Protein S Ac
Intended Use
For the determination of the functional activity of protein S in human plasma.
Summary and Explanation
Protein S, a vitamin K-dependent plasma protein, is the cofactor of activated protein C (protein Ca). It stimulates the proteolytic inactivation of Factor Va and Factor VIIIa by protein Ca, thereby stimula-ting its coagulation-inhibistimula-ting effect 1, 2 . Protein S occurs in the plasma both as a free, physiologically coagulation-active protein as well as in an inactive form bound to C4b binding protein (C4bBP). A diminished protein S activity increases the thromboembolic risk. Homozygous protein S deficiency, like homozygous protein C deficiency, leads to Purpura fulminans in neonates.
Causes of diminished protein S activities are2,3 - hereditary protein S deficiency
- hepatic disorders - oral anticoagulation - treatment with L-asparaginase - pregnancy
- oral contraceptives - estrogen therapy
- elevated plasma levels of C4bBP as an acute-phase reaction. The relative Protein S activity can depend on the test method employed4.
Immunological methods are recommended for the determination of free and bound proteins if hereditary or acquired deficiencies are to be identified or if the extent of a deficiency of Protein S activity caused by increased C4bBP is to be determined.
Principle of the Method
Protein Ca proteolytically cleaves F Va which is generated during the activation of the coagula-tion cascade by RVV (venom of Vipera russelli). In this reaccoagula-tion protein S acts as a cofactor which accelerates the reaction. As a result, the coagulation time increases proportionally to the activity of protein S in the sample. The addition of deficient plasma ensures that the test mixture has a sufficient supply of fibrinogen, Factor V and the other necessary coagulation factors. Coagulation is triggered at the level of Factor X by the FX activator of RVV. FXa forms thrombin from prothrom-bin under the action of the remaining Factor Va. The resulting thromprothrom-bin finally converts fibrinogen to fibrin. The coagulation time can be detected mechanically, optically or by other measurement principles.
Reagents
Materials provided Testkit Code No. OPAP
6 x for 1 mL Protein S Ac Deficient Plasma 2 x for 2 mL Protein S Ac APC Reagent 2 x for 5 mL Protein S Ac Starting Reagent Composition
Protein S Ac Deficient Plasma: lyophilized, human citrated plasma with an unmeasurable residual activity of protein S. The plasma is likewise free of C4bBP.
Protein S Ac APC Reagent, lyophilized: purified, activated human protein C containing calciumchloride. Preservative: 5-chloro-2-methyl-isothiazole-3-one (3.8 mg/L)
2-methyl-isothiazole-3-one (1.3 mg/L)
Protein S Ac Starting Reagent, lyophilized; activator derived from the venom of Russell's Viper (Vipera russelli) with added phospholipids.
Preservative: Sodium azide (0.5 g/L) Warnings and Precautions
1. For in vitro diagnostic use.
2. Reagents containing sodium azide must be handled with due caution:
Do not ingest or allow to contact skin or mucous membranes! Sodium azide can form explo-sive azides when contacting heavy metals such as copper or lead!
3. Each individual blood donation for use in manufacture of the Protein S Deficient Plasma is tested for hepatitis B surface antigen, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2 by FDA-required testing. Only donations with negative findings are used for manufacture.
Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained from human blood should always be handled with due care, observing the precautions re-commended for biohazardous material 7.
Preparation of the Reagents
Protein S Ac Deficient Plasma: Dissolve in the labeled quantity of distilled water and incubate at +15 to +25 °C for 60 min.
Protein S Ac APC Reagent: Dissolve in the labeled quantity of distilled water and incubate at +15 to +25 °C for 60 min.
Protein S Ac Starting Reagent: Dissolve in the labeled quantity of distilled water, incubate at +37 °C for 60 min in the water bath and mix gently before use.
Storage and Stability
The test kit is to be stored unopened at +2 to +8 °C and used by the date given on the label. Stability after reconstitution (closed vials):
Temperature Protein S Ac Protein S Ac Protein S Ac
Deficient Plasma APC Reagent Starting Reagent
+37 °C - - 4 hours
+15 to +25 °C 8 hours 8 hours 8 hours
+2 to +8 °C - 2 days 2 days
≤ - 18 °C 2 months 2 months 2 months
Various analyzers do have individual stability data. Materials required but not provided
Standard Human Plasma, Code No. ORKL Control Plasma N, Code No. ORKE Control Plasma P, Code No. OUPZ
Coagulation analyzer (see “Limitation of the Procedure”)
Specimens
To obtain the plasma, carefully mix 1 part sodium citrate solution 0.11 mol/L (3.2%) with 9 parts venous blood, avoiding the formation of foam. Centrifuge immediately at no less than 1500 x g for at least 10 min. When removing the plasma, take care to ensure that no platelets are withdrawn. If the sample is to be frozen repeat centrifugation, rapidly freeze the collected plasma in a well-closed plastic container.
Stability of the sample:
≤ - 18 °C 1 month
+15 to +25 °C 4 hours
Plasma stored at ≤ - 18 °C is to be thawed within 10 minutes at +37 °C after which the assay is to be performed within 4 hours.
Procedure
For procedural details please refer to the manufacturer's instruction manuals and application sheets for Protein S Ac on the suitable analyzers.
Results
The results are obtained using a reference curve prepared beforehand by serially diluting Standard Human Plasma with Protein S Deficient Plasma. Sample testing must follow the determination of the reference curve immediately. Care is to be taken to ensure that conditions for establishing the reference curves and for performing the subsequent measurements are the same (e.g. temperature of the reagents).
Internal Quality Control
Normal range: Control Plasma N, Code No. ORKE Pathological range: Control Plasma P, Code No. OUPZ Controls should be run in each series of measurements.
If the result of the control is outside the confidence interval, the determination must be repeated. If the repeated determination confirms the deviation, a new reference curve must be established. Do not release patient results until the cause of the deviation has been identified and corrected. Coagulation Analyzer (see "Limitation of the Procedure")
Protein S Ac Kit can be used with a variety of coagulation analyzers. (follow manufacturer’s instruction manual!)
Limitation of the Procedure
Suitable coagulation analyzers are those for which assay protocols are provided by Dade Behring. The use of Protein S Ac on other coagulation analyzers must be validated by the test laboratory. In such cases, the performance characteristics may differ from those stated. The precision of the test is highly dependent on the precision of pipetting, especially in the case of the small sample volumes!
With deep-frozen samples, the recovery of protein S may be diminished if platelets and leuco-cytes were not carefully separated off during withdrawal of the plasma. Before samples are fro-zen they must be centrifuged a second time.
The existence of a mutation in Factor V at its protein Ca cleavage site may lead to diminished recovery of protein S8.
The antiphospholipid antibodies (e.g. Lupus anticoagulant) may be accompanied by either increased5 or decreased6 Protein S activity test results.
Heparin activities up to 3 U/mL (UFH and LMWH) do not disturb the test. Faktor VIII activities up to 400% do not interfere.
Reference Intervals
In a study with ostensibly healthy subjects (n=218) using the Sysmex® CA-1500 the following data were obtained (5. - 95. Percentile):
60% - > 130%, Median: 95% (Men: 75% - > 130%, Median: 104%; women without oral contracep-tives: 59% - 118%, Median: 90%; women with oral contracepcontracep-tives: 52% - 118%, Median: 81%). Reference values vary from laboratory to laboratory depending on technique used, therefore, each laboratory should establish its own reference interval (For more information on establishing reference intervals see NCCLS document C28-A “ How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Specific Performance Characteristics
Measuring Range
The measuring range for the Sysmex® CA-1500 extends from 10 to 130% of the norm. Specificity
The test detects functionally active protein S. Precision and Reproducibility
For normal plasma samples measured using the Sysmex® CA-1500, the resulting variation coef-ficients ranged between 3.6% and 5.1% within the series of measurements, and between 2.0% and 4.1% from day to day. Total precision ranged from 4.6 to 5.5%.
For pathologically deficient plasma samples which were measured using the Sysmex® CA-1500, the resulting variation coefficients ranged between 4.7% and 9.2% within the series of measure-ments, and between 1.9% and 7.7% from day to day. Total precision ranged from 4.8 to 11.6%. Method Comparison
The Protein S Ac assay was compared to a commercially available protein S assay by evaluation of 239 plasma samples.
