dela vitamina A en UI por mililitro) en la solución de referencia (véase el numeral 5.8);
As es el valor numérico del área del pico de vitamina A en la solución de ensayo (véase el numeral
5.9);
Ar es el valor numérico del área del pico de vitamina A en la solución de referencia (véase el
numeral 5.9);
V1 es el volumen total, en mililitros, del extracto de éter de petróleo (V1 = 200 ml);
V2 es el volumen, en mililitros, de la alícuota tomada en V 1
V3 es el volumen, en mililitros, de metanol en el cual el residuo se disuelve (V 3 = 10 ml);
V4 es el volumen total, en mililitros, de la solución de ensayo (véase el numeral 5.6.2) (V 4 = 100 ml);
V5 es el volumen, en mililitros, de la parte de alícuota de la solución de ensayo (véase el numeral
5.7.1) (V5= 25 ml)
m es la masa de la muestra para ensayo, en gramos.
4.11. PRECISIÓN
4.11.1 ENSAYO INTERLABORATORIO
Se han publicado los detalles de un ensayo interlaboratorio realizado de acuerdo con ISO 5725-1:1994 e ISO 5725-2:1994. Los valores derivados de este ensayo interlaboratorio pueden no ser aplicables a otros rangos de concentración y matrices diferentes a aquellos dados.
4.11.2 REPETITIVDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayo, únicos, independientes, obtenida empleando el mismo método, sobre material de ensayo idéntico, en el mismo laboratorio, por el mismo operador, utilizando el mismo equipo, dentro de un intervalo corto de tiempo, no será en más del 5 % de los casos superior al 14% de la media aritmética de los dos resultados.
4.11.3 REPRODUCIBILIDAD
La diferencia absoluta entre dos resultados de ensayos únicos, independientes, obtenida empleando el mismo método, sobre material de ensayo idéntico, en diferentes laboratorios, con diferentes operadores, usando diferentes equipos, no será en más del 5 % de los casos superior al 17 % de la media aritmética de los dos resultados.
4.12 INFORME DE ENSAYO
El informe del ensayo debe especificar:- toda la información requerida para la completa identificación de la muestra;- el método de muestreo empleado, si se conoce;- el método de ensayo empleado, con referencia a la presente norma;- todos los detalles operativos no especificados en esta norma, o considera dos opcionales, junto con detalles de los incidentes que puedan haber influido en el(los) resultado(s) del ensayo;- el (los) resultado(s) de ensayo obtenidos; y- si se ha verificado la repetitividad, el resultado final obtenido
Anexo A
(Informativo)
Actividad expresada en Unidades Internacionales (UI)
A1. ACTIVIDAD DE LA VITAMINA A
La actividad de la vitamina A se expresa en Unidades Internacionales. Se ha definido en la Farmacopea Europea (European Pharmacopoeia, Monograh vitamin A), que 1 UI de vitamina A corresponde a la actividad de 0,344 µg de todo-trans-retinil acetato.
La actividad de otros compuestos de vitamina A se calcula estequiométricamente tal que 1 Ul corresponde a la actividad de 0,300 µg de todo-trans-retinol, 0,359 µg de todo-trans-retinil propionato o 0,500 µg de todo-trans-retinil palmitado, respectivamente.
Esto significa que la actividad de 1 g, de todo-trans-vitamina A alcohol y ester, expresado en Unidades Internacionales, es igual a:
- vitamina A alcohol (retinol) 3 333 000 Ul;
- vitamina A acetato 2 907 000 Ul;
- vitamina A propionato 2 785 000 Ul;
- vitamina A palmitato 1 818 000 Ul;
A2. ENSAYO DE VITAMINA A ESTÁNDAR
Con una aproximación de 0,1%, se pesan 25 mg de ester de vitamina A en un matraz. Se disuelve esta en 5 ml de pentano y se diluye, dependiendo de la cantidad pesada, con 2-propanol a una presunta concentración de 10 Ul/mL hasta 15 Ul/mL. Se verifica que la absorción máxima, Am, de la
solución está situada entre 325 nm y 327 nm usando 2-propanol como líquido de compensación (blanco). Se mide la absorbancia, An, a 300 nm, 326 nm y 730 nm. Se calcula la relación An/Am para
cada longitud de onda mencionada. Si las relaciones no exceden de 0,593 a 300 nm, 0,537 a 350 nm, 0,142 a 370 nm respectivamente, entonces se calcula el contenido, w, de vitamina A en Unidades Internacionales por gramo usando la ecuación:
en donde:
Am es el valor numérico de la absorbancia máxima obtenida a 326 nm;
V es el volumen total al cual la vitamina A éster ha sido diluida para dar 10 Ul/mL hasta 15 Ul/mL
d es el factor para convertir la absorbancia específica de ésteres de vitamina A a Unidades Internacionales por gramo (d = 1 900);
Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR
ISO 5555 − Aceites y grasas de origen animal y vegetal. Toma de muestras.
Z.2 BASES DE ESTUDIO
Norma ISO 12080-1, Dried Skimmed Milk. Determination of Vitamin A Content. Part 1. Colorimetric Method. . International Organization for Standardization ISO. Geneve, 2000.
Norma ISO 12080-2, Dried Skimmed Milk. Determination of Vitamin A Content. Part 2. Method using High-Performance Liquid Chromatography. International Organization for Standardization ISO. Geneve, 2000.
NTE INEN 0275
VEGETAL. MARGARINA. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE VITAMINA A.
AL: 02.07-301
ORIGINAL:
Fecha de iniciación del estudio:
REVISIÓN:
Fecha de aprobación anterior del Directorio
Oficialización con el Carácter de Voluntaria por Resolución No. de
publicado en el Registro Oficial No. de Fecha de iniciación del estudio:
Fechas de consulta pública: de a Subcomité Técnico:
Fecha de iniciación: Fecha de aprobación: Integrantes del Subcomité Técnico:
NOMBRES:
Mediante compromiso presidencial N° 16364, el Instituto Ecuatoriano de Normalización – INEN, en vista de la necesidad urgente, resuelve actualizar el acervo normativo en base al estado del arte y con el objetivo de atender a los sectores priorizados así como a todos los sectores productivos del país.
Para la revisión de esta Norma Técnica se ha considerado el nivel jerárquico de la normalización, habiendo el INEN realizado un análisis que ha determinado su conveniente aplicación en el país. La Norma en referencia ha sido sometida a consulta pública por un período de 30 días y por ser considerada EMERGENTE no ha ingresado a Subcomité Técnico.
INSTITUCIÓN REPRESENTADA:
Otros trámites: Esta NTE INEN 0275:2012 Aceites y grasas de origen animal y vegetal.Margarina. Determinación del contenido de vitamina A, reemplaza a la NTE INEN 0275:1978.- Margarina. Determinación de vitamina A.
La Subsecretaría de la Calidad del Ministerio de Industrias y Productividad aprobó este proyecto de norma
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