1 UNIVERSIDADE DOS AÇORES
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
Avaliação da qualidade dos ovos e das
larvas de
Solea senegalensis
(Kaup,1858)
através da manipulação alimentar dos seus
reprodutores
Nédia Remália Delma Matusse
Tese de Mestrado em Engenharia Zootécnica
Orientadores:
Doutora Florbela Soares – IPIMAR-Olhão
Professor Doutor Joaquim Fernando Moreira da Silva – Universidade dos
Açores
ANGRA DO HEROÍSMO 2012
2
Agradecimentos
Quando atingimos um objetivo, notamos o encaixe perfeito de algumas
peças, como um quebra-cabeça. Somente com o suporte de família e amigos é
que obtemos êxito.
Primeiramente devo agradecer a Deus por tudo, principalmente pela
vida, saúde e juízo.
Ao IPAD (Instituto Português de Apoio ao Desenvolvimento), por ter
apostado em mim e contribuido financeiramente para os meus estudos em
Portugal.
A Universidade dos Açores, por me ter concedido esta oportunidade de
cursar ao Mestrado em Engenharia Zootécnica.
Ao Doutor Pedro Pousão Ferreira responsável da EPPO- Estação de
Piscicultura de Olhão por me ter concedido a oportunidade de realizar o ensaio
para esta tese durante 10 meses.
À orientadora Doutora Florbela Soares, pela orientação, ajuda material,
interesse e disponibilidade demonstrada, importantes para a realização desta
tese.
Ao orientador Professor Doutor Joaquim Moreira, por toda ajuda
acadêmica durante o mestrado.
A todos os colegas da EPPO-Olhão, pela simpatia e ajuda prestada, em
espécial a Ana Margarida Gamboa pela colaboração, partilha de
conhecimentos e pelo excelente ambiente de trabalho. A sua ajuda foi Divina.
Os meus agradecimentos.
À Doutora Laura Ribeiro e a Maria Santos (Milu) pela simpatia e ajuda
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Ao colega Miguel Sáenz, pelas inumeras e generosas ajudas científicas
(su paciencia y amizad conmigo no tiene precio).
A amiga Daniela Boanares, pela ajuda inicial de material.
A amiga Sandra e ao casal Heliodoro pela contribuição na revisão
ortográfica, apoio e muita paciência.
Aos meus pais Delma Fugel e André Matusse pela presença constante,
paciência e apoio. Vocês são os melhores pais que poderia sonhar ter.
A paixão da minha vida, meus dois irmãos Adriel Timótio e Eunício Joel,
pelo carinho amizade e compreensão. Sem vocês a vida teria muito menos
brilho.
A familia Buscapé (Mara, Eduardo e Johana) pela adoção em vossa
família durante o tempo em que estive em Olhão. As palavras faltam-me para
expressar toda a minha gratidão. Fostes para mim uma nova família, irei
guardar-vos para todo o sempre, no meu coração.
A familia Lima pelo acolhimento, simpatia e amizade demostrado no
pequenoperiodo que passei na Ilha Terceira (Porto Judeu), mas que para mim
foi como uma vida. O meu muito obrigado.
Aos verdadeiros amigos por compreenderem a distância e mesmo assim
se fazerem presentes em minha vida.
Enfim, a todos amigos e conhecidos que não mencionei, mas que
fizeram parte da minha história em Portugal (Angra do Heroismo e Algarve -
Olhão), que me fizeram sorrir em vários momentos, a todos os meus mais
sinceros agradecimentos.
“Eu poderia suportar, embora não sem dor, se tivessem morrido todos os meus amores, mas enlouqueceria se morressem todos os meus amigos!" - Fernando Pessoa.
5 “ O pensamento é o unico lugar onde ainda estamos seguros, onde nossa loucura é permitida e todos os nossos atos são inocentes."
Martha Medeiros
“He who gets wisdom loves his own soul; He who keeps understanding will find good”.
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Resumo
Este trabalho tem como objectivo a avaliação da qualidade e quantidade
dos ovos e larvas de linguados Solea senegalenis (Kaup, 1858), após terem os
progenitores sido alimentados com uma dieta diferenciada. Para isso, um total
de quarenta e quatro reprodutores desta espécie foram distribuidos em dois
tanques externos e divididos na proporção de (1:1) machos e fêmeas. Aos dois
grupos foram se administradas as mesmas quantidades diárias, com dietas
diferenciadas no teor dos ácidos gordos essenciais (EPA) e em ácido
docosahexaenóico (DHA). Ao primeiro grupo de peixes foi fornecido a dieta
enriquecida (DE) que continha 0,81% de EPA e 1,05% de DHA a mais que a
dieta controlo (DC) fornecida ao segundo grupo de peixes.
Durante o ensaio decorrido nos meses de setembro a janeiro foi também
avaliada a importância e influência de outros parâmetros de qualidade dos ovos
e larvas, tais como a periodicidade e peso total das posturas, tamanhos, pesos
secos, níveis de atividade proteica e os efeitos da temperatura sobre os ovos e
o desenvolvimento das larvas até a abertura da boca.
A produção total de ovos foi obtida em maior quantidade para os peixes
alimentados com a dieta enriquecida, tendo neste grupo sido observadas
quarenta e sete posturas, trinta e duas mais que as observadas nos peixes
pertencentes ao grupo controlo. Os ovos pertencentes ao tanque alimentado
com a dieta enriquecida apresentaram também melhores taxas de eclosão que
variando entre 40,1% e 100% para o tanque DE, 31,1% e 95,7% para o tanque
7
A temperatura durante o período de desova variou entre 16,7 e 21,7°C, e
não tendo sido manipulada para que não houvesse oscilação dos valores.
As larvas do tanque DC, foram provenientes de ovos com diâmetros e
peso seco maiores que os do tanque DE, e em sequência tiveram maiores
comprimentos em 0,12 mm e maior peso seco, embora não tenha tido as
melhores taxas de eclosão ao longo do tempo.
Na avaliação dos níveis de atividade das catepsinas do tipo B e D nos
ovos viáveis e inviáveis provenientes do tanque DE, constou se que houve
maior atividade da catepsina D nos ovos inviáveis e menor atividade nos ovos
viáveis em relação a catepsina B, sendo que não houveram diferenças
significativas nos níveis de atividade da catepsina B entre os ovos viáveis e nos
inviáveis.
Tendo em conta as condições em que este trabalho foi realizado,
podemos concluir que a administração com uma dieta enriquecida em
DHA/EPA durante o período reprodutivo dos linguados, melhora a qualidade e
a quantidade de posturas, condicionando quer a disponibilidade de larvas quer
8
Abstract
This work aims to evaluate the quality and quantity of eggs and larvae of
Solea senegalenis, (Kaup, 1858), after their parents have been fed with a different diet. To do this, a total of forty-four breeding of this species were
distributed in two external tanks and divided in the ratio of (1:1) male and
female. The two groups were given the same amounts up daily diets differed in
content of essential fatty acids (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA). The
First group of fish was administered with enriched diet (DE) with 0,81% of
essential fatty acids (EPA) and 1,05% of Docosanhexaenoic acid (DHA), more
than control diet (DC) supplied to the second group of fish.
During the essay elapsed in the months of September to January was
also assessed the importance and influence of other parameters of quality of
eggs and larvae, such as the periodicity and total weight of postures, sizes, dry
weights, levels of protein activity and effects of temperature on the eggs and the
development of the larvae until the opening of the mouth.
The total Production of eggs was in greater quantity for the fish fed by the
diet enriched and these also presented best rates of outbreak that varied
between 40,05% and 100% for the DE tank, 31,11% and 95,69% for the tank
DC.
The temperature during the spawning varied between 16,7 and 21,7°C,
and has not been manipulated so that there would not be fluctuation of the
values.
