5
Ácidos nucleicos
«La doble hélice es una estructura elegante, pero su mensaje es abso-lutamente prosaico: la vida es senci-llamente una cuestión de química. Crick y yo comprendimos rápida-mente el significado intelectual de nuestro descubrimiento, pero en modo alguno podíamos haber pre-visto el impacto explosivo de la do-ble hélice en la ciencia y la sociedad. Las encantadoras curvas de la molé-cula contenían la clave de la biología molecular, una nueva ciencia que en el curso de estos últimos cincuenta años ha progresado de un modo sorprendente… El ADN ya no es so-lo un asunto que interese a so-los cien-tíficos de bata blanca en oscuros la-boratorios universitarios; nos afecta a todos».
JAMESD. WATSON. ADN: el secreto de la vida. Ed. Taurus.
1.
Ácidos nucleicos.
2.
Ácido desoxirribonucleico (ADN).
3.
Otros niveles de complejidad
del ADN.
4.
Ácido ribonucleico (ARN).
5.
Funciones biológicas de los ácidos
nucleicos.
1. Ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicosson moléculas fibrilares gigantes, no ramificadas, que de -sempeñan funciones biológicas de trascendental importancia en todos los seres vivos. Contienen información genética, es decir, la información codificadaque permite a los organismos desarrollar sus ciclos biológicos, desde su nacimiento a su muerte, y no solamente cuentan con el mensaje genético (los genes), sino también con las instrucciones precisas para su lectura, como veremos en las uni-dades 12 y 13.
Los ácidos nucleicos son biopolímeros formados por otras subunidades estructurales más pequeñas o monómeros, denominadas nucleótidos.
Ribonucleósido de adenina, que se de nomina adenosina.
Pentosa Grupo fosfato
ß-D-Ribosa (Ri) ß-D-Desoxirribosa (dRi)
Bases púricas
Adenina (A) Guanina (G)
Bases Pirimidínicas
Timina (T) Citosina (C) Uracilo (U)
Los nucleótidos, a diferencia de los aminoáci-dos, que constituyen cada uno una molécula sencilla, son ya ellos mismos moléculas comple-jas que resultan de la combinación de tres com-ponentes:
» Una molécula de ácido fosfórico (en forma de
gru po fosfato).
» Un azúcar (pentosa).Se encuentra en la forma cíclica y puede ser:
› La -D-ribosa(en los ribonucleótidos compo-nentes de los ácidos ribonucleicos o ARN).
› La -D-desoxirribosa (en los desoxirribonu-cleótidos que constituyen las moléculas de los ácidos desoxirribonucleicos o ADN).
» Una base nitrogenada(se denomina base por-que su presencia aumenta el pH en una disolu-ción). Tiene una estructura en forma de anillo que contiene átomos de carbono y de nitrógeno. Las bases nitrogenadas pueden ser de dos tipos:
› Púricas (derivadas de la purina), presentan una estructura formada por un doble anillo: son la adenina (A) y laguanina (G).
› Pirimidínicas (derivadas de la pirimidina), pre-sentan una estructura con un solo anillo: son la citosina (C), latimina (T) y eluracilo (U).
1.1
Nucleósidos
Se domina nucleósido a la molécula que resulta de la unión entre la pento-sa (ribopento-sa o desoxirribopento-sa) y una base nitrogenada (púrica o pirimidínica).
De las cinco bases, solo intervienen cuatro de ellas en los dos tipos de nucleósidos: » Los ribonucleósidoscontienen A, G, Cy Uunidas a la ribosa.
» Los desoxirribonucleósidos contienenA, G, Cy Tunidas a la desoxirribosa.
El enlace entre la pentosa y la base nitrogenada es de tipo N–glucosídicoy se establece, con pérdida de una molécula de agua, entre el —OH hemiacetálico del C1de la pentosa (ribosa o desoxirribosa) y el hidrógeno del N1 , si se trata de una base pirimidínica, o del N9 , si es una base púrica(para evitar confusiones, los átomos de la base nitrogenada se numeran con la serie 1, 2, 3, 4..., mientras que los átomos de la pentosa lo hacen con la serie 1’, 2’, 3’, 4’ ,5’).
Enlace N-glucosídico
1.2
Nucleótidos
Se denomina nucleótidoa la molécula que resulta de la unión mediante un enlace éster de una molécula de ácido fosfórico(en forma de grupo fosfato) con el —OH de carbono 5’ de la pentosa de un nucleósido,de manera que el nucleótidoes el nucleósidofosforilado en posición 5’.
■
Tipos de nucleótidos y funciones que desempeñan
Algunos nucleótidos se presentan libres en la naturaleza y forman parte de otras moléculas que no son ácidos nucleicos, como por ejemplo, moléculas portado-ras de energía, moléculas señalizadoportado-ras o coenzimas; otros se encuentran poli-merizados y forman ácidos nucleicos. En todos los casos, el grupo fosfato de los
nucleótidos-5’-monofosfato puede unirse a otros grupos y dar lugar a las siguien-tes combinaciones de gran interés biológico:
» Forma enlaces «ricos en energía» con otros grupos fosfato para dar lugar a los
nucleótidos difosfato y trifosfato, como el ADPy el ATP, capaces de transpor-tar la energía almacenada en sus enlaces, que son fácilmente hidrolizables (ver página 187).
» Establece un segundo enlace éster con el —OH en posición 3’, lo que origina un puente intramolecular y da lugar al AMP cíclico (AMPc), que es una molé-cula señalizadora que actúa de segundo mensajeroentre las moléculas extra-celulares portadoras de información (neurotransmisores, hormonas, prosta-glandinas, etc.) y el interior de la célula (ver página 279).
» Si se une al grupo fosfato de otro mononucleótido o de otra sustancia, da lugar a los nucleótidos no nucleicosque actúan de coenzimas. Por ejemplo, la
coenzima A, el FAD (flavín adenín dinucleótido) y el NAD+ (nicotín adenín
dinucleótido) (ver página 185).
» Por último, forma otro enlace éster con el —OH en posición 3’ de otro nucleó -tido; que a su vez puede incorporar otro nucleótido, y así sucesivamente hasta originar cadenas de polinucleótidos constitutivas de los ácidos nucleicos. Son estas formaciones las que se van a considerar a continuación con más deteni-miento.
1. Indica si son verdaderas o falsas las siguientes frases:
a) El ARN posee ribonucleótidos de timina.
b)Todos los nucleótidos son componentes de los ácidos nucleicos.
c) La adenosina es un ribonucleósido de adenina.
Ribonucleótido de adenina que se denomina adenosina-5’-monofosfato (AMP).
ATP: adenosina-5’-trifosfato.
AMP cíclico (AMPc).
Nomenclatura y clases de nucleósidos y de nucleótidos
Bases Ribonucleósidos (constituyentes del ARN)Ribonucleótidos Desoxirribonucleósidos Desoxirribonucleótidos(constituyentes del ADN) Adenina (A) Adenosina Adenosina-5’-monofosfato Desoxiadenosina Desoxiadenosina-5’-monofosfato
(AMP) (dAMP)
Guanina (G) Guanosina Guanosina-5’-monofosfato Desoxiguanosina Desoxiguanosina-5’-monofosfato
(GMP) (dGMP)
Citosina (C) Citidina Citidina-5’-monofosfato Desoxicitidina Desoxicitidina-5’-monofosfato
(CMP) (dCMP)
Uracilo (U) Uridina Uridina-5’-monofosfato (UMP)
Timina (T) Desoxitimidina Desoxitimidina-5’-monofosfato (dTMP)
Enlace N-glucosídico Enlace
éster
Enlaces éster «ricos» en energía
Puente intramolecular
2. Ácido desoxirribonucleico (ADN)
Las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN)son biopolímeros linea-les formados por la polimerización de desoxirribonucleótidos-5’-monofosfa-to de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T).
