Facultad de Ciencias Biológicas
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I
TESIS DOCTORAL
INTERACCIONES MOLECULARES EN LA TRANSFERENCIA
CONJUGATIVA DEL PLÁSMIDO pMV158
Memoria presentada por Fabián Lorenzo Díaz para optar al grado de Doctor en
Biología por la Universidad Complutense de Madrid
Luis Fabián Lorenzo Díaz bajo la dirección del Profesor Manuel
Espinosa Padrón, en el Departamento de Ciencia de Proteínas del
Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), con la financiación
concedida por el Ministerio de Sanidad y Consumo a través del
Instituto de Salud Carlos III (Beca BEFI 03/00529) y por el Consejo
Superior de Investigaciones Científicas a través del Proyecto
Intramural Especial (PIE) 200420E410.
Opta al grado de Doctor VºBº del director de la Tesis
Gracias a mi familia. A mi madre por estar siempre ahí, cuidando de mí. Por enseñarme a ser quien soy y a tener “fundamento”. A mi hermano por ser mi mejor amigo y por todo su apoyo. A Noemi, por todo lo que hemos compartido estos años, por motivarme continuamente, sobre todo en momentos difíciles.
A toda la gente del Hospital Universitario Ntra. Sra. de La Candelaria (Tenerife). A Chano por abrirme las puertas del mundo de la investigación, y a Jesús Villar por recibirme en su grupo. A Félix, por mi primer artículo, además de por su apoyo para dar el salto y, como en su día me decía Manolo, arriesgarme a la “aventura
peninsular”. A Carlos, por estar siempre ahí.
A mi segunda familia, el CIB. Gracias a Manolo, por recibirme en su laboratorio, por ser un gran director de tesis y por recordarme continuamente que hay que disfrutar de lo que hacemos. A “mis chicas del lab”: a Alicia, por todo lo que he aprendido de ella y por su ayuda; a Gloria, por tener siempre tiempo para ayudarme; a Maite y a Lorena, por todo su trabajo; a Concha, por su entusiasmo; a Celeste, Ana, Virtu, Inma, Sofi, Wai Ting, Tania, Marta y Cristi, por todo su apoyo. Al “compañero” Jose, por su ayuda constante. A los vecinos del 306 (el grupo de Paloma López).
A toda la gente con la que hemos colaborado. A Miquel Coll y a todo su grupo del Instituto de Biología Estructural de Barcelona (CSIC), en especial a Silvia y Rosa, por su dedicación y empeño. Al grupo del Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (Argentina), en especial a Cecilia, Silvia y Diego. A Rudi Lurz, del Max-Planck Institut für molekulare Genetik de Berlin (Alemania) por dedicarnos su tiempo. Al grupo de Joel Schildbach de la John Hopkins University (Baltimore, USA), por recibirme en su laboratorio y a Lubos, por toda su ayuda. A Margarita Menéndez, y todo su grupo del Instituto de Química-Física “Rocasolano” (CSIC, Madrid), por su paciencia y dedicación.
Sin duda, ha sido una de las mejores decisiones que he tomado en mi vida.
No solo porque me ha permitido aprender más cosas de las que podía imaginar, sino porque me ha ayudado a crecer como persona.
INTRODUCCIÓN ... 1
1. PLÁSMIDOS BACTERIANOS ... 1
1.1. Clasificación ... 1
1.2. Mecanismos de replicación y control ... 2
1.3. Rango de huésped. ... 4
2. TRANSFERENCIA GENÉTICA HORIZONTAL ... 5
2.1. Modelo de transferencia de DNA por conjugación ... 7
2.2. Bases moleculares de la conjugación ... 8
2.3. Orígenes de transferencia y relaxasas ... 18
2.3.1. Familia MOBF ... 20 2.3.2. Familia MOBH... 23 2.3.3. Familia MOBC... 23 2.3.4. Familia MOBQ ... 23 2.3.5. Familia MOBP ... 24 2.3.6. Familia MOBV ... 26 3. EL PLÁSMIDO pMV158 ... 27 3.1. El módulo LIC ... 28 3.2. El módulo DET ... 30 3.3. El módulo MOB ... 31
3.4. Orígenes de cadena retrasada (sso) ... 34
OBJETIVOS ... 37
MATERIALES Y MÉTODOS ... 41
MATERIALES ... 43
1. ESTIRPES BACTERIANAS ... 43
2. MEDIOS DE CULTIVO Y SELECCIÓN ... 43
3. ÁCIDOS NUCLEICOS ... 45
3.1. Plásmidos ... 45
3.2. Oligonucleótidos ... 46
4. ENZIMAS, PRODUCTOS QUÍMICOS Y REACTIVOS ... 47
5. TAMPONES ... 49
6. SOPORTE INFORMÁTICO ... 51