The Larvae of the tank DC were hatched from eggs with diameter higher
than those of DE, dry weight of, and in larger lengths and larger sequence had
9
accomplished, we can conclude that the administration with diet enriched during
the reproductive period of sole, improves the quality and quantity of postures,
making either the availability of larvae want their quality at an early stage.
In assessing of activity levels of cathepsins B and D type in viable and
unviable eggs from the tank DE, consisted that there was increased activity of
cathepsin D in eggs unviable and viable eggs in lower activity against cathepsin
B, and not there were significant differences in activity levels of cathepsin B
between viable and non-viable eggs.
Considering the conditions under which this work was performed, we
conclude that administration with a diet enriched in DHA/EPA during the
reproductive period of the sole senegalensis, improves the quality and quantity
of postures, condition necessary of larvae for their quality an early stage of
development.
Key-words: Solea senegalensis; flatfish; fatty acids; DHA/EPA; intensive produticions
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Índice Geral
Agradecimentos ... 2 Resumo ... 6 Abstract ... 8 Índice Geral ... 10Lista de símbolos e abreviaturas ... 12
I. Introdução... 15
II. Revisão Bibliográfica ... 18
2.1 Evolução da Aquacultura ... 18
2.1.1 Aquacultura em Portugal ... 19
2.2 Biologia do Solea Senegalensis Kaup, 1858 ... 20
2.2.1 Taxonomia e distribuição geográfica ... 20
2.3 Linguado em Aquacultura ... 23
2.3.1 Reprodução do Linguado ... 24
2.3.2 Ovos e larvas de Linguado ... 27
2.3.2.1. Ação das catepsinas nos ovos ... 32
2.3.2.2 Desenvolvimento inícial das larvas ... 35
2.3.3 Nutrição dos Linguados ... 36
2.3.3.1 Função dos lípidos na alimentação ... 38
2.3.3.2 Regime alimentar de reprodutores da Solea segalensis ... 41
III. Material e Métodos ... 44
3.1 Descrição do ensaio ... 44
3.1.1 Acondicionamento dos reprodutores ... 44
3.1.2 Parâmetros físico-químicos ... 46
3.1.3 Recolha dos ovos e caracterização das posturas ... 47
11
IV. Resultados ... 54
4.1 Condições ambientais dos tanques e alimentação dos reprodutores ... 54
4.2 Efeito das diferentes dietas (DE e DC) na quantidade e qualidade das posturas de S. senegalensis ... 55
4.2.1 Taxas de eclosão... 56
4.2.2 Tamanhos dos ovos e das larvas ... 59
4.2.3 Qualidade dos ovos através da atividade catepsina B e D... 62
4.3 Ensaio à temperatura de 17ºC desde a eclosão dos ovos até à abertura da boca, com ovos provenientes dos tanques DE e DC ... 65
V. Discussão ... 69
VII. Conclusões ... 78
VIII. Referências Bibliográficas ... 79
IX. Anexos ... 87
9. 1 Anexo I ... 87
12
Lista de símbolos e abreviaturas
ARA – Arachidonic Acid (ácido araquidónico)
°C – graus Celsius
DAE – Dia após a eclosão
DHA – Docosahexaenoic Acid (ácido docosahexaenóico)
DC – Dieta Controlo (ração comum oferecida ao segundo grupo de
reprodutores de linguados durante o presente trabalho)
DE – Dieta Enriquecida em DHA/EPA (ração oferecida ao primeiro grupo
de reprodutores de linguados durante o presente trabalho)
DGPA – Direção Geral das Pescas e da Aquacultura
EFA – Essential Fatty Acids (ácidos gordos essenciais)
EPA – Eicosapentaenoic Acid (ácido eicosapentaenóico)
FA – Fatty acid (Ácido gordo)
FSH – Follicle-stimulating hormone (hormona estimulante do folículo)
F1 – Cruzamento simples
GnRH – Gonadotropin-Releasing Hormone (hormonas gonadotropinas)
GtHm – Gonadatrofina maturacional plasmática
HUFA – Highlyunsaturated Fatty Acids (ácidos gordos polinsaturados)
kg – Quilograma
l – Litro
LINOLEICO – Ácido linoleico (18:2n-6)
LINOLÉNICO – Ácido linolénico (18:3n-3)
LH – Luteinizing hormone (hormona luteizante)
13
MUFA – Monounsaturated Fatty Acids (ácidos gordos monoinsaturados)
mg – Miligrama
µg – Micrograma
ppt (o/oo) – Partes por milhar
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15
I. Introdução
A procura de alimento sempre foi uma das maiores preocupações da
vida do Homem, desde a recolha de frutos, vegetais, caça e pesca. Por isso,
passou a cultivar terras e a domesticar animais tornando-se autossufíciente.
A aquacultura é uma atividade que engloba o cultivo de organismos
aquáticos (algas, moluscos, crustáceos e peixes), sendo necessária a
intervenção humana para o sucesso da mesma.
Os peixes vivem num meio que experimenta trocas constantes de luz,
temperatura, salinidade, pH, oxigénio, pressão barométrica, precipitação,
presença de alimentos, etc. A sobrevivência, reprodução e crescimento dos
mesmos dependem da percepção destes estímulos e das condições
adequadas a cada espécie.
Na região maritíma do sul da Europa, nas últimas duas décadas houve
uma maior concentração na produção em aquacultura de dourada (Sparus
aurata) e de robalo (Dicentrarchus labrax), surgindo uma necessidade científica e tecnólogica para desenvolver cultivos de novas espécies com potencial para
a aquacultura. Um dos promissores candidatos foi o linguado da família dos
soleidae, que é uma espécie bem adaptada a climas quentes e criada em
viveiros ao longo da costa sul de Portugal e Espanha (Dinis et al., 1999).
Na aquacultura, um dos aspectos mais estudados é a gestão nutricional
dos lotes principalmente dos reprodutores que melhoram desse modo a
qualidade das larvas. A baixa qualidade do ovo é um factor de importante
restrinção para expansão da produção de peixes em aquacultura e eles são
utilizados para se estudarem os níveis de mobilização das proteínas vitelinas
16
Os produtos sintetizados no ovo, incluindo as enzimas vitais como as
catepsinas e os mecanismos que controlam as suas expressões,
desempenham um papel crucial na determinação da qualidade do ovo (Brooks
et al., 1997).
A realização deste trabalho permitiu comparar a qualidade e quantidade
dos ovos e das larvas produzidas pelos reprodutores de S. senegalensis
selvagens, alimentados por uma ração enriquecida em ácidos gordos, de modo
a averiguar o efeito dessa dieta na sua prole, melhorar o conhecimento sobre a
influência nutricional, na sobrevivência e desenvolvimento das larvas a
17
18
II. Revisão Bibliográfica
2.1 Evolução da Aquacultura
A aquacultura é uma atividade milenar, com 4.000 a 5.000 anos de
história. A nível mundial tem-se desenvolvido de forma gradual e, durante a
segunda Guerra Mundial beneficiou de avanços tecnológicos e.g. eco-sonar
para detecção dos cardumes, aperfeiçoamento dos métodos de captura, etc.,
tornando-se desde então a atividade na área da produção alimentar que mais
se desenvolveu, sendo responsável por cerca 50% do peixe consumido no
mundo (Furuya, 2001).
Segundo os dados da Food and Agriculture Organization (FAO), em 2005
houve uma produção mundial de pescados aquícolas na ordem de 158 milhões
de toneladas, cerca de 124 milhões de toneladas foram destinadas ao
consumo humano, sendo 90% deste valor destinado ao mercado Chinês
(Öczan, 2010).