En el medio acuoso celular, los largos filamentos de ADN adoptan —igual que las proteínas— una estructura tridimensionalo, lo que es lo mismo, una confor-mación espacial.Pero no es tan compleja como la desarrollada por las proteínas, ya que no llega a formar estructuras terciarias y cuaternarias que sean compara-bles, y tan solo manifiesta estructura primariay secundaria.Aunque, como vere-mos más adelante, cuando el ADN se asocia a determinadas proteínas para su empaquetamiento puede alcanzar niveles de gran complejidad estructural.
2.1
Estructura primaria del ADN
La estructura pri mariadel ADN consiste en la formación de largas cadenas de polinucleótidos por unión de desoxirribonucleótidos–5’–monofosfato.
En el ADN se encadenan los nucleótidos mediante enlaces éster: elgrupo fosfa-toque se encuentra en posición 5’ de un nucleótido esterifica al grupo —OH
situado en posición 3’ del nucleótido siguiente; de esta forma se va alargando la cadena por el encadenamiento de nucleótidos en las posiciones 5’ →3’ →5’ → 3’..., donde cada molécula del grupo fosfatoforma un puente fosfodiésterentre dos moléculas de desoxirribosa. En un polinucleótido se pueden diferenciar dos partes:
El esqueleto de polidesoxirribosa-fosfato (... dRi-P–dRi-P–dRi-P–...), que es común para todas las clases de ADN. En cada cadena aparece un extremo 5’,
que posee un grupo fosfato libre unido al carbono 5’ del nucleótido, y un extre-mo 3’,que posee el —OH(alcohol) en posición 3’ del nucleótido también libre. Las diferentes bases, A, G, C y T, alineadas a lo largo de este esqueleto, que constituyen el elemento característico y diferenciador entre las distintas clases de
ADN. Aparece aquí, al igual que en las proteínas, la noción de secuencia.Se nombran indicando los extremos y la secuencia de bases, como por ejemplo: 5´...ATTACGCGGCCTCGGCTTTAAA... 3´
Cada molécula de ADN se caracteriza por la composición o porcentaje de cada una de sus bases y por la secuencia, es decir, el orden de distribución de los cuatro tipos de bases (A, G, C, T) a lo largo del esqueleto de polide-soxirribosa fosfato y es en la naturaleza misma de esta secuencia donde resi-de la información necesaria para la síntesis de las proteínas.
2.2
Estructura secundaria del ADN
La estructura secundaria del ADN es una doble hélice formada por dos cadenas de polinucleótidos enfrentadas por sus bases y unidas entre sí mediante puentes de hidrógeno.
La estructura resultante se asemeja a una escalera de mano, cuyos pasamanos corresponden a los esqueletos de polidesoxirribosa–fosfato y los peldaños son los pares de bases enfrentadas entre sí. En realidad, el conjunto se pliega sobre sí mismo obligado por lospuentes de hidrógenoestablecidos entre diferentes regiones de la molécula, hasta adoptar la conformación más estable, que es la
doble hélice. Estructura primaria del ADN. En cada
polidesoxirribonucleótido se diferen-cia el esqueleto de polidesoxirribosa fosfato y las distintas bases alineadas en este esqueleto y dispuestas según una secuencia característica.
Adenina Citosina Timina Guanina Extremo 3’ Extremo 5’ Puente fosfodiéster Esqueleto de polidesoxirribosa fosfato
■
Modelo de doble hélice ADN-B
El modelo de la estructura secundariadel ADNen forma de
doble hélice dextrógira (ADN-B), propuesto por Watson y Crick,pone de manifiesto que la estructura de la molécula de
ADN presenta las siguientes características:
» Las cadenas polinucleotídicas son antiparalelas, es decir, una se encuentra en dirección opuesta a la otra: si una pre-senta la dirección 5’➝3’, la otra posee la dirección 3’➝ 5’. Esto es así con el fin de que ambas cadenas queden enfren-tadas por sus bases y puedan unirse mediante puentes de hidrógeno.
» Las secuencias de bases soncomplementarias, pues existe una correspondencia entre las bases de ambas cadenas, de tal forma que la adenina solo puede estar frente a la timina
(y viceversa) y la guanina frente a la citosina (y viceversa). La correspondencia entre las bases es la causa de que las dos cadenas de ADN posean secuencias complementarias.
Las bases púricas, que son más grandes, se encuentran enfrentadas a las bases pirimidínicas, más pequeñas, y la unión se realiza porpuentes de hidrógenoentre los grupos polares de las bases: dos puentes de hidrógeno en los pares
A = T y tres en los pares G ⬅C.Por tanto, el enlace G ⬅C
es más fuerte que el A = T; de ahí que la cadena de ADN que posea mayor número de pares G ⬅Cserá más estable al efecto de la temperatura y más resistente a la desnatura-lización (ver página siguiente).
» El enrollamiento entre las dos hebras de la doble hélice es
dextrógiro y de tipoplectonémico, como si estuvieran tren-zadas. En este modelo de doble hélice ADN-Blos pares de bases están casi horizontales (inclinación cero) y el eje los atraviesa prácticamente por su centro.
1. ¿Qué características definen la estructura primaria del ADN?
2. Una cadena de ADN tiene la secuencia y orientación siguientes: 5’...AGGCTGCTTAATTGCCGTA...3’. Escri-be la secuencia y orientación de su cadena comple-mentaria.
3. Indicar cuál de estas secuencias es incorrecta para un ADN. a) ... A T T C G G T C C A T C G ... b)... G C T A A A C G T A A A ... ... C G A T T T G C A T T T ... c) ... A G G T C U T T C G G A A ... ... T C C A G A A A G C C T T ... Estructura secundaria del ADN:
A) Disposición antiparalela de las dos cadenas de ADN en la estructura se-cundaria.
B) Apareamiento entre bases complementarias mediante puentes de hidró-geno: las bases púricas A, G se aparean con las pirimidínicas, T, C, respecti-vamente.
C) Plegamiento plectonémico de la doble hélice del ADN en el modelo de Watson y Crick, también llamado forma B: los pares de bases están casi hori-zontales y el eje los atraviesa prácticamente por su centro.
A B C Eje central Pares de bases horizontales Esqueletos de polidesoxirribosafosfato
2.3
Desnaturalización del ADN
La desnaturalización del ADNse produce cuando el incremento de temperatura, la variación del pH o de las condiciones iónicas del medio rompen los puentes de hidrógeno entre las bases y se separan las dos cadenas del ADN sin que se vean afectados los enlaces covalentes fosfodiéster de los esqueletos de polidesoxirri-bosa-fosfato.
La desnaturalización del ADN provocada por el incremento de la temperatura se denomina fusión. Cuando la temperatura alcanza determinado valor, llamado
punto de fusióndel ADN (Tm,del inglés melting temperature), la agitación térmi-ca es térmi-capaz de separar las dos hebras: el punto de fusiónes la temperatura a la cual se encuentran desnaturalizadas la mitad de las moléculas de ADN.
La desnaturalización del ADN es un proceso reversible,ya que una disolución de ADN calentado ligeramente por encima de su punto de fusión y desnaturalizado, cuando se enfría y se mantiene en esta temperatura durante el tiempo suficien-te, es capaz de recuperar su forma inicial de doble hélice (renaturalización).La única condición para que dos cadenas recuperen la estructura de doble hélicees que sean complementarias o, al menos, que posean tramos con secuencias com-plementarias suficientemente largos. Variaciones bruscas depHtambién provo-can desnaturalización del ADN, que se renaturaliza cuando los valores de pH se sitúan dentro de los parámetros biológicos.
La reversibilidad de la desnaturalización ha dado lugar en los últimos años a una importante aplicación conocida como hibridación,que constituye una de las técnicas fundamentales en la tecnología de ADN recombinante
(como la reacción de la polimerasa en cadena o PCR), fundamento de la
ingeniería genéticao biotecnología (ver unidad 15).