MÉTODOS ... 53
1. CRECIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS ... 53
2. CLONACIÓN DE DNA ... 53
2.1. Preparación de células competentes ... 53
2.3. Obtención de fragmentos de DNA ... 54
2.3.1. Digestión con enzimas de restricción ... 54
2.3.2. Amplificación en cadena de la DNA polimerasa (PCR) ... 55
2.4. Purificación ... 55 2.4.1. DNA bicatenario ... 55 2.4.2. Oligonucleótidos ... 55 2.5. Ligación de DNA ... 56 2.6. Transformación ... 56 2.6.1. Transformación natural ... 56
2.6.2. Transformación mediante electroporación ... 56
2.7. Construcción de plásmidos recombinantes ... 57
2.7.1. Vectores de expresión de mutantes de la proteína MobM ... 57
2.7.2. Mutantes en los orígenes de cadena retrasada (sso) de pMV158 ... 58
3. ANÁLISIS DE DNA ... 58
3.1. Cuantificación ... 58
3.2. Electroforesis ... 58
3.2.1. Geles de Agarosa ... 58
3.2.2. Geles de Poliacrilamida ... 59
3.2.2.1. Geles PAA nativos ... 59
3.2.2.2. Geles PAA desnaturalizantes ... 59
3.3. Secuenciación ... 60
3.3.1. Secuenciación Manual ... 60
3.3.2. Secuenciación Automática ... 60
4. MARCAJE RADIACTIVO DE DNA ... 60
4.1. Marcaje en el extremo 5‟ ... 60 4.2. Marcaje interno ... 61 5. MANIPULACIÓN DE RNA ... 61 5.1. Transcripción in vitro ... 61 5.2. Retrotranscripción ... 62 6. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ... 62 6.1. MobM y derivados ... 63 6.2. MobMN199His ... 64
6.3. Purificación de MobMN199 con Selenio-Metionina ... 65
7. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS ... 65
7.1. Cuantificación ... 65
7.4.1. Velocidad de Sedimentación ... 66
7.4.2. Equilibrio de Sedimentación ... 67
7.5. Medida de masas moleculares por MALDI-TOF ... 67
7.6. Predicción de estructura secundaria de proteínas ... 67
7.7. Análisis de dicroísmo circular ... 68
7.7.1. Determinación espectroscópica ... 68
7.7.2. Análisis de la estabilidad térmica ... 68
7.8. Calorimetría isotérmica de valoración (ITC) ... 69
8. INTERACCIONES DNA-PROTEÍNA ... 69
8.1. Visualización de complejos nucleoproteicos por microscopía electrónica ... 69
8.1.1. Complejos entre MobM y pMV158 ... 69
8.1.2. Complejos entre RNA polimerasa y el promotor del gen mobM ... 70
8.2. Análisis de la actividad de corte y cierre de MobM ... 70
8.2.1. DNA superenrollado ... 70
8.2.2. DNA monocatenario ... 71
8.3. Cálculos estequiométricos ... 71
8.4. Análisis y medidas de afinidad ... 71
8.5. Ensayos de competición ... 72
8.5.1. Movilidad diferencial en geles nativos (EMSA) ... 72
8.5.2. Cinética de disociación ... 72
8.6. Calorimetría diferencial de barrido (DSC) ... 73
8.7. Footprinting sobre DNA superenrollado ... 73
8.8. Técnicas de cristalización ... 74
9. ANÁLISIS DE TRANSFERENCIA PLASMÍDICA ... 75
9.1. Ensayo convencional de conjugación en filtro ... 75
9.2. Ensayos de conjugación en placas multipocillo ... 75
10. DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS PLASMÍDICAS Y ACUMULACIÓN INTRACELULAR DE ssDNA ... 77
RESULTADOS ... 79
CAPÍTULO 1: ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL GEN mobM ... 81
1.1. Análisis de la interacción entre el promotor de mobM y la RNAP ... 84
1.2. Transcripción in vitro con la RNAP de E. coli ... 87
1.3. Determinación de la transcripción in vivo del gen mobM ... 88
CAPÍTULO 2: CARACTERIZACIÓN DEL DOMINIO RELAXASA DE LA PROTEÍNA MobM ... 91
2.4. Determinación de la estructura secundaria de MobMN199 ... 100
2.5. Medidas de estabilidad térmica de MobMN199 ... 101
2.6. Actividad de MobMN199 de tras la desnaturalización térmica ... 102
2.7. Efecto de los iones Mn2+ en la desnaturalización de MobMN199 ... 104
CAPÍTULO 3: INTERACCIONES ENTRE MobM Y EL ORIGEN DE TRANSFERENCIA DE pMV158 ... 107
3.1. El origen de transferencia de pMV158 tiene tres IRs ... 109
3.2. Reconocimiento de diferentes sustratos de DNA por MobM ... 112
3.3. Interacciones entre MobM y DNA superenrollado de pMV158 ... 116
3.4. Estequiometría de unión entre MobMN199 y el oriT ... 123
