DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS Y CITOCINESIS

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DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS Y CITOCINESIS

OBJETIVOS:

1.- Estudiar la división celular en células somáticas.

2.- Aprender los métodos para observar la mitosis al microscopio compuesto. 3.- Reconocer las cuatro fases principales de la mitosis.

CONTENIDO:

- El proceso de división celular: mitosis y citocinesis.

- Fases de la mitosis: profase, metafase, anafase y telofase. - Los cromosomas como unidad física hereditaria.

- Preparación de láminas de tejido meristemático subapical (raíz).

INTRODUCCIÓN:

Los organismos eucarióticos unicelulares se multiplican por división celular, mientras que los organismos pluricelulares crecen por división celular. Las células eucarióticas de carácter vegetativo tienen dos conjuntos homólogos de cromosomas “2n” (diploides), debido a que cada progenitor aporta un conjunto de cromosomas, que representa el número mínimo de cromosomas

n” (haploide), de la especie correspondiente.

La división celular involucra dos procesos: el primero es la división del núcleo o mitosis, durante la cual el material genético del núcleo, que ha sido previamente duplicado durante la interfase, se divide dando origen a dos nuevos núcleos idénticos; el segundo es la división del citoplasma o citocinesis, durante la cual se forma una nueva pared celular que separa en entidades celulares independientes los dos núcleos recién formados, originándose de esta manera dos nuevas células.

La mitosis es un proceso continuo en el cual se distinguen convencionalmente cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase, que se reconocen por el arreglo de los cromosomas en el citoplasma. El lapso entre una división y otra se denomina interfase (fig. 4a).

Existen sustancias químicas capaces de provocar alteraciones en la división celular, tanto de la mitosis como de la citocinesis. Una de estas sustancias es la

cafeína, un alcaloide que en altas dosis inhibe la formación de la nueva pared celular durante la citocinesis, dando como resultado células binucleadas, dependiendo del tiempo de acción al que haya sido sometido el tejido meristemático al alcaloide. Cuando la cafeína actúa por tiempos muy prolongados puede inhibir dos citocinesis seguidas y producir células tetranucleadas.

Otra sustancia capaz de alterar la división celular es la colchicina, también un alcaloide que actúa como inhibidor de la mitosis a nivel de la metafase, ya que

impide la formación del huso acromático y, por lo tanto, evita la separación de las cromátidas hermanas y su migración a los polos de la célula. La

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colchicina se utiliza para el estudio de la mitosis ya que acumula las células en metafase. Las células sometidas a la acción de la colchicina que se originan después de un tratamiento prolongado por más de un ciclo celular pueden ser

tetraploides (4n), pues se duplica el material genético (los cromosomas), pero al inhibirse la formación de las fibras del huso acromático no migran las cromátidas hermanas para formar dos núcleos independientes, de forma que se restituye una membrana nuclear alrededor de un núcleo con contenido multiplicado.

El tejido más comúnmente utilizado para el estudio de la mitosis es el meristema de las raíces nuevas (fig. 4b). En esta práctica se utilizarán raíces de cebolla, (Allium cepa). Hay que tener en cuenta que la actividad mitótica varía durante el día, por lo que lo más correcto es verificar previamente la intensidad de la actividad mitótica contra las horas del día. Esto permite determinar el momento en el que el meristema muestra el mayor número de divisiones. Se encontrarán más figuras mitóticas si la fijación del material no se hace al azar sino a la hora del día en que el gráfico muestra un pico de mitosis. Sin embargo, como siempre hay células en división, esto no es absolutamente indispensable. Por lo general, en el trópico, las horas óptimas de actividad mitótica van desde el amanecer hasta las 10:30 a 11 am, con un óptimo alrededor de las 9 o 10 de la mañana. Por lo tanto, es a esa hora en que se realizará la colecta de raíces en crecimiento, seguida de la fijación en una mezcla de etanol absoluto-ácido acético glacial en proporción 3:1 y su posterior refrigeración a 4 °C por un mínimo de 24 horas.

4a (http:// www.bio.miami.edu/dana/250/mitosis.jpg)

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4b

(http://www.uc.cl/sw_educ/biologia/bio100/html/portadaMlval10.1.2.html) Figura 4. a.- Células mostrando interfase y las diferentes fases de la mitosis: profase, metafase, anafase y telofase. b.- Sección longitudinal de raíz mostrando las distintas zonas.

MATERIALES:

1.- Raíces de cebolla, las cuales se inducen en bulbos colocados en contacto con agua y en oscuridad durante 5 días a temperatura ambiente. Para facilitar la aparición de las raíces se raspa ligeramente con una hojilla la zona basal del bulbo para separar el tejido seco. Las raíces se cosechan a las 9 y 30 am, fijándose de inmediato en Carnoy 3:1 etanol: ácido acético glacial) y se guardan en la nevera por lo menos por una noche a 4º C.

2.- Portaobjetos, cubreobjetos, vidrios de reloj o cápsulas de Petri, pinzas, agujas de disección, hojillas, pipetas Pasteur, papel de filtro y servilletas de papel absorbente, esmalte de uñas transparente.

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3.- Agua destilada, ácido clorhídrico 50% en agua destilada, carbolfucsina modificada u orceína acética al 1% (en ácido acético de 45%), glicerina 50% en agua destilda fenolada.

