DEISY NATALI MESA OSPINA

HIDROXIAPATITA E HIDROXIAPATITA CON

RECUBRIMIENTO DE QUITOSANO OBTENIDAS POR

DIVERSOS MÉTODOS.

DEISY NATALI MESA OSPINA

POSGRADO EN INGENIERÍA DE MATERIALES

FACULTAD DE INGENIERÍA

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

MEDELLÍN, 2017

EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS, MECÁNICAS

Y BIOLÓGICAS DE SCAFFOLDS DE HIDROXIAPATITA E

HIDROXIAPATITA CON RECUBRIMIENTO DE QUITOSANO

OBTENIDAS POR DIVERSOS MÉTODOS.

DEISY NATALI MESA OSPINA

Trabajo de grado para optar al título de Msc en Ingeniería de

Materiales

Directora

DIANA MARCELA ESCOBAR SIERRA

Ing Met. Ph.D. en Ciencias Químicas

Grupo de Investigación en Biomateriales

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE INGENIERÍA

MEDELLÍN

2017

AGRADECIMIENTOS

Mi primer agradecimiento sin sonar a cliché es para Dios porque en especial me ha dado tanto, un poco más de lo que he merecido siempre, por sus tantas bendiciones, amor, por no abandonarme a pesar de todo.

A mi asesora Diana Marcela Escobar docente del programa de Bioingeniería y coordinadora del laboratorio de Biomateriales del Programa de Bioingeniería, porque ha sido la única persona que se ha preocupado realmente por el apoyo tanto académico como personal en esta investigación, me ha estimulado y corregido todo el tiempo que ha sido necesario, dando un gran aporte intelectual y algunas bases necesarias hasta para la vida.

A Andrés López gran amigo y persona, que hizo parte esencial en este proceso, ayudándome con el trabajo de laboratorio, el apoyo y la compañía en momentos que necesite de alguien, de una mano y un apoyo; que quede plasmado aquí mi gran admiración y agradecimiento para estas dos últimas personas.

Al laboratorio de BIOMAT por el acceso a todas sus instalaciones, equipos, reactivos y demás mientras estuve en experimentación. A los docentes Diego Giraldo y Ricardo Aristizabal de Ingeniería de Materiales por el préstamo de algunos equipos para los ensayos mecánicos y químicos respectivamente. A Dayana Meza del SEM por su gran amabilidad y disposición siempre. A Sara Robledo y Victoria Ospina del PECET que contribuyeron en una parte esencial del proyecto con las pruebas y ensayos biológicos

in vitro.

Y por último a mi Alma Mater la Universidad de Antioquia por existir y formarme en todos los aspectos, porque en ella he pasado los mejores y peores momentos de mi vida. Porque siempre la tendré en el corazón y no existe una Universidad que me hubiese hecho sentir tan orgullosa de ser egresada…

TABLA CONTENIDO

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y ALCANCES ... 21

1.1. INTRODUCCIÓN ... 21

1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 22

1.3. ALCANCE DEL PROYECTO ... 24

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 1 ... 25

CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE ... 26

2.1. TEJIDO ÓSEO ... 26

2.2. BIOMATERIALES DE USO EN MEDICINA REGENERATIVA ... 35

2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS PROPIEDADES DE LOS BIOMATERIALES PARA IT ... 62

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 2 ... 66

CAPÍTULO 3. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL ... 74

3.1. OBJETIVOS... 74

3.2. MATERIALES Y METODOLOGÍA EXPERIMENTAL... 74

3.2.2.4. Preferencias de Diseño ... 79

3.2.5. Caracterización físico-química de scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo 83 3.2.6. Caracterización morfológica y superficial de los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo ... 84

3.2.7. Caracterización mecánica de los scaffolds mediante ensayos de compresión ... 92

3.2.8. Evaluación de la biocompatibilidad mediante ensayos biológicos in vitro ... 93

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 3 ... 99

CAPÍTULO 4. RESULTADOS, ANÁLISIS Y DISCUSIÓN ... 101

4.1. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA DE LOS SCAFFOLDS DE HA CON Y SIN RECUBRIMIENTO DE Qo ... 101

4.1.1. Obtención de los scaffolds de HA ... 101

4.1.2. Obtención de los recubrimientos de Qo sobre scaffolds de HA ... 102

4.1.3. Fluorescencia de rayos X (FRX) ... 103

4.1.4. Espectroscopía de dispersión de energía (EDS). ... 104

4.1.5. Difracción de rayos X (DRX) ... 105

4.1.6. Espectroscopía Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) ... 108

4.2. CARACTERIZACIÓN MORFÓLOGICA Y SUPERFICIAL DE LOS SCAFFOLDS ... 113

4.2.1. Estereomicroscopía de la superficie de los scaffolds ... 113

4.2.2. Microscopía electrónica de barrido (SEM) ... 115

4.2.3. Ensayo de degradabilidad in vitro en SBF ... 123

4.2.4. Porosidad e interconectividad de los scaffolds ... 130

4.2.5. Mojabilidad y adhesividad de los recubrimientos de Qo ... 139

4.2.6. Trabajo de adhesión termodinámico (Wad) ... 143

4.3. CARACTERIZACIÓN MECÁNICA DE LOS SCAFFOLDS ... 144

4.3.1. Ensayo de resistencia mecánica a la compresión ... 144

4.3.2. Correlación De Datos ... 151

4.4. CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DE LOS SCAFFOLDS ... 153

4.4.1. Citotoxicidad celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo ... 153

4.4.2. Proliferación celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo ... 155

4.4.3. Adhesión, interacción y morfología celular de los scaffolds de HA con recubrimiento de Qo. ... 157

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 4 ... 165

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama que representa los componentes del tejido óseo [3]. ... 27

Figura 2. Corte longitudinal para ilustrar el hueso cortical y trabecular a nivel macroscópico (a) Corte longitudinal y transversal de hueso cortical ilustrando a nivel microscópico las osteonas, la capilarización, el endiostio y el periostio (b) [2]. ... 28

Figura 3. Tipos de células óseas [6]. ... 30

Figura 4. Fases del remodelado óseo normal (BRU: Unidad de Remodelado Óseo; CL: línea de cemento; OS: osteoide) [10]. ... 33

Figura 5. Tipos de implantes para regeneración de tejido. ... 34

Figura 6. Evolución histórica de las técnicas utilizadas para el tratamiento de diferentes afecciones [11]. ... 36

Figura 7. Ingeniería de tejidos aprovechada para regeneración de tejidos. Existen dos estrategias diferentes in vivo e in vitro. Ambos métodos usan scaffolds porosos los cuales son cargados con células [21]. ... 38

Figura 8. Estructura química de la quitosano [31]. ... 47

Figura 9. Esquema en el que se representan los principales tipos de recubrimientos superficiales sobre materiales [33]. ... 54

Figura 10. Tipo de crecimiento de un cultivo celular (monocapa, en suspensión o tridimensionales con esquema de las morfologías de las células en cultivo [60]. ... 58

Figura 11. Tipos de cultivo de tejidos, adaptada y modificada de Handbook [58 y 60]. . 59

Figura 12. Diferentes cultivos celulares de acuerdo a su origen, modificación genética y fenotípica [60]. ... 61

Figura 13. Esquema de procesos (unidad experimental y variables del diseño experimental). ... 77

Figura 14. Esquema del procedimiento planteado para la obtención de scaffolds de HA por la técnica gel-casting. ... 80

Figura 15. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el

film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA. ... 82

Figura 16. Técnica de recubrimiento obtenido entre la superficie de contacto que une el film y el material que actúa de sustrato, siendo en este caso HA. ... 83

Figura 17. Estereomicroscopio Zeiss DV4 con cámara digital incorporada. ... 84

Figura 18. Microscopio Electrónico de Barrido marca Jeol JSM-6490LV. ... 85

Figura 19. Obtención de degradabilidad in vitro en SBF. ... 87

Figura 20. Montaje para la obtención del porcentaje de porosidad e interconectividad de los scaffolds. ... 88