3.5. Afinidad de MobMN199 por oligonucleótidos ... 124
3.6. Definición in vitro del oriT mínimo en estado monocatenario ... 125
3.7. Estabilidad térmica de MobMN199 unida a DNA ... 128
3.8. Estructura tridimensional de MobMN199 unida a DNA ... 129
3.9. Papel del residuo Y44 de MobM en el corte de DNA ... 132
3.10. Actividad de corte de MobMN199 sobre DNA monocatenario ... 133
CAPÍTULO 4: PAPEL DE LOS ORÍGENES DE REPLICACIÓN DE CADENA RETRASADA EN LA TRANSFERENCIA DE pMV158 ... 137
4.1. Construcción de plásmidos deficientes en la actividad de los orígenes de cadena retrasada ... 139
4.2. Protocolo de conjugación en filtro con placas multipocillo ... 141
4.3. Análisis de la eficiencia de transferencia en los mutantes sso ... 145
4.4. Medidas en la acumulación de ssDNA en la célula receptora ... 146
DISCUSIÓN ... 149
¿Es MobM un regulador transcripcional? ... 151
El dominio relaxasa de MobM se conserva en los plásmidos transferibles de la familia de replicación de pMV158 ... 153
Propiedades y requerimientos estructurales del dominio relaxasa de la proteína MobM ... 155
¿Cuál es el residuo catalítico en las relaxasas de la familia MOBV? ... 159
Las interacciones de la proteína MobM con el oriT dependen de la secuencia y topología del DNA ... 161
La funcionalidad total del sso es esencial en el proceso conjugativo ... 167
CONCLUSIONES ... 171
BIBLIOGRAFÍA ... 175
TABLAS
Tabla 1. Plásmidos conjugativos modelo de bacterias Gram-negativas. ... 10
Tabla 2. Estirpes bacterianas empleadas en este trabajo. ... 43
Tabla 3. Composición del medio mínimo enriquecido (MME). ... 44
Tabla 4. Listado de los plásmidos utilizados en este trabajo. ... 45
Tabla 5. Oligonucleótidos ... 46
Tabla 6. Tampones. ... 49
Tabla 7. Soporte informático ... 51
Tabla 8. Purificación de MobMN199 y medidas de actividad específica. ... 96
Tabla 9. Contenido en estructura secundaria de la proteína MobMN199. ... 101
Tabla 10. Transferencia intra- e inter-específica de pMV158 y pMV158GFP. ... 143
Tabla 11. Número de copias plasmídico, ratios moleculares ss/ds DNA y coeficiente de acumulación (AC). ... 147
Tabla 12. Plásmidos movilizables de la familia de replicación de pMV158. ... 153
Tabla 13. Actividad de MobM y sus derivados ... 156
FIGURAS
Figura 1. Modelo de replicación por círculo rodante del plásmido pT181. ... 4Figura 2. Transferencia de DNA entre células bacterianas. ... 6
Figura 3. Circuito regulador de los genes de transferencia de plásmidos tipo F. ... 9
Figura 4. Ensamblaje de proteínas del relaxosoma de los plásmidos F y R388. ... 11
Figura 5. Mecanismo catalítico de TrwC en el inicio de la transferencia. ... 12
Figura 6. Características estructurales de TrwB. ... 14
Figura 7. El sistema T4S. ... 15
Figura 8. Procesamiento del DNA durante la transferencia de R388. ... 17
Figura 9. Modelo de replicación conjugativa en la célula receptora. ... 18
Figura 10. Esquema de las relaciones entre las diferentes familias de relaxasas. ... 19
Figura 11. Estructuras del dominio relaxasa de las proteínas TrwC (A) y TraI (B). ... 22
Figura 12. Estructura del oriT en estado monocatenario tras la unión a TrwC o TraI. . 22
Figura 13. Orígenes de transferencia. ... 26
Figura 14. Mapa genético y funcional del plásmido pMV158. ... 28
Figura 15. Estructura tridimensional de RepB e interacciones con el dso. ... 29
Figura 16. Circuito de control del número de copias de pMV158. ... 30
Figura 17. La proteína MobM. ... 31
Figura 18. Interacciones entre MobM y el oriT. ... 33
Figura 19. Actividad relaxasa de MobM. ... 33
Figura 20. Orígenes de cadena retrasada de pMV158. ... 35
Figura 23. Cristales del complejo MobMN199 con el oligonucleótido IR1+8... 74
Figura 24. Región promotora del gen mobM de pMV158. ... 84
Figura 25. Resolución de complejos específicos formados entre la región promotora del gen mobM y la RNAP de E. coli. ... 85