MÉTODOS:

La preparación de las láminas se realizará de acuerdo al siguiente protocolo:

1.- Lavar las raíces para eliminar el fijador. Para ello coloque las raíces en un vidrio de reloj o en una cápsula de Petri con agua destilada por 5 minutos. Realice tres cambios de agua destilada, para un total de 15 min de proceso de lavado. 2.- Maceración: para ello elimine el agua destilada y añada HCl al 50%, y deje actuar por durante 15 minutos, o por el tiempo mínimo suficiente para que el tejido radical se ablande. La maceración provoca la disgregación celular del tejido meristemático, por degradación de la lamela media de la pared celular, permitiendo una buena separación de las células.

Este paso es muy sensible al tiempo transcurrido: si se deja actuar demasiado al ácido, éste digiere completamente la lamela media y penetra en el interior celular comenzando la degradación del protoplasto y su contenido; por el contrario, si el tiempo de acción del ácido no es suficiente, no se logrará la degradación de la lamela media y la consecuente disgregación del tejido meristemático y las células no podrán por tanto disponerse en una monocapa luego de su separación, por lo que los resultados serán láminas con células superpuestas, donde es imposible distinguir las diferentes fases mitóticas.

3.- Lavar las raíces para eliminar el HCl, utilizando 3 cambios de agua destilada de 5 minutos cada uno, para un total de 15 min de proceso de lavado. Es importante el lavado del HCl pues éste interfiere con la coloración de los cromosomas.

4.- Disgregación: añadir una gota de ácido acético al 45% en una lámina portaobjetos, luego colocar la raíz, cortar con una hojilla y conservar los 2 mm terminales del lado del meristema (del lado de la caliptra o cofia) y eliminar el resto de la raíz. El meristema se distingue por ser más blanco. Con un par de agujas finas se disgrega el meristema en tiras finas como mechas y se elimina en lo posible la caliptra terminal, dejando lo más limpio y disgregado posible el tejido meristemático. ES MUY IMPORTANTE NO DEJAR NUNCA QUE EL MATERIAL SE SEQUE EN LA LÁMINA PORTAOBJETOS.

5.- Ponga una gota de colorante (carbolfucsina u orceína) sobre el material disgregado. Espere 1 a 3 minutos, cuidando en todo momento que el material no se seque y monitoreando bajo la lupa el avance del proceso de coloración.

6.- Cuando las tiras de tejido hayan adquirido coloración uniforme tape el preparado con un cubreobjetos teniendo cuidado que no entre aire. Espere un minuto.

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7.- Coloque la lámina entre hojas de papel de filtro o una servilleta absorbente y presione con la yema del dedo pulgar firmemente contra la superficie plana y uniforme de una mesa, pero con cuidado de no romper la lámina, y sobre todo, de no mover lateralmente el cubreobjetos mientras se ejerce la presión; el movimiento lateral del cubreobjetos genera el enrollamiento de las células meristemáticas disgregadas sobre el portaobjeto, generando la pérdida de la preparación.

8.- Realice las observaciones bajo el microscopio, comenzando por ubicar las agrupaciones de células meristemáticas sobre el portaobjetos para luego cambiar a un aumento de observación mayor e identificar las distintas fases que caracterizan la división celular (interfase y mitosis) y de la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase).

BIBLIOGRAFÍA:

JIMÉNEZ – MARTÍN, G.; GONZALEZ, A. y J. A. LOPEZ. 1965. New method of labeling cells. J. Cell Biol. 26: 305-309.

LINDORF, H.; L. Parisca y P. Rodríguez. 1985. Botánica. Clasificación, Estructura, Reproducción. EBUC. Caracas. Cap. V.

RAVEN, P.H.; R.F. Evert y S.E. Eichhorn. 1999. 6a. Ed. W.H. Freeman and Co. Worth Publishers. New York. Cap. 8.

SHARMA, A.K. y A. Sharma. 1972. Chromosome Techniques, Theory and Practice. 2a Ed. Butterworths-University Park Press. London-Baltimore.

STRASBURGER, E.; F. Noll; H. Schenck & A.F.W. Schimper. 1986. Tratado de Botánica. 7ª Ed. Marín. Barcelona. Cap. 1. Pág.49.

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Guía-Informe

Práctica de División Celular

NOMBRE: CÉDULA:

Fecha:

OBSERVACIONES:

1.- En las láminas preparadas a partir de meristema de raíces de cebolla (Allium cepa), localice las cuatro fases principales de la mitosis y células en interfase. Dibuje cada fase y describa brevemente qué caracteriza a cada fase.

INTERFASE: PROFASE: Aumento: Aumento: ___________________________ ____________________________ ___________________________ ____________________________ METAFASE: ANAFASE: Aumento: Aumento: ___________________________ ____________________________ ___________________________ ____________________________

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TELOFASE:

Aumento:

___________________________ ___________________________

2.-Utilizando aumento mediano y para tres campos diferentes cuente las células que se encuentran en cada una de las fases de la mitosis: Profase, metafase, anafase, telofase y también las que aparecen en interfase.

Campo 1 Campo 2 Campo 3 Interfase

Profase Metafase Anafase Telofase

3.-Calcule el índice mitótico (IM) utilizando los datos anteriores, de acuerdo a la siguiente fórmula:

IM= Número total de células en mitosis x 100 Número total de células

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