A correlation coefficient of r = 0,92 was obtained, with a y-intercept value of 1,53 and a slope of 0,96. The values cited for the specific performance characteristics of the assay represent typical resul-ts and are not to be regarded as specifications for Protein S Ac test.
Bibliography
1. B Dahlbäck: Factor V and Protein S as Cofactors to Activated Protein C. Haematologica 82 (1997) 91-95.
2. D Borgel: Protein S Deficiency. Thromb. Haemost. 78 (1997) 351–356.
3. B Kemkes-Matthes: Acquired Protein S Deficiency, Clin. Investig. 70 (1992) 529-534. 4. C Boyer-Neumann: Comparison of Functional Assays for Protein S: European Collaborative
Stu-dy of Patients with Congenital and Acquired Deficiency. Thromb. Haemost. 70 (1993) 946-950. 5. A S Lawrie: Assay of protein S in Systemic Lupus Erythematosus. Blood Coagulation and
Fibrionolysis 6 (1995) 322-324.
6. E Rossi et al.: Functional Protein S in Women with Lupus Anticoagulant Inhibitor. Thromb Res 65 (1992) 253-262.
7. U.S. Department of Health and Human Services CDC, Biosafety in Microbiological and Bio-medical Laboratories, HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16
8. E M Faioni et al.: Another Protein S Functional Assay is Sensitive to Resistance to Activated Protein C. Thromb. Haemost. 72 (1994) 643-651.
Sysmex is a registered trademark of SYSMEX CORPORATION in the USA, Germany and other countries. Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
USA Distributor: Dade Behring Inc. Newark, DE 19714 U.S.A.
OPAP G03 E0541 (257) W 2
Protein S Ac
Anwendungsbereich
Zur Bestimmung der funktionellen Aktivität von Protein S in menschlichem Plasma.
Diagnostische Bedeutung
Protein S, ein Vitamin K-abhängiges Plasmaprotein, ist der Kofaktor von aktiviertem Protein C (Protein Ca). Es stimuliert die proteolytische Inaktivierung von Faktor Va und VIIIa durch Protein Ca und damit dessen gerinnungshemmende Wirkung 1, 2 . Protein S liegt im Plasma sowohl als freies, gerinnungsphysiologisch aktives Protein als auch in einer inaktiven Form gebunden an das C4b-Bindungsprotein (C4bBP) vor. Eine verringerte Protein S-Aktivität erhöht das throm-boembolische Risiko. Homozygoter Protein S-Mangel führt bei Neugeborenen, ähnlich wie ho-mozygoter Protein C-Mangel, zu Purpura fulminans.
Ursachen für verminderte Protein S-Aktivitäten sind 2,3 - hereditärer Protein S-Mangel
- Leberfunktionsstörungen - orale Antikoagulation - Behandlung mit L-Asparaginase - Schwangerschaft
- orale Kontrazeptiva - Östrogentherapie
- erhöhte Plasmaspiegel an C4bBP als akute Phase-Reaktion.
Die jeweilige Protein S Aktivität kann von der verwendeten Testmethode abhängen4. Zur Abklärung hereditärer oder erworbener Mängel und zur Abgrenzung von einem durch erhöh-tes C4bBP hervorgerufenen Mangel an Protein S-Aktivität wird empfohlen, mit immunologi-schen Methoden freies und gebundenes Protein S zu bestimmen.
Prinzip der Methode
Protein Ca spaltet proteolytisch F Va, der bei der Aktivierung der Gerinnungskaskade durch RVV (Gift von Vipera russelli) entsteht. Protein S wirkt dabei als Kofaktor, der die Reaktion beträcht-lich beschleunigt. Dadurch kommt es zu einer mit der Aktivität an Protein S in der Probe propor-tional zunehmenden Gerinnungszeit. Der Zusatz von Mangelplasma sorgt für eine ausreichende Versorgung des Ansatzes mit Fibrinogen, F V und den anderen benötigten Gerinnungsfaktoren. Die Gerinnung wird auf der Stufe des Faktors X durch den FX-Aktivator aus RVV angestossen. FXa bildet unter Vermittlung des noch verbliebenen Faktors Va Thrombin aus Prothrombin. Thrombin setzt schließlich Fibrinogen um.
Der Gerinnungszeitpunkt kann mechanisch, optisch oder durch andere Messprinzipien detek-tiert werden.
Reagenzien
Inhalt der Handelspackung Testkit Bestell Nr. OPAP
6 x für 1 ml Protein S Ac Mangelplasma 2 x für 2 ml Protein S Ac APC Reagenz 2 x für 5 ml Protein S Ac Startreagenz Zusammensetzung
Protein S Ac Mangelplasma: lyophilisiertes, humanes Citrat-Plasma mit nicht messbarer Rest-aktivität an Protein S. Das Plasma ist ebenfalls frei von C4bBP.
Protein S Ac APC Reagenz, lyophilisiert; gereinigtes und aktiviertes, humanes Protein C mit Zusatz von Calciumchlorid.
Konservierungsmittel: 5-Chlor-2-methyl-isothiazol-3-on (3,8 mg/l), 2-methyl-isothiazol-3-on (1,3 mg/l)
Protein S Ac Startreagenz, lyophilisiert; Aktivator aus dem Gift der Russells Viper (Vipera rus-selli) mit Zusatz von Phospholipiden.
Konservierungsmittel: Natriumazid (0,5 g/l) Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung
2. Beim Umgang mit Natriumazid-haltigen In-vitro-Diagnostica ist zu beachten:
Verschlucken und Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Natriumazid kann mit Schwermetallen, wie Kupfer oder Blei, explosive Azide bilden.
3. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung von Protein S Ac-Mangelplasma vorgese-hen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet.
Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter Ein-haltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden7. Vorbereitung der Reagenzien
Protein S Ac Mangelplasma: mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und mindestens 60 min bei +15 bis +25 °C inkubieren.
Protein S Ac APC Reagenz: mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen und mindestens 60 min bei +15 bis +25 °C inkubieren.
Protein S Ac Startreagenz: mit der auf dem Etikett angegebenen Menge dest. Wasser lösen, bei +37 °C für 60 min in einem Wasserbad inkubieren und vor Gebrauch vorsichtig schütteln. Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen
Der Testkit ist ungeöffnet bei +2 bis +8 °C zu lagern und bis zu dem auf dem Etikett angegebe-nen Datum verwendbar.
Stabilität nach Rekonstitution (verschlossene Fläschen):
Temperatur Protein S Ac Protein S Ac Protein S Ac
Mangelplasma APC Reagenz Startreagenz
+37 °C - - 4 Stunden
+15 bis +25 °C 8 Stunden 8 Stunden 8 Stunden
+2 bis +8 °C - 2 Tage 2 Tage
≤ - 18 °C 2 Monate 2 Monate 2 Monate
Die verschiedenen Gerinnungs-Messgeräte haben individuelle Stabilitätsdaten. Zusätzlich benötigte Materialien
Standard-Human-Plasma, Bestell-Nr. ORKL Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE Kontroll-Plasma P, Bestell-Nr. OUPZ
Gerinnungsmessgerät (siehe Kapitel “Einschränkungen der Testdurchführung”)
Untersuchungsmaterial
Zur Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat-Lösung 0,11 mol/l (3,2%) mit 9 Teilen Venenblut sorg-fältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort mindestens 10 min bei nicht weni-ger als 1500 x g zentrifugieren. Bei Entnahme des Plasmas darauf achten, dass keine Plätt-chen abpipettiert werden. Falls die Probe eingefroren werden soll, erneut zentrifugieren und entnommenes Plasma in einem gut verschlossenen Kunststoffgefäß schnell einfrieren.
Stabilität der Probe:
≤ - 18 °C 1 Monat
+15 bis +25 °C 4 Stunden
Bei ≤ - 18 °C gelagerte Plasmen innerhalb von 10 min bei +37 °C auftauen, mischen und die Bestimmung innerhalb von 4 Stunden durchführen.