Figura 26. Mapeo del sitio de unión de la RNAP de E. coli en la región promotora del gen mobM por microscopía electrónica. ... 86
Figura 27. Transcripción in vitro con la RNAP de E. coli. ... 88
Figura 28. Iniciación de la transcripción del mRNA del gen mobM en E. coli (1)y S. pneumoniae (2). ... 89
Figura 29. Esquema de la proteína MobM y MobMN199. ... 94
Figura 30. Pasos en la purificación de la proteína MobMN199. ... 95
Figura 31. Perfil de ultracentrifugación analítica de MobMN199. ... 97
Figura 32. Actividad de corte de MobM, MobMN199 (A) y MobMN199His (B) sobre DNA superenrollado de pMV158. ... 98
Figura 33. Actividad de corte de MobMN199 en presencia de diferentes cationes divalentes. ... 99
Figura 34. Análisis de la estructura secundaria de MobMN199. ... 100
Figura 35. Análisis de la estabilidad térmica de MobMN199 (15 µM). ... 102
Figura 36. Actividad de corte/cierre de MobMN199 tras el tratamiento de desnaturalización térmica, con o sin metales divalentes. ... 103
Figura 37. Estabilidad térmica de MobMN199 (15 µM) con diferentes concentraciones de MnCl2. ... 105
Figura 38. Árbol filogenético y alineamiento de la secuencia del oriT de la familia de plásmidos de replicación por círculo rodante (RC) de pMV158. ... 110
Figura 39. Representación de las posibles estructuras secundarias que se pueden formar en la cadena transferente del oriT de pMV158. ... 111
Figura 40. EMSA con DNA bicatenario lineal (A) o superenrollado (B y C). ... 113
Figura 41. Mapeo de los sitios de unión de la proteína MobM en el plásmido pMV158 mediante microscopía electrónica. ... 114
Figura 42. Capacidad de unión MobM o MobMN199 a IR2, IR3 y ORIT. ... 115
Figura 43. Aproximación experimental para el análisis de las interacciones entre MobM y el oriT mediante footprinting sobre DNA superenrollado. ... 116
Figura 44. Footprinting con DNasa I de MobM unida al oriT sobre DNA superenrollado de pMV158 . ... 118
Figura 45. Footprinting con DMS de MobM unida al oriT sobre DNA superenrollado de pMV158 . ... 119
Figura 46. Footprinting con permanganato potásico de MobM unida al oriT sobre DNA superenrollado de pMV158 . ... 121
Figura 47. Footprinting con permanganato potásico (KMnO4) de la cadena no-transferente del oriT de pMV158 . ... 122
Figura 48. Estequiometría de unión de MobMN199 por los oligonucleótidos IR3 (A) y ORIT (B). ... 123
conformación de cadena sencilla. ... 126
Figura 51. Competición entre IR3-Cy5 y el mismo oligonucleótido (A), el oligonucleótido ORIT (B), IR1+8 (C), o los oligonucleótidos IR1, IR3-R y 10-NIC (D). ... 127
Figura 52. Cinética de competición de IR3 (A) e IR1+8 (B) sobre los complejos formados por MobMN199 y el oligonucleótido marcado IR3-Cy5. ... 128
Figura 53. Influencia de la unión de DNA en la estabilidad térmica del dominio relaxasa de la proteína MobM. ... 129
Figura 54. Estructura tridimensional de MobMN199 unida al oligonucleótido IR1+8. 130 Figura 55. Comparación entre plegamiento del dominio relaxasa de MobM (en rojo) con las proteínas TrwC (violeta) y TraI (marrón). ... 130
Figura 56. Mapa de interacciones entre MobM y el DNA del oriT. ... 131
Figura 57. Centro activo de MobM. ... 132
Figura 58. Actividad de corte de MobM(Y44F) y MobM. ... 133
Figura 59. Comparación entre las estructuras de TrwCN293 (izquierda) y MobMN199 (derecha) indicando la posición de los extremos 3‟ de los respectivos DNAs empleados en la obtención de los cocristales. ... 134
Figura 60. Propiedades de la proteína MobMN243. ... 135
Figura 61. Características de los mutantes en los sso de pMV158. ... 140
Figura 62. Procedimiento experimental (A) y esquema de la distribución (B) de los ensayos de conjugación en filtro con placas multipocillo. ... 142
Figura 63. Correlación entre emisión de fluorescencia y frecuencia de transferencia de pMV158GFP. ... 144