Figura 21. Esquema del sistema de ángulo de contacto [10]. ... 90

Figura 22. Imagen de los componentes del tensiómetro digital Krüss K-12. ... 91

Figura 23. Tensiómetro de superficie (a) Método de placa de Wilhelmy (b) [11]. ... 92

Figura 24. Ensayos de compresión para scaffolds en Máquina Universal Diggimes. ... 93

Figura 25. Metodología general propuesta para los ensayos biológicos. ... 94

Figura 26. Línea celular SAOS2 (anclo dependientes) al microscopio óptico (X20 y X40). ... 95

Figura 27. Esquema del área de trabajo y disposición de materiales en campana de cultivo celular para evaluación biológica in vitro, adaptada y modificada de [12]. ... 95

Figura 28. Montaje para el ensayo de citotoxicidad con MTT. ... 97

Figura 29. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting, sin sinterizar (a), con 50% de sólidos (b) y con 60% de sólidos (c). ... 101

Figura 30. Soluciones de Qo a diferentes concentraciones (a), scaffolds recubiertos en solución de Qo (b). ... 102

Figura 31. Imágenes obtenidas al SEM de scaffolds de HA por gel-casting (a) Espectros EDS correspondiente a las superficies de los Scaffolds de HA (b). ... 104

Figura 32. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con menor tiempo de exposición (5min). ... 106

Figura 33. Difractograma obtenido para scaffolds de HA preparados por gel-casting (a) y para scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones (b - e) con mayor tiempo de exposición (30min). ... 108

Figura 34. Espectro infrarrojo obtenido para el Qo (a), scaffolds de HA preparados por gel - casting (b) y scaffolds de HA con recubrimientos de quitosano a diferentes concentraciones (c – f) a mayor tiempo de exposición (20 min). ... 109

Figura 35. Espectro Infrarrojo de estándares de hidroxiapatita HAp (a), quitosano CS (b) y partículas hibridas de HAp – CS a diferentes concentraciones (c y d) [14]. ... 112

Figura 36. Scaffolds de HA preparados por gel-casting vistos con aumentos de 8X (a) y 16X (b) al estereomicroscopio. ... 113

Figura 37. Scaffolds de HA con recubrimientos de Qo observadas al estereomicroscopio en aumentos de 8X y 16X. ... 114

Figura 38. Scaffolds de HA obtenidos por gel-casting observados al SEM en aumentos de 40X (a), 500X (b), 1000X (c) y 2500X (d). ... 116

Figura 39. Scaffolds de HA reportados en la literatura observados al SEM a diferentes aumentos, poros esféricos de 100–200 µm (a), superficie de scaffolds (b) [16, 17, 18]. ... 117

Figura 40. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 0.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 1000X. ... 118

Figura 41. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 1%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 2000X. ... 118

Figura 42. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 1.5%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumento de 500X... 119

Figura 43. Imágenes al SEM y EDS obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo al 2%, menor tiempo de inmersión (5 min) en aumentos de 500X. ... 119

Figura 44. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (0.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min) aumento de 500X. ... 120

Figura 45. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (1%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumentos de 2000X. ... 120

Figura 46. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (1.5%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 500X. ... 121

Figura 47. Imágenes al SEM (a) y EDS (b) obtenidos para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo (2%), mayor tiempo de inmersión (20 min), aumento de 2000X. ... 121

Figura 48. Gráfico de barras obtenido para la pérdida de peso de los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo con su respectiva D.E. ... 125

Figura 49. Estadística descriptiva para datos de degradabilidad de las muestras. ... 126

Figura 50. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo para el menor tiempo de inmersión. ... 128

Figura 51. Gráfico de pH vs tiempo para scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo para el mayor tiempo de inmersión. ... 128

Figura 52. Representación de la degradación de las películas de Qo en SBF. ... 126

Figura 53. Morfología celular en scaffold microporoso [29].. ... 126

Figura 54. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA patrón (sin recubrimiento de Qo) a 40X, 200X y 500X. ... 133

Figura 55. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y menor tiempo de inmersión (5 min) a 35X y 200X. ... 134

Figura 56. Estructura y medidas de porosidad obtenidas al SEM para scaffolds de HA con recubrimiento de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1. 1.5 y 2%) y mayor tiempo de inmersión (20 min) a 40X y 200X. ... 135

Figura 57. Hueso esponjoso o trabecular al SEM 200X (Narváez, 2004) [35].. ... 151

Figura 58. Estadística descriptiva para datos de porosidad de las muestras. .. ... 151

Figura 59. Estadística descriptiva para datos de interconectividad de las muestras. .. . 151

Figura 60. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%)... ... 151

Figura 61. Curva obtenida con el método de Washburn para los scaffolds de HA con solución de Qo a diferentes concentraciones (0.5, 1, 1.5 y 2%). .. ... 151

Figura 62. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con recubrimientos de Qo a menor tiempo de inmersión... 151

Figura 63. Curvas de tensión – Deformación para scaffolds de HA patrón y con recubrimientos de Qo a mayor tiempo de inmersión. .. ... 151

Figura 64. Scaffolds con y sin recubrimiento de Qo obtenidos después del ensayo de compresión (a mayor tiempo de inmersión). .. ... 151

Figura 65. Estadística descriptiva para datos de resistencia mecánica de las muestras. .. ... 151

Figura 66. Estadística descriptiva para datos de módulo elástico de las muestras. .. ... 151

Figura 67. Correlación de variables respuesta. . .. ... 151

Figura 68. Resultados de citotoxicidad mediante ensayo de MTT para las muestras de los scaffolds evaluados y el control. . .. ... 151

Figura 69. Evaluación in vitro: Las imágenes corresponden al cultivo de células Saos-2 en presencia de los biomateriales luego de 48 horas de incubación. A: M1, B: M2, C: M3, D: M4, E: M5 y F: Células sin biomaterial (Aumento 20X). . .. ... 151

Figura 70. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M1 (scaffold de HA patrón). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. . .. ... 151

Figura 71. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M2 (scaffold de HA con recubrimiento 0,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. ... 159

Figura 72. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M3 (scaffold de HA con recubrimiento 1% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. . ... 151

Figura 73. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M4 (scaffold de HA con recubrimiento 1,5% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000, 3000 y 4000X. ... 161

Figura 74. Prueba de adherencia de las células Saos2 al M5 (scaffold de HA con recubrimiento 2% Qo). Las flechas indican la presencia de las células adheridas al material luego de 48 horas de cultivo, aumentos de 1000 y 3000X. ... 161

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades mecánicas del hueso cortical y trabecular [5]. ... 29

Tabla 2. Tipos de respuestas del tejido al implante [25]. ... 41

Tabla 3. Propiedades de la Hidroxiapatita [31]. ... 44

Tabla 4. Métodos para modificación superficial de biomateriales [21]. ... 53

Tabla 5. Parámetros de las formulaciones generadas en el diseño de experimentos. ... 78

Tabla 6. Concentración de iones del SBF y plasma sanguíneo humano [3, 4]. ... 86

Tabla 7. Orden, cantidad y peso fórmula de los reactivos para preparación de SBF. ... 86

Tabla 8. Composición química de scaffolds de hidroxiapatita obtenidos por gel-casting. ... 103

Tabla 9. Análisis químico por EDS para scaffolds de HA sin recubrimiento. ... 105

Tabla 10. Comparación de valores de los difractogramas de rayos X. ... 107

Tabla 11. Bandas de vibración reportadas en la literatura [13]. ... 110

Tabla 12. Características obtenidas al SEM reportadas para los scaffolds de HA con recubrimientos de Qo a diferentes concentraciones y tiempos. ... 123

Tabla 13. Porcentaje de pérdida de peso de los scaffolds (Degradabilidad). ... 124