La hibridación de hélices bicatenarias no naturales deADN-ADN y ADN-ARN, entre otras aplicaciones, permite reconocer el grado de relación genética o parentesco entre dos ADN y aplicarlo al estudio de las relaciones filogenéticas entre las especies; también se ha revelado de gran interés en biotecnología para la elaboración de sondas, que son fragmentos de ADN monocatenarios, de secuencia conocida, que permiten la detección de fragmentos de ADN que son complementarios.
La hibridación del ADN
Las hebras de ADN desnaturali-zadas, pertenecientes a indivi-duos diferentes (de la misma o de distinta especie) pueden re-naturalizarse y formar dúplex hí-bridos al aparear secuencias complementarias.
OBSERVA
El contenidoo porcentaje GC (gua-nina y citosina) es una característica del genoma de un organismo o de cualquier fragmento de ADN o ARN y se utiliza a veces para clasificar organismos en taxonomía.
En la siguiente gráfica se representa la relación existente entre la varia-ción del punto de fusión del ADN y el contenido GC de distintos geno-mas: 1) Staphylococcus aureus; 2) Timo de becerro; 3) Escherichia coli; 4) Brucella abortus; 5) Streptomyces griseus.
¿A qué crees que se debe el incre-mento del punto de fusión del ADN conforme aumenta su porcentaje de GC? ¿Por qué el contenido GC tien-de a ser mayor en las arqueobacte-rias hipertermófilas que soportan temperaturas de casi 100 ºC? RAZONA Desnaturalización y renaturalización del ADN. Renaturalización Desnaturalización
Doble hélice de ADN
ADN parcialmente desnaturalizado ADN desnaturalizado Calentamiento Enfriamiento Calentamiento ADN1 desnaturalizado ADN2 desnaturalizado Enfriamiento 2 1 100 95 90 85 80 30 45 % G+C Tm(°C) 60 75 3 4 5 Doble hélice híbrida Doble hélice de ADN1 Doble hélice de ADN2 Enfriamiento
El descubrimiento de la doble hélice del ADN
En 1869, el químico J. F. Miescher descubrió que en el núcleo celular existía una sustancia que denominó nucleína, a la que más tarde se dio el nombre de ácido desoxirribonucleico. La existencia de un alto grado de complejidad en el ADN se puso de manifiesto en la década de los años cincuenta del pasado siglo, a partir de la hipótesis de Erwin Chargaff, quien, tras analizar numerosas muestras de ADN pro-cedentes de células de distintas especies animales, demostró que, salvo en muy raras excepciones, todos los ADN poseen igual número de moléculas de timina y adenina, y tantas de citosina como de gua-nina.
Este hecho se puede representar mediante las llamadas reglas de Chargaff: A = T y G = C, o bien, A/T = 1 y G/C = 1; sin embargo, A+T
G+C, y es precisamente el valor de la relación A+T/G+C lo que dis-tingue los ADN de especies diferentes, siendo los valores tanto más parecidos cuanto más emparentadas filogenéticamente estén las especies entre sí.
Por aquellos años, Linus Pauling era científico del Caltech, en EE.UU, y gozaba de excelente reputación entre sus colegas, pues a él se debía el modelo de hélice-propuesto para la estructura secundaria de las proteínas. Pero no gozaba de tan buena reputación entre deter-minados miembros de su gobierno, ya que su ideología pacifista a principios de los años 50 del pasado siglo —cuando la «caza de bru-jas» se encontraba en pleno auge— fue considerada subversiva y se le negó el pasaporte para acudir a Inglaterra, donde se celebraban reuniones sobre las últimas investigaciones llevadas a cabo por Rosa-lind Franklin y Maurice Wilkins, científicos ingleses del King’s College, sobre difracción por rayos X.Estas indicaban que la molécula de ADN era fibrosa y presentaba una estructura helicoidal.
La misoginia reinante en los ambientes académicos a lo largo de la historia ha dificultado la actividad científica de muchas mujeres como Rosalind Franklin (por ser mujer se le negaba el acceso al club de la cafetería, organizado solo para los profesores varones). Ignorada e infravalorada, mantenía una difícil relación personal y profesional con su jefe, M. Wilkins. Pero era una excelente experimentadora y había demostrado su habilidad para obtener las mejores imágenes del ADN mediante difracción por rayos X.
Wilkins mostró sin su permiso la imagen de difracción de rayos X del ADN (conocida hoy como la famosa fotografía 51) a dos jóvenes cien-tíficos, James Watson y Francis Crick. Con esta información en su poder y sin llevar a cabo ninguna experimentación formal, al cabo de un mes lograron armar un modelo teórico para la estructura del ADN: el modelo de la doble hélice del ADN, que fue publicado en 1953 en la revista Nature, en un artículo de no más de dos páginas. En aque-lla época se consideró una propuesta revolucionaria y marcó el inicio del espectacular avance registrado en la biología molecular en las décadas posteriores.
Tal vez, como más tarde comentó Watson, si Pauling hubiera podido viajar hasta Inglaterra y hubiera podido ver las fotografías de difrac-ción por rayos X, «a más tardar en una semana, Linus tendría la estruc-tura». Pauling, demostrando gran categoría, felicitó a los dos jóvenes investigadores por su ingeniosa solución del enigma de la doble héli-ce del ADN. El modelo de la doble hélihéli-ce del ADN propuesto por Watson y Crick en 1953 explicaba satisfactoriamente los resultados de los experimentos de Chargaff, Franklin y Wilkins, al tiempo que demostraban la estructura que adoptaban las fibras de ADN en el espacio.
En 1962, Watson, Crick y Wilkins, recibieron el premio Nobel de Fisio-logía y Medicina. Rosalind Franklin no figuró entre los premiados, pues para entonces, en 1958, a la edad de 38 años, había muerto de cáncer de ovarios, probablemente a causa de las repetidas exposicio-nes a los rayos X durante sus investigacioexposicio-nes (el premio Nobel no se concede con carácter póstumo y tampoco se comparte entre más de tres personas).
CONTEXTO HISTÓRICO Y SOCIAL
Imagen obtenida por difracción de rayos X del ADN, conocida hoy como la fotografía 51.
Modelo espacial compacto de la doble hélice del ADN propuesto por Watson y Crick. Con sus bases di-rigidas hacia el interior, se asemeja a una estructura rí-gida destinada a proteger la información genética que contiene. Es un modelo capaz de explicar las dos funciones básicas del material hereditario: obtener ré-plicas que se transmiten a la descendencia, abriéndo-se como una cremallera, y almacenar información co-dificada en un idioma de cuatro letras para la síntesis de proteínas.
Separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa
La electroforesispermite separar fragmentos de ADN, ARN o proteí-nas según su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de una corriente eléctrica continua. Esta técnica se basa en el principio de la emigración de los iones cuando se someten a un campo eléctrico: los iones positivos tienden a emigrar al cátodo y los negativos, al ánodo. Se puede realizar sobre diversos soportes, pero cuando se utiliza como técnica de separación y análisis de fragmentos de ADN, uno de los soportes que ofrece mejores resultados por su resolución es el gel de agarosa(un heteropolisacárido extraído de las algas rojas). El pro-tocolo experimental es el siguiente:
» Los tubos eppendorf (1) contienen los fragmentos de ADN que se desean separar, disueltos en una solución tampón: muestra 1 (frag-mentos A y B), muestra 2 (frag(frag-mentos C y D) y muestra 3 (fragmen-tos A, E y D)
» Se polimeriza el gel de agarosa: se disuelve el polisacárido en agua fría, luego se calienta y después se deja enfriar. Se utiliza un molde que permite la formación de una especie de muescas o pocillos en su parte superior (2) y a continuación se coloca a modo de lámina entre dos placas de vidrio, con las muescas hacia arriba (3), que se sitúa, a su vez, entre las cubeta superior (4) e inferior (5).