Entre as espécies mais cultivadas, os peixes que apresentam maior
percentagem de produção são os peixes de água doce com 60,7%; os peixes
diádromos representam 7%, os salmonídeos 2,47% e os moluscos 23,6%
(FAO, 1996).
A pesca em pequena escala pode garantir a alimentação dos povos,
reduzindo o índice de pobreza e melhoria do desenvolvimento económico de
países em vias de desenvolvimento. Além disso, a aquacultura serve, também
para a produção de peixes para fins lúdicos e ornamentais.
Segundo Branco (2003) e Nomura (2010), há duas décadas que a
aquacultura se tem transformado essencialmente numa prática mais focada em
19
que estas são as melhores qualidades dietéticas que os mariscos possuem. O
seu ritmo contínuo desempenha um papel socioeconómico fundamental,
aproveitando-se dos recursos naturais.
A pesca e a aquacultura são atividades competitivas, mas podem
complementar-se ao serem administradas em simultâneo, sendo a aquacultura
o suporte das pescas pelo repovoamento das marés, na restauração da
riqueza pesqueira de uma determinada região, ou ao aliviar a pressão exercida
sobre algumas espécies através da sua oferta como alternativa ao consumidor
(Pillay & Kutty, 2005).
2.1.1 Aquacultura em Portugal
Portugal possui características edafoclimáticas por causa da sua
situação geográfica, que permitem a influência do mar Mediterrâneo e do
oceano Atlântico (Diniz et al., 1998). Isso faz com que o País desfrute de um
potencial único na atividade aquícola e no desenvolvimento de algumas
espécies com grande interesse comercial. É também um dos países europeus
que está referenciado como detentor de um elevado potencial para esta
atividade.
O país apresenta um consumo de peixe per capita bastante elevado, que
segundo dados da DGPA (Direção Geral das Pescas e da Aquacultura) em
2005 foi cerca 59,3 kg, colocando-o em 3° lugar a nível mundial depois do
Japão e da Islândia (Ildefonso, 2011).
Com queda da atividade pesqueira, a aquacultura pode constituir uma
importante alternativa às formas tradicionais de abastecimento de pescado.
Devido a restrinções burocráticas e legais esta atividade está longue de atingir
20
A espécie Solea senegalensis e a Scophthalmus maximus (Pregado),
são também dois fortes candidatos à aqualcultura em Portugal e tem-se
verificado o incremento da sua produção. Apesar do preço de mercado da
espécie S.senegalensis ser elevado, é uma espécie que muito se adapta às
condições existentes.
2.2 Biologia do
Solea Senegalensis
Kaup, 1858
2.2.1 Taxonomia e distribuição geográfica
A S.senegalensis Kaup, 1858 é uma espécie nova para a aquacultura, vulgarmente conhecida em Portugal, Espanha e nos países Lusófonos por
linguado.
Esta espécie está bem adaptada às águas subtropicais e temperadas, a
ambientes de salinidade elevada (30 e 35 ppm) com forte evaporação. Ela
encontra-se constantemente, nas águas do oceano Atlântico (nos estuários do
Tejo, do Sado e da costa algarvia), próximo à costa das regiões do Senegal até
La Rochelle (França); no mar mediterrâneo, nas costas do norte de África,
Espanha, Itália e Grécia (Figura 1), em profundidades de 80 a 100 m (Branco,
2003 e Öczan, 2010).
As larvas desta espécie ao eclodirem são planctónicas com um
comprimento de 2,4 ± 0,1mm, com uma fisionomia comum à das outras
espécies e uma vida pelágica durante 15 a 20 dias. Ao terminarem a
metamorfose tornam-se bentónicas com uma condição dextrógira ou levógira
(migração do olho esquerdo para o lado direito da cabeça) e ausência de
simetria bilateral (Pleuronectiforme), comum a todos os peixes com forma plana
21
Dentro desta ordem, está incluída a família soleidae, cujos peixes são
bentónicos, que em ambiente selvagem utilizam o estuário dos rios como
berçário para os indivíduos juvenis (Antunes, 2011). Apresentam um corpo oval
e achatado, cabeça redonda e pouco saliente, focinho arredondado e uma
boca pequena em forma arqueada semi-circular que alcança a borda inferior do
olho direito, sem dentes e com a mandíbula superior mais desenvolvida que a
parte inferior (Sarasquete, 2005).
Figura 1: Distribuição geográfica de Solea senegalensis em cor de rosa (Porta, 2006).
São pouco ativos e demersais (costumam permanecer em fundos
arenosos ou lodosos). Além disso, têm como base alimentar pequenos
invertebrados, embora consigam resistir a longos períodos de fome (Dinis et
al., 1999). A cor do manto superior é acastanhada, e tem a particularidade de
poder modificar-se devido aos mecanismos de mimetismo que possuem.
A espécie Solea senegalensis (Figura 2) é uma espécie de peixes
teleósteos que possui as seguintes caraterísticas taxonómicas apresentadas na
22 Tabela 1- Posição sistemática de Solea senegalensis
Filo: Vertebrata
Superclasse: Osteictios (Osteichthyes)
Classe: Actinopterigidos (Actinopterygii)
Ordem: Pleuronectiformes (Pleuronectiformes)
Família: Soleidos (Soleidae)
Género: Solea
Espécie: Solea senegalensis (Kaup, 1858)
Segundo Öczan (2010), a espécie S. senegalensis, anteriormente
denominada como Solea melanochira, era confundida com a espécie Solea
vulgaris no Atlântico e com a S. vulgaris e S. aegyptica no mediterrâneo, tendo adquirido o atual nome nos trabalhos de Chabanaud (1927), registados no
Atlântico e posteriormente na costa norte da Tunísia (Goucha & Ktari, 1981), no
lago Ichkeul (Chaouachi & Hassine, 1998), no Golfo de Lyon (Quignard et al.,
23 Figura 2: Exemplares adultos de Solea senegalensis durante a época de posturas na primavera, com aproximadamente 45 cm de comprimento e 1,8kg de peso corporal.
2.3 Linguado em Aquacultura
O linguado é um peixe de grande valor comercial, que se tornou uma
espécie prioritária para a diversificação da aquacultura nos países banhados
pela costa mediterrânea (Dinis et al., 1999). Embora seja uma nova espécie
para as águas mediterrâneas, é de grande potencial reprodutivo e de rápido
crescimento, sendo importante a sua utilização como espécie aquícola.
Como em qualquer outra indústria de produção animal, o controlo
zootécnico, tem sido a chave para o seu sucesso. Os linguados, normalmente
têm desovas eficazes mas, em cativeiro, torna-se fundamental a racionalização
alimentar, pois esta tem influência na reprodução, na quantidade e qualidade
das posturas, no tamanho dos ovos e das larvas até à abertura da boca.
Um dos problemas observados na linhagem F1 produzida em cativeiro é
a disfunção reprodutiva e o método atual para superar essa dificuldade é a
24
(Rasines et al., 2012). Esta disfunção tem causa ainda desconhecida mas,
pensa-se ser devido a vários factores ambientais, tais como: o maneio incorreto
das larvas na fase inicial, a alimentação defeituosa que leva ao stress, perda
de peso de alguns e conferindo-lhe assim uma baixa qualidade dos
espermatozóides e dos ovócitos.
2.3.1 Reprodução do Linguado
Os linguados são peixes gonocóricos, têm uma maturação sexual que
ocorre naturalmente quando atingem 3 a 4 anos de vida. Nessa fase costumam
apresentar tamanhos entre 25-32 cm de comprimento (Sarasquete, 2006;
Idelfonso, 2011). As fêmeas apresentam um par de ovários que estão situados
na região do ventre, na cavidade abdominal. Os machos têm os testículos de
forma triangular que se localizam no dorso do abdómen por baixo da
bexiga-natatória. O tamanho dos testículos e dos ovários vária consoante a idade do
peixe e a fase do ciclo reprodutivo e, logo após iniciarem a fase de maturidade
sexual a taxa de crescimento dos peixes reduz para ambos os sexos (Dinis et
al., 1999).
