PROYECTO PROALMEX-DAAD:
DIVERGENCIA EN LINAJES DE EUGLOSSA (HYMENOPTERA: EUGLOSSINI) EN RELACIÓN CON LA DISPONIBILIDAD DE FRAGANCIAS A LO LARGO DE UNA CLINA ECOLÓGICA EN LA PENÍNSULA DE YUCATÁN, MEXICO.
GRUPO DE TRABAJO
RESPONSABLE ALEMANIA: DR THOMAS ELTZ EQUIPO ALEMANIA:
Dr. Klaus Lanau
Dr. Yvonne Zimmermann Biol. Marko Hannibal
RESPONSABLE MEXICO: DR JAVIER QUEZADA EUAN EQUIPO MEXICO:
M en C. Humberto Moo Valle M en C. Jorge Ramirez Pech
1. ANTECEDENTES
Los insectos frecuentemente utilizan señales químicas para atraer conespecíficos para apareamiento o explotación de recursos en forma colectiva. La naturaleza química de las
moléculas emitidas por los insectos es diversa pero las señales deben ser distinguibles de aquellas usadas en forma simultánea por otras especies (Wyatt 2003). En comunidades diversas, las señales químicas pueden estar sujetas a selección debido a interferencia con especies simpátricas que usan señales químicas similares (Groot et al. 2006). Dicha interferencia puede también ocurrir con los atrayentes sexuales donde la señal química correcta puede ser total o parcialmente
responsable del aislamiento reproductivo entre especies cercanas (McElfresh y Millar 1999, Higgie et al. 2000, Gries et al. 2001, McElfresh y Millar 2001). La diferenciación química entre especies cercanas puede lograrse por dos vías principales mismas que interactúan y que pueden ser consideradas parte de un continuo. Por un lado la transferencia de información puede darse por un único tipo de molécula que debido a su compleja estructura química es imposible de ser duplicada por otras especies. En el otro extremo tenemos el caso de moléculas simples que mezcladas en proporciones características confieren a la mezcla una propiedad distintiva (Bjostad et al. 1987). Un buen ejemplo de este último caso son las feromonas sexuales de algunas polillas que consisten en mezclas de varios derivados de ácidos grasos (Bjostad et al. 1987, Morse y Meighen 1987, Roelofs y Rooney 2003).
Las abejas de las orquídeas son insectos neotropicales Apidae, Euglossini, ~250 especies) que se caracterizan por su larga probóscis pero también por un sistema de comunicación química único en las abejas, que probablemente sea parte del ritual de apareamiento de las mismas (Roubik y Hanson 2004, Zimmermann et al. 2006). Los machos de todas las especies de abejas de las orquídeas poseen cavidades amplias en sus tibias traseras que usan para la colecta y
almacenamiento de compuestos volátiles exógenos principalmente de flores, exudados vegetales y materia en descomposición (Vogel 1966, Whitten et al. 1993, Eltz et al. 2007). Este
comportamiento único ha llevado a la evolución de uno de los síndromes de polinización más conocidos: las flores de las más de 700 especies de Orchideaceae producen fragancias que atraen específicamente a machos de una o unas pocas especies de Euglossini. Así, los machos al colectar las fragancias de tales especies actúan como sus polinizadores exclusivos (Dressler 1982, Ramírez et al. 2002). Los machos de Euglossini acumulan fragancias volátiles durante la mayor parte de su vida y por tanto adquieren mezclas complejas que consisten de diversos compuestos terpenoides y aromáticos (Eltz et al. 1999). Estas mezclas son expuestas por los machos durante el cortejo nupcial en el que defienden territorios ubicados en la espesura de la selva (Bembé 2004, Eltz et al. 2005b). Se ha observado que las hembras se acercan a los machos que exponen sus fragancias algunas veces en dirección de éstas y copulan con ellos en sus perchas (Kimsey 1980, Stern 1991, Zimmermann et al. 2006). Aunque la prueba contundente de la atracción de las hembras a las fragancias de los machos permanece aún elusiva, es probable que las señales por medio de fragancias tengan un papel en el reconocimiento de pareja y su selección.
En machos de la misma especie las sustancias químicas en sus fragancias varían en cantidad y complejidad. Sin embargo, cuando se compararon tres especies de Euglossa de Centro América,
se encontró que la composición de las mezclas individuales fue más similar intra que inter específicamente y que tal diferencia persiste aún cuando se incluyen muestras de diferentes localidades y hábitats (Eltz et al. 2005a). Bioensayos con extractos de las patas traseras confirman también que las fragancias en ellas son mediadores en la atracción especie-específica
(Zimmermann et al. 2006).