Tabla 14. Resultados de Porosidad e Interconectividad para los scaffolds de HA con y sin recubrimiento de Qo y su respectiva D.E. ... 130

Tabla 15. Valores promedio de los tamaños de poro obtenidos al SEM. ... 136

Tabla 16. Ángulo de contacto para scaffolds de HA con las diferentes soluciones de Qo. ... 140

Tabla 17. Tensión superficial y viscosidad de las soluciones de Qo a diferentes concentraciones. ... 141

Tabla 18. Trabajo de adhesión (Wad), para la interacción entre los sustratos HA/recubrimientos Qo. ... 143

Tabla 19. Propiedades mecánicas de los scaffolds de HA con y sin recubrimientos de Qo. ... 146

Tabla 20. Resumen estadístico de datos de las variables respuesta.. ... 152

Tabla 21. Correlaciones de Pearson entre variables respuesta. ... 152

Tabla 22. Porcentajes de viabilidad de células (Saos-2) cultivadas en los scaffolds evaluados con y sin recubrimiento de Qo. ... 154

Tabla 23. Porcentajes de proliferación celular (Saos-2) cultivadas en los scaffolds evaluados con y sin recubrimiento... ... 152

GLOSARIO

Biomaterial: Cualquier sustancia o combinación de sustancias, distinta de las drogas, de origen sintético o natural, que puede ser usada por cualquier período de tiempo para aumentar o reemplazar parcialmente o totalmente cualquier tejido, órgano o función del cuerpo, con el fin de mantener o mejorar su función. Éstos deben cumplir unos requisitos imprescindibles como no ser citotóxico, mutágeno, alergénico, cancerígeno, ni radiactivo. Para que esto se cumpla deben ser química, mecánica, y clínicamente compatibles y sus productos de degradación no deben ser tóxicos.

Biocompatibilidad: Capacidad de un material para cumplir su función en una aplicación específica con una respuesta apropiada por parte del tejido. Capacidad de para cumplir su función terapéutica sin producir efectos indeseados, sean locales o sistémicos, en el beneficiario del tratamiento, pero sí originando la respuesta más apropiada a nivel celular o tisular en esa situación concreta, optimizando así el efecto terapéutico beneficioso más relevante de dicho tratamiento.

Biodegradabilidad: Un material biodegradable, es no tóxico y se disuelve al colocarlo en el medio biológico. La composición del material debe ser tal que pueda ser disuelto químicamente por los fluidos fisiológicos o bien consumido por los macrófagos. Diseñado para degradarse gradualmente en el tiempo y ser remplazado por tejido natural

Ingeniería de tejidos: Es la aplicación de principios y métodos de ingeniería para el entendimiento de estructuras funcionales y el desarrollo de sustitutos biológicos para restaurar, mantener o mejorar tejidos y sus funciones.

Scaffold: Son estructuras tridimensionales porosas que sirven como base o soporte y poseen nutrientes esenciales para la proliferación celular. La traducción de la palabra scaffold es andamio, pero en español se conoce como matriz o cuerpo poroso.

Recubrimiento: Corresponde a películas superficiales formadas con los productos de una reacción o adhesión entre el sustrato y el medio circundante que se adhiere a dicha superficie, constituyendo una barrera física cuyas características más apreciadas son impermeabilidad, invisibilidad, tenacidad, baja solubilidad, aumento de la vida útil, protección, etc.

Hidroxiapatita: La HA es un fosfato de calcio (Ca10(PO4)6OH) con composición similar a la

parte mineral del tejido óseo, es biocompatible y bioactiva, por lo cual es un material ideal para regeneración ósea.

Quitosano: [poli (1-4)-β-D-glucosamina] es un biopolímero resultante de la N-desacetilación de la quitina y se obtiene principalmente a partir de crustáceos, hongos y algunas algas. Segundo polímero natural más abundante de la tierra y posee comportamiento policationico capaz de atraer moléculas cargadas negativamente, que da como resultado su naturaleza antibacteriana.

Gel-Casting: Este proceso consiste en la polimerización de una solución acuosa de polvo cerámico y monómeros orgánicos para formar una espuma, obteniéndose cuerpos con porosidad abierta e interconectada que posibilitan el crecimiento celular y la vascularización en su interior al momento de ser implantados; mejorando así la osteointegración del material.

Osteoinductividad: Es el proceso mediante el cual las células madre y osteoprogenitoras, células pluripotenciales, son reclutadas en el sitio de regeneración ósea y estimuladas para diferenciarse a osteoblastos.

Formazan: Es un compuesto artificial insoluble en agua, producto de la reducción de sales de tetrazolio por deshidrogenasas y reductasas y es utilizado entre otras cosas para pruebas con células para identificar la cantidad de células vivas por medio de densitometría óptica. Tiene una variedad de colores de azul oscuro a rojo profundo a naranja, dependiendo de la sal de tetrazolio original utilizado como sustrato para la reacción.

Alamar Blue: Colorante indicador redox que produce un cambio colorimétrico y una señal fluorescente en respuesta a la actividad metabólica. Es seguro y no tóxico y se utiliza para el análisis cuantitativo de la viabilidad celular y la proliferación celular, bioensayos de citoquinas y en estudios de citotoxicidad in vitro.

Proliferación celular: Es el incremento del número de células por división celular.

Resistencia mecánica: Capacidad de los materiales de soportar fuerzas que pasan a través de ellos.

ABREVIATURAS

HA: Hidroxiapatita Qo: Quitosano

IT: Ingeniería de tejidos

ASTM: American Society for Testing Materials

SBF: Fluido Corporal Simulado (Simulated Body Fluid) SFB: Suero Fetal Bovino

SEM: Microscopía Electrónica de Barrido EDS: Espectroscopia por electrones dispersos DRX: Difracción de Rayos X

FTIR: Espectroscopia Infrarroja por transformada de Fourier XRF: Espectroscopía de fluorescencia de rayos X

TGA: Análisis Termo gravimétrico MO: Microscopia Óptica

MTT: Bromuro de 3-(5,4 dimetil tizol-2-I) -2-5 difenil tretrazolium) Ti6Al4V: Aleación de titanio con aluminio al 6% y vanadio al 4%

BMP: Proteína morfogenética ósea ECM: Matriz Extracelular

DMEM: Medio mínimo esencial para el cultivo celular PMMA: Polimetil metacrilato

PVA: Polivinil alcohol

ANOVA: Análisis de varianza de una vía

MANOVA: Analisis multivariante de la varianza UV: Ultravioleta visible

MPa: Megapascales E: Módulo elástico σ: Tensión

ɛ: Deformación ρ: Densidad

RESUMEN

Un material ideal para reemplazar el hueso tiene que imitar al tejido que reemplaza respondiendo de manera adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento, además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir ningún tipo de afección. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades como estructura, funcionalidad y además ser tolerado adecuadamente por el organismo. Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto que más se emplea, por ser el que facilita mejor su recuperación. Sin embargo, es limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria otra intervención quirúrgica, la cual puede resultar en un procedimiento traumático.

Por lo anterior, las investigaciones en el área de ingeniería de tejidos como alternativa de solución para reemplazo óseo tienen como fundamento esencial el uso de biomateriales usados para plataformas de crecimiento celular o soporte, conocidos como scaffolds y el uso de células asociadas a éstos, esto exige que las variables de estudio correspondan en lo posible al entorno real. Por otra parte, la literatura especializada para ingeniería de tejidos muestra además un aumento en la tendencia hacia el desarrollo de andamiajes con materiales compuestos por cerámica y adición de polímeros, ya que la preparación de estos va a permitir la incorporación de propiedades favorables de ambos componentes.