O comportamento reprodutivo é influenciado por estímulos internos
(genéticos, biológicos e alimentação) e por estimulos externos (natureza,
mecanismos de influências físicas, bióticas e sociais) que afetam a evolução
normal do processo reprodutivo e pertubam o sistema endócrino em níveis
diferentes no eixo pineal-cérebro-hipófise-gónoda (Figura 3), que regula as
respostas comportamentais necessárias para que ocorra a reprodução
(Cuento, 2009).
O orgão pineal e o cérebro desempenham um papel importante na
25
e efectoras. Segundo Gozalbo (2008) estes estimulos actuam sobre o
hipotálamo desencadeando a sintese de neurotransmissores. O neuropeptideo
liberta as hormonas gonadotropinas (GnRH) que chegam à hipófise através da
glândula pituitária pela enervação direta das neuronas hipotalámicas. As
células formadoras de gonadotropinas, que é a hormona estimulante do folículo
(FSH) e a hormona luteizante (LH), são secretadas para a corrente sanguínea
estimulando as gónodas através de recetores específicos, a produzirem
esteródes sexuais e fatores de crescimento. Pouco se sabe como é que as
informações ambientais atuam no eixo do hipotálamo-hipófise-gónodas.
(Foto período, temperatura, factores sociais e químicos)
Sistemas sensoriais Neuro-hormonas Gonadotrofinas FSH/LH Esteroidogénese Gametogénese - Andrógenos - Progesterona Vitelogénese - Estrógenos
Figura 3: Esquema representativo do eixo do hipotálamo-hipófise-gónodas, que governa o processo reprodutivo nos peixes.
Cérebro Hipófise Gónodas Factores Ambientais GnRH Dopamina Neuropepitideo Galanina Noradrenalina Serotonina GABA Pineal Melatonina Retina Cérebro Hipófise Gónodas Figado
26
A melatonina é o principal mediador dos sinais fotoperiódicos na
maturação gonodal nos peixes, no caso dos peixes teleósteos os níveis de
melatonina variam de acordo com o ciclo dia/noite, sendo altos durante a noite
e baixos durante o dia (Oliveira et al., 2009).
O fotoperíodo e a temperatura são responsáveis por regularem as
atividades fisiológicas, através da glândula pineal que é a responsável por
traduzir estímulos ambientais em impulsos hormonais e/ou neurais ao sistema
nervoso central e periférico, controlando desta forma muitos processos
fisiológicos nos peixes sazonais (Iseki et al., 2008). Nos peixes teleósteos a
ovulação e a desova ocorre durante a noite, isso porque os picos da
gonadatrofina maturacional plasmática (GtHm) neste período influenciam a
secreção e a liberação da testosterona, da 17α hidroxiprogesterona (17α OH-P)
e da 17α,20β-dihidroxiprogesterona (17α 20β diOH-P), sendo esta a hormona
mais importante na maturação final dos ovócitos (Muniz et al., 2008), atuando
sobre o ovócito através de um recetor de membrana, o qual ativa o factor
promotor de maturação no citoplasma do ovócito, responsável pela meiose
(Gozalbo, 2008).
Alguns níveis de temperatura da água inibem a postura dos ovos durante
o período reprodutivo. A temperatura favorável situa-se entre 16,5 ± 0,5ºC a 22
± 1ºC (Dinis et al., 1999; Branco, 2003 e Idelfonso, 2011). Este intervalo de
temperatura está ligado à sobrevivência da prole na fase pelágica. Assim
sendo, a temperatura é um factor crítico e indicador externo do início e do
términus das posturas.
Uma desova natural de linguado ocorre imediatamente depois do
anoitecer (Oliveira et al., 2009), durante a primavera e início do verão (Março
27
Outono, quando as temperaturas são similares (Dinis et al., 1999; Beirão et al.,
2011), isso porque nessa época há uma maior disponibilidade de alimentos,
favorecendo a sobrevivência das larvas em ambiente selvagem.
Nos machos a produção espermática ocorre normalmente ao longo do
ano, sem estimulação hormonal ou alterações dos factores bióticos (Anguis &
Canavate, 2005; Cabrita et al., 2006). No entanto, pode sofrer alguns
problemas tais como, a produção reduzida do esperma e do aspecto viscoso,
indutor de consequências negativas para a fertilização natural bem como para
a artificial. Esta baixa qualidade da produção espermática ocorre normalmente
pelo facto do reprodutor se encontrar em cativeiro, pela modificação de
estação, aumento da temperatura, idade do reprodutor, indisponibilidade de
alimentos e de factores abióticos (Mañanos et al., 2009; Santos, 2011),
enquanto para o desenvolvimento dos ovos nas fêmeas, ainda que em
estações propícias, é necessário a presença dos machos para que estas
fiquem estimuladas.
2.3.2 Ovos e larvas de Linguado
Para garantir o repovoamento dos tanques de cultivo, a chave príncipal é
o controlo reprodutivo que depende essencialmente de um bom planeamento e
cuidados com os reprodutores. A relação macho e femea em cativeiro deve ser
de 1:1 ou 2:1, a fim de favorecer a fecundação e minimizar o número de
posturas não fecundadas, o que vem limitando no cultivo desta espécie.
A incubação dos ovos de peixe em cativeiro tem sido um sucesso na
aquacultura, facilitando o aumento no número de lotes com caraterísticas
parentais desejadas, sendo assim possível avaliá-los, quer a nível quantitativo
28
A ovogénese é o processo pelo qual as células primordiais e germinais
formam um ovo pronto a ser fertilizado. Um ovo não fertilizado ou gâmeta
feminino é um ovócito bloqueado em metáfase II (Bobe & Labbé, 2010), e estes
são incapazes de desenvolver embriões, limitando assim a reprodução
controlada de uma espécie (Carnevali et al., 2001).
Quando o ovócito chega ao seu máximo estado de desenvolvimento, no
final da vitelogénese, fica preparado para a maturação. Após a postura dos
ovos e até ao início da alimentação exógena das larvas, o saco vitelino é a
única fonte de nutrientes disponível para o desenvolvimento embrionário. Isto
deve-se ao facto de as membranas estruturais dos ovos e embriões
apresentarem uma elevada hipermeabilidade (Conceição et al., 2009).
O ovo é composto pelo vitelo, constituída por uma mistura de matéria
orgânica que é utilizada para a nutrição durante a fase de desenvolvimento
embrionário. A composição bioquimica é específica para cada espécie e dentro
dela variam de acordo com a sazonalidade, a localização geográfica e tipo de
dieta que o peixe tem quando adulto. A composição dos ovos quer lipídica,
quer proteíca (aminoacidos essenciais) é afectada diretamente pela alteração
da composição da dieta do reprodutor, servindo como indicador de qualidade
da dieta.
A estratégia fisiológica é de maximizar a qualidade da composição
bioquímica do ovo para garantir a maior sobrevivência das larvas (Riveiro et al.,
2003). A maioria dos ovos pelágicos contém gotas de óleo em número e
dimensões variadas (0,1 a 1,0 mm). O tamanho dos ovos também é
considerado um indicador de qualidade, porque muitas vezes o tamanho do
ovo está relacionado com a viabilidade das larvas em incubação (Geffen &
29
O principal componente do vitelo é a fosfoglicoproteina vitelogénica
(VTG), que em alguns peixes é sintetizada no fígado sob controlo hormonal,
transportada pelo sangue e incorporada no ovócito em crescimento, cujo
metabolismo é mediado pelo recetor endocitose e posteriormente transformado
em proteínas vitelinas: lipovitelina e fosvitina (Carnevali et al., 2008 e Gozalbo,
2008). Depois disto ocorre o processo de translocação citoplasmática da
fosfoglicoproteina vitelogenica, que é acompanhada por um processo proteolítico específico, processado nas proteínas da gema (Figura 4). Estas proteínas são
derivadas da clivagem enzimática do soro proteíco materno durante a fase da
vitelogenese.