Testdurchführung
Detaillierte Informationen zur Testdurchführung können den Bedienungsanleitungen der geeig-neten Gerinnungsmessgeräte und den gerätespezifischen Protein S Ac Anwendungsvorschrif-ten entnommen werden.
Auswertung
Die Auswertung erfolgt anhand einer Bezugskurve, die vorher durch serielle Verdünnung des Standard-Human-Plasma mit Protein S Ac-Mangelplasma erstellt wird. Die Untersuchung des Probenmaterials muss unmittelbar nach der Ermittlung der Referenzkurve erfolgen. Es ist dar-auf zu achten, dass die Bedingungen für die Erstellung der Referenzkurven und den anschlie-ßenden Messungen gleich sind (z. B. Temperatur der Reagenzien).
Interne Qualitätskontrolle
Normalbereich: Kontroll-Plasma N, Bestell-Nr. ORKE Pathologischer Bereich: Kontroll-Plasma P, Bestell-Nr. OUPZ In jeder Messserie muss eine Kontrolle mitgeführt werden.
Liegt das Messergebnis der Kontrolle außerhalb des Vertrauensbereichs, muss die Bestimmung wiederholt werden. Falls die Wiederholung das Messergebnis bestätigt, muss eine neue Refe-renzkurve erstellt werden. Erst wenn die Ursache der Abweichung identifiziert und korrigiert wurde, dürfen Messwerte von Patienten weitergegeben werden.
Gerinnungsmessgeräte (siehe Kapitel "Einschränkungen der Testdurchführung") Das Protein S Ac Kit kann bei einer Vielzahl von Gerinnungsmessgeräten eingesetzt werden (Bedienungsanleitung des Herstellers beachten!).
Einschränkungen der Testdurchführung
Es sind Gerinnungsmessgeräte geeignet, für die Dade Behring Anwendungsvorschriften bereit-stellt. Die Verwendung von Protein S Ac Reagenz an anderen Gerinnungsmessgeräten muss vom Untersuchungslabor validiert werden. Dabei können andere als die angegebenen Lei-stungsdaten erhalten werden.
Die Präzision des Tests hängt stark von der Präzision der Pipettierung, speziell bei kleinen Pro-benvolumina, ab!
Bei tiefgefrorenen Proben kann es zu erniedrigter Wiederfindung von Protein S kommen, wenn Plättchen und Leukozyten nicht sorgfältig bei der Plasmagewinnung abgetrennt wurden. Es ist notwendig, einzufrierende Proben ein zweites Mal zu zentrifugieren.
Das Vorliegen einer Mutation des Faktors V an der Protein Ca-Spaltstelle kann zu einer ernied-rigten Wiederfindung von Protein S führen8.
Antiphospholipid-Antikörper (z.B. Lupus Antikoagulans) können zu erhöhten5 oder erniedrigten6 Protein S-Aktivitätstestergebnissen führen.
Heparinaktivitäten bis 3 U/ml (UFH und LMWH) stören den Test nicht. Faktor VIII-Aktivitäten bis 400% zeigen keine Interferenzen.
Referenzbereich
In einer am Sysmex® CA-1500 durchgeführten Studie mit augenscheinlich gesunden Proban-den (n = 218) wurProban-den folgende Daten erhoben (5. - 95. Percentile):
60% - > 130%, Median: 95% (Männer: 75% - > 130%, Median: 104%; Frauen ohne orale Kontra-zeption: 59% - 118%, Median: 90%; Frauen mit oraler KontraKontra-zeption: 52% - 118%, Median: 81%). Die Referenzbereiche können in Abhängigkeit zur eingesetzten Technik von Labor zu Labor variieren, daher sollte jedes Labor seinen eigenen Referenzbereich bestimmen (Weitere Infor-mationen zur Bestimmung des Referenzbereiches siehe NCCLS-Dokument C28-A “ How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Leistungsmerkmale des Tests
Messbereich
Der Messbereich reicht für den Sysmex® CA-1500 von 10 bis 130% der Norm. Spezifität
Der Test weist funktionell aktives Protein S nach. Präzision und Reproduzierbarkeit
Für Normalplasmen wurden am Sysmex® CA-1500 Variationskoeffizienten in der Serie zwischen 3,6% und 5,1%, von Tag zu Tag zwischen 2,0% und 4,1% gefunden. Die Gesamtpräzision lag zwischen 4,6% und 5,5%.
Für pathologisch erniedrigte Plasmen wurden am Sysmex® CA-1500 Variationskoeffizienten in der Serie zwischen 4,7% und 9,2%, von Tag zu Tag zwischen 1,9% und 7,7% gefunden. Die Gesamtpräzision lag zwischen 4,8% und 11,6%.
Methodenvergleich
Der Protein S Ac Test wurde mit einem anderen kommerziell erhältlichen Protein S Test durch die Bewertung von 239 Plasma-Proben verglichen.
Erzielt wurden ein Korrelationskoeffizient r = 0,92, ein y-Achsenabschnitt von 1,53 und eine Steigung von 0,96.
Die Daten, die als spezifische Leistungsdaten des Tests angegeben werden, stellen typische Ergebnisse dar und sollen nicht als Spezifikationen des Protein S Ac-Tests angesehen werden.
Literatur
Siehe Seite 1.
Sysmex ist eine eingetragene Marke der SYSMEX CORPORATION in den USA, Deutschland und anderen Ländern.
Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Protein S Ac
Domaine d’utilisation
Pour la détermination de l’activité fonctionnelle de la protéine S dans le plasma humain.
Intérêt diagnostique
La protéine S, une protéine plasmatique vitamine K-dépendante, est le cofacteur de la protéine C activée (protéine Ca). Elle stimule l’inactivation protéolytique des facteurs Va et VIIIa par la protéine Ca, et par là leur effet inhibiteur sur la coagulation1,2. La protéine S est présente dans le plasma aussi bien comme protéine libre et active sur le plan physiologique de la coagulation, que, sous forme inactive, comme protéine liée à la protéine de fixation du C4b (C4bBP). Une diminution de l’activité de protéine S augmente le risque thromboembolique. Un déficit homozy-gote en protéine S, tout comme un déficit homozyhomozy-gote en protéine C, provoque chez les nou-veau-nés un purpura fulminans.
Les causes d’une activité de protéine S diminuées sont2,3: - déficit héréditaire en protéine S
- lésions hépatiques - prise d’anticoagulants oraux - traitement à la L-Aspariginase - grossesse
- contraception orale - traitement aux oestrogènes
- taux plasmatique de C4bBP augmenté comme réaction de la phase aiguë. L’activité en protéine S peut varier selon la méthode de dosage utilisée4.
Pour déterminer un déficit héréditaire ou acquis en activité de protéine S, et le différencier d’un déficit dû à une augmentation de C4bBP, il est recommandé de faire un dosage immunologique de la protéine S libre et de la protéine S liée.
Principe de la méthode
La protéine Ca dégrade protéolytiquement le facteur Va qui apparaît, lors de l’activation de la cascade de la coagulation, sous l’effet du VVR (venin de Vipera russelli). Dans ce processus, la protéine S agit comme un cofacteur qui accélère considérablement la réaction. On obtient ainsi un temps de coagulation qui s’allonge proportionnellement à l’activité de protéine S de l’échantillon. L’addition de plasma exempt permet d’obtenir un mélange contenant suffisamment de fibrinogène, de facteur V et d’autres facteurs de la coagulation nécessaires à la réaction. La coagulation arrive au niveau du Facteur X par le FX-activateur provenant du VVR. Le FXa transforme, en présence de Facteur Va résiduel, la prothrombine en thrombine. La thrombine agit enfin sur le fibrinogène.
Le point final du temps de coagulation peut être détecté mécaniquement, photométriquement, ou selon d’autres principes de mesure.
Réactifs
Conditionnement Coffret, code OPAP
6 x pour 1 ml de Plasma exempt de Protéine S Ac 2 x pour 2 ml de Réactif APC Protéine S Ac 2 x pour 5 ml de Réactif déclenchant Protéine S Ac Composition
Plasma exempt de Protéine S Ac : plasma citraté humain, lyophilisé, ayant une activité résidu-elle de protéine S non mesurable. Le plasma est également exempt de C4BBP.