Debido a esta tendencia, en esta investigación se desarrollaron scaffolds de hidroxiapatita (HA) con 50% de sólidos por medio de la técnica gel-casting basada en la polimerización in situ de monómeros de acrilamida para formar un cuerpo poroso, estos fueron recubiertos con un polímero natural biodegradable llamado Quitosano a diferentes concentraciones mediante una metodología sencilla de inmersión a diferentes tiempos de exposición y en condiciones ambientales. El recubrimiento de Quitosano se realizó con el fin de verificar la influencia de este en las propiedades mecánicas, la estabilidad de los scaffolds y el comportamiento celular, comparando con las propiedades del hueso a fin de mejorar los prerrequisitos necesarios para un implante ortopédico.

Este material fue evaluado in vitro mediante pruebas de citotoxicidad, proliferación, y adhesión con el fin de observar las interacciones de las células óseas con el material,

con el fin de verificar su biocompatibilidad. Además, estos materiales fueron analizados mediante ensayos mecánicos y técnicas de caracterización tales como difracción de rayos X (XRD), espectroscopía infrarroja por transformada de fourier (FTIR) y microscopía electrónica de barrido (SEM) para determinar la porosidad y la interconexión, así como otras propiedades químicas, físicas y superficiales, entre otras. Por último, con este proyecto se obtuvieron características de un material el cual puede ser una buena alternativa en términos mecánicos y biológicos para ser utilizado en campo de la ortopedia y regeneración de hueso.

Los resultados de todas las pruebas mostraron que los scaffolds de HA con recubrimientos de quitosano presentaron en general buenas propiedades de resistencia mecánica y de degradabilidad, adecuadas para su uso en regeneración de tejido óseo, confirmando considerablemente mejoras en éstas y demostrando un blindaje eficaz y eficiente de los scaffolds de HA en condiciones fisiológicas a mayor concentración de quitosano con respecto a los scaffolds de HA sin recubrimiento. Los ensayos de biocompatibilidad revelaron resultados favorables.

Palabras clave: Hidroxiapatita, quitosano, biopolímero, scaffold, biocompatibilidad, ensayos in vitro, gel-casting, inmersión.

ABSTRACT

An ideal material for bone replacements needs to have the faculty of imitating the host tissue reacting in a suitable manner to requirements of form and function, also providing a proper response to the biological system without induce any kind of disease. While the material interacts with tissue, simultaneously it must acquire its properties like structure, functionality and be tolerated by the host. Generally, autologous implants are the most often used due to their high compatibility and recuperation. However, this option is limited for the amount of available tissue and these required a second surgery which can do of this a traumatic procedure.

Therefore, researches around tissue engineering focused on find alternative solution for the bone replacement have a main purpose the use of biomaterials as platform to induce the cell growth, these structures are called as scaffolds, and the use of cells associated with them, in this conditions is important to have the control of variables as close as possible to the real environment. On the other hand, specialized literature in tissue engineering shows an increasing trend toward the development of scaffolds mixing ceramic and polymers with the purpose to improve and complement the properties of both materials.

Due to this trend, in this research, scaffolds of Hydroxyapatite (HA) with 50% solids will be produced by gel-casting based on polymerization in situ of acrylamide monomers to form a porous body, and were coated with a biodegradable natural polymer chitosan different concentrations, by the technique of dip coating at different times under environmental conditions. The coating of chitosan is performed in order to verify the influence of the mechanical properties, the stability of scaffolds and cell behavior, compared to the properties of bone to improve the prerequisites for an orthopedic implant.

This material will be evaluated in vitro using cytotoxicity, proliferation, adhesion test and by observation of interactions of bone cells with the material in order to verify their biocompatibility. Furthermore, these materials will be analyzed by mechanical tests and characterization techniques such as X-ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and Scanning electron microscopy (SEM) to determine porosity and interconnectivity as well as other properties. Finally with this project we expect to have a good material which can be a good alternative in mechanical and biological terms to be used in orthopedic field and bone regeneration.

The results of the tests indicated that scaffolds of HA with coatings of chitosan presented in general good properties of mechanical resistance and degradability, suitable for their use in regeneration of bone tissue, showing improvements and demonstrating an efficient protection of HA scaffolds under physiological conditions at higher concentration of chitosan with respect to uncoated HA scaffolds. The biocompatibility tests revealed favorable results.

Key words: Hydroxyapatite, chitosan, biopolymers, scaffolds, biocompatibility, in vitro tests, gel- casting, dip coating.

CAPÍTULO 1.

INTRODUCCIÓN, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y ALCANCES

1.1. INTRODUCCIÓN

Un material ideal para reemplazar o regenerar el hueso tiene que imitar al tejido respondiendo de manera adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento, además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir ningún tipo de infección. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades y ser tolerado adecuadamente por el organismo [1]. Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto que más se emplea, por ser el que facilita mejor su recuperación. Sin embargo, es limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria otra intervención quirúrgica ya que puede presentarse infección o rechazo [2].

Debido a esto surge la ingeniería de tejidos como una disciplina necesaria debido a los múltiples daños degenerativos a los que está expuesto el hueso ya sea por enfermedad o traumatismo; con el empleo de factores bioactivos y de scaffolds como soportes pueden obtenerse estructuras conductoras e inductoras, que proporcionan apoyo mecánico e integridad al hueso y que permiten a su vez un crecimiento adecuado del tejido natural [3].

La producción de scaffolds es una de las opciones que más se está empleando en la actualidad debido a que se pueden utilizar células del propio paciente, lo que disminuye el rechazo. Las características que deben cumplir éstos son las de biocompatibilidad, la no generación de productos tóxicos de desecho, estructura de poros accesibles, interconectados y de tamaño adecuado, además si éste es de un material biodegradable la degradación no debe darse antes de que las células logren realizar una proliferación adecuada. Para tal fin se han usado técnicas de síntesis de scaffolds utilizando diversas técnicas y materiales, entre estos, algunos cerámicos bioactivos como la Hidroxiapatita (HA), la cual debido a su capacidad de enlazarse directamente al tejido óseo resulta ser idóneo para regeneración ósea, sin embargo, como presenta muy baja resistencia, no es posible su implantación en lugares del cuerpo con altas cargas mecánicas [4].

Por otra parte, cabe resaltar que la matriz ósea está compuesta por dos fases principales; una inorgánica que es la fase dura compuesta por minerales de tipo fosfato de calcio tipo apatitas y la orgánica compuesta por proteínas y colágeno, esta asociación de materiales permite darle la resistencia necesaria para soportar las cargas. Para tratar de simular este tipo de estructuras en la ingeniería de tejidos se ha dado una mayor tendencia a desarrollar scaffolds híbridos con materiales compuestos de cerámica y polímeros, buscando asociar las excelentes propiedades osteoconductivas de los cerámicos, a su vez la flexibilidad y degradabilidad de los polímeros [5]. De ahí que la preparación de compuestos de fosfatos de calcio y biopolímeros, permitan la asociación de propiedades favorables de ambos componentes.

En los últimos años el quitosano ha mostrado grandes ventajas para aplicaciones biomédicas, este polímero natural es no tóxico, biodegradable, biocompatible y bioadhesivo, otra ventaja muy importante es su excelente propiedad de bioestimulación, la cual facilita la reconstrucción y vascularización de los tejidos dañados, además de poseer la capacidad para compensar las deficiencias de los componentes celulares que conducen a la formación de cicatrices pequeñas [6].

1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos juega un papel muy importante; específicamente el uso de sustitutos óseos, ya sea para reemplazar el tejido afectado o para favorecer su regeneración. Un material ideal para reemplazo tiene que imitar al tejido que reemplaza respondiendo de forma adecuada a sus requerimientos de forma y funcionamiento, además de promover una respuesta adecuada del sistema biológico sin inducir infecciones. A medida que interactúa con el tejido debe adquirir sus cualidades y ser tolerado adecuadamente por el organismo.