El adquirir un distintivo químico no es una cuestión trivial para los machos de Euglossini por tres razones que complican la obtención de las mezclas de fragancias que lo componen. Primero, las mezclas específicas son colectadas de fuentes cuya disponibilidad varía espacial y temporalmente (Eltz et al. 2005a). Los resultados de un estudio previo muestran que las abejas ejercen una selección con base en su experiencia (retroalimentación negativa) para compensar por la
disponibilidad fluctuante. Segundo, las fuentes naturales de fragancias normalmente (aunque no siempre) producen ellas mismas mezclas de componentes y no componentes puros (e.g. (Gerlach y Schill 1991, Whitten et al. 1993), reduciendo los grados de libertad para acumular mezclas específicas. Tercero, obtener un distintivo químico en abejas Euglossinas se hace difícil por el elevado número de especies característico de esta tribu; una comunidad determinada puede contener hasta 50 especies con una fracción significativa de las mismas en actividad al mismo tiempo (Roubik y Hanson 2004).
Existen dos hipótesis sobre la dinámica de la evolución química en sistemas de reconocimiento de pareja (Symonds y Elgar 2008). La visión tradicional enfatiza que ocurren cambios graduales y lentos en las mezclas de feromonas sexuales debido a la necesidad del reconocimiento óptimo de las mismas. Sin embargo, recientemente, se ha demostrado que cambios rápidos (saltos) en la química de las señales puede ocurrir al alterarse las rutas de biosíntesis de las feromonas y que tales cambios abruptos pueden iniciar la divergencia de especies (Baker 2002, Roelofs et al. 2002). Estudios en polillas y escarabajos madereros han revelado diferencias sustanciales en las
feromonas de taxa cercanamente relacionados lo cual parece dar soporte al modo de evolución en saltos (Löfstedt et al. 1991, Symonds y Elgar 2004). En Euglossini nuestro equipo ha encontrado diferenciación sustancial en las fragancias de taxa cercanamente relacionados. Además, hemos encontrado que muchos componentes importantes concurren en varias especies lo que parece ser consistente con los cambios en ‘saltos’ en la colecta de fragancias (Zimmermann et al. en prensa). Tales cambios pueden tener base en diferencias en el comportamiento de preferencia o
alteraciones en la percepción olfativa de los individuos. Los genes que codifican para los receptores de olor (ORs) o proteinas que se ligan a olores (OBPs) son miembros de familias multigénicas grandes. Estudios genómicos en Drosophila y Apis sugieren que tales genes evolucionan en un esquema de nacimiento-muerte, experimentando cambios frecuentes en número de copias por duplicación o pseudogenización (Robertson y Wanner 2006, Vieira et al. 2007). La pérdida y reactivación de los receptores de olor pueden haber inducido cambios en la colecta de fragancias en machos de Euglossini y causar el patrón recurrente (homoplásico) de evolución de señales químicas. Un estudio reciente en Euglossa de México señala la importancia de la percepción olfativa periférica para la selección de fragancias en machos (Euglossa viridissima y su aún no descrita especie hermana Euglossa sp. 2D) los perfumes de los machos de ambas
especies difieren principalmente en un único compuesto químico (2-hydroxy-6-nona-1,3-dienyl-benzaldehido (HNDB)), el cual es colectado en grandes cantidades por los machos de sólo un linaje (E. viridissima). La presencia de tal componente en los machos de ese linaje se asocia con una mayor sensibilidad olfativa de los mismos a ese componente (Eltz et al. 2008).
Ambas especies hermanas ocurren en simpatría en la Península de Yucatan (Eltz et al. 2008). Sin embargo, una especie es particularmente abundante en la vegetación de la costa (Euglossa sp. 2D) mientras que la otra (E. viridissima) domina las selvas del interior. Este patrón opuesto de relativa abundancia numérica parece coincidir con la presencia/ausencia de algunos de los principales componentes en sus respectivos bouquets de fragancias (T. Eltz & J. Quezada-Euan, datos
preliminares). Este patrón de distribución geográfica de dos linajes hermanos en Euglossini es una situación única que permitirá evaluar hipótesis relacionadas con la divergencia genética debido a diferencias en sus preferencias por hábitats, en este caso ligada a la obtención de fragancias específicas de cada linaje.