Durante o desenvovimento embrionário, os materiais acumulados no
ovócito incluindo fontes de energia são rapidamente degradados para produzir
e.g. aminoácidos livres, FAs, fósforo e cálcio, posteriormente utilizados pelo
30
Ovócito Figado
E2
Figura 4: Esquema resumo do processo geral da vitelogénese.
Nos sistemas intensivos existem algumas desvantagens na utilização
dos ovos das posturas, especialmente quando se trata da contribuição de
gâmetas, de um grande número de peixes em cativeiro, tornando difícil a
identificação para efeitos parentais. Outro problema encontrado no estudo da
dinâmica da população dos peixes é da sobrevivência dos primeiros estágios
de desenvolvimento (ovo/larva) bem como os factores que a condicionam
(Meneses, 2003).
Assim, a fecundidade está relacionada com o tamanho dos reprodutores
e com as condições ambientais, enquanto as posturas estão relacionadas com
o tipo de desenvolvimento ovocitário e com a frequência da libertação de
ovócitos maduros no período da reprodução.
Os ovos podem ser libertados, depositados no substrato, colocados em
ninhos ou guardados pelos progenitores. No caso dos linguados, pela
caraterística da espécie, os ovos contêm numerosos aglomerados de glóbulos
VTG Catepsinas Lipovitelina Fosvitina Componente β VTG-R VTG
31
lipídicos (Figura 5), que ajudam no ajuste da sua densidade em direção às
correntes de água.
Figura 5: Foto ilustrativa de ovos viáveis de Solea senegalensis
A temperatura e a salinidade afectam a flutuabilidade dos ovos e
posteriormente das larvas. Os ovos pelágicos como os do linguado têm como
caraterística principal a flutuabilidade, devido ao processo de hidratação
durante a reprodução que é responsável por esta caraterística. Além disso,
existe a proteólise D do vitelo que também leva à flutuabilidade mas que afecta
a fertilidade e a sobrevivência dos ovos gerados (Carnevali et al., 1999).
A flutuação é importante na desova dos peixes, porque permite que este
tipo de ovos evite condições de baixo nível de oxigênio das camadas profundas
(Guisande et al., 1998), nos ovos dos linguados a flutuabilidade pode ser
comprometida pela salinidade da água, que ao atingir percentagens inferiores a
32
As formas e padrões do ciclo de vida dos peixes são as mais variadas
entre os vertebrados. Existem estratégias de reprodução, que possibilitam o
sucesso em ambientes distintos. Estas são conhecidas pelo elevado grau de
fecundidade, libertando entre centenas a milhões de ovócitos anualmente
(Araújo, 2009).
2.3.2.1. Ação das catepsinas nos ovos
A baixa qualidade do ovo é um factor de importante restrinção para
expansão da produção de peixes em aquacultura. Esta é definida como a
capacidade de um ovo produzir um embrião viável e descendentes, e
determinada pelas propriedades intrínsecas do desenvolvimento do ovócito em
si e do ambiente no qual o ovo está a ser incubado.
Os embriões são bons indicadores para se estudarem os níveis de
mobilização das proteínas vitelinas durante a embriogénese dos peixes, pois é
nessa fase que o embrião em formação requer aminoácidos livres provenientes
das proteínas das reservas vitelinas para o seu rápido desenvolvimento
(Carnevali et al., 2001).
Segundo os mesmos autores, durante o desenvolvimento embrionário há
um acumular de materiais nos ovócitos (fontes de energia) que são
rapidamente degradados para produzir aminoácidos livres, ácidos gordos,
fosforo, cálcio, etc, que são posteriormente utilizados pelo embrião.
Durante o desenvolvimento embrionário existem enzimas responsáveis
pela degradação das proteínas do vitelo, denominadas catepsinas. Elas sob
determinadas condições fisiológicas, são localizados nos lissosomas, em
resposta a certos sinais que são libertados a partir dos lissosomas para o
33
várias vias, incluindo a activação ou a libertação de factores pro-apoptóticos a
partir da mitocôndria (Chwieralski et al.,2006).
Nos ovos esta degradação é bem controlada por inibidores específicos
das proteases que estão associadas às proteínas do vitelo (Carnevali et al.,
2001).
A qualidade dos ovos dos peixes pode variar muito, podendo estes
serem dependentes dos genes paternos. Os produtos sintetizados no ovo,
incluindo as enzimas vitais como as catepsinas e os mecanismos que
controlam as suas expressões, são susceptíveis de desempenhar um papel
crucial na determinação da qualidade do ovo (Brooks et al.,1997).
Segundo Carnevali et al. (2006) no final da fase de reprodução, as
enzimas lissosomais encontram-se também envolvidas com a reabsorção dos
ovócitos e são reguladas por diversos factores incluindo hormônas sexuais, tal
como o estradiol. A degeneração dos folículos que não atingiram a maturação
(atrésia folicular) ocorre sob controlo das catepsinas e afetam o potêncial da
fecundidade.
As atividades das catepsinas B e D atuam de forma diferente nos ovos
entre espécies diferentes ou até na mesma espécie de peixe. As funções e
características das catepsinas (B e D) em estudo nos ovos viáveis e inviáveis
são:
a) Catepsina B
A catepsina B é uma cisteino-protease lisossomal, que possui tanto
atividade endopeptidática como a atividade carboxidipeptidil-peptidásica, o que
a distigue das demais enzimas da familia da papaína Nägler et al., (1997). Ela
34
clínicas. E isto faz desta catepsina um indicador confiável no diagnóstico e
prognóstico de cancro (Kos & Lah, 1998).
Segundo Fu et al., (1998) as funções normais da catepsina B estão
relacionadas com processos celulares como o de degradar proteínas da matriz
extra-celular, no processo de reciclagem de proteinas e durante o metabolismo
do vitelo em ovócitos de peixes (Tingaud-Siqueira et al., 2010), além disso
especula-se que ela pode estar envolvida na ativação inícial das catepsinas D
e L, e no controle da morte celular programada a apoptose (Carnevali et al.,
2001).
Segundo os mesmos autores, em ovos de peixes marinhos, a atividade
da catepsina B é visível em ovos inviáveis e durante todos os estados de
desenvolvimento embrionário dos ovos viáveis, com picos elevados em relação
as catepsinas (A, D e L) em 100% de atividade na fase de morula, tendo
valores mais baixos e semelhantes no estado de blastula, gastrula e
segmentação, voltando a aumentar à eclosão em ovos de robalos.
b) Catepsina D
A catepsina D que também é conhecida como protéase aspártica, é uma
enzima proteolítica da família da pepsina, com maxima atividade nos ovos
durante a incubação, embora possuam níveis de atividade enzimática
significativamente altos em ovos inviáveis (Carnevali et al., 1999). A catepsina
D é considerada um marcador de má qualidade de ovos (Carnevali et al.,
2001).
Esta catepsina é também encontrada em muitos tipos de células
diferentes, estando envolvida no processo de apoptose como ativador
35
regressão da cauda nos anfíbios; esse processo pode ser um dos responsáveis
pelo alto nível de atividade destas catepsinas nos ovos inviáveis, e
desempenha um papel importante na produção de ovos viáveis.
O nível de atividade da catepsina D durante a ovogénese depende do
estado de maturação dos ovócitos, e isso pode estar relacionado com as
necessidades de energía por parte dos embriões, que durante a primeira fase
do desenvolvimento embrionário quando as divisões são rapidas e sem
aumento do volume, a mobilização do vitelo e os de catepsina D são baixos
(Carnevali et al., 1999).