Generalmente, el tejido óseo extraído del propio paciente es el sustituto más comúnmente empleado, por ser el que facilita la mejor recuperación. Sin embargo, es limitada la cantidad de tejido que puede ser auto trasplantado y a veces es necesaria otra intervención quirúrgica [7]. Por esto se hace necesario buscar otras alternativas de regeneración, como por ejemplo, el uso de biocerámicas para la creación de plataformas tridimensionales (scaffolds) que sirvan de estructura de soporte temporal para hacer crecer las células óseas, y una vez implantados estos scaffolds se forme el nuevo tejido.

Uno de los materiales más estudiados en este campo para la fabricación scaffolds es la Hidroxiapatita [HA, Ca10 (PO4)6(OH)2], cuya composición química es similar a la del hueso

(fase inorgánica). Es un cerámico bioactivo debido a su capacidad de enlazarse directamente al tejido óseo y es uno de los más utilizados debido a esta característica y a las propiedades que posee de biocompatibilidad y osteointegración, está entre los más importantes sustitutos del hueso humano en implantes [8], además ofrece diversas posibilidades de conformación, siendo posible fabricar polvos, recubrimientos, cuerpos densos y scaffolds; estos últimos pueden ser utilizados para el relleno de defectos óseos o como plataformas de crecimiento celular [9].

La principal desventaja de este material es que presenta baja resistencia mecánica, sin embargo, con el fin de mejorar esta propiedad y producir scaffolds cerámicos que puedan ser usadas como scaffolds, se han desarrollado diferentes técnicas de procesamiento entre las cuales están la infiltración de espumas poliméricas, el gel-casting, la liofilización, el prototipado rápido y las combinaciones entre ellas, etc. A su vez, con la utilización de agentes reticulantes se logra mejorar la resistencia mecánica y otorgar porosidades que promuevan la adhesión, la migración, el crecimiento y la proliferación celular, para una buena integración con el tejido circundante, a fin de mejorar la respuesta biológica del hueso y ser un firme candidato como sustituto de injertos óseos [2, 10].

Cabe resaltar además que la matriz ósea está compuesta por dos fases principales; una inorgánica que es la fase dura compuesta por minerales de tipo fosfato y la orgánica compuesta por proteínas y colágeno, esta asociación de materiales permite darle la resistencia necesaria para soportar las cargas. Para tratar de simular este tipo de estructuras en la ingeniería de tejidos se ha dado una mayor tendencia a desarrollar scaffolds híbridos con materiales compuestos por cerámica y polímeros, buscando asociar las excelentes propiedades osteoconductivas de los cerámicos, a su vez la flexibilidad y degradabilidad de los polímeros. De ahí que la preparación de compuestos de fosfatos de calcio y biopolímeros, permitan la asociación de propiedades favorables de ambos componentes.

Por lo expuesto anteriormente y a la tendencia a desarrollar scaffolds para ingeniería de tejidos con materiales cerámicos y poliméricos se plantea en este proyecto la posibilidad de realizar un método alternativo que permita la obtención de estas estructuras porosas con un cerámico comercial de hidroxiapatita por el método de gel-casting y recubrirlas con películas de quitosano a diferentes concentraciones con el fin de comprobar el efecto que pueda aportar este biopolímero sobre los scaffolds de HA con respecto a sus diversas propiedades físicas, químicas, mecánicas y biológicas, con el fin de determinar si cumplirán los requisitos de biocompatibilidad y biofuncionalidad idóneos para ser considerados en la regeneración ósea.

1.3. ALCANCE DEL PROYECTO

Este proyecto empieza con una serie de fundamentos teóricos y un estado del arte que contextualizan al lector, luego se detalla la obtención de los scaffolds de hidroxiapatita, el desarrollo de los recubrimientos y de las técnicas de caracterización y por último, se presentan los resultados obtenidos.

Básicamente se centra en los siguientes aspectos:

Capítulo 2. Marco teórico y Estado del arte: Se encuentran los fundamentos teóricos sobre los elementos utilizados para desarrollar los materiales y recubrimientos de estudio, las características de biomateriales en general, scaffolds y recubrimientos, las técnicas de caracterización y un acercamiento a los cultivos celulares

Capítulo 3. Objetivos, Materiales y métodos: Se describen los objetivos planteados para el desarrollo de la investigación y se detallan los materiales y métodos utilizados para obtener los scaffolds y recubrimientos con el biopolímero, como caracterizarlos química, física, mecánica y biológicamente y el diseño experimental aplicado a dicha investigación.

Capítulo 4. Resultados y discusión: contiene los resultados obtenidos en proceso de obtención y ensayos de caracterización, con una breve discusión y explicación de cada uno de ellos.

Capítulo 5. Conclusiones: conclusiones generales extraídas de toda la experimentación y los resultados obtenidos durante la investigación.

Cada capítulo cuenta con sus respectivas referencias bibliográficas; trabajos de investigación, tesis, artículos científicos utilizados para la realización del proyecto, patentes, libros y consultas de internet.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO 1

[1] R. Sastre, S. Aza, and J. San Román, Biomateriales. Castelló de la Plana: Faenza Editrice Ibérica, 2004.

[2] C. A. Martínez and A. Ozols, “Biomateriales utilizados en cirugía ortopédica como sustitutos del tejido óseo,” Rev. la Asoc. Argentina Ortop. y Traumatol., vol. 77, no. 2, pp. 140–146, 2012.

[3] G. Wei and P. X. Ma, “Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and polymer/bone-like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres,” J. Biomed.

Mater. Res. - Part A, vol. 78, no. 2, pp. 306–315, 2006.

[4] C. B. Carter and G. Norton, Ceramic Materials: Science and Engineering, Second. USA: Springer New york, 2013.

[5] C. Peniche, Y. Solís, N. Davidenko, and R. García, “Materiales compuestos de quitosana e hidroxiapatita,” Biotecnología Aplicada, vol. 27, no. 3. Madrid - España, p. 10, 2010.

[6] S. K. Mishra and S. Kannan, “Development, mechanical evaluation and surface characteristics of Chitosan/polyvinyl alcohol based polymer composite coatings on titanium metal,” J. Mech. Behav. Biomed. Mater., vol. 40, pp. 314–324, 2014.

[7] U. Valle and U. Valle, “Desarrollo y caracterización de cementos óseos macroporosos de fosfato de calcio,” vol. 37, p. 129, 2006.

[8] P. Sepulveda, J. G. P. Binner, S. O. Rogero, O. Z. Higa, and J. C. Bressiani, “Production of porous hydroxyapatite by the gel-casting of foams and cytotoxic evaluation,” J.

Biomed. Mater. Res., vol. 50, no. 1, pp. 27–34, 2000.

[9] A. Woesz, M. Rumpler, J. Stampfl, F. Varga, N. Fratzl-Zelman, P. Roschger, K. Klaushofer, and P. Fratzl, “Towards bone replacement materials from calcium phosphates via rapid prototyping and ceramic gelcasting,” Mater. Sci. Eng. C, vol. 25, no. 2, pp. 181–186, 2005.

[10] K. Zhao, Y. F. Tang, Y. S. Qin, and J. Q. Wei, “Porous hydroxyapatite ceramics by ice templating: Freezing characteristics and mechanical properties,” Ceram. Int., vol. 37, no. 2, pp. 635–639, 2011.

CAPÍTULO 2.

MARCO TEÓRICO Y ESTADO DEL ARTE

El conocimiento de la estructura, la fisiología, los mecanismos de formación y de regeneración ósea son fundamentales para la medicina regenerativa y la ingeniería de tejido óseo. Por esta razón se presenta a continuación un resumen de las características del hueso bajo condiciones fisiológicas normales sin patologías.