Figura 64. Expresión del gen gfp en células portadoras del plásmido pMV158GFP. 144 Figura 65. Frecuencias de movilización de pMV158 y derivados deficientes en los sso desde S. pneumoniae con pAMβ1 hacia un receptor de S. pneumoniae (barra gris) o de E. faecalis (barra rayada). ... 146
Figura 66. Acumulación de formas ssDNA de pMV158 y derivados con mutaciones en ssoA o en ssoU (A) o en ambos sso (B), en S. pneumoniae. ... 148
Figura 67. Acumulación de formas monocatenarias de pMV158 y derivados con mutaciones en ssoA o en ssoU (A) o en ambos sso (B), en E. faecalis. ... 148
Figura 68. Análisis del circuito regulador de MobM en E. coli. ... 152
Figura 69. Árbol filogenético y alineamiento de la secuencia de la región amino-terminal de las proteínas de tipo MobM pertenecientes a la familia de plásmidos RCR de pMV158. ... 154
Figura 70. Superposición de los centros activos de las relaxasas MobM-26DNA y TrwC-25DNA-Ni2+. ... 160
Figura 72. Modelo de interacción proteína-DNA en el inicio de la transferencia. ... 162
Figura 73. Funcionalidad del oriT en el inicio y la terminación de la transferencia conjugativa. ... 164
Figura 74. Correlación entre la estructura tridimensional y los datos de footprinting sobre DNA superenrollado. ... 166
Figura 75. Modelo de síntesis de doble cadena después de la transferencia de pMV158. ... 169
A Absorbancia
Ap Ampicilina
ATP Adenosina 5´-trifosfato
BrEt Bromuro de Etidio
BSA Seroalbúmina bovina
CD Dicroísmo circular Ci Curios Cm Cloramfenicol Cy5 Indocarbocianina-5 DNasa I Desoxirribonucleasa I DMS Dimetil sulfato DMSO Dimetilsulfóxido DO Densidad óptica DOC Deoxicolato DR Repetición directa
DSC Calorimetría diferencial de barrido
dsDNA DNA de doble cadena
dso Origen de replicación de cadena doble
EDTA N,N,N´,N´-etilendiamino tetraacetato disódico
Em Eritromicina
EMSA Ensayos de movilidad diferencial en geles nativos
Fig. Figura
G+ Gram-positiva
G- Gram-negativa
GFP Proteína fluorescente verde
HGT Transferencia genética horizontal
HPLC Cromatografía líquida de alta presión
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
ITC Calorimetría isotérmica de valoración
kb Kilobase, kilopares de bases
Km Kanamicina
IR Repetición invertida
nic Sitio de corte
Nov Novobiocina
oriT Origen de transferencia
PAA Poliacrilamida
PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida
PEI Poli-etilenimina
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
Rif Rifampicina
rpm Revoluciones por minuto
s segundos
SDS Dodecil Sulfato Sódico
Se-Met Selenio-metionina
ssDNA DNA de cadena sencilla
sso Origen de replicación de cadena retrasada
T-DNA DNA transferente por conjugación
Tc Tetraciclina
TEMED N,N,N´,N´-tetrametilen-diamina
Tris Trihidroximetil-amino-metano
U Unidad(es) enzimática(s)
U.A. Unidades de Absorbancia
1
1. PLÁSMIDOS BACTERIANOS
Los plásmidos son elementos genéticos extracromosómicos con capacidad para autoreplicarse de forma controlada, con ayuda de factores codificados en el DNA cromosómico del huésped y de forma coordinada con la división celular bacteriana. En la mayoría de los casos son circulares y bicatenarios, pudiendo variar en tamaño (<1-500 Kb) y en número de copias (1-30 copias/célula), manteniéndose estables en las poblaciones bacterianas a través de procesos de transferencia vertical y horizontal. Aunque se suele considerar material genético dispensable, la mayoría de los plásmidos proporcionan una gran variedad de fenotipos a sus huéspedes, reportándoles algún tipo de ventaja evolutiva a través de una relación simbiótica. Ejemplos de ello pueden ser la capacidad para degradar compuestos orgánicos, fijar nitrógeno, conferir resistencia a radiación, antibióticos o metales pesados, y producción de bacteriocinas. Así, los plásmidos pueden constituir entre un 1 y un 15% del genoma de muchas especies bacterianas y representan vehículos portadores de genes que, dependiendo del número de copias plasmídico, se encuentran en dosis más elevadas que en el cromosoma, y además pueden dispersarse por transferencia genética horizontal.