Réactif APC Protéine S Ac, lyophilisé : protéine C humaine, purifiée, activée, et additionnée de chlorure de calcium.
Agents de conservation : 5-chloro-2-méthyl-isothiazol-3-one (3,8 mg/l), 2-méthyl-isothiazole-3-one (1,3 mg/l)
Réactif déclenchant Protéine S Ac, lyophilisé : activateur obtenu à partir de venin de vipère de Russell (Vipera russelli), additionné de phospholipides.
Agent de conservation : azide de sodium (0,5 g/l) Mises en garde et précautions d’emploi
1. Réservé à un usage in vitro.
2. Les réactifs contenant de l’azide de sodium doivent être manipulés avec précaution : ne pas avaler et éviter tout contact avec la peau et les muqueuses. L’azide de sodium peut devenir explosif au contact de métaux lourds comme le cuivre ou le plomb.
3. Tout don de sang individuel prévu pour la préparation du Plasma exempt de Protéine S Ac est testé vis-à-vis de l’antigène HBs, de l’anticorps anti-VHC, de l’anticorps anti-VIH 1 et de l’anticorps anti-VIH 2. Seuls les dons trouvés négatifs sont utilisés.
Indépendamment de cela, tout échantillon (par ex. sérum ou plasma de patient) ou préparation obtenu à partir de sang humain doit être manipulé avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où on ne peut exclure totalement un risque d’infection7. Préparation des réactifs
Plasma exempt de Protéine S Ac : le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le laisser incuber au moins 60 mn à +15/+25°C.
Réactif APC Protéine S Ac : le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, et le laisser incuber au moins 60 mn à +15/+25°C.
Réactif déclenchant Protéine S Ac : le reconstituer avec la quantité d’eau distillée indiquée sur l’étiquette, le laisser incuber au bain-marie 60 mn à +37°C, et l’agiter avec précaution avant emploi.
Stabilités et conditions de conservation
Le coffret non ouvert se conserve à +2/+8°C jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette. Stabilités après reconstitution (flacons fermés) :
Température Plasma exempt Réactif APC Réactif déclenchant de Protéine S Ac Protéine S Ac Protéine S Ac
+37 °C - - 4 heures
+15 / +25 °C 8 heures 8 heures 8 heures
+2 / +8 °C - 2 jours 2 jours
≤ - 18 °C 2 mois 2 mois 2 mois
Chaque automate de coagulation possède des données de stabilité spécifiques. Matériel et autres réactifs nécessaires
Plasma Standard Humain, code ORKL Plasma de contrôle N, code ORKE Plasma de contrôle P, code OUPZ
Automate de coagulation (cf. Chapitre “Limites de réalisation du test”)
Echantillons à tester
Pour obtenir les plasmas, prélever 1 volume de solution de citrate de sodium 0,11 mol/l (3,2 %) avec 9 volumes de sang veineux, et mélanger avec précaution en évitant la formation de mousse. Centrifuger immédiatement pendant au moins 10 minutes à au moins 1500 g. Lors du prélèvement du plasma à l’aide d’une pipette, veiller à ne prélever aucune plaquette. Si le plasma doit être congelé, le centrifuger à nouveau, prélever le plasma surnageant, le distribuer dans un récipient en plastique, bien fermer celui-ci, et congeler rapidement.
Stabilité de l’échantillon : 1 mois à ≤ -18°C 4 heures à +15/+25°C
Décongeler les plasmas conservés à ≤ -18 °C en 10 mn à +37°C, les homogénéiser et les tester dans les 4 heures.
Réalisation du test
Pour toutes informations sur la réalisation du test, se reporter au manuel d’utilisation de l’automate de coagulation utilisé et au protocole d’adaptation du test Protéine S Ac spécifique à l’appareil.
Exploitation
L’exploitation se fait à l’aide d’une courbe d’étalonnage établie à partir d’une série de dilution du Plasma Standard Humain avec le Plasma exempt de Protéine S Ac. Les échantillons de patients doivent être testés immédiatement après la courbe d’étalonnage. Veiller à respecter les mêmes conditions d’analyse pour l’établissement de la courbe d’étalonnage et pour la mesure des échantillons de patients (par ex. température des réactifs).
Contrôle de qualité interne
Domaine normal : Plasma de contrôle N, code ORKE Domaine thérapeutique : Plasma de contrôle P, code OUPZ Introduire un contrôle dans chaque série de mesures.
Si le résultat du contrôle sort de son domaine de confiance, le retester. Si la déviation est confir-mée lors du deuxième test, refaire une nouvelle courbe d’étalonnage. Les résultats des patients ne peuvent être rendus qu’après avoir identifié et corrigé l’origine de la déviation.
Automates de coagulation (cf. Chapitre “Limites de réalisation du test”)
Le coffret Protéine S Ac peut être utilisé sur un grand nombre d’automates de coagulation (re-specter les instructions du fabricant !).
Limites de réalisation du test
Dade Behring propose des protocoles d’adaptation pour certains automates de coagulation. L’utilisation du Réactif Protéine S Ac sur d’autres automates doit être validée par chaque labora-toire. Dans ce cadre, des caractéristiques différentes que celles indiquées ci-dessous pour le test peuvent être obtenues.
La précision du test dépend largement de la précision du pipetage, surtout lorsque les volumes sont faibles !
Lorsqu’on utilise des échantillons congelés, la restitution de protéine S peut être diminuée si les plaquettes et les leucocytes n’ont pas été correctement séparés au moment du prélèvement du plasma. Il est nécessaire de centrifuger deux fois les échantillons devant être congelés. Une mutation du Facteur V au niveau du site de dégradation par la protéine Ca peut entraîner une restitution diminuée de protéine S8.
La présence d’anticorps antiphospholipidiques (par ex. Lupus anticoagulant) peut provoquer une augmentation5 ou une diminution6 de l’activité en protéine S.
Une activité d’héparine jusqu’à 3 U/ml (UFH et LMWH) ne perturbe pas le test. Aucune interférence n’a été observée avec des activités de Facteur VIII jusqu’à 400%.
Domaine de référence
Une étude réalisée avec le Sysmex® CA-1500 sur des sujets apparemment sains (n = 218) a donné les résultats suivants (5ème – 95ème percentile) :
60% à >130%, médiane : 95% (hommes : 75% à >130%, médiane : 104% ; femmes sans contraception orale : 59% à 118%, médiane : 90% ; femmes sous contraception orale : 52% à 118%, médiane : 81%).
Les domaines de références peuvent varier d’un laboratoire à un autre selon la technique utili-sée. C’est pourquoi chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine de référence (pour plus d’informations sur la détermination du domaine de référence, se reporter au document NCCLS C28-A ” How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Caractéristiques du test
Domaine de mesure
Le domaine de mesure pour le Sysmex® CA-1500 s’étend de 10 à 130% de la normale. Spécificité
Le test révèle la protéine S fonctionnellement active. Précision et reproductibilité
Pour des plasmas normaux, les coefficients de variation suivants ont été trouvés sur le Sysmex® CA-1500 : répétabilité de 3,6% à 5,1%, et reproductibilité de 2,0% à 4,1%. La précision globale a été trouvée entre 4,6% et 5,5%.
Pour des plasmas pathologiquement diminués , les coefficients de variation suivants ont été trouvés sur le Sysmex® CA-1500 : répétabilité de 4,7% à 9,2%, et reproductibilité de 1,9% à 7,7%. La précision globale a été trouvée entre 4,8% et 11,6%.
Comparaison avec une autre méthode
Le test Protéine S Ac a été comparé à un autre test Protéine S du commerce, en testant 239 échantillons plasmatiques. Les données suivantes ont été obtenues : coefficient de corrélation de r = 0,92, intersection de l’axe des y à 1,53 et pente de 0,96.
Les valeurs indiquées comme caractéristiques du dosage représentent des résultats types et ne doivent pas être considérées comme des spécifications du test Protéine S Ac.
Littératur
Cf. page 1.
Sysmex est une marque déposée de SYSMEX CORPORATION aux USA, en Allemagne et dans d’autres pays.
Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OPAP G03 E0541 (257) W 4
Protein S Ac
Uso previsto
Per la determinazione dell’attività funzionale della proteina S nel plasma umano.