2.1.1. Características generales del hueso

El tejido óseo, denominado comúnmente hueso forma la base o sostén del sistema locomotor y constituye el esqueleto del organismo, y junto con los dientes es el tejido más duro del cuerpo. Es una forma especializada de tejido conjuntivo que está compuesto dentro del componente orgánico por matriz extracelular la cual se conoce también como osteoide (conformada en un 90% por varios tipos de colágeno en su mayoría tipo I y el 10% de proteínas no colágenas como son los proteoglucanos, las proteínas multiadhesivas, factores de crecimiento, citocinas entre otras) y diferentes tipos de células. En cuanto al componente inorgánico que está representado por un 65% del peso seco y está constituido por cristales de Hidroxiapatita [Ca10 (PO4)6(OH)2],

bicarbonato, citrato, magnesio, sodio y potasio; esto hace que una de las características que distinga al tejido óseo de los otros tipos de tejidos conjuntivos sea la mineralización de su matriz, la cual produce un tejido muy duro capaz de proveer sostén y protección [1, 2].

Se muestra en la figura 1 un diagrama de los componentes del tejido óseo de forma resumida.

Figura 1. Diagrama que representa los componentes del tejido óseo [3].

2.1.2. Estructura y fisiología del hueso

Existen dos variedades de tejido óseo atendiendo a sus características macroscópicas (anatómicas); tejido óseo compacto y tejido óseo esponjoso o laminar, estos dos tipos de hueso sólo se distinguen en el grado de porosidad y densidad, básicamente debido a la organización y al nivel de mineralización de la matriz de colágeno. El tejido óseo compacto se compone de un 80 a 90% de calcio, está formado por una masa ósea densa, compacta sin espacios, el cual se encuentra en la porción más externa de todos los huesos y en la mayor parte de la diáfisis de los huesos largos. El tejido óseo esponjoso sólo tiene un 15 a 25% de calcio y está constituido por finas trabéculas (delgadas espículas de tejido óseo anastomosadas) que se entrecruzan dando lugar a un entramado en forma de red cuyos espacios están intercomunicados y albergan la médula ósea. Este tipo de tejido está en la porción central de los huesos planos y en las epífisis de los huesos largos, tiene una porosidad media del 75 al 95% y una densidad de aproximadamente 0,2g/cm3 [4].

La unidad básica estructural del hueso es la osteona o sistema de Havers, que con un tamaño de 200 µm se compone de láminas concéntricas de matriz colágena mineralizada y contiene un canal central por el que pasan capilares y nervios. Estas osteonas se agrupan y ordenan formando láminas que a la vez se unen para conformar la parte cortical del hueso (figura 2) [2].

Figura 2. Corte longitudinal para ilustrar el hueso cortical y trabecular a nivel macroscópico (a) Corte longitudinal y transversal de hueso cortical ilustrando a nivel

microscópico las osteonas, la capilarización, el endiostio y el periostio (b) [2].

Por otra parte, es importante destacar que el tejido óseo en general tiene poros de tamaño que van de 1 a 100 micras para el hueso cortical normal y de 200 a 400 micras para el hueso trabecular, en este último el 55 al 70% de los poros están interconectados [5]. Estos dos tipos de hueso también tienen diferentes propiedades mecánicas como se observa en la Tabla 1.

Tabla 1. Propiedades mecánicas del hueso cortical y trabecular [5].

PROPIEDADES MECÁNICAS HUESO

CORTICAL

HUESO TRABECULAR

Resistencia a la compresión (MPa) 150 - 230 2 - 12

Resistencia a la tracción (MPa) 100 - 150 10 - 20

Resistencia a la flexión (MPa) 100 - 240 ---

Deformación de pre-fallo (%) 1 - 3 5 - 7

Resistencia al agrietamiento (MPa·m1/2) 2 - 12 ---

Módulo elástico (MPa) 7000 - 30000 400 – 1700

Porosidad (%) 5 - 30 30 - 90

El hueso es un órgano muy importante y éste tiene que cumplir múltiples funciones tanto a nivel mecánico como metabólico. Las funciones del tejido óseo son:

Mecánicas: La protección de los órganos internos (por ejemplo, el cráneo protege el cerebro y las costillas protegen el corazón y los pulmones); además da forma y apoyo al cuerpo, esto permite el movimiento a través de la interacción con los músculos [5].

Síntesis: La producción de células rojas y blancas de la sangre en la medula ósea, la cual se encuentra en la parte interior del hueso [5].

Metabólica: Es una fuente importante de minerales, tales como el calcio y el fósforo, factores de crecimiento como la proteína morfogenética ósea (BMP) y el factor de crecimiento transformante (TGF) y grasa (la de la médula ósea amarilla que actúa como reserva de almacenamiento de ácidos grasos). Además, el hueso amortigua la sangre contra los cambios de pH excesivos mediante la absorción o liberación de sales, la desintoxicación de la sangre de metales pesados almacenándolos y evitando su influencia en otros órganos [5].

En virtud de su contenido mineral, el tejido óseo sirve como sitio de depósito de calcio y fosfato, los cuales pueden ser movilizados de la matriz ósea y captados por la sangre según sea necesario para mantener las concentraciones adecuadas en todo el organismo. Por consiguiente, además de sostén y protección, el tejido óseo desempeña un papel secundario importante en la regulación homeostática de la calcemia (concentración de calcio en la sangre) [1].

2.1.3. Células óseas

En la matriz ósea hay espacios llamados lagunas u osteoplastos, cada uno de los cuales contiene una célula ósea u osteocito; estos son osteoblastos que quedan atrapados entre la matriz ósea calcificada, dentro de cavidades llamadas lagunas óseas. El osteocito extiende una gran cantidad de prolongaciones en túneles estrechos denominados canalículos. Los canalículos atraviesan la matriz mineralizada para conectar las lagunas contiguas y permitir el contacto entre las prolongaciones de osteocitos vecinos. De esta manera se forma una red continua de canalículos y lagunas con células y sus prolongaciones en toda la masa del tejido mineralizado. El tejido óseo depende de los osteocitos para mantener su viabilidad ya que mantienen el intercambio de sustancias nutritivas entre los vasos sanguíneos del tejido óseo y la matriz ósea y depositan o extraen pequeñas cantidades de sales de calcio cuando el metabolismo del hueso así lo requiere. Sin embargo, además de los osteocitos, en el tejido óseo hay otros tipos de células, en la figura 3 se muestran las principales [2, 3, 6].

Figura 3. Tipos de células óseas [6].

2.1.3.1. Células osteoprogenitoras

Estas se derivan de células madre mesenquimáticas que se encuentran en las superficies externas e internas de los huesos (periostio y endostio). Son células indiferenciadas similares a los fibroblastos. Durante la formación del hueso, estas células se dividen y se diferencian en dos tipos de células formadoras de tejido óseo: los osteoblastos y los preosteoclastos, que darán origen a los osteocitos y osteoclastos

respectivamente. Son capaces de dividirse y proliferar para la formación y reparación ósea. Asimismo, tienen la capacidad de diferenciarse a otros tipos celulares: adipocitos, condroblastos y fibroblastos. Estructuralmente, son células de núcleo oval y cromatina laxa, citoplasma escaso y con forma ahusada [7].

2.1.3.2. Osteoblastos

Son células que secretan la matriz extracelular del tejido óseo; una vez que la célula queda rodeada por la matriz secretada pasa a llamarse osteocito. Son células formadoras de tejido óseo y por su capacidad de dividirse, se asemejan a los fibroblastos y los condroblastos. Secretan el colágeno y la sustancia fundamental que constituyen el tejido óseo no mineralizado, sustancia osteoide o preósea, que es la parte orgánica de la matriz ósea (colágeno tipo I, proteoglucanos y glucoproteínas) [7].

2.1.3.3. Osteoclastos

Son células móviles cuya función es la resorción ósea, están presentes en las superficies óseas donde el hueso se está eliminando o remodelando (reorganizando) o donde el hueso se ha lesionado, estos no están emparentados con los osteoblastos sino que derivan de la fusión de células progenitoras hematopoyéticas mononucleares [1]. Son células de gran tamaño o gigantes, multinucleadas (6 - 50 núcleos) y acidófilas. En su ultra estructura se destaca un citoplasma granuloso y vacuolado. Cuando el osteoclasto está en actividad, se apoya y adhiere directamente sobre la superficie ósea donde se producirá el mecanismo de resorción, formando por debajo una excavación poco profunda, que se denomina laguna de Howship. La superficie celular de los osteoclastos que está en contacto con la matriz ósea posee microvellosidades y recibe el nombre de superficie activa, borde rugoso o borde plegado [3, 7].