O pico máximo de atividade enzimática é observada durante a fase de
gástrula e na fase de blástula lenta em ovos de dourada, quando a divisão
celular é lenta. Segundo Carnevali et al. (2001), a inibição da catepsina D
resulta no bloqueio da proteólise do vitelo e desenvolvimento anormal ou
mesmo mortalidade dos embriões.
Segundo Brooks et al. (1997), a catepsina D nos ovos de peixes é
responsável por mediar o processamento das proteínas do vitelo no ovócito, e
é vital para a produção de um ovo viável.
2.3.2.2 Desenvolvimento inícial das larvas
A larvicultura é uma parte do processo da aquacultura, com dificuldades
de atingir sucesso, devido ao índice elevado de mortalidade durante esta fase.
Normalmente, numa desova natural eclodem entre 20% a 70% dos ovos
no sistema de cultivo intensivo (Bock & Padovani, 2000). Após a eclosão, a
mortalidade está frequentemente relacionada com a alimentação, que quando
não atinge as exigências nutricionais dos reprodutores, promove um maior
36
Além disso, importa salientar também as condições abióticas
desfavoráveis, a densidade da população adulta, em que quanto maior a
quantidade dos reprodutores, maiores são as probabilidades de abortos dos
ovos, o parasitismo e a existência de predadores (Borges et al., 2001).
Os ovos dos peixes marinhos são ricos em Hufas na série n-3 e os seus
reprodutores têm uma exigência nutricional em ácidos gordos essenciais
(Ferreira, 2009), que são importantes para o desenvolvimento embrionário nas
primeiras fases larvares. A deficiência destes ácidos gordos pode levar a
patologias, como o stress, deficiências no crescimento, problemas de
pigmentação, da migração do olho durante a metamorfose em linguados
juvenis e aumento da mortalidade.
No momento final de absorção das reservas vitelinas (abertura da boca),
a fase de alimentação exôgena é muito crítica e está associada a um alto nível
de mortalidade, o que pode ter uma relação com a escassez de alimento
adequado, com a predação, a densidade e a existência de condições abióticas
desfavoráveis.
2.3.3 Nutrição dos Linguados
O papel da nutrição na reprodução de peixes tem sua importância
principalmente para o desenvolvimento reprodutivo. Mesmo reconhecendo a
importância da adequada alimentação para a reprodução e para a qualidade
das posturas em peixes teleósteos, os requisitos nutricionais continuam a ser
uma das áreas menos evoluidas no campo da nutrição de peixes
(Fernández-Palacios & Izquierdo, 2009). Mas, isto é devido à necessidade de grandes
37
Na aquacultura os custos totais relacionados com a alimentação na
produção são cerca de 50% a 80% no seu total (Turchini et al., 2011). O
assunto ligado à nutrição, principalmente nos reprodutores, não é bem
compreendido nas pesquisas de peixes ósseos. Para se oferecer uma dieta
tem que se ter conhecimento adequado das várias informações sobre a
espécie a ser criada, a fase de crescimento, assim como o valor nutritivo dos
ingredientes que irão compor a dieta.
Os alimentos são substâncias que, depois de ingeridas pelo animal,
podem ser digeridas, absorvidas e assimiladas, fornecendo energia ao
organismo para o crescimento, a reprodução e para manutenção do
metabolismo basal (Gomes, 1998). Os peixes são os vertebrados que
convertem melhor o alimento exógeno em proteína corporal com menor gasto
de energia.
É obvio que os requerimentos nutricionais dos reprodutores são maiores
e diferentes que à dos juvenis e dos adultos que não se encontrão em fase
reprodutiva, chegando a comprometer notoriamente a reprodução, na
qualidade dos gâmetas, ao desenvolvimento dos gónadas, a composição dos
espermatozóides, do plasma seminal (antioxidante presente no sémen) e na
fecundidade (De Coen et al., 1995; Jasso et al., 2003 e Santos, 2011).
Tendo os peixes o alimento disponibilizado, existem alguns factores que
impedem com que estes aproveitem perfeitamente. O uso das rações na
aquacultura surgiu com o objetivo de ajudar a balancear os nutrientes
adequados para os peixes e que não podem ser sintetizados por eles. Quando
oferecidos e não eficientemente ingeridos e absorvidos, resulta no desperdício
de alto aporte de nutrientes na água, o que em ambientes fechados contribui
38
da água em cativeiro, aumentando o desenvolvimento de microorganismos e a
possibilidade do aparecimento de doenças (Sussel, 2008). E não somente, as
rações têm também a vantagem de não possuirem riscos de transmissão de
patologias via alimentos húmidos.
São vários os tipos de nutrientes capazes de influenciar na reprodução,
como os lípidos, proteinas, carboidratos, vitamina A e E, ácido ascórbico,
carotenoides e os nucleótidos. Neste âmbito, o uso de gordura na ração quer
de origem animal ou vegetal, constitui um importante factor para a alimentação
dos peixes, como forma concentrada de energia influenciando, positivamente
nas outras exigências nutricionais e para compactar as rações (Gomes, 1998).
2.3.3.1 Função dos lípidos na alimentação
Os lípidos constituiem um grupo heterogénio, caracterizam-se por
apresentarem uma estrutura molecular (ácidos gordos com pelo menos 8
átomos de carbono) que podem ser divididos em grupos, em função da
presença do glicerol: ácidos gordos em estado livre, lípidos com glicerol
(triglicéridos e fosfolípidos) e lípidos sem glicerol, onde se englobam os
esteróides que são também componentes fundamentais para o correto
funcionamento e desenvolvimento dos organismos. Servem como veículo
biológico na absorção de vitaminas lipossolúveis (A, E e K) e esteróides
(Mendes, 2008). Segundo Gomes (1998); Bell & Koppe (2011), os lípidos para
além de energéticos (9,5 Kcal.g-1) têm outras funções estruturais, de serem
co-enzimáticas, hormonais e nutricionais importantes. São precursores da síntese
de prostaglandinas, componentes e precursores das hormonas parácrinas e
39
Uma dieta, conténdo lípidos principalmente os ácidos gordos essenciais
(EFA), influenciam na qualidade das posturas especialmente em espécies que
apresentam posturas contínuas e periodos vitelogênicos curtos. Os ácidos
gordos polinsaturados (PUFA - polyunsaturated fattyacids) são agrupados em
duas famílias: a série linoleica (n-6) e a série linolénica (n-3), que não podem
ser sintetizados pelos animais porque as suas enzimas são incapazes de
inserir novas ligações duplas entre a já existente e o grupo carboxilo. Estas
duas séries são consideradas ácidos gordos essenciais, havendo assim a
necessidade de os adicionar à dieta.
Os ácidos gordos essenciais são os precursores dos restantes ácidos
gordos da mesma série do ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6), do ácido
eicosapentaenóico (EPA, 20:5n-3) e do ácido docosahexaenóico (DHA,
22:6n-3) (Villalta et al., 2005; Souza et al., 2007). Estes ácidos são importantes no crescimento e desenvolvimento normal dos linguados, para melhorar a fluidez
do esperma, dar resistência aos efeitos osmóticos do ejaculado que são os
principais factores de sucesso na reprodução e sobrevivência da prole
(Izquierdo et al., 2011).
As exigências lipídicas apresentam grandes variações entre as espécies
cultivadas. Nos linguados, durante o processo reprodutivo, a adição de PUFAs
à dieta leva a um aumento na sensibilidade da membrana e à peroxidação
lipídica nos espermatozóides que, posteriormente, participam nas reservas
vitelinas, garantindo a sobrevivência e crescimento das larvas após a eclosão e
antes da abertura da boca (Ferreira, 2009).