Significato diagnostico
La proteina S, una plasmaproteina vitamina K-dipendente, è il cofattore della proteina C attivata (proteina Ca). Essa stimola l’inattivazione proteolitica del fattore Va e VIIIa mediante la proteina Ca e quindi il suo effetto inibitorio sulla coagulazione1,2. La proteina S si riscontra nel plasma, sia come proteina coagulante libera fisiologicamente attiva, sia in forma inattiva legata alla proteina legante il C4b (C4bBP). Una ridotta attività della proteina S fa aumentare il rischio tromboembo-lico. Nei neonati la carenza omozigote di proteina S, analogamente alla carenza omozigote di proteina C, è causa di Purpura fulminans.
Le cause di ridotta attività della proteina S sono2,3: - carenze congenite di proteina S
- affezioni epatiche
- terapia con anticoagulanti orali - trattamento con L-asparaginasi - gravidanza
- contraccezione orale - terapia a base di estrogeni
- aumentato livello plasmatico di C4bBP quale reazione della fase acuta. L’attività della proteina S è legata ai metodi impiegati4.
Per la diagnosi di carenze congenite e per distinguere una carenza dell’attività della proteina S dovuta ad un aumento della C4bBP, si consiglia di determinare la proteina S libera e legata con metodi immunologici.
Principio del metodo
La proteina Ca scinde proteoliticamente il F Va, generato durante l’attivazione della cascata della coagulazione, mediante RVV (veleno di Vipera russell). La proteina S agisce quindi da cofattore che accelera la reazione, conducendo così a tempi di coagulazione che crescono in proporzione al contenuto di proteina S presente nel campione. L’aggiunta di plasma carente permette di ottenere una miscela contenente sufficiente fibrinogeno, Fattore V e altri fattori della coagulazione, necessari alla coagulazione.
La coagulazione viene stimolata fino al livello del Fattore X, mediante l’attivatore FX ottenuto da RVV. Per l’azione del Fattore Va residuo, il FXa, trasforma la protrombina in trombina. La trom-bina infine trasforma il fibrinogeno in fibrina.
Il tempo di coagulazione può essere individuato meccanicamente, otticamente o con altri metodi di misura.
Reagenti
Contenuto della confezione Kit, codice OPAP
6 x 1 mL Plasma carente di proteina S Ac 2 x 2 mL Reagente proteina S Ac APC 2 x 5 mL Reagente attivatore per proteina S Ac Composizione
Plasma carente di proteina S Ac: plasma umano liofilizzato citratato con un’attività residua di proteina S non misurabile. Il plasma è pure esente da C4bBP.
Reagente proteina S Ac APC, liofilizzato: proteina C umana purificata e attivata con aggiunta di cloruro di calcio.
Conservante: 5-cloro-2-metil-isotiazolo-3-one (3,8 mg/L). 2-metil-isotiazolo-3-one (1,3 mg/L).
Reagente attivatore per proteina S Ac, liofilizzato: attivatore estratto da veleno di vipera Rus-sell Viper (Vipera rusRus-selli) con aggiunta di fosfolipidi
Conservante: sodio azide (0,5 g/L) Avvertenze e precauzioni
1. Solo per uso diagnostico in vitro.
2. Quando si impiegano diagnostici in vitro contenenti sodio azide osservare le seguenti pre-cauzioni: non ingerire ed evitare contatti con la cute e le mucose.
La sodio azide a contatto con metalli pesanti, come rame e/o piombo, può formare azidi esplosive.
3. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione del plasma carente di proteina S è stata esaminata per la ricerca dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B e degli anti-corpi anti-HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione.
Tuttavia, poiché non è possibile escludere con assoluta certezza il pericolo di agenti patoge-ni, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni ris-pettando le norme di sicurezza sul rischio biologico7.
Preparazione dei reagenti
Plasma carente di proteina S Ac: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata in eti-chetta e incubare per almeno 60 min. a +15/+25°C.
Reagente proteina S Ac APC: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata in etichetta e incubare per almeno 60 min. a +15 /+25°C.
Reagente attivatore per proteina S Ac: sciogliere con la quantità di acqua distillata indicata in etichetta, incubare in bagnomaria per 60 min. a +37°C e mescolare delicatamente prima dell’uso.
Conservazione e stabilità
I reagenti in confezione originale, conservati a +2/+8°C, sono stabili fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta. Stabilità dopo ricostituzione (flaconi chiusi):
Temperatura Plasma carente di Reagente Reagente attivatore proteina S Ac proteina S Ac APC per proteina S Ac
+37 °C - - 4 ore
+15/+25 °C 8 ore 8 ore 8 ore
+2/+8 °C - 2 giorni 2 giorni
≤ - 18 °C 2 mesi 2 mesi 2 mesi
I diversi analizzatori hanno dati di stabilità individuali. Materiale necessario ma non fornito
Plasma umano standard, codice ORKL Plasma di controllo N, codice ORKE Plasma di controllo P, codice OUPZ
Analizzatore per coagulazione (v. “Limitazioni della procedura”).
Campioni in esame
Per la preparazione del plasma mescolare accuratamente, evitando la formazione di schiuma, 1 parte della soluzione di citrato di sodio, 0,11 mol/L (3,2 %), con 9 parti di sangue venoso. Centri-fugare subito per 10 min. ad almeno 1500 x g. Nel separare il plasma accertarsi che le piastrine non vengano rimosse con la pipetta. Se il campione dovesse essere congelato, ripetere la centrifugazione e congelare velocemente il plasma prelevato ben sigillato in contenitori di plastica.
Stabilità del campione:
≤ -18°C 1 mese
+15/+25°C 4 ore
Scongelare entro 10 min. a + 37°C il plasma conservato a ≤ -18°C ed effettuare l’analisi entro 4 ore.
Metodica
Per maggiori informazioni fare riferimento al manuale d’uso del produttore e ai fogli applicativi per la Proteina S specifici dell’analizzatore.
Risultati
La valutazione avviene mediante una curva di calibrazione, allestita in precedenza dosando diluizioni seriali di Plasma umano standard con Plasma carente di proteina S. Dopo la prepara-zione della curva di calibraprepara-zione procedere immediatamente con l’analisi del campione. Occorre fare attenzione affinché le condizioni per l’allestimento delle curve di calibrazione siano le stesse di quelle rispettate per la successiva misura dei campioni (ad es. temperatura dei reagenti). Controllo di qualità interno
Intervallo normale: Plasma di controllo N, codice ORKE Intervallo patologico: Plasma di controllo P, codice OUPZ In ciascuna serie di misure occorre inserire un controllo.
In caso di variazione dei controlli rispetto all’intervallo di accettabilità, ripetere la determinazione. Se anche questa seconda determinazione conferma la deviazione, preparare una nuova curva di calibrazione. Non rilasciare i risultati del paziente, se prima non sono state identificate e rimos-se le caurimos-se della deviazione.
Analizzatori per coagulazione (v. “Limitazioni della procedura”)
Il kit Proteina S Ac può essere utilizzato con una varietà di analizzatori per coagulazione (consul-tare il manuale d’uso del produttore).
Limitazioni della procedura
Utilizzare analizzatori per coagulazione per i quali la Dade Behring fornisce i protocolli analitici. L’utilizzo della Proteina S Ac su altri analizzatori per coagulazione deve essere validato dal labo-ratorio. In tal caso, le caratteristiche del test possono differire da quelle indicate.
La precisione del test è strettamente legata alla precisione con cui si esegue il pipettamento, specialmente di piccoli volumi!
In campioni congelati è possibile ottenere un basso recupero di proteina S, se durante la prepa-razione del plasma, le piastrine e i leucociti non sono stati accuratamente separati. Si raccoman-da di centrifugare una seconraccoman-da volta i campioni prima di congelarli.
La presenza di una mutazione al livello del sito di scissione del Fattore V da parte della proteina Ca può portare ad un recupero ridotto di proteina S8.
Gli anticorpi anti-fosfolipidi (ad es. anticoagulante Lupus) possono portare ad un aumento5 o una diminuzione6 dei risultati del test di attività della Proteina S.