Las células osteoprogenitoras y los osteoblastos son precursores del desarrollo de los osteocitos. Los osteoclastos son células fagocíticas producto de la fusión de células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea que dan origen a los linajes granulocítico, neutrófilo y monocítico [1].

2.1.3.4. Células de revestimiento óseo

Estas permanecen en la superficie ósea cuando no hay crecimiento activo. Derivan de aquellos osteoblastos que quedan después del cese del depósito óseo. En los sitios en

los que no se está produciendo remodelado del tejido óseo maduro, las superficies óseas están revestidas por una capa de células aplanadas con citoplasma muy delgado y orgánulos escasos más allá de la región perinuclear. Las células de revestimiento óseo ubicadas en las superficies externas del hueso reciben el nombre de células periósticas y las que tapizan las superficies internas con frecuencia se denominan células endósticas. También se cree que intervienen en el mantenimiento y la nutrición de los osteocitos incluidos en la matriz ósea subyacente y que regulan el movimiento del calcio y el fosfato desde la sangre hacia el hueso y desde el hueso hacia la sangre [1].

2.1.3.5. Remodelado óseo

El remodelado óseo es una secuencia de eventos celulares que tiene como función principal el rejuvenecimiento del esqueleto o reestructuración del hueso existente, este proceso renueva anualmente un 3,5% del hueso cortical y alrededor de un 30% del trabecular que está en constante formación y reabsorción. De manera secundaria desempeña un papel preponderante en el control de la homeostasis mineral, mediante la liberación al torrente sanguíneo de iones de calcio-fosforo [8].

A nivel microscópico, el remodelado óseo se produce en las unidades básicas multicelulares, donde los osteoclastos reabsorben una cantidad determinada de hueso y los osteoblastos forman la matriz osteoide y la mineralizan para rellenar la cavidad previamente creada. En estas unidades hay osteoclastos, macrófagos, preosteoblastos y osteoblastos que están regidos por una serie de factores, tanto generales como locales, permitiendo el normal funcionamiento del hueso y el mantenimiento de la masa ósea. Es importante destacar que cuando este proceso se desequilibra aparece la patología ósea, bien sea por exceso (osteopetrosis) o por deterioro (osteoporosis) [9].

La remodelación se inicia cuando un conjunto de osteoclastos erosiona una cavidad en la superficie ósea. En ausencia de osteoblastos, se establece un intervalo quiescente (fase de inversión). En ese período la superficie irregular de la cavidad se alisa y se deposita un estrato de sustancia de cemento. Posteriormente, un conjunto de osteoblastos sustituye el hueso recientemente erosionado. El remodelado óseo es un ciclo que se produce en 5 etapas sucesivas que son quiescencia, activación, reabsorción, inversión y formación (figura 4) [10].

Figura 4. Fases del remodelado óseo normal (BRU: Unidad de Remodelado Óseo; CL: línea de cemento; OS: osteoide) [10].

2.1.4. Patologías óseas y su relevancia

Como se ha mencionado, el hueso es un tejido dinámico en constante formación y reabsorción, que permite el mantenimiento del volumen óseo, la reparación del daño tisular y la homeostasis del metabolismo fosforo/calcio [9]. Sin embargo este tejido reacciona ante una gran diversidad de trastornos, muchos de las cuales tienen su origen fuera del sistema esquelético. Estas reacciones sirven como espejo de enfermedades, en el sentido que refleja la naturaleza de la anomalía subyacente. Por tanto, las reacciones del hueso como órgano y como estructura son importantes en el diagnóstico y tratamiento de los pacientes. Sin un adecuado conocimiento del hueso, como órgano y estructura se corre el riesgo de diseñar productos terapéuticos no adecuados [11].

La osteoporosis, la enfermedad de Paget, la osteogénesis imperfecta, el raquitismo, la osteomalacia, la displasia fibrosa entre otras, son solamente algunos de los trastornos que pueden afectar muy seriamente tanto la calidad, como la cantidad de masa ósea en el cuerpo. Todo esto genera uno de los mayores problemas de salud pública para muchos países del mundo, además de los altos costos debido a los tratamientos. En la mayoría de casos quienes requieren una intervención ya sea preventiva o curativa se encuentran incapacitadas para pagar o acceder a dichos tratamientos y de no ser tratadas oportunamente dichas patologías pueden llevar a que el paciente pierda sus capacidades funcionales o afecte su calidad de vida [8].

2.1.5. Estrategias terapéuticas para la regeneración de tejido óseo

Tradicionalmente los defectos óseos se han tratado con terapias convencionales implantando tejidos autólogos, alogénicos o xenogénicos o materiales sustitutos en otros casos (figura 5). En las últimas décadas se ha incrementado de forma exponencial la utilización de tejido óseo en la práctica habitual de la cirugía ortopédica y dental. No obstante, las complicaciones vinculadas a la toma de injertos autólogos como son la limitada cantidad de hueso a extraer y la morbilidad en el lugar de extracción (dolor, infección, hematoma, hernias abdominales, etc.) y los potenciales riesgos de carácter infeccioso e inmunológico (hepatitis, VIH, priones, etc.) en relación con los aloinjertos y heteroinjeros han impulsado la búsqueda de alternativas diferentes a éstas [12].

Figura 5. Tipos de implantes para regeneración de tejido.

En la actualidad se cuenta con una gran variedad de implantes de materiales que no tienen su origen en seres vivos como son los polímeros, cerámicos, metales o composites cuyo fin es lograr productos con propiedades químicas, físicas y mecánicas más parecidas al hueso y con los cuales se pueda lograr un mejor desempeño funcional como sustitutos del injerto de hueso. Sin embargo, muchos de estos materiales presentan varias desventajas, ya que están sujetos a la fatiga, fractura, toxicidad y desgaste; por lo demás, no se remodelan con el tiempo. Por ejemplo se pueden presentar problemas de integración del implante con los tejidos adyacentes, puesto que

no pueden adherirse a éste de forma correcta y de esta manera se crean deficiencias de tipo mecánico [13].

A causa de obstáculos como la escasez de donantes, la transmisión de enfermedades, la morbilidad del sitio de extracción y la incapacidad de los materiales para remodelarse y reaccionar ante condiciones fisiológicas, ninguno de los tratamientos convencionales ha podido suplir todas las necesidades a la hora de tratar problemas relacionados con la pérdida o deterioro del tejido óseo; por lo tanto, se hace necesaria la búsqueda de soluciones alternas. Esta creciente necesidad de órganos ha llevado a los investigadores a plantear la posibilidad de utilizar células y materiales de diversa naturaleza para la reconstrucción de órganos y tejidos, para dar así nacimiento a una disciplina conocida como Ingeniería de Tejidos (IT) que es definida como el uso de los principios y métodos de la ingeniería, la biología, la bioquímica y las ciencias de la vida orientados a la comprensión de la estructura y la función de los tejidos normales y patológicos de los mamíferos, y el consecuente desarrollo de sustitutos biológicos para restaurar, mantener o mejorar las funciones de los organismos [14, 15].

En todos los casos, estos materiales tienen que cumplir una serie de requisitos ya que son considerados biomateriales, por tanto deben ser biocompatibles con el organismo receptor, es decir, no generar rechazo, ni daños, deben tener una determinada vida media para desarrollar su tarea y aportar las prestaciones necesarias para realizar bien la función a la que van destinados [16]. A continuación se destacan algunos materiales de uso común en medicina regenerativa, su clasificación y características.