1.1. Clasificación
Existen diferentes estrategias para clasificar y establecer relaciones entre plásmidos. El primer sistema de clasificación atendía a características relacionadas con la capacidad de transferencia por conjugación y con la capacidad de inhibir la transferencia del plásmido F. Sin embargo, el descubrimiento y estudio de nuevos plásmidos, incluyendo aquellos que no pertenecían a enterobacterias o no eran auto-transmisibles, requería un nuevo esquema. Dado que es posible encontrar varios plásmidos en una célula, surgió una clasificación basada en grupos de incompatibilidad (Datta & Hedges, 1971), incluyendo en una misma familia a aquellos plásmidos relacionados que no son capaces de mantenerse y de ser heredados de forma estable en la misma línea celular, debido a que comparten los mecanismos de replicación y control. Hoy día, este análisis de incompatibilidad ha quedado obsoleto debido a: i) el gran número de plásmidos identificados que no pueden replicar en un huésped común, y ii) mutaciones puntuales en los elementos de control hacen que se pierda la incompatibilidad (López et al., 1989). La secuenciación de DNA ha permitido el diseño de estrategias muy fiables de clasificación, basadas en el análisis y comparación de las regiones del plásmido que codifican funciones de replicación y
2
transferencia horizontal. Según la base de datos de replicones plasmídicos (DPR, Database Plasmid Replicons), pueden definirse 17 familias de plásmidos que replican por el mecanismo de círculo rodante (RC) y 5 familias con replicación tipo theta. Sin embargo, esta base de datos ha quedado obsoleta por falta de actualización desde el año 2000. Por otro lado, recientemente se ha publicado un sistema de clasificación de plásmidos conjugativos basado en la comparación de las secuencias de las proteínas iniciadoras de la transferencia (relaxasas), donde pMV158 es el plásmido representante de una de las seis superfamilias definidas (Garcillán-Barcia et al., 2009; ver más adelante).
1.2. Mecanismos de replicación y control
La única región esencial para un plásmido es aquella en la que se encuentran los genes y las secuencias específicas implicadas en la replicación y el control del número de copias. Este módulo, conocido como replicón básico, se compone de: i) un origen de replicación (ori); ii) genes cop / inc, relacionados con el control del inicio de la replicación; y iii) genes rep, que codifican proteínas iniciadoras de la replicación. Tras el ensamblaje de todas las proteínas sobre el origen de replicación (replisoma), los plásmidos usan dos estrategias generales para iniciar el proceso replicativo (del Solar et al., 1998):
Replicación tipo theta. El nombre que define este tipo de replicación proviene de la forma similar a la letra griega θ (theta) que adquieren los intermediarios de replicación al ser visualizados mediante microscopía electrónica. Este mecanismo implica la apertura de las dos hebras de DNA en una región del origen con alto porcentaje A/T y la síntesis de fragmentos de RNA (pRNA) que sirven como cebadores para la iniciación de la replicación bidireccional de DNA, de forma continua sobre la cadena líder y discontinua sobre la cadena retrasada. En la mayoría de los casos se necesita una proteína iniciadora Rep y, según el replicón, pueden ser dependientes o no de la actividad de la DNA polimerasa I (Pol I). Así, en los plásmidos dependientes de Pol I, el replisoma se ensambla después de la síntesis inicial de la cadena líder por esta enzima. Por el contrario, el ensamblaje del replisoma en los plásmidos independientes de Pol I incluye interacciones macromoleculares que causan la apertura del origen y la carga sucesiva de la helicasa, primasa y DNA polimerasa III. El plásmido RSF1010 representa una variante de replicación de tipo theta (denominada replicación por desplazamiento de cadena) que no solo es independiente de Pol I, sino también de la
3 actividad helicasa y primasa de la célula, lo cual justifica su amplio rango de huésped (revisado en Espinosa et al., 2000).