Não é somente o conteúdo individual de cada ácido gordo que importa
mas, também, as proporções entre eles, a qualidade e a quantidade dos DHA e
40
desenvolvimento dos ovos e das larvas e são primordiais na pigmentação e
migração do olho. O excesso ou deficiência na sua assimilição pode provocar
várias disfunções, malformações e patologias de várias ordens em peixes
planos (Mendes, 2008). O ácido docosahexaenóico é especialmente importante
no tecido neural das larvas, retina, nervo óptico e estruturas relacionadas com
os orgãos de sentido, demostrando ser mais determinante que os ácidos
gordos essenciais na maioria das espécies marinhas.
A necessidade por ácidos gordos essenciais muda ao longo da vida dos
peixes. Quando os peixes se encontram na fase juvenil podem ser capazes de
sobreviver meses com uma dieta pobre em ácidos gordos essenciais. As larvas
morrem em poucos dias e nos reprodutores há uma necessidade durante a
fase da gametogénese e durante as posturas, pois afetam a qualidade dos
ovos (Izquierdo, 2002).
Durante o desenvolvimento das larvas da S. senegalensis existe uma
diminuição de ácidos gordos, que apoiam a ideia de que larvas de peixe têm
um metabolismo rápido e altas exigências nutricionais, utilizando lípidos (ácidos
gordos essênciais) como fonte de energia metabólica (Conceição et al., 2007).
Para além disso, os ovos dos linguados apresentam os melhores valores na
razão DHA/EPA de 4,3 comparado com 2 a 3 que, normalmente apresentam as
outras espécies.
A relação de (DHA/EPA) na dieta é determinante para distintas funções
fisiológicas principalmente a reprodução (Fernández-Palacios & Izquierdo,
2009). Alguns autores como Ferreira (2009) falam sobre a importância da
relação (DHA/EPA) para a nutrição larval após a abertura da boca, melhorando
assim o seu desenvolvimento larvário e sugerem que ambas as relações
41
posturas, sendo estes dois ácidos importantes no controlo da ovulação, na
embriogénese, eclosão e desenvolvimento larvário inícial.
2.3.3.2 Regime alimentar de reprodutores da
Solea segalensis
São poucos os estudos sobre os efeitos nutricionais das larvas da S.
senegalensis, a base alimentar das post-larvas e juvenis (até 7 cm de comprimento total) é de pequenos crustáceos, entre os quais predominam os
copépodes harpacticoides, mas também consomem poliquetas em quantidades
apreciáveis (Branco, 2003). Para reprodutores S. senegalensis, a base
alimentar normalmente é de Lula-comum (Loligo vulgaris), diferentes espécies
de poliquetas marinhas vivas e/ou descongeladas, mexilhão (Mytilus
galloprovincialis) e ração bêntica em cativeiro (Conceição et al., 2007).
Os poliquetas são um grupo de invertebrados anelídeos da classe
polychaeta abundantes que se encontram, desde entre as marés e estuários, a regiões com grande profundidade das fossas oceânicas. Existem cerca de
8000 espécies distintas que vivem associados aos substratos dos oceanos,
chegando a serem conhecidos como indicadores de poluição (Paiva, 2006).
Além disso, têm a capacidade de incorporar detritos orgânicos, que são
transformados em biomassa animal e ao serem ingeridos por peixes e outros
aquáticos que tem hábito de se alimentarem no fundo, vão retornar para o ciclo
de material orgânico dos oceanos.
Estes anelídeos, que costumam ter entre 5 a 50 cm de comprimento, são
muito nutritivos, sendo utilizados como suplemento alimentar às rações
comerciais em cultivos extensivos e semi-intensivos, aumentando o potencial
de produção, visto que fornecem elementos essenciais como 20% de ácidos
42
contêm hormonas que podem promover a função de reprodução dos
organismos marinhos.
As lulas são reconhecidas como componentes dietéticos ricos em
proteínas para os reprodutores e, juntamente com uma boa concentração de
ácidos gordos, altamente insaturados (HUFAs), que conduzem a uma
performance reprodutiva positiva (Izquierdo et al., 2011).
Os mexilhões são ricos em selénio (Se), cálcio (Ca), ferro (Fe), magnésio
(Mg), fósforo (P), vitaminas (A, B1, B2, B6, B12 e C) e em ácidos gordos
polinsaturados (37- 48% de ácidos gordos principalmente o n-3), o que permite
uma maior concentração de colesterol na membrana dos espermatozóides e no
plasma seminal (Cabrita et al., resultados não publicados).
A ração comercial normalmente utilizada para a alimentação de
linguados contém uma mistura de farinha de peixe e óleo extraído de pequenos
peixes pelágicos marinhos. Estes são ingredientes que históricamente têm sido
43
44
III. Material e Métodos
3.1 Descrição do ensaio
Este trabalho foi realizado na Estação Piloto de Piscicultura de Olhão
(EPPO) – IPIMAR, no Algarve (36° 59′ 0″ N, 7° 55′ 0″ W), Portugal (Figura 6).
Figura 6: Localização da piscicultura (EPPO) no Parque natural da ria Formosa, (http://descobrir-a-terra.blogs.sapo.pt/24081.html).
3.1.1 Acondicionamento dos reprodutores
Foram utilizados 44 reprodutores adultos de Solea senegalensis divididos
em dois tanques paralelos retangulares. Os peixes eram provenientes do meio
selvagem há aproximadamente 4 ou 5 anos e, previamente acondicionados a
cativeiro.
Para que a dieta tivesse influência sobre as posturas, um mês antes de
se inciarem a época das posturas introduziram-se as dietas. Os peixes foram
diariamente alimentados com cerca de 3% do peso vivo de cada um dos
tanques. Foram fornecidas duas rações semi-húmidas (Sparus®) distintas a
cada um dos tanques, uma rica em ácidos gordos (Dieta Enriquecida - DE) e a
outra simples denominada ração controlo (Dieta Controlo - DC), (Tabela 2).
Esporadicamente e a ambos os tanques, foram fornecidos outros alimentos EPPO
45
como tentáculos de lula, mexilhão e poliquetas marinhas, que normalmente são
comuns na dieta dos adultos da espécie S. senegalensis.
Tabela 2- Dados da composição das rações oferecidas aos dois tanques com os reprodutores de Solea senegalensis durante o ensaio, retirados da tabela nutricional da ração da Sparus®.
Composição Dieta Enriquecida (%) Dieta Controlo (%)
Proteína 54,8 54,8 Proteína digestivel 50,9 50,9 Gordura 23,0 16,1 Energia 22,8 21,1 ARA 0,22 0,18 EPA 2,29 1,48 DHA 1,96 0,89
Os dados relativamente aos linguados dos dois tratamentos estão
resumidos na Tabela 3.
Tabela 3- Dados de estabulação dos 44 reprodutores de Solea senegalensis nos tanques DE e DC. Tanque DE Tanque DC Número de linguados 22 22 Comprimentos (cm) 53,0 ± 2,37 51,9 ± 4,58 Peso médio (g) 1669,5 ± 319,19 1721,3 ± 470,44 Densidade (kg/m³) 2,0 2,1 Biomassa (g) 36,73 37,87 Relação (macho:fêmea) 1:1 1:1
Os tanques usados neste ensaio eram internamente revestidos de
azulejos com 18 m³ de volume de água tratada, vinda da Ria formosa (Figura
7). Estes tanques foram monitorizados de igual maneira, desde o início do
ensaio, sendo limpos 3 vezes durante a semana e efetuadas, diariamente
46
3.1.2 Parâmetros físico-químicos
Houve a necessidade de controlar diariamente a temperatura da água,
níveis de saturação de oxigénio dissolvido na água e o nível de oxigénio em
(mg/l), utilizando oxímetros “Oxy Guard” com as marcas Handy Gamma e
Handy Mk III.