» En cada muesca de la parte superior del gel se aplica con una micropipeta eppendorf una muestra diferente (6). A continuación, se añade a cada muestra una pequeña cantidad de glicerol para que adquiera mayor densidad y no se mezcle con la solución tam-pón de la cubeta superior. También se le añade un colorante de localización, como el azul de bromofenol, que se desplaza más rápidamente que el fragmento de ADN más veloz (7). Cuando este colorante se aproxime al extremo inferior del gel es la señal para detener la electroforesis.
» Las cubetas superior e inferior contienen una solución de electroli-tos tamponada y en ellas se colocan los electrodos: en la cubeta superior (4), el cátodo (–) y en la inferior (5), el ánodo (+).
» Entre ellas se hace pasar una corriente continua de unos 100 V (8) durante un tiempo suficiente para que se produzca la separación de las diferentes fracciones de ADN de cada muestra, que lo harán en función de su carga neta, y de su tamaño: en conjunto, definen un parámetro que es característico de cada fragmento, denomina-do movilidad electroforética (). Los grupos fosfato del ADN sue-len estar desprotonados, por lo que adquieren carga neta negati-va y migran hacia el ánodo.
» Al cabo de un tiempo, la mezcla de fragmentos de ADN se ha separado en bandas que se pueden identificar y poner de mani-fiesto si teñimos la lámina de agarosa con colorantes fluorescentes, como el bromuro de etidio, que hace visibles las bandas bajo la luz ultravioleta (9).
» Evidentemente, los fragmentos con más carga negativa se move-rán más deprisa hacia el ánodo, pero si son voluminosos vemove-rán fre-nado su movimiento, pues el interior del gel de agarosa forma un retículo que se comporta como una criba molecular; por esta razón, los fragmentos más pequeños (A) avanzan más rápido que los más grandes (B) (10).
» La movilidad electroforética () de los distintos fragmentos de ADN, medida en mililímetros recorridos por cada fragmento de ADN en el gel, es proporcional a sus tamaños,medidos en pares de bases (pb) (11). EVIDENCIA EXPERIMENTAL 1 2 6 6 4 10 7 5 9 11 10 3 + – 8 Muestra 1 A A B D ED C 1 2 3 Muestra 2 100 V Muestra 3 A Gel de agarosa Micropipeta eppendorf B 1 2 3 B C D D A E 32 000 pb 11 000 5 000 2 500 26 500 A
3. Otros niveles de complejidad del ADN
Tanto en el citoplasma de las células procariotas como en el núcleo de las célu-las eucariotas debe resolverse el mismo problema: cómo almacenar grandes can-tidades de ADN en un volumen reducido y, al mismo tiempo, que la información que contiene resulte accesible.
3.1
Empaquetamiento del ADN en procariotas
El ADN de lasbacterias y, en general, de todos los procariotas y también de las
mitocondrias y de los cloroplastos de las células eucariotas es una doble hélice circular(excepto en algunos grupos bacterianos, que es lineal). En un principio se consideró que el cromosoma estaba desnudo, pero actualmente se sabe que está asociado a un pequeño número de proteínas que, junto a ciertas moléculas de ARN, desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de su estruc-tura y en el empaquetamiento en la región del nucleoide.
Elcromosomade una bacteria como Escherichia coli cuando está estirado mide casi un milímetro de longitud. Entonces, ¿cómo empaquetar una macromolécula tan larga en el interior de la bacteria, cuyo tamaño oscila entre 0,3 y 10 m? La solución a la que se llega se basa en generar torsiones en la doble hélice circular, que responde a la tensión mediante el superenrollamiento.
El cromosoma bacteriano se pliega como una superhélice en forma de ochos y da lugar a una serie de dominios o bucles que le permiten ocupar un espacio mínimo.
Para conseguir el máximo grado de empaquetamiento deben resolverse compli-cados problemas topológicos, para lo cual las células disponen de un equipo de topoenzimas que, como la ADN girasa, participan en el empaquetamiento del
ADN y en su posterior descondensacióndurante la transcripcióny la replicación.
3.2
Empaquetamiento del ADN en eucariotas:
cromatina y cromosomas
En este caso el problema consiste en introducir en cada célula (como, por ejem-plo, una célula humana) más de un metro de ADN en el interior de un núcleo cuyo diámetro apenas mide 10 m. Evidentemente el empaquetamiento debe ser aún más compacto, y para ello el ADN se asocia con un tipo particular de pro-teínas, denominadas histonas (el núcleo de los espermatozoides presenta otra clase de proteínas análogas, las protaminas).
La forma compacta que adquiere el ADNunido a las histonasen el núcleo de las células eucariotasse conoce como cromatina, y aunque aparentemente se asemeja a un conjunto de fibras entremezcladas y apelotonadas, en realidad esconde una estructura muy compleja y ordenada, en la que se distinguen diferentes niveles de organización estructural: nucleosoma y«collar de per-las», fibra cromatínica o de30 nm, dominios estructurales en forma de bucles radiales, rosetón, espiral de rosetones y, por último, cromosoma.
1. Si los fragmentos mayores de ADN tienen más carga negativa, debido a la presencia de los grupos fosfato, ¿por qué se mueven más despacio que los fragmentos más pequeños cuando se desplazan en la electroforesis hacia el ánodo a través de un gel de agarosa?
2. ¿Qué estructura adopta el cromosoma de Escherichia coli?
3. ¿Qué niveles de organización estructural adopta el ADN en el núcleo de las células eucariotas?
El superenrollamiento del ADN en el cromosoma bacteriano
El cromosoma circular de E. coli está empaquetado en la región del nucleoide (1). Contiene unos 50 dominios de doble hélice de ADN superenrollados que se es-tabilizan mediante ARN y un con-junto de proteínas a las que se unen, similares a las histonas (2). El superenrollamiento del ADN circular en cada dominio (3) es si-milar al que se produce en un ca-ble de teléfono retorcido (4).
OBSERVA 1 2 3 4 Flagelo Pared celular Dominios de ADN Proteínas y ARN Enrollado Superenrollado Citoplasma Ribosomas
■
Empaquetamiento del ADN en el núcleo interfásico:
estructura de la cromatina
» Nucleosoma y «collar de perlas»
Para conseguir el máximo empaquetamiento, la doble hélice de ADN se enrolla periódicamente alrededor de grupos de proteínas del tipo de las his-tonas para formar estructuras que reciben el nombre de nucleosomas y constituyen la subunidad fundamental de la estructura de la cromatina.
Cada nucleosoma consta de un núcleo compuesto por un octámero de histonas
alrededor del cual se enrollan dos vueltas de ADN bicatenario. Los diferentes nucleosomas aparecen unidos por segmentos de ADN bicatenario, lo que con-fiere a este nivel de empaquetamiento el aspecto de un «collar de perlas», sien-do las perlas los nucleosomas y el hilo que las engarza, los segmentos de ADN. » Fibra de 30 nm (300 Å) o fibra cromatínica
La fibra de 30 nm (300 Å) ofibra cromatínicaes una estructura que repre-senta un nivel de plegamiento aún más complejo, caracterizado por el enro-llamiento del «collar de perlas» sobre sí mismo hasta adoptar la forma de
solenoides (aproximadamente seis nucleosomas por vuelta de solenoide).
En estas estructuras los segmentos de ADN internucleosómicos interaccionan con moléculas de histonas H1 dispuestas en el núcleo de los solenoides, y el resultado de este enrollamiento solenoidal es la formación de una fibra de cro-matina cuyo diámetro observado con el microscopio electrónico es de 30 nano-metros (300 ángstrom) (ver página 221).