Replicación por círculo rodante (RC). Este tipo de replicación se ha observado en un gran número de plásmidos de pequeño tamaño (<10 kb) aislados de bacterias G+ (como es el caso del plásmido pMV158), G- y Arquea. El mecanismo de replicación RC es unidireccional y asimétrico, ya que la síntesis de las cadenas líder y retrasada no está acoplada (Fig. 1). Este tipo de replicación comparte muchas similitudes con el proceso de transferencia genética horizontal por conjugación (Waters & Guiney, 1993). En concreto, el proceso es iniciado por la proteína Rep, tras reconocer el origen de cadena doble (dso) e introducir, a través de un residuo Tyr situado en el centro activo, un corte sobre el enlace fosfodiéster de un dinucleótido específico, solo en una de las cadenas del DNA plasmídico. La rotura genera un extremo 3'-OH desde el cual se inicia la síntesis de la cadena líder. Se postula que en la elongación intervendrían proteínas del huésped, esencialmente las DNA polimerasas I y III, una helicasa y la proteína de unión a DNA de cadena sencilla, SSB. Una vez que el replisoma alcanza el dso reconstituido, la replicación de la cadena líder concluye con una serie de reacciones de transesterificación (Rasooly et al., 1994). En este punto de la replicación coexiste una molécula plasmídica, compuesta por la cadena parental molde y la cadena líder de nueva síntesis, y un intermediario replicativo monocatenario (ssDNA) y circular, que corresponde a la cadena parental líder desplazada (te Riele et al., 1986). Estos intermediarios de ssDNA, distintivos de la replicación por círculo rodante, se convierten posteriormente en plásmidos bicatenarios (dsDNA) a partir del origen de cadena retrasada (sso), donde la RNA polimerasa sintetiza un cebador de RNA, que es extendido de forma consecutiva por Pol I y Pol III (Kramer et al., 1997). Por último, la ligasa cierra los extremos del dsDNA resultante y la girasa produce el superenrollamiento del mismo (revisado en Espinosa et al., 2000).
De las tres etapas de la replicación (iniciación, elongación y terminación), es en la iniciación cuando los plásmidos estudiados hasta la fecha controlan su número de copias. En todos los casos, esta regulación se realiza mediante sistemas de control negativo basados en diferentes estrategias: i) pequeños RNAs contratranscritos (ctRNA), que aparean por complementariedad y bloquean RNAs esenciales para la replicación (pRNA o mRNA de rep); ii) iterones, repeticiones directas de DNA que secuestran la proteína Rep o influyen en su autorregulación, o bien desactivan el origen de replicación por el mecanismo de handcuffing (Chattoraj, 2000); o iii) la acción
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combinada de una proteína represora que inhibe la transcripción de los genes rep, y un ctRNA que inhibe la traducción de las proteínas Rep (del Solar & Espinosa, 2000).
Figura 1. Modelo de replicación por círculo rodante del plásmido pT181.
La proteína Rep (dimérica) reconoce el origen de replicación (dso) sobre DNA superenrollado (SC) y genera un extremo 3'-OH, desde el que se inicia la síntesis de la cadena líder. Cuando el replisoma alcanza nuevamente el dso, la proteína Rep cataliza una reacción de transesterificación que libera una molécula plasmídica de doble cadena y un intermediario replicativo monocatenario (ssDNA). A partir del origen de cadena retrasada (sso), expuesto en los intermediarios de ssDNA, se genera una segunda copia de plásmido bicatenario. Por último, la ligasa cierra los extremos del dsDNA resultante y la girasa produce el superenrollamiento del mismo. Modificado de Khan, 1997.
1.3. Rango de huésped
La mayoría de los plásmidos de bacterias G- (como ColE1, pSC101, P1, F, R6K y R1) solo pueden replicar y mantenerse de forma estable en un número limitado de huéspedes muy relacionados entre sí. Otros plásmidos, como RK2, RP4 y RSF1010, especialmente este último, han desarrollado diferentes estrategias que les permiten extenderse a la gran mayoría de los huéspedes G- y a alguna bacteria G+. En bacterias G+, muchos plásmidos que replican por los mecanismos tipo theta o RC presentan un rango de huésped medio-alto, pudiendo establecerse en bacterias no relacionadas entre sí (incluyendo G-), razón por la que se denominan plásmidos promiscuos. Aunque los plásmidos son capaces de controlar de forma autónoma la frecuencia de inicio de la replicación, dependen, en mayor o menor medida, de la maquinaria sintética de la célula en la que se hospedan, tanto para el ensamblaje del
5 replisoma como para las siguientes etapas de elongación y terminación. Esto implica la existencia de una comunicación adecuada entre los factores específicos del plásmido y los del huésped, incluyendo: i) un equilibrio entre la transcripción y traducción de los genes encargados de la replicación y control; ii) unos niveles de superenrollamiento adecuados; y iii) la interacción apropiada con proteínas reguladoras (H-NS, Hfq) o proteínas de tipo histona (HU, IHF, FIS), implicadas en la curvatura del DNA y la formación del replisoma (revisado en Espinosa et al., 2000). No obstante, un estudio reciente a nivel genómico ha demostrado que, al menos en Escherichia coli, no hay genes cromosómicos con un papel esencial en la conjugación plasmídica, sugiriendo que este mecanismo actúa como un sistema de inyección de DNA que no tiene en cuenta la constitución de la célula receptora (Pérez-Mendoza & de la Cruz, 2009).