Evaluaremos la hipótesis relacionada con el efecto de las clinas en el gradiente de distribución de los dos linajes de machos y su asociación con la disponibilidad de fragancias por medio de capturas individuos y análisis de sus componentes químicos en varias localidades distribuidas a lo largo de la costa y en el interior de la Península de Yucatán.
2. JUSTIFICACION
El proyecto se sitúa dentro en el marco de "especiación ecológica" en el que se considera que las barreras para el flujo de genes (aislamiento reproductivo) pueden evolucionar separando
poblaciones como resultado de una selección divergente con base en factores ecológicos i.e. a lo largo de gradientes de hábitats. Este es uno de los conceptos más innovadores dentro de la Biología Evolutiva. Las abejas de las orquídeas en la península de Yucatán son organismos particularmente promisorios para evaluar hipótesis en esta área debido al nexo único que existe entre el ambiente y las señales reproductivas de los machos de linajes hermanos que deben estar bajo selección natural.
OBJETIVO GENERAL:
Evaluar la diferenciación entre poblaciones de dos especies hermanas de Euglossa del sur de Mexico (Euglossa viridissima y su especie hermana aún no descrita conocida como Euglossa sp. 2D) debida a diferencias en fragancias a lo largo de un gradiente de hábitats en la península de Yucatán, México.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1) Determinar si los patrones de abundancia de cada tipo de macho son producto de la disponibilidad de fuentes críticas de fragancias entre hábitats (i.e. perfumes).
2) Evaluar si la especialización debida al tipo de hábitat (preferencia por fragancias) propicia una barrera para el flujo de genes entre poblaciones hermanas de Euglossa viridissima.
3. METODOLOGIA 3.1. Sitios de muestreo.
Doce pares de sitios en costa e interior de la Península de Yucatán (total 24 sitios) con una distancia de ~40 km entre ellos serán seleccionados para captura de machos de ambos linajes de Euglossa por medio de atrayentes químicos (p-dimethoxybenzeno, eugenol, methyl cinnamato, cineole, y HNDB). Los atrayentes se expondrán de forma estandarizada que permita una comparación directa de números de machos capturados entre localidades. Los especímenes se capturarán por medio de redes entomológicas e identificados en campo por medio de lupa portátil registrando el tipo de atrayente en que se capturó a cada individuo. Las patas traseras de cada macho serán seccionadas y colocadas en 0.5 ml de hexano para el análisis subsecuente de fragancias por medio de cromatografía de gas y espectrometría de masas (GC/MS). El resto de cada individuo se mantendrá en etanol absoluto para referencia y análisis de microsatélites.
3.2. Marcaje y recaptura.
Para determinar si los machos de ambos linajes son residentes o transitorios de un sitio
determinado y para investigar si el grado de residencia (fidelidad) es diferente en ambos linajes se realizarán ensayos de marcaje captura en todos los sitios. Un número elevado de machos será marcado por medio de colores específicos para cada linaje y tipo de hábitat sobre el segundo tergito abdominal y liberados inmediatamente. Al día siguiente se continuará con la colecta y se determinará el número y porcentaje de machos recapturados. La comparación de tasas de recaptura permitirá evaluar los efectos de especie y/o hábitat en la fidelidad al sitio. 3.3. Preferencia química.
Para investigar si las preferencias por hábitat (evidenciadas por la abundancia numérica diferencial y fidelidad al sitio) están relacionadas a la disponibilidad de componentes críticos en las fragancias colectadas por los machos en los sitios, se evaluarán las concordancias y diferencias hábitat-específicas en preferencia por atrayentes químicos. Las diferencias en preferencias de los machos por atrayentes entre sitios se han demostrado previamente en abejas de las orquídeas
hábitat y si existe una correlación entre preferencias por atrayentes y la presencia de los componentes importantes en el perfume de los machos.
3.4. Análisis de fragancias.
Se utilizará Cromatografía de Gas/Espectrometría de Masa (GC/MS) en el Departamento de Neurobiología de Düsseldorf, usando una HP 5890 II GC con una columna de 30m DB-5 no-polar y un HP 5972 MSD. La inyección de soluciones se realizará en un horno programado a 60 -300°C a 3°C/min con presión automática pre programada.