Doble hélice de ADN: 2 nm de diámetro Nucleosoma: dos vueltas de ADN bicatenario alrededor del octámero de histonas: 11 nm de diámetro Nivel de empaquetamiento de «collar de perlas» Nivel de empaquetamiento de solenoideen la fibra cromatínica:30 nm de diámetro Nivel de empaquetamiento de
bucleso lazos radiales
Cromatina
Envoltura nuclear
Sección transversal
de un solenoide: disposición del «collar de perlas» alrededor de las histonas H1 ADN
Histona H1
Octámero de histonas
Núcleo interfásico
Núcleo mitótico
La fibra cromatínica es el nivel de empaquetamiento que presenta el ADN cuando se encuentra en estado de cro-matina, es decir, cuando se encuentra empaquetado en el interior del núcleo en interfase. Es en este estado cuando la cé-lula está activa y sus ge-nes resultan localiza-bles y accesilocaliza-bles por el aparato enzimáti-co encargado de la transcripción y de la replicación, co-mo vereco-mos en las unidades 12, 13 y 14.
■
Empaquetamiento del ADN en el núcleo mitótico:
estructura del cromosoma
Cuando la célula entra en mitosis (o en meiosis), el ADN se acaba de replicar y la
cromatina se organiza y se empaqueta aún más, en forma de enrollamientos de enrollamientos de enrollamientos... (ver página 222).
Lafibra de 30 nm se pliega en forma de grandes bucles o lazos radiales,y estos se compactan extraordinariamente y se enrollan para formar sucesiva-mente rosetones de bucles, espirales de rosetonesy, por fin, las cromátidas
de cada cromosoma. Con esto se logra un grado de compactación unas 10 000 veces mayor que la fibra de ADN desnudo.
Losbucles radiales,al parecer, constituyen regiones estables relacionadas con la transcripción, ya que ciertas zonas de estos bucles se descondensan y se convier-ten en zonas activas para la transcripción al final de la interfase y al comienzo de la mitosis o de la meiosis; pero, más tarde, pueden volver a condensarse de nuevo, sus genes quedan inaccesibles y ya no se pueden transcribir (ver unidad 12).
1. Ordena del más sencillo al más complejo los siguientes niveles de empa-quetamiento del ADN en células eucariotas: cromosoma, «collar de per-las», nucleosoma, rosetones de bucles, fibra cromatínica o de 30 nm, bucles o lazos radiales y espirales de rosetones.
2. ¿Qué diferente grado de empaquetamiento alcanza el ADN en el núcleo interfásico y en el núcleo mitótico de una célula eucariota?
Cromosomametafásico
formado por dos cromátidas: 1 400 nm de diámetro Espiral de rosetones: 700 nm de diámetro. Constituye el nivel de empaquetamiento de cada una de las dos
cromátidas del cromosoma
Nivel de empaquetamiento
de rosetones de bucles:
300 nm de diámetro
Célula en metafase. El empaquetamiento del ADN en las células eucariotas se encuentra en estado de cromosoma en células en mitosis o meiosis.
El ADN no siempre se presenta de la misma forma en todos los organismos; en general pueden distinguirse cuatro clases de ADN:
» Lineal unicatenario, se encuentra en algunos virus, como el bacteriófago MS2.
» Lineal bicatenario,se presen-ta en algunos virus bacteriófa-gos (T2, T4, etc.) y en el núcleo de las células eucariotas (aso-ciado a cierto tipo de proteí-nas). También constituye el cromosoma de algunas bacte-rias, como Borrelia burgdorfe-ri, causante de la enfermedad de Lyme.
» Circular unicatenario, propio de ciertos virus, como el -X-174 (1).
» Circular bicatenario, constitu-ye el cromosoma desnudo (1) y los plámidos (2) de la mayo-ría de las bacterias; también aparece en ciertos virus (SV40) y en las mitocondrias y cloro-plastos de las células eucario-tas. ¿LO SABÍAS? 0 600 600 1 200 1 200 1 800 nm Plásmido 1 1 2
4. Ácido ribonucleico (ARN)
Las moléculas de ARN son también biopolímeros y están formadas por el encadenamiento de ribonucleótidos-5’-monofosfato.
La estructura primariaen todos los tipos deARNes similar a la del ADN y está constituida por las uniones fosfodiéster 5’–3’ de los ribonucleótidos. Queda definida, igual que la estructura primaria del ADN, por la naturaleza y la secuen-ciade bases de sus nucleótidos. Las características químicas que diferencian el
ARN del ADN son las siguientes:
» Los nucleótidos del ARN poseen ribosa, mientras que los del ADN contienen
desoxirribosa. Esta característica permite que los grupos—OH en posición 2’ de los ribonucleótidos queden libres cuando se encadenan para dar molécu-las de ARN, lo que origina en la estructura primaria tensiones que hacen que el ARN sea químicamente menos estable que el ADN.
Por esta causa el ARN en disolución acuosa se hidroliza con mayor facilidad, y tal vez por ello la información genéticase encuentra almacenada en el ADN,
que es una molécula más estable y mejor adaptada para guardar información durante largos períodos de tiempo (aunque parece ser que en el comienzo de la vida fueron las moléculas de ARN las encargadas de conservar la informa-ción genética).
» Otra de las diferencias reside en la naturaleza de las bases nitrogenadas, pues si bien tres de ellas, adenina, guanina y citosina, se encuentran en ambos ácidos nucleicos, en el ARN en lugar de timina existe uracilo (al igual que la timina, su base complementaria también es la adenina). Además, en ciertas clases de ARN, particularmente en el ARN de transferencia (ARNt),
se encuentran, aunque en menor proporción, otros componentes nitrogena-dos; entre los más característicos están el pseudouracilo (), la dimetilguani-na (GdiMe), la hipoxantina (Hi), la metilhipoxantina (HiMe), el dihidrouraci-lo (UH2),la ribotimidina (T), etc.
» Una última característica diferencial consiste en que las moléculas de ARN sue-len tener únicamente estructura primaria, aunque en algunos casos existen ciertas regiones en una misma cadena que poseen secuencias complementa-rias capaces de aparearse y formar estructuras secundarias (doble hélice) y
terciarias.Solo se ha descrito una estructura en doble hélice de ARN bicate-nario en un tipo de virus denominadoreovirus (clase III).
Existen determinados ARN que constituyen el genomade ciertos virus. Otros ARN manifiestan actividad catalítica,es decir, se comportan como enzimasy se denominan ribozimas:intervienen en determinados procesos relacionados con la maduración de las cadenas del ARN y en la catálisis del enlace peptídico en el ribosoma (ver página 298).
Recientemente se ha descubierto que diversos tipos de pequeñas moléculas de
ARN interferente (ARNi),de una longitud entre 21-25 nucleótidos, están implica-das en el control de una amplia variedad de procesos del desarrollo y la diferen-ciación celular. El papel que desempeñan estos ARNi es cada vez más importan-te, ya que realizan diversas tareas relacionadas con el control de la expresión génica en la célula: en la mayoría de los casos inducen el corte y la posterior degradación de los ARNm, o bien inhiben la traducción de dichos ARNm. Estos ARNi también actúan en la degradación de ARN procedentes de virus y, por tanto, en la defensa antiviral (ver página 281).
Como criterio declasificaciónde los ARN se adopta la masa molecular media de sus cadenas, cuyo valor se deduce del coeficiente de sedimentación(está en fun-ción de la velocidad con que sedimentanlas moléculas sometidas a un campo centrífugo). El coeficiente de sedimentación, que es una medida cualitativa de su masa molecular y de las dimensiones de la molécula, se expresa en unidades
Svedberg (S),nombre del científico sueco que puso a punto las técnicas de cen-trifugación analítica.
Estructura primaria del ARN. Esquele-to de polirribosa-fosfaEsquele-to y secuencia de bases.
La centrifugación analítica en gra-diente de densidad de cloruro de ce-sio permite separar diferentes com-ponentes moleculares en función de su coeficiente de sedimentación ex-presado en unidades Svedberg.
Adenina Uracilo Citosina Guanina Extremo 3’ Ultracentrífuga ADN Proteína Proteína = 1,65 Densidad = 1,80 ADN ARN ARN Extremo 5’ Esqueleto de polirribosa-fosfato Puente de fosfodiéster ⎧ ⎪ ⎪ ⎨ ⎪ ⎪ ⎩
4.1
ARN mensajero (ARNm)
Las moléculas de ARNmson largas cadenas de polinucleótidos de tamaño variable que solo presentan estructura primaria,por lo que tienen aspecto filamentoso. El nombre de «mensajero» hace referencia a la función que des-empeña, ya que cada ARNm contiene la información necesaria para la sínte-sis de una proteína determinada.