O fotoperíodo para os tanques dos linguados foi natural, com
intensidades de luz solar entre 330 e 800 lux. Os tanques eram cobertos com
rede sombreada para diminuir a entrada da luminosidade, já que os linguados
são habitantes de regiões profundas, e para impedir que as variações de
luminosidade que ocorrem durante os dias e entre as estações do ano os
influenciassem diretamente. Também impediu que a incidência da luz
favorecesse o desenvolvimento de algas, que resultaria na diminuição de
oxigénio.
O sistema de água nos tanques era aberto com renovação de água em
500 l/h e a salinidade variou, ao longo do ensaio, de acordo com as condições
47 Figura 7: Tanque exterior de acondicionamento dos reprodutores de linguado (Solea
senegalensis).
3.1.3 Recolha dos ovos e caracterização das posturas
Para determinar a existência do ritmo de postura de S. senegalensis, em
Outubro, um mês após ao início do ensaio, foram colocados à saída de água
em ambos os tanques coletores de ovos externos (Figura 8). Diariamente
48
Quando a desova ocorria, os ovos eram recolhidos em ambos os
coletores e transferidos para um recipiente com água salgada oriunda do
tanque de desova. Eram separados ovos viáveis (Figura 9.a) dos não viáveis
(Figura 9.b), através do método de decantação tendo em conta a sua
flutuabilidade. Assim, os ovos viáveis mantinham-se a flutuar na superfície da
água, enquanto os não viáveis se depositavam no fundo do recipiente.
Figura 8: Um dos coletores externos de ovos junto a um dos tanques utilizados no ensaio.
Depois de separados os ovos, as quantidades de ovos viáveis e de não
viáveis eram determinadas. Da porção de ovos viáveis eram recolhidas
amostras para observação à lupa do seu estado de desenvolvimento,
determinação do diâmetro, peso seco, taxa de eclosão, viabilidade e análise
das catepsinas. Dos ovos não viáveis, somente eram recolhidas amostras para
49
Figura 9: Ovos viáveis (A) e ovos inviáveis (B) de Solea senegalensis
• Estado de desenvolvimento e viabilidade
Para cada postura, eram colocados 30 ovos viáveis numa lâmina de
vidro e, com auxílio de uma lupa, (em ampliação de 20x) eram observados e
registados os estados de desenvolvimento dos ovos (morula, blastula, gástrula
ou neurula) e calculada a viabilidade dos 30 ovos (percentagem de ovos
viáveis).
• Taxa de eclosão
Para a determinação da taxa de eclosão, em cada postura foram
colocados 90 ovos viáveis, divididos por igual em copos flutuadores em
triplicado (Figura 10). E imediatamente eram postos a flutuar numa incubadora.
Ao fim de 24h normalmente era possível determinar a percentagem dos ovos
eclodidos, com auxílio de uma lupa (em ampliação de 20x).
• Peso seco
Para determinação do peso seco dos ovos e das larvas, eram recolhidos
triplicados com 30 ovos viáveis em ependorfs de cada postura e triplicados com
5 larvas dos diferentes dias após a eclosão (DAE) até a abertura da boca.
Eram conservados em camaras refrigeradas a (-22°C), depois eram liofilizadas,
e através de uma balança de precisão em (µg) eram os ovos e as larvas.
50
Figura 10: Flutuador de incubação A e do flutuador numa incubadora B.
• Análises das catepsinas
Esta análise foi baseada na metodologia de Carnevali et al., (2008).
Recolheram-se 22 amostras (viáveis/inviáveis) de 11 posturas, sendo 2
posturas do tanque DC e 9 posturas do tanque DE no estado de
desenvolvimento embrionário blastula e com as taxas de eclosão a 100%.
Recolheram-se aproximadamente 200 mg de ovos viáveis e não viáveis
previamante limpos em água destilada e conservados em azoto líquido, para se
determinarem os níveis de actividade das catepsinas B e D de acordo com o
protocolo em anexo (Anexo I).
• Incubação dos ovos
Os restantes ovos viáveis de cada postura colocavam-se numa
incubadora com volume de 200 l (Figura 11), para serem feitas as várias
análises desde a eclosão até à abertura da boca das larvas.
Durante esse período, mantiveram-se as incubadoras com arejamento e
higienizadas (aspiradas) duas vezes ao dia para evitar que alguns ovos
abortados ou larvas mortas permanecessem no fundo do tanque, criando
condição para o desenvolvimento bactériano.
51 Figura 11: Incubadora – tanque cilindrocónico branco de 200L.
• Ensaio à temperatura de 17ºC desde a eclosão dos ovos até à
abertura da boca, com ovos provenientes dos tanques DE e DC.
Para este ensaio, após a obtenção de posturas no mesmo dia em ambos
os tanques, foram efetuados os procedimentos diários de cada postura. As
características utilizadas para o ensaio encontram-se descritos na Tabela 5.
Assim, controlou-se diariamente a temperatura da água para que
permanecesse idêntica em ambos os tanques.
Tabela 5- Principais dados dos ovos (DE/DC) para o ensaio com temperatura a 17ºC. Tanque Ovos viáveis Ovos não
viáveis Ovos incubados Viabilidade Estado de desenvolvimento DE 78 (g) 158 (g) 43 (g) 80% 50% Gástrula 50% Neurula DC 69 (g) 86 (g) 43 (g) 90% 100% Gástrula
52
3.1.4 Análise estatística
Para o tratamento dos dados utilizou-se o software Statistical Package
for the Social Sciences (SPSS) versão 20.0® para avaliar a comparação das médias das taxas de eclosão recolhidas nos mesmos dias de posturas entre os
tanques DE e DC.
Para avaliar se a dieta enriquecida possuia um efeito significativo na
quantidade de posturas, na qualidade dos ovos da postura, na sobrevivência
ao eclodirem, no tamanho, no peso e no desenvolvimento até a abertura da
boca, foi realizado um teste T simples. Devido a alguns dados recolhidos
estarem em percentagem, houve a necessidade de realizar transformações
matemáticas corretivas de modo a corrigir os desvios da normalidade utilizando
a fórmula X’=arcsen. X½, em que X é o dado original e o X’ o dado
transformado (Zar, 1996). Isso foi utilizado para o caso da relação entre as
taxas de eclosão e a taxa de viabilidade dos ovos. O pressuposto de
homogeneidade da variância foi avaliado com o teste de regressão.
Para os restantes tratamentos dos dados utilizou-se o programa
Statistica 7 e foi também realizado o teste T simples.
Consideraram-se estatisticamente significativos os testes cujo valor p for
igual ou inferior a 0,05 (p≤ 0,05).
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IV. Resultados
O objetivo princípal do ensaio foi o de avaliar a quantidade dos ovos por
postura e avaliar a qualidade dos ovos ao longo do ensaio sob o efeito da dieta
enriquecida em DHA e EPA (DE) sobre a qualidade e quantidade das posturas.
4.1 Condições ambientais dos tanques e alimentação dos
reprodutores
Na avaliação das caraterísticas físico-químicas da água dos tanques com
os reprodutores alimentados com a DE e a DC, foi observado que durante todo
o ensaio, decorrido de Setembro (2011) a Janeiro (2012), a temperatura da
água oscilou entre 9,8 e 21,8°C. O ad libitum alimentar dos reprodutores de
ambos os tanques pela ração (enriquecida e a controlo), não sofreu grandes
variações apresentando uma média e desvio padrão de 236,54 ± 67,62 g
(Figura 12).
Figura 12: Relação alimentar dos tanques DE e DC sob influência da temperatura, durante o ensaio.