Los espectros de masa y los índices de retención asociados de los picos integrados serán
comparados con espectros de la biblioteca de referencia local (>1000 componentes de perfumes en Euglossini, T. Eltz, no publicados). Componentes nuevos serán adicionados en el curso de este estudio. La caracterización química será realizada por comparación con estándares auténticos o por medio de comparación de los espectros y tiempos de retención existentes en la literatura (Adams 2001). Las características del espectro de masa por sí sola no serán consideradas
suficientes para identificación de compuestos pero será usada para asignar a clases de sustancias. La similitud de perfumes total será analizada por medio de escala multidimensional no métrica (MDS) y técnicas asociadas (Legendre y Legendre 1998, Clarke y Warwick 2001). MDS es flexible en relación a la medida de similitud usada lo que permite el uso de el índice de Bray-Curtis index como medida de similitud-disimilitud química entre muestras (individuos). El valor de este índice entre un par cualquiera de individuos es producto solamente de los compuestos químicos que se presentan en conjunto en ambos individuos pero no aquellos ausentes en ambos. Esta es una medida deseable ya que las similitudes son fijas entre pares de individuos independientemente de los fenotipos químicos de otros individuos en la matriz de datos (Clarke and Warwick 2001). Antes de calcular el índica, las áreas totales de los picos (corrientes iónicas integradas MS) serán
estandarizadas para representar las contribuciones relativas de las fragancias a los picos (en %). De tales datos se derivarán una matriz de similitud triangular con base en el índice de Bray-Curtis index. Las similitudes inter-individuales serán ordenadas en dos o tres dimensiones en el programa PRIMER v6 (Clarke y Gorley 2001). Se evaluará la hipótesis nula de que el factor hábitat no tiene efecto sobre las similitudes entre individuos usando permutaciones de una via para cada especie por medio de ANOSIM (Clarke y Green 1988). Se evaluará también para el efecto de hábitat sobre la abundancia relativa de ciertos componentes blanco (específicamente HNDB) en mezclas individuales directamente.
3.5. Estructura poblacional.
Para evaluar el efecto de hábitat versus distancia sobre la estructura de las poblaciones se hará una evaluación de diferenciación genética en muestras de machos usando entre 3-6
microsatellites (Zimmermann et al. 2009). Se extraerá el ADN de los tóraces contenidos en etanol con protocolos establecidos (Hunt y Page 1995). Reacciones múltiples de PCR serán realizadas con plantillas marcadas con tintes fluorescentes (VIC, 6-FAM and NED; Applied Biosystems). 4 µl de
alicuota de ADN serán añadidos a una solución Master de 12.5 µl HotStar conteniendo TaqTM (Qiagen), y el volmen total completado a 25 µl con agua libre de ARN-asa(Qiagen). las reacciones de PCR serán realizadas en un termociclador Eppendorf Mastercycler con las siguientes
características: 95°C por 15 min, despuésn 94°C por 30 s, 52°C por 90 s, 67°C por 90 s por 22 cycles, y después 67°C por 10 min. El análisis de los productos será realizado por medio de un secuenciador ABI Prism 310TM Sequencer (PE Applied Biosystems).
Se caracterizarán las diferentes poblaciones (por hábitat y sitio) usando los siguientes parámetros: a) frecuencias alélicas observadas y estimaciones de heterocigosis esperada (Nei 1978) usando el paquete FSTAT (Goudet 1996); b) el número efectivo de elelos será calculado como na = 1/Σ p2i donde pi es la frecuencia del iésimo alelo; c) desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg por locus y población serán realizados por medio del GENEPOP usando una aproximación a la cadena de Markov; d) estimación multilocus de FST entre poblaciones se usará para determinar
diferenciación genética (Weir y Cockerham, 1984) usando el paquete FSTAT (Goudet, 1996) que se usará también para calcular el coeficiente de consanguinidad FIS y sus límites de confianza. Para evaluar el efecto de habitat sobre la estructura poblacional global de cada linaje se usará el programa STRUCTURE (Falush et al 2007).
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Cronograma.
Task 2010 2011
JFMAMJJASOND JFMAMJJASOND
Selection of field sites , starting the
project (JQ-E, TE, MH, NN) x Spring sampling period: Sampling,
mark-recapture, bait preferences (MH, NN) xxx
Perfume analysis (NN, MH) xxx xxx xxx
Mid-term data evaluation ( JQ-E, TE) x Summer sampling period: Sampling,
mark-recapture, bait preferences ( NN,
MH) xxx
Microsatellite analysis ( NN, MH) xxxx xxx Data analysis, publication (JQ-E, TE, MH,
NN) xxxxxxxx xxxxx
Abbreviations:
JQ-E = Javier Quezada-Euan TE = Thomas Eltz MH = Marko Hannibal NN = UADY student Bold: Mexico Plain: Germany Italics: both