Existe una correspondencia lineal entre la secuencia de bases del ARNm y la secuencia de aminoácidos de la proteína que se forma (ver página 292). Las molé-culas de ARNm presentan características diferentes en procariotas y en eucariotas: » En los procariotas, como, por ejemplo, las bacterias, los ARNm poseen en el
extremo 5’ un grupo trifosfato.
» En los eucariotas, por su parte, la mayoría de los ARNm poseen en el extremo 5’ una especie de «caperuza» compuesta por un residuo de metil-guanosina unida al grupo trifosfato, y en el extremo 3’ presentan una «cola»formada por un fragmento de unos 150 a 200 nucleótidos de adenina denominada «cola» de poli A.
Además, estos ARNm de eucariotas contienen secuencias de bases que codifi-can para la síntesis de proteínas (exones) intercaladas con otras secuencias que no contienen información para la síntesis proteica (intrones); es decir, la informa-ción genética aparece fragmentada, por lo que requieren un proceso de madu-raciónantes de convertirse en ARNm funcionales (ver página 276). Una caracte-rística peculiar de los ARNm es su corta vida, pues pueden transcurrir tan solo unos pocos minutos desde el momento de su síntesis hasta que son degradados.
4.2
ARN nucleolar (ARNn)
El ARNnes un ARN de elevado peso molecular (45 S), con estructura secun-daria y terciaria en algunas regiones de la molécula, que se sintetiza en el nucleolo de las células eucariotas y, en realidad, no es más que el precursor de diferentes tipos de ARN ribosómico (ARNr).
En efecto, la larga cadena de ARN nucleolar 45 S se rompe en lugares específi-cos y da lugar a diferentes fragmentos de ARNr de las subunidades grande y pequeña del ribosoma.
4.3
ARN ribosómico (ARNr)
Los ARNr son moléculas de diferentes tamaños, con estructuras secundaria y terciaria en algunas regiones de la molécula, que participan en la forma-ción de las subunidades ribosómicas al unirse a más de setenta proteínas. En los organismos procariotasexisten tres tipos de ARNr, 23 S, 16 S y5 S; mien-tras que en los organismos eucariotashay cuatro tipos de ARNr: 28 S, 18 S, 5,8 S y 5 S(ver página 156).
Los distintos tipos de ARNr contribuyen a que las subunidades grande y peque-ña de los ribosomas posean una estructura acanalada, con hendiduras o sitios capaces de albergar simultáneamente a una molécula de ARNm(la subunidad pequeña) y a los diferentes aminoácidos unidos a los ARNt que participaran en la síntesis de una cadena polipeptídica (la subunidad grande).
Además, el ARNr 23 S en procariotas y el ARN 28 S en eucariotas tienen actividad de ribozimasy actúan como agentes catalíticos en la formación del enlace pep-tídico durante la síntesis de las proteínas.
1. ¿En qué se diferencia el ADN del ARN?
2. ¿Qué son las ribozimas? 3. ¿Qué son las unidades
Svedberg y para qué se utilizan?
ARN mensajeros (ARNm) de procario-tas (bacterias) (1) y de eucarioprocario-tas (2).
Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli.
1 2 Exones
Intrones Cola de poli A
4.4
ARN de transferencia (ARNt)
Los ARNt son moléculas pequeñas (entre 80 y 100 nucleótidos), con estruc-turas secundaria y terciaria, encargadas del transporte de los aminoácidos hasta los ribosomas durante la síntesis de las proteínas.
Cada ARNt presenta estructura secundariaen algunas regiones de su molécula que contienen secuencias de bases complementarias y permiten el apareamien-to y la consiguiente formación de una doble hélice;las zonas que no se aparean adoptan el aspecto de bucles,como una hoja de trébol. Aunque, en realidad, el plegamiento es mucho más complejo y ofrece una imagen tortuosa y retorcida, que en nada se parece a una hoja de trébol, al adoptar la estructura terciariaque tiene forma de L, como un bumerán.
Otra característica de los ARNt es la de contener aproximadamente un 10 por 100 de bases procedentes de modificaciones en las cuatro bases normales (A, G, C y
U), como el pseudouracilo y otras ya mencionadas anteriormente.
5. Funciones biológicas de los ácidos
nucleicos
La estructura en doble hélice del ADN refleja su función. El ácido desoxirribonu-cleico es una macromolécula que desempeña dos funciones de trascendental importancia para todos los seres vivos: se replica y guarda la información genética. » La doble hélice del ADN se replica. Para ello, en primer lugar, se libera de las histonas y luego se abre, como si fuera una cremallera, de manera que cada una de las dos hebras del ADN sirve de molde para que se sintetice su cade-na complementaria (el codigo de complementariedad es A = T y G ⬅C). Así, cada molécula de ADN puede originar dos réplicas idénticas de sí misma, con la misma composición y secuencia de bases que la molécula original, que se repartirán una a cada célula hija.
Gracias a esta propiedad, cada célula, antes de dividirse, hace una copia de sus genes con el fin de que cada célula hija contenga la misma dotación genética que la célula madre; de esta manera, la información genética se transmite de generación en generación. (Estos procesos se estudiarán con más detalle en la unidad 14).
1. ¿Qué tipos de bases pecu-liares presentan los ARNt que no existen en otros ARN?
2. ¿Dónde se localizan el bra-zo aceptor y el anticodón en los ARNt y qué funcio-nes desempeñan?
3. ¿Qué funciones biológicas desempeñan los ácidos nucleicos?
En la estructura secundaria de los ARNt se distinguen las siguientes características:
» Brazo aceptorformado por el extremo 5’ y el extremo 3', que en todos los ARNt posee la secuencia CCA, cuyo grupo —OH terminal sirve de lugar de unión con el aminoácido.
» El bucle(o brazo) TψC,que actúa como lugar de recono-cimiento del ribosoma.
» El bucle(o brazo) D,cuya se-cuencia es reconocida de manera específica por una de las veinte enzimas, llama-das aminoacil-ARNt sinteta-sas, encargadas de unir cada aminoácido con su corres-pondiente molécula de ARNt.
» El buclesituado en el extre-mo del brazo largo del bu-merán, que contiene una secuencia de tres bases lla-mada anticodón. Cada ARNt «cargado» con su co-rrespondiente aminoácido se une, mediante la región del anticodón, con tripletes de bases del ARNm (tres bases del ARNm definen un triplete o codón) en el pro-ceso de la traducción de la información genética que conduce a la síntesis de las proteínas, como veremos en la unidad 13. Brazo aceptor Bucle (o brazo) D Bucle D Bucle (o brazo) TC Bucle TC Sitio de unión del aminoácido Brazo aceptor Anticodón Anticodón Sitio de unión del aminoácido
» El ADN de los cromosomas es el material del que están for-mados los genes. Contiene la información necesaria que per-mite la síntesis de todas las proteínas de un organismo, que vienen a ser como los robots encargados de ejecutar sus órdenes. Pero esta información genética heredada de nues-tros progenitores debe descodificarse para poder ser utiliza-da por la célula y este proceso se realiza en dos fases:
› Transcripción de la información genética contenida en un gen. Se sintetiza una cadena de ARN mensajero (ARNm)
utilizando como molde una de las hebras del ADN del gen. Se denomina ARNm porque en las células eucariotas sale del núcleo y se dirige al citoplasma llevando el mensaje genético para que se sintetice una proteína. La transcrip-ción utiliza una clave de complementariedad de bases simi-lar a la que vimos en la replicación, pero teniendo en cuen-ta que la cadena de ARNmsintetizada tiene uracilo (U)en lugar de timina (T), la complementariedad será: G ⬅C y A = U (ver unidad 12).