L’attività di eparina fino a 3 U/mL (UFH e LMWH) non influenza il test. L’attività di Fattore VIII fino al 400% non interferisce con il test.
Intervalli di riferimento
In uno studio condotto su soggetti apparentemente sani (n= 218) con Sysmex® CA-1500 si sono ottenuti i seguenti risultati (5-95° percentile):
60% - > 130%, mediana: 95% (uomini: 75% - > 130%, mediana: 104%; donne senza contraccezio-ne orale: 59% - 118%, mediana: 90%; doncontraccezio-ne con contracceziocontraccezio-ne orale: 52% - 118%, mediana: 81%). I valori di riferimento differiscono da laboratorio a laboratorio, a seconda della tecnica utilizzata; pertanto ogni laboratorio dovrebbe stabilire il proprio intervallo di riferimento (per maggiori infor-mazioni consultare il documento NCCLS C28-A “How to Difine and Determine Reference Inter-vals in the Clinical Laboraotory”. Linee Guide approvate).
Caratteristiche specifiche del test
Intervallo di misura
L’intervallo di misura per il Sysmex® CA-1500 si estende da 10 a 130% della norma. Specificità
Il test rivela la proteina S funzionalmente attiva. Precisione e riproducibilità
Per i plasmi normali misurati con l’uso di Sysmex® CA-1500, i coefficienti di variazione nelle serie sono risultati essere compresi tra 3,6% e 5,1%, e tra serie sono risultati essere compresi tra 2,0% e 4,1%. La precisione totale è compresa tra il 4,6% e 5,5%.
Per i plasmi patologicamente carenti, misurati con l’uso del Sysmex® CA-1500, i coefficienti di variazione nelle serie sono risultati essere compresi tra 4,7% e 9,2%, e tra serie sono risultati essere compresi tra 1,9% e 7,7%. La precisione totale è compresa tra il 4,8% e 11,6%. Confronto fra i metodi
Il test Proteina S Ac è stato confrontato con un test proteina S disponibile in commercio, median-te la valutazione di 239 campioni di plasma.
Si è ottenuto un coefficiente di correlazione di r = 0,92 con una intercetta y = 1,53 ed un penden-za di 0,96.
I valori indicati per le caratteristiche specifiche del test rappresentano risultati tipici e non devono essere considerati come specifiche per il test Proteina S Ac.
Bibliografia
Vedere pagina 1.
Sysmex è un marchio registrato della SYSMEX CORPORATION negli USA, in Germania e negli altri Paesi.
Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Protein S Ac
Campos de aplicación
Para la determinación de la actividad funcional de la Proteína S en plasmas humanos.
Significado diagnóstico
La proteína S, una proteína del plasma dependiente de la vitamina K, es el cofactor de la proteí-na C activada (proteíproteí-na Ca). La proteíproteí-na S estimula la iproteí-nactivación proteolítica de los factores Va y VIIa mediante la proteína Ca y de esta manera su acción inhibidora en la coagulación1, 2. La proteína S existe en el plasma tanto en forma libre, proteína activa en la fisiología de la coagu-lación, como en una forma inactiva unida a la proteína fijadora del C4b (C4bBP). Una baja actividad de proteína S aumenta el riesgo tromboembólico. El déficit de proteína S en homocigo-tos, al igual que el déficit de proteína C en los mismos, ocasiona en recién nacidos púrpura fulminans.
Las causas para una disminución en la actividad de la proteína S son2, 3 - deficiencias hereditarias de proteína S
- alteraciones de las funciones del hígado - anticoagulantes orales
- tratamiento con L-asparaginasa - embarazo
- anticonceptivos orales - terapéutica con estrógenos
- un nivel elevado de C4bBP en plasma como reacciones de fase aguda.
La correspondiente actividad de la proteína S depende del método de ensayo utilizado4. Para aclarar las deficiencias hereditarias o adquiridas y para delimitar una deficiencia en la actividad de la proteína S, ocasionada por un aumento en C4bBP, se recomienda la determina-ción de la proteína S libre y unida, empleando métodos inmunoquímicos.
Principio del método
La proteína Ca disocia proteolíticamente el factor Va, el cual se produce durante la activación de la cascada de la coagulación por medio del RVV (veneno de Vipera russelli). La proteína S actúa en este caso como cofactor acelerando considerablemente la reacción. Así, se produce un au-mento en el tiempo de coagulación proporcional a la actividad de la proteína S en la muestra. La adición, a la preparación, de un plasma deficiente permite el suministro adecuado de fibrinóge-no, factor V y de otros factores necesarios para la coagulación.
La coagulación se activa en la etapa del factor X por medio del activador FX, proveniente del RVV. El factor Xa genera, bajo la mediación del factor Va restante, trombina a partir de protrom-bina. La trombina transforma finalmente el fibrinógeno.
El tiempo de coagulación se puede determinar mecánicamente, ópticamente o por otros princi-pios de medida.
Reactivos
Contenido del envase comercial Teskit, N° de pedido OPAP
6 x para 1 ml Protein S Ac Plasma deficiente 2 x para 2 ml Protein S Ac Reactivo APC 2 x para 5 ml Protein S Ac Reactivo iniciador Composición
Protein S Ac Plasma deficiente: Plasma humano citratado, liofilizado y sin actividad restante medible de proteína S. Este plasma está igualmente libre de C4bBP.
Protein S Ac Reactivo APC, liofilizado; Proteína C-humana purificada y activa, con adición de cloruro de calcio.
Agentes de conservación: 5-cloro-2-metil-isotiazol-3-ona (3,8 mg/l), 2-metil-isotiazol-3-ona (1,3 mg/l).
Protein S Ac Reactivo iniciador, liofilizado; activador obtenido del veneno de Russells Viper (Vipera russelli), con adición de fosfolípidos.
Agente de conservación: azida de sodio (0,5 g/l). Advertencias y medidas de seguridad
1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro.
2. En el manejo de diagnósticos in-vitro que contengan azida sódica debe observarse la siguiente regla: No ingerir y evitar contacto con la piel y mucosas. La azida sódica puede formar azidas explosivas con metales como cobre y plomo.
3. Cada donación de sangre destinada a la preparación del Protein S Ac Plasma deficiente, fue sometida a pruebas para detectar la presencia de HBsAg, anti-HCV, anti-HIV 1 y anti-HIV. Para la elaboración sólo se utilizaron donaciones con resultados negativos.
Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir sangre humana deben ser manipulados con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad reco-mendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente la existencia de agentes patógenos7.
Preparación de reactivos
Protein S Ac Plasma deficiente: Disolver en la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta e incubar entre +15 y +25°C por lo menos durante 60 min.
Protein S Ac Reactivo APC: Disolver en la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta e incubar entre +15 y +25°C por lo menos durante 60 min.
Protein S Ac Reactivo iniciador: Disolver en la cantidad de agua destilada indicada en la etiqueta e incubar, en baño de agua, durante 60 min. a +37°C. Agitar cuidadosamente antes de usarse. Estabilidad y almacenaje
El testkit aún cerrado y almacenado a una temperatura entre +2 y +8°C puede ser utilizado hasta la fecha de vencimiento dada en la etiqueta.
Estabilidad después de la reconstitución (frascos cerrados):
Temperatura Protein S Ac Protein S Ac Protein S Ac
Plasma deficiente Reactivo APC Reactivo iniciador
+37 °C - - 4 horas
entre +15 y +25 °C 8 horas 8 horas 8 horas
entre +2 y +8 °C - 2 días 2 días
≤ - 18 °C 2 meses 2 meses 2 meses
Los diferentes aparatos de medida de la coagulación tienen datos individuales de estabilidad. Materiales adicionales necesarios
Plasma humano estándar, N° de pedido ORKL Plasma de control N, N° de pedido ORKE Plasma de control P, N° de pedido OUPZ
Aparato de medida de la coagulación (ver capitulo „ Limitaciones del procedimiento“)
Material a investigar
Para obtener el plasma mezclar cuidadosamente 1 parte de solución de citrato de sodio 0,11 mol/l (3,2 %) con 9 partes de sangre venosa, evitando la formación de espuma. Centrifugar inmediatamente durante 10 min. por lo menos a 1500 x g.