2.2. BIOMATERIALES DE USO EN MEDICINA REGENERATIVA

La ciencia de los Biomateriales es una disciplina que surge a partir de la necesidad de reparar o reconstruir tejidos u órganos del cuerpo humano que han sido dañados ya sea por enfermedades, defectos congénitos, accidentes traumatológicos, entre otros. Esta es una ciencia interdisciplinar donde intervienen especialistas en muchas áreas que van desde la medicina hasta la ingeniería y se desarrolló rigurosamente en la segunda mitad del siglo XX, ofreciendo actualmente múltiples tratamientos favorables contra las diferentes afecciones humanas [11]. La figura 6 muestra de forma esquemática la evolución histórica del concepto y aplicación de técnicas a lo largo del tiempo para el tratamiento de las afecciones sin tener en cuenta su causa.

Figura 6. Evolución histórica de las técnicas utilizadas para el tratamiento de diferentes afecciones [11].

Un biomaterial es cualquier sustancia o combinación de sustancias de origen natural o sintético, solas o en combinación con drogas como parte de un dispositivo en el tratamiento, aumento o remplazo de algún tejido u órgano sin causar daño agudo o crónico al huésped mientras mantiene su efectividad física y biológica durante su vida útil in vivo [17]. Estos pueden ser utilizados sin incompatibilidades como dispositivos biomédicos y además colocarse en contacto con los tejidos vivos sin provocar daños o alteraciones. Por lo anterior deben cumplir los requerimientos de la aplicación específica para la cual son diseñados además de presentar una alta biocompatibilidad al ser evaluado su comportamiento in vitro e in vivo [18].

En la actualidad, el uso de biomateriales tiene aplicación en casi todos los sistemas del organismo humano y existe un rango muy amplio de materiales útiles para todo tipo de aplicaciones biomédicas, estos se pueden clasificar según su naturaleza química en metales, polímeros, cerámicos y compuestos; sin embargo mantener el equilibrio entre la biocompatibilidad y las propiedades mecánicas de estos restringen su uso en esta área. Entre los biomateriales más empleados se encuentran los metales y sus aleaciones, los cuales fueron los primeros usados para implantes y actualmente son los

más usados por su resistencia mecánica y a la corrosión. Los polímeros también son ampliamente utilizados por su variedad de composiciones, facilidad de producción con diferentes modelos geométricos y con determinadas propiedades, pueden ser rígidos o blandos y algunos resultan adecuados para reemplazos temporales por su composición biodegradable. Las cerámicas también son muy útiles por su alta estabilidad y dureza, y por último están los compuestos que son una combinación artificial de dos o más materiales que difieren en forma o composición donde cada constituyente va a mantener su identidad física o química. Todos tienen un amplio espectro de aplicaciones de acuerdo a una necesidad específica [18, 19].

Cabe resaltar que son muchas las enfermedades y lesiones que requieren una intervención quirúrgica para implantar un biomaterial o un dispositivo médico. En general, los índices de éxito de dichas intervenciones son elevados, pero todavía hay aspectos mejorables entre los que cabe destacar el diseño de técnicas quirúrgicas menos agresivas, la anticipación del tratamiento de las enfermedades degenerativas y la mejora de los biomateriales y dispositivos implantables [20].

La medicina regenerativa ha traído grandes expectativas para un número significativo de enfermedades humanas actuales en todo el mundo. Enfermedades, tales como la enfermedad de Parkinson, el Alzheimer, la osteoporosis, lesiones de columna, el cáncer, entre otras pueden tratarse en un futuro próximo con métodos que tienen como objetivo la regeneración de tejidos enfermos o dañados El objetivo ideal de la medicina regenerativa es la de la regeneración in vitro o in vivo de un órgano funcional complejo que consta de un andamio o Scaffold hecho a partir de materiales sintéticos o naturales que se han cargado con células vivas. Debido a esto surge la ingeniería de tejidos, un campo de investigación que tiene como objetivo desarrollar sustitutos para los órganos y los tejidos dañados por enfermedad o accidentes, evitando los trasplantes que requieren un donante o minimizando de alguna forma el riesgo al rechazo. Lo que se busca es desarrollar tejidos a partir de las propias células del paciente. En primer lugar, las células se cultivan fuera del cuerpo, en un soporte apropiado que simula el entorno externo de la célula y posteriormente, cuando su crecimiento es el adecuado, se trasplanta al cuerpo, figura 7 [21].

Figura 7. Ingeniería de tejidos aprovechada para regeneración de tejidos. Existen dos estrategias diferentes in vivo e in vitro. Ambos métodos usan scaffolds porosos los

cuales son cargados con células [21].

El término ingeniería de tejidos fue acuñado oficialmente en un taller de la National Science Fundation en 1988 abarcando principios y métodos de las ciencias de la vida y de la ingeniería. Para estos desarrollos se construyen pequeños andamios que sirven para definir la forma del órgano a reemplazar. El reto de la ingeniería de tejidos es imitar lo que sucede en la naturaleza. En términos generales la ingeniería tisular tiene como objetivo fabricar tejidos u órganos similares a los tejidos u órganos originales de un paciente que, dañados o enfermos, deben ser sustituidos [15,22].

La ingeniería de tejidos requiere 3 componentes críticos: Las células, los niveles adecuados de moléculas biofuncionales solubles e insolubles y el scaffold para el soporte de las células en crecimiento y formación de tejidos. Este último actúa como una matriz extracelular que permite la fijación de células temporalmente y la adaptación al medio ambiente. Para lograr el objetivo final de la formación de tejido, el andamio debe poseer varias características muy importantes, que incluyen la biocompatibilidad, la formación de subproductos de degradación no tóxicos, estructura de la porosidad accesible (poros interconectados) y la degradación del andamio en un tiempo apropiado que permita la invasión de células y la reestructuración del tejido. Para la infiltración de células en los andamios, el diámetro de poro debe ser lo suficientemente grande para la invasión celular y la migración dentro del andamio. La

porosidad y la interconectividad de los poros debe ser lo suficientemente grande para la distribución celular adecuada, pero lo suficientemente pequeña para evitar el desprendimiento de las células por el flujo de fluidos corporales [23]. Es importante destacar que el diseño apropiado del scaffold y la evaluación de su estructura tras su fabricación, son muy importantes para obtener las características requeridas y adecuadas para ser usado en reparación de tejido óseo.

La clasificación de los biomateriales puede realizarse atendiendo a su comportamiento cuando se implantan o bien atendiendo a su naturaleza química [16].

2.2.1. Clasificación de biomateriales según su naturaleza química

Entre los biomateriales más usados en ingeniería de tejidos se encuentran los siguientes grupos:

2.2.1.1. Metales y sus aleaciones

Fueron los primeros materiales utilizados para los implantes y actualmente son los más usados por su buena resistencia mecánica y a la corrosión [17]. Los metales han sido muy utilizados como biomateriales con dos propósitos principales los cuales son la fabricación de prótesis para reemplazar una parte del cuerpo (articulaciones, placas craneales, clavos, etc.), o implantes utilizados en la estabilización y ayuda al proceso normal de reparación de un tejido (por ejemplo, unión de huesos rotos). Entre los metales más utilizados con estos fines cabe destacar las diferentes clases de aceros inoxidables, las aleaciones de Co-Cr (con Mo y Ni), el titanio y sus aleaciones (con Al, V, Ni), entre otros. Uno de los problemas que pueden presentar este tipo de materiales es la liberación de productos al medio lo que produce consecuentemente, una determinada reacción tisular adversa [16].

2.2.1.2. Polímeros

Son ampliamente usados por sus grandes posibilidades, presentan una amplia variedad de composiciones, son fáciles de producir, con diferentes modelos geométricos y con determinadas propiedades, son versátiles, pueden ser rígidos, fluidos o blandos, de origen natural o sintético y son adecuados para reemplazos temporales por su composición biodegradable. Las aplicaciones biomédicas de los polímeros se pueden clasificar atendiendo a la función que desempeña el polímero en cuestión. Una de las aplicaciones biomédicas más importantes de los polímeros es su utilización como