› Traducción del mensaje contenido en la secuencia de bases del ARNm correspondiente a un gen. Al igual que una banda magnética o un código de barras, el mensaje es captado por una especie de cabezal de lectura, llamado
ribosoma, y convertido en la secuencia de aminoácidosde una proteína. En este proceso se utiliza un diccionario uni-versal, conocido como código genético, que asigna a cada grupo de tres bases del ARNm (denominado triplete o
codón) uno de los veinte aminoácidos de las proteínas. El ribosoma recorre la molécula de ARNm, un codón tras otro, y va incorporando los aminoácidos,que llegan al ribo-soma transportados por moléculas de ARN de transferen-cia(ARNt). De esta forma, los aminoácidos se incorporan de uno en uno a la proteína que se está formando y en el orden que indica la secuencia de bases del ARNm, es decir, la sucesión de codones del ARNm (ver unidad 13).
Los procesos de replicación, transcripción y traducción, se resumen en lo que se ha dado en llamar el «dogma central de la biología molecular»: la secuencia de bases de un seg-mento de ADN (un gen) se replica (1) y también se transcri-be en la secuencia de bases de una molécula de ARNm (2) que, a su vez, se traduce en la secuencia de aminoácidos de una proteína (3).
SÍNTESIS: Diferencias entre ADN y ARN
ADN ARN Tipo de pentosa Bases nitrogenadas Estructura Niveles de complejidad estructural Función •Desoxirribosa •A, C, G, T
•Bicatenario (lineal o circular), excepto en ciertos virus que es monocatenario (lineal o circular).
•ADN procariota: estructura primaria y secun-daria (enrollamiento en superhélice).
•ADN eucariota: estructura primaria, secunda-ria y otros niveles de complejidad: nucleoso-ma, «collar de perlas», fibra cromatínica o de 30 nanómetros, dominios estructurales en for-ma de bucles radiales, rosetón de bucles ra-diales, espiral de rosetones y, por último, cro-mosoma.
•Replicación: la información genética se trans-mite de generación en generación.
•Almacenamiento de la información genética.
•Transcripción (síntesis de ARN).
• Ribosa
• A, C, G, U
• Monocatenario, excepto en ciertos virus que es bicatenario.
• ARNm: estructura primaria.
• ARNn, ARNr y ARNt: estructura primaria, se-cundaria y terciaria (en algunas regiones de la molécula que presentan secuencias de bases complementarias).
• ARNm: se traduce y da lugar a la secuencia de aminoácidos de una proteína.
• ARNn: precursor de los ARNr.
• ARNr: forma parte de las subunidades ribosó-micas.
• ARNt: transporta aminoácidos hasta los ribo-somas en la síntesis de las proteínas.
• ARNi: controla la expresión de los genes.
1 2 3 ADN Ribonucleótidos Envoltura nuclear Codón Anticodón Ribosoma TRADUCCIÓN ARNt Aminoácidos ARNr ARNt ARNm Proteína Ribosoma REPLICACIÓN TRANSCRIPCIÓN
Objetivos
Romper o lisar con detergentes la pared celular, la mem-brana plasmática y la memmem-brana nuclear para dejar libre el ADN y hacer que precipite en alcohol.
Materiales
Una cebolla, cuchillo, batidora eléctrica con el vaso, vasos de precipitado de 250 y de 500 mL, tubos de ensayo, deter-gente lavavajillas, baño de agua a 60-65 ºC, termómetro, embudo, papel de filtro, nevera y hielo triturado, agua des-tilada, sal común, bicarbonato sódico, enzimas proteasas, alcohol etílico muy frío, palillos largos de madera.
Procedimiento
1. Prepara la solución de lisis con los siguientes ingre-dientes y viértela en el vaso de la batidora:
» 100 mL de agua, si es posible destilada y, si no, mi-neral. No usar agua del grifo.
» 3 g de NaCl o de sal de mesa.
» 5 g de bicarbonato sódico.
» 10 mL de detergente líquido de lavavajillas. 2. Corta una cebolla de tamaño medio en trozos grandes
y colócalos en el vaso de la batidora que contiene la solución de lisis. Emplea la batidora para triturar la cebolla, pero no la mantengas en marcha durante más de 10 segundos seguidos para evitar el calentamiento (a).
3. Transfiere el contenido triturado del vaso de la batido-ra a un vaso de precipitado de 500 mL e introdúcelo en un baño de agua caliente, entre 60 y 65 ºC, durante 15 minutos (b).
4. Saca el vaso del baño de agua y filtra su contenido. Para ello, coloca un filtro cónico en otro vaso de preci-pitado de 250 mL (o emplea un embudo y una serville-ta de papel); a continuación, vierte la cebolla triturada y lisada en el filtro. Deja gotear durante un rato y si es necesario exprime el filtro, pero no dejes que caigan sólidos al vaso de 250 mL (c).
5. Introduce el vaso de 250 mL con el filtrado en un reci-piente con hielo picado durante unos minutos para que se enfríe, y añade al filtrado un comprimido de despro-teinización, de los utilizados para limpiar las lentillas, o bien, añade 3 cucharaditas de café de zumo de piña o papaya y mézclalo bien (contienen enzimas proteasas que rompen las proteínas de la disolución y se eliminan las enzimas que rompen las cadenas de ADN) (d). 6. Vierte 20 mL del extracto de cebolla lisado y
desprotei-nizado en un tubo de ensayo. Sujeta el tubo formando un ángulo de 45º y con mucha lentitud añade un volu-men equivalente de alcohol etílico muy frío (recién sacado de la nevera o del hielo) resbalando por la cara interna del tubo y evitando que se mezclen los dos líquidos (e).
7. Observa el ADN como una nube de hilillos finos y vis-cosos en la interfase, la zona donde los dos líquidos están en contacto.
8. Introduce una varilla delgada de vidrio o un palillo largo de madera en el tubo de ensayo hasta que su extremo esté justo debajo de la interfase. Da vueltas al palillo subiendo y bajando por las dos fases. El ADN se enrollará al palillo (f).
9. Lleva el palillo con el ADN enrollado a otro tubo que contenga alcohol. Gira el palillo para que se libere el ADN en el alcohol. Repite la operación para trasladar más cantidad de ADN. Observa el color y la forma de las fibras.
Laboratorio y procedimientos
Aislamiento de ADN de cebolla
500 mL 60-65 °C 250 mL 20 mL de extracto ADN Proteasa Hielo Etanol muy frío a b c d e f
Actividades finales
1. Indica si las siguientes proposiciones son verdaderaso falsas: a) A / T = 1. b) G / T = 1. c) A + G / T + C = 1. d) A + T G + C. e) A + T / G + C = 1.
2. ¿Qué diferencia hay entre nucleósido y nucleótido? 3. ¿En qué se basa el modelo de Watson y Crick de la
do-ble hélice del ADN y cuáles son sus características? 4. ¿A qué tipo de ácido nucleico corresponde la
si-guiente estructura?
5. Con respecto a la fórmula adjunta, contesta a las pre-guntas siguientes:
a) ¿De qué tipo de molécula se trata? b) ¿Cuáles son sus unidades estructurales? c) ¿De qué macromolécula forma parte?
d) ¿Qué funciones desempeña esta macromolécula? 6. ¿Cómo resuelven las células procariotas el problema
del empaquetamiento del ADN en su interior? 7. ¿Qué es el ARN nucleolar? ¿Dónde se sintetiza y qué
función desempeña?
8. ¿Qué se entiende por «dogma central de la biología molecular»?
9. Explica los distintos niveles de complejidad o tipos de conformación que adoptan las moléculas de los diferentes ARN.
10. Indica las diferencias entre el ADN y el ARN: a) De composición.
b) Estructurales. c) Funcionales.
11. Observa el esquema adjunto y responde a las si-guientes cuestiones:
a) ¿A qué clase de molécula corresponde? b) ¿Qué tipos de conformación espacial adquiere? c) ¿Qué elementos estructurales se destacan en
estas conformaciones?
d) ¿Qué función desempeña esta molécula?