Al retirar el plasma tener cuidado de no pipetear las plaquetas. En caso de que las mue-stras tengan que ser congeladas, centrifugarlas de nuevo y congelar el plasma separado rápi-damente en un recipiente plástico herméticamente cerrado.
Estabilidad de la muestra:
< - 18°C 1 mes
entre +15 y +25°C 4 horas
Las muestras almacenadas a < - 18°C se deben descongelar en máximo 10 min. a 37°C, mez-clarse y su determinación debe efectuarse dentro de las 4 horas siguientes.
Procedimiento
Detallada información sobre el desarrollo del test se puede tomar del manual de operaciones del aparato apropiado para medir la coagulación y de las instrucciones de aplicación especificas del aparato para proteína S.
Valoración
La valoración se hace por medio de una curva de referencia, preparada con anterioridad, con una serie de diluciones del plasma humano estándar con el Protein S Ac Plasma deficiente. El estudio de las muestras debe hacerse inmediatamente después de preparar la curva de refe-rencia. Es importante tener en cuenta, que las condiciones para la preparación de las curvas de referencia y las utilizadas para las medidas sean las mismas (por ej. la temperatura de los reactivos).
Control de calidad interno
Rango normal: Plasma de control N, N° de pedido ORKE Rango patológico: Plasma de control P, N° de pedido OUPZ Con cada serie de medidas se debe medir un control.
Si los resultados de las medidas del control se encuentran por fuera de su rango de confianza, se debe repetir la determinación del control. Si después de la repetición, se comprueba la des-viación, se debe realizar una nueva curva de referencia. Los resultados de los pacientes deben ser entregados únicamente cuando la causa de esta desviación sea conocida y eliminada. Aparato de medida de la coagulación (ver capítulo „Limitaciones del procedimiento“) El kit Proteína S Ac puede ser utilizado en un gran número de aparatos de medida de la coagu-lación (¡Observe las instrucciones de manejo del fabricante!).
Limitaciones del procedimiento
Existen aparatos de medida de la coagulación apropiados, para los cuales Dade Behring tiene listo instrucciones de manejo. El uso del reactivo Protein S Ac en otros aparatos de medida de la coagulación debe ser validado por el laboratorio que realiza la investigación. En este caso, se pueden obtener para las características otros valores diferentes a los dados.
¡La precisión del test depende especialmente de la precisión al pipetear, especialmente para volúmenes pequeños de muestra!
En muestras congeladas se puede llegar a tener una muy baja recuperación de la proteína S, cuando las plaquetas y los leucocitos no son separados completamente al obtener el plasma. Las muestras que se van a congelar deben centrifugarse por una segunda vez.
La existencia de una mutación del factor V en el sitio de ruptura de la proteína Ca puede condu-cir a una reducción de la recuperación de la proteína S8.
Anticuerpos antifosfolípidos (por ej., anticoagulante lúpico) pueden conllevar a resultados de la actividad de la proteína S elevados5 o disminuidos6.
Actividades de heparina hasta de 3 U/ml (UFH y LMWH) no alteran el test. Actividades del factor VIII hasta de 400% no muestran ninguna interferencia.
Rango de referencia
En un estudio realizado con el Sysmex® CA-1500, con sujetos de apariencia sana (n = 218) se obtuvieron los siguientes datos (5. - 95. percentile):
60% - > 130 %, mediana: 95% (Hombres: 75% -> 130%, mediana 104%; Mujeres sin anticon-cepción oral: 59% - 118%, mediana: 90%; Mujeres con anticonanticon-cepción oral: 52% - 118%, media-na: 81%).
Los rangos de referencia pueden variar de laboratorio a laboratorio dependiendo de la técnica utilizada, por esta razón deberá cada laboratorio determinar sus propios rangos de referencia. (Para mayor información sobre la determinación de los rangos de referencia ver los documentos NCCLS C28-A „How to Define and Determinate Reference Intervals in the Clinical Laboratory“, Approved Guideline).
Características del test
Rango de medida
El rango de medida para el Sysmex® CA-1500 va de 10 a 130% del valor normal. Especificidad
El test registra proteína S activa funcional. Precisión y reproducibilidad
Para plasmas normales el coeficiente de variación de la serie en el Sysmex® CA-1500 se encu-entra entre 3,6 % y 5,1 % y para las medidas día a día entre 2,0 % y 4,1 %. La precisión total se encontró entre 4,6% y 5,5%.
Para plasmas patológicamente disminuidos se encontraron en el Sysmex® CA-1500 coeficientes de variación de la serie entre 4,7 % y 9,2 %, y para las medidas día a día entre 1,9 % y 7,7 %. La precisión total se encontró entre 4,8% y 11,6%.
Comparación de métodos
El test Protein S Ac fue comparado con otro test para proteína S existente en el comercio medi-ante la valoración de 239 muestras de plasmas.
Se obtuvo un coeficiente de correlación r = 0,92, un corte del eje-y de 1,53 y una pendiente de 0,96.
Los datos dados como datos específicos de las características del test, representan resultados típicos y no se deben tomar como especificaciones del test Protein S Ac.
Literatura
Ver la página 1.
Sysmex es una marca de fábrica registrada de SYSMEX CORPORATION en USA, Alemania y en otros países.
Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
OPAP G03 E0541 (257) W 6
Protein S Ac
Campo de aplicação
Para determinação da actividade funcional da proteína S no plasma humano.
Significado diagnóstico
A proteína S, uma proteína plasmática dependente da vitamina K, é o co-factor da proteína C activada (proteína Ca). Ela estimula a inactivação proteolítica dos factores Va e VIIIa através da proteína C e, dessa maneira, o seu efeito inibidor da coagulação 1,2. A proteína S existe no plasma sob a forma de uma proteína livre activa da coagulação fisiológica e sob a forma de uma proteína inactiva ligada à proteína de ligação C4b (C4bBP). Uma redução da actividade da proteína S aumenta o risco tromboembólico. Nos recém-nascidos, a deficiência homozigótica de proteína S provoca, tal como a deficiência homozigótica de proteína C, Purpura fulminans. As causas para a redução de actividade da proteína S são 2,3
- Deficiência hereditária de proteína S - Perturbações hepáticas funcionais - Anti-coagulação oral
- tratamento com L-Asparaginase - Gravidez
- Anticoncepcionais orais - Terapia com estrogéneo
- Nível elevado de CAbMP no plasma como reacção de fase aguda.
A actividade da respectiva proteína S pode depender do método de ensaio utilizado 4. Para a clarificação das deficiências hereditárias ou adquiridas de proteína S e a demarcação da deficiência de actividade da proteína S provocada pelo nível elevado de C4bBP, é aconselhável proceder à determinação da proteína S, na sua forma livre e ligada, com métodos imunológicos.
Princípio metodológico
A proteína Ca produz a degradação proteolítica do F Va originado pelo RVV (veneno da Vipera russelli) durante a activação da cascata da coagulação.
Neste caso, a proteína S actua como co-factor que acelera a reacção consideravelmente. Desse modo, ocorre um aumento do tempo de coagulação que é proporcional à actividade da proteína S na amostra. A adição de plasma deficiente encarrega-se de fornecer à preparação fibrinogénio, F V e os outros factores de coagulação necessários, de forma suficiente. A coagulação é impulsionada ao nível do factor X pelo activador FX do RVV. Com a intervenção do factor Va ainda remanescente, o FXa forma trombina a partir da protrombina. Por fim, a trombina transforma o fibrinogénio. O momento da coagulação pode ser detectado de forma mecânica, óptica ou através de outros princípios de medição.
Reagentes
Conteúdo da embalagem comercial Kit de teste ref. OPAP
6 x para 1 ml Protein S Ac Plasma deficiente 2 x para 2 ml Protein S Ac APC Reagente 2 x para 5 ml Protein S Ac Reagente inicial Composição
Protein S Ac Plasma deficiente: Liofilizado de plasma humano citratado com actividade resi-dual da proteína S não mensurável. O plasma também está isento de C4bBP.
Protein S Ac APC Reagente, liofilizado de proteína C humana purificada e activada, com adição de cloreto de cálcio.