2. TRANSFERENCIA GENÉTICA HORIZONTAL
La transferencia genética horizontal (HGT, horizontal gene transfer) hace referencia a los eventos de intercambio de material genético entre bacterias no relacionadas filogenéticamente o incluso con organismos eucarióticos. Este fenómeno supone una fuerza evolutiva importante en la organización, adaptación y especialización de los genomas bacterianos en diversos nichos medioambientales. La HGT requiere una maquinaria compleja de proteínas que hacen posible el paso de una molécula de DNA a través de la barrera que supone la envuelta celular bacteriana. Los tres sistemas HGT descritos son la transformación, la transducción y la conjugación.
La transformación fue el primer mecanismo HGT descubierto (Griflith, 1928) y se define como un cambio genético estable producido al incorporar DNA desnudo (sin proteínas asociadas), desde el exterior celular. El proceso supone una liberación de DNA en el ambiente, bien por muerte celular o por secreción activa de células vivas, que luego interacciona con receptores de superficie de células competentes y se introduce hacia el citoplasma en forma de ssDNA. Si esta molécula no tiene capacidad autoreplicativa podría integrarse en el genoma bacteriano mediante recombinación homóloga, dependiendo del grado de similitud de secuencia. Esta limitación supone que la incorporación de DNA extracelular mediante transformación solo es posible entre especies bacterianas estrechamente relacionadas (Claverys et al., 2009).
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La transducción se define como el proceso de transporte de DNA de una célula a otra a través de un virus bacteriano (bacteriófago). Tras la absorción del bacteriófago a la superficie bacteriana y la inyección del DNA en el interior celular, el ciclo de reproducción vírico puede ser lítico o lisogénico. En el primero, el DNA vírico replica rápidamente para generar nuevas partículas virales que finalmente rompen la célula y continúan la infección. En el segundo, el DNA vírico se integra en el genoma bacteriano (profago), y replica de acuerdo con la división celular hasta que entra nuevamente en fase lítica en respuesta a estímulos ambientales. Algunas veces, durante la escisión del DNA profágico (estado lisogénico) o el empaquetado del DNA en la cápsula (estado lítico), parte del DNA del huésped también puede ser procesado y transferido a otras células. Como ocurre en la transformación, este DNA debe integrarse en el genoma de la célula receptora, lo cual también supone un límite en el rango de huésped.
Figura 2. Transferencia de DNA entre células bacterianas.
En la transformación (1) el DNA libre de doble cadena es procesado mediante helicasas y exonucleasas para introducirlo en la célula en estado monocatenario. En la transducción (2) el DNA genómico de un bacteriófago (amarillo) se inserta en el cromosoma de la bacteria (azul) como un profago. Tras la replicación, parte del DNA del hospedador (transducción generalizada) o del DNA próximo al sitio de integración del profago (transducción especializada) se encapsula accidentalmente. Las partículas víricas infectan una nueva célula receptora, en que el DNA recombina con el cromosoma (rojo). En la conjugación (3) se transfiere DNA entre dos bacterias que están en contacto mediante el pilus. Un plásmido movilizable (azul claro) puede transferirse con la ayuda de las funciones codificadas en los plásmidos conjugativos auto-transmisibles (naranja). Modificado de Frost et al., 2005.
7 La conjugación es la transferencia de material genético (plásmidos o transposones) desde una célula donadora a otra receptora mediante contacto físico (Fig. 2). En este caso, el DNA transferido (T-DNA) posee su propio origen de replicación y, a diferencia de la transformación y transducción, no es necesaria su integración en genoma de la célula, lo cual permite un mayor rango de huésped (Frost et al., 2005). El gran número de elementos conjugativos identificados hasta la fecha (>1000 miembros; Garcillán-Barcia et al., 2009) confirma que la conjugación es el mecanismo de transferencia genética horizontal más extendido y supone el mayor reservorio de genes móviles en el mundo procariota. Entre los elementos móviles, los plásmidos son unas piezas clave debido a su habilidad de transferirse mediante conjugación entre estirpes relacionadas o muy distantes desde el punto de vista filogenético. Mientras que los plásmidos conjugativos aislados en bacterias G- han sido estudiados exhaustivamente, se ha prestado menos atención a los elementos conjugativos de bacterias G