12. Describe las formas en las que se empaqueta el ADN en las células eucariotas. ¿Cómo se encuentra el ADN durante la división celular? ¿Y durante la intefa-se celular?
13. Observa la siguiente tabla, que muestra las propor-ciones de las bases nitrogenadas del ADN o ARN en algunos organismos, y contesta a las siguientes cues-tiones:
a) ¿Se cumplen en todos los casos las reglas de Char-gaff? Si no es así, ¿a qué crees que se debe? b) ¿Cuál de estos ADN crees que tendrá mayor
tem-peratura o punto de fusión? ¿Cuál es la causa?
ADN A G C T Timo de bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 Germen de trigo 27,3 22,7 16,8 27,1 Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 ØX174 24,3 24,5 18,2 32,3 ARN A G C U Reovirus 28,0 22,3 22,0 27,9 Adenina Citosina Guanina
Debate y opina
Webquest
«Los investigadores de todas las disciplinas tienen el lema “publica o muere”. Tan pronto como Watson y Crick termina-ron su modelo del ADN, de inmediato publicatermina-ron un ensayo de una página que conmovió al mundo. Recibieron poca atención todos los demás que de una u otra manera habían contribuido. Una de esas personas fue Rosalind Franklin a quien recientemente empieza a reconocérsele su aportación. Rosalind Franklin llegó al King’s Laboratory en Londres con credenciales impresionantes. Había inventado un método perfeccionado de difracción de rayos X mientras estudiaba en París la estructura del carbón. Adoptó un nuevo enfoque matemático para interpretar las imágenes de la difracción y, como Pauling, había diseñado modelos moleculares tridimen-sionales. Ahora le habían encargado crear y dirigir un moder-no laboratorio de cristalografía con rayos X. Su labor consistía en investigar la estructura del ADN.
... Nadie se molestó en decirle a Wilkins lo que haría esta mujer; supuso que era una técnica contratada para que hicie-ra el thicie-rabajo de cristaloghicie-rafía con hicie-rayos X, pues él no sabía hacerlo. Y así se desató una encarnizada lucha. Wilkins le parecía demasiado quisquilloso a Franklin. A él le molestaba la falta de deferencia por parte de Franklin...
Cinco meses más tarde Franklin dio una conferencia sobre lo que había descubierto hasta ese momento. El ADN, asegu-ró, tal vez tiene dos, tres o cuatro cadenas paralelas enrolla-das en una espiral, con grupos de fosfato proyectándose hacia afuera.
Gracias a sus conocimientos de cristalografía Crick habría reconocido la importancia de su informe, en caso de haber
estado allí (un par de cadenas orientadas en sentidos opuestos sería lo mismo aun con una inclinación de 180 grados). ¿Dos pares de cadenas? No. Lo excluía la den-sidad del ADN. Pero, ¿un par de cadenas? ¡Sí!, Watson estaba entre la audiencia pero sin saber a qué se refería Franklin.
Tiempo después Franklin produjo su excelente imagen de las fibras húmedas de ADN mediante la difracción de rayos X. La imagen casi gritaba ¡ESPIRAL! También calculó la longitud y el diámetro del ADN. Pero como llevaba mucho tiempo tra-bajando con fibras secas, decidió no investigar el significado de los nuevos datos. Wilkins lo hizo.
En 1953, sin que lo supiera Franklin, permitió a Watson ver la imagen y recordó lo que Franklin había expuesto más de un año antes. Cuando Watson y Crick se concentraron en esos datos, obtuvieron el último trozo de información que necesi-taban para construir un modelo aceptable del ADN: un modelo con dos cadenas enrolladas en forma de espiral que se dirigían a sentidos opuestos.»
C. STARR YR. TAGGART.
Biología. Ed. Thomson.
» ¿Crees que Rosalind Franklin hubiera merecido compartir el premio Nobel, junto con Watson y Crick?
Tarea
Elabora un trabajo sobre los aspectos que consideres más destacables de los ácidos nucleicos en formato Word o en PowerPoint. Incluye en él fotografías, gráficos, animacio-nes o secuencias de vídeo.
Proceso
Reúne información sobre los siguientes temas:
» Nucleótidos nucleicos y no nucleicos.
» Estructura primaria y secundaria del ADN.
» Desnaturalización del ADN y punto de fusión.
» Descubrimiento de la doble hélice del ADN.
» Empaquetamiento del ADN en procariotas y eucariotas.
» Estructura del ARN y tipos de ARN.
» Funciones que desempeñan los ácidos nucleicos.
Recursos
Consulta libros de la biblioteca, prensa y revistas, y visita las siguientes páginas web:
Biología 2.º de Bachillerato
http://web.educastur.princast.es/proyectos/biogeo_ov/ 2BCH/INDICES/apuntes_pdf.htm
Estructura de los ácidos nucleicos
http://www.ucm.es/info/genetica /grupod/Estruadn/estruadn.htm El cromosoma eucariótico http://www.ucm.es/info/genetica /grupod/Cromoeuc/cromoeuc.htm Biomodel http://biomodel.uah.es/ Ácidos nucleicos http://www.ehu.es/biomoleculas/an/tema12.htm
UNA MIRADA HACIA ATRÁS
UNA MIRADA HACIA DELANTE
■ En el bloque I has aprendido que estructuras, propiedades y funcionesson tres términos estrechamente relacionados. Desde la idoneidad del carbono hasta la doble hélice del ADN, se repite la misma idea: la confor-mación espacial o geométrica que adopta una molécula es responsable, en buena parte, de las propiedades fisicoquímicas que manifiesta que, a su vez, explican su actividad biológica.
■ Por el hecho de que el átomo de carbono presenta una particular confi-guración electrónica, es capaz de formar enlaces covalentes consigo mismo o con otros elementos y originar así una enorme variedad de molé-culas orgánicas. Y la peculiar disposición tetraédrica de los orbitales sp3
del átomo de oxígeno junto con su carácter electronegativo son la causa de que la molécula de agua adopte determinada conformación espacial, adquiera polaridad y presente una estructura reticular que justifica sus propiedades fisicoquímicas peculiares que, a su vez, determinan las fun-ciones biológicas que desempeñan.
■ Debido a que los monosacáridos presentan átomos de carbono asimétri-cos, algunos azúcares como la glucosa pueden adoptar configuración o
, lo que decide que unos polisacáridos sean fácilmente hidrolizables, como el almidón, y otros sean muy resistentes a la hidrólisis, como la celu-losa. Y el que los aminoácidos se unan en secuencias específicas determina la disposición particular de las hélices , de las láminas y de las estructu-ras terciarias y cuaternarias de las proteínas, que son responsables de su funcionalidad biológica y de su capacidad para unirse específicamente con-sigo mismas o con otras moléculas: la enzima con su sustrato, el anticuerpo con su antígeno...
■ Por último, la conformación espacial que adopta el ADN en forma de doble hélice y el apareamiento específico y la complementariedad entre sus bases, convierten a estas moléculas —y también a los ARN— en los soportes idóneos para el almacenamiento y la expresión de la información genética que se transmite fielmente de generación en generación.
■ El estudio sistemático y descriptivo de los componentes moleculares de la célula que acabas de realizar tal vez genere una imagen estática de la materia viva. Sin embargo, la célula viva está constituida por materia en continuo dinamismo, cuyos componentes forman un sistema que, gracias al aporte continuo de energía y materias primas, mantiene y aumenta su complejo grado de organización.
■ En el bloque II estudiarás los aspectos dinámicos de la materia viva, es decir, los diferentes modelos de organización celular, mostrando, de nuevo, la íntima relación entre estructura y función, pues las distintas estructuras celulares son las que posibilitan que la energía y las materias primas sean captadas, transportadas, almacenadas y utilizadas mediante una serie de cambios químicos complejos que constituyen el metabolis-mo celular, fuente de la vida.