Conservante: 5-cloro-2-metil-isotiazol-3-on (3,8 mg/l), 2-metil-isotiazol-3-on (1,3 mg/l)
Protein S Ac Reagente inicial, liofilizado, activador de veneno da víbora de Russell (Vipera russelli) com adição de fosfolípidos.
Conservante: Azida de sódio (0,5 g/l). Advertências e medidas de precaução 1. Só para uso diagnóstico in vitro.
2. Ao manipular diagnósticos in vitro que contêm azida de sódio, é necessário prestar atenção ao seguinte: Evitar a ingestão ou o contacto com a pele ou mucosas. A azida de sódio em contacto com os metais pesados como o cobre ou o chumbo pode formar azidas explosivas. 3. Cada dávida individual de sangue destinada à preparação de Proteína S Ac plasma deficien-te, foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, HCV, HIV1 e Anti-HIV2. Na preparação só foram utilizadas dávidas com resultado negativo. Independente-mente disso, todos as amostras e produtos obtidos a partir de sangue humano (p. ex., soros e plasmas de pacientes) devem ser manuseados com as precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco biológico, uma vez que o risco de contaminação por agentes patogénicos nunca pode ser inteiramente excluído 7. Preparação dos reagentes
Protein S Ac Plasma deficiente: Dissolver com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e deixar incubar 60 min., no mínimo, entre +15 e +25 °C.
Protein S Ac APC Reagente: Dissolver com a quantidade de água destilada indicada no rótulo e deixar incubar 60 min., no mínimo, entre +15 e +25 °C.
Protein S Ac Reagente inicial: Dissolver com a quantidade de água destilada indicada no rótulo, incubar durante 60 min. em banho-maria à temperatura de +37 °C e agitar cuidadosamente antes de usar. Estabilidade e condições de conservação
O kit de teste deverá ser conservado, não aberto, entre +2 e +8 °C e poderá ser usado até à data indicada no rótulo.
Estabilidade após a reconstituição (frascos fechados):
Temperatura Protein S Ac Protein S Ac Protein S Ac
Plasma deficiente APC Reagente Reagente inicial
+37 °C - - 4 horas
+15 a +25 °C 8 horas 8 horas 8 horas
+2 a +8 °C - 2 dias 2 dias
≤ - 18 °C 2 meses 2 meses 2 meses
Os diversos aparelhos de medição da coagulação possuem dados individuais de estabilidade. Outros materiais necessários
Plasma humano padrão, ref. ORKL Plasma de controlo, ref. ORKE Plasma de controlo P, ref. OUPZ
Aparelho de medição de coagulação (vide o capítulo ”Limitações de realização do teste”)
Material de análise
Para a obtenção de plasma, misturar cuidadosamente 1 parte de solução de citrato de sódio 0,11 molar/l (3,2 %) com 9 partes de sangue venoso, evitando a formação de espuma. Centrifu-gar, imediatamente, durante 10 min., a não menos de 1500 x g. Ao extrair o plasma, prestar atenção a que as plaquetas não sejam retiradas com a pipeta.
Se se pretender congelar esta amostra, centrifugar uma vez mais e congelar rapidamente o plasma extraído num recipiente de plástico bem fechado.
Estabilidade da amostra:
≤ - 18 °C 1 mês +15 a +25 °C 4 horas
Descongelar a +37° C os plasmas conservados a ≤ - 18 °C num espaço de tempo de 10 min., misturar e executar a análise num espaço de 4 horas.
Execução do teste
Informações detalhadas sobre a execução do teste podem ser consultadas no manual de in-struções dos coagulómetros apropriados e nas inin-struções de uso da Proteína S Ac específicas do aparelho.
Avaliação dos resultados
A avaliação é feita com base numa curva de referência que foi estabelecida previamente através de diluições em série do plasma humano padrão com Protein S Ac Plasma deficiente. A análise do material da amostra tem de ser feita imediatamente após a determinação da curva de referência. Dar atenção a que as condições para o estabelecimento das curvas de referência e as me-dições seguintes sejam as mesmas (p. ex., a temperatura dos reagentes).
Controlo de qualidade interno
Intervalo normal: Plasma de controlo N, ref. ORKE Intervalo patológico: Plasma de controlo P, ref. OUPZ
Em cada série de medição deverá ser efectuado um controlo conjuntamente.
Se o resultado da medição do controlo se situar fora do intervalo de confiança, a determinação terá de ser repetida. Caso a repetição confirme o resultado da medição, é necessário estabele-cer uma curva de referência nova. Os valores de medição dos pacientes só poderão ser divulga-dos, depois da causa do desvio ter sido identificada e eliminada.
Coagulómetros (vide o capítulo “Limitações de execução do teste”)
O Kit de Protein S Ac pode ser utilizado numa multiplicidade de coagulómetros (Seguir o manu-al de utilização do fabricante!).
Limitações de execução do teste
São apropriados os coagulómetros para os quais a Dade Behring disponibiliza instruções de uso. A utilização do Reagente Protein S Ac noutros coagulómetros tem de ser validada pelo laboratório de análise. Neste caso, podem obter-se características de performance diferentes das indicadas. A precisão do teste depende muito da precisão da pipetagem, em especial com volumes de amostras pequenos! Nas amostras congeladas rapidamente, se as plaquetas e os leucócitos não forem removidos cuidadosamente durante a extracção do plasma, a recuperação de proteí-na S pode ser reduzida. É necessário centrifugar as amostras a congelar uma segunda vez. A presença de uma mutação do factor V no ponto de desagregação da proteína Ca pode provo-car uma recuperação reduzida da proteína S 8.
Os anticorpos antifosfolípidos (p. ex., o anticoagulante lúpus), podem provocar resultados de teste de actividade da proteína S elevados 5 ou reduzidos6.
Actividades de heparina até 3U/ml (UFH e LMWH) não perturbam o teste. Actividades do factor VIII até 400% não apresentam interferências.
Intervalo de referência
Num estudo executado no Sysmex® CA-1500 com indivíduos testados aparentemente saudá-veis (n = 218) foram colhidos os seguintes dados (5. - 95. percentis):
60% - > 130%, valor médio: 95% (homens: 75% - > 130%, valor médio: 104%; mulheres com contracepção oral: 59% 118%, valor médio: 90%; mulheres com contracepção oral: 52% -118%, valor médio: 81%).
Os intervalos de referência podem variar de laboratório para laboratório em função da técnica utiliza-da e, por isso, cautiliza-da laboratório deverá definir o seu intervalo de referência próprio. (Vide mais infor-mações sobre a definição do intervalo de referência no documento C 28-A do NCCLS ”How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory”, Approved Guideline).
Características do teste
Intervalo de medição
Para o Sysmex® CA-1500 é suficiente um intervalo de referência de 10 a 130% da norma. Especificidade
O teste detecta a proteína S funcionalmente activa. Precisão e reprodutibilidade
Nos plasmas normais, no Sysmex® CA-1500 foram encontrados coeficientes de variação na série de 3,6% e 5,1% e de 2,0% a 4,1% no dia a dia. . A precisão total situou-se entre 4,6% e 5,5%.
Nos plasmas com valores patológicos reduzidos, no Sysmex® CA-1500 foram encontrados coeficientes de variação na série de 4,7% e 9,2%, e de 1,9% e 7,7% no dia a dia. . A precisão total situou-se entre 4,8% e 11,6%.
Comparação de métodos
O teste Protein S Ac foi comparado com um outro teste de proteína S disponível no mercado, através da avaliação de 239 amostras de plasma.
Obteve-se um coeficiente de correlação de r = 0,92, um segmento axial y 1,53 e um aumento 0,96. Os valores indicados para as características específicas do teste representam resultados típi-cos e não devem ser considerados como especificação para o teste Protein S Ac.
Bibliografia
Vide a página 1.
Sysmex é uma marca registada da SYSMEX CORPORATION nos EUA, na Alemanha e noutros países. Dade Behring Marburg GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
www.dadebehring.com
Edição Dezembro 2002
Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles / Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos
Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario para Diagnóstico In Vitro Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de Lote Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de vencimiento / termo da validade
Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE
Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de Catálogo Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice d’Utilisation / Istruzioni per l’uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as Instruções de Utilização
IVD
LOT
EXPCCYY-MM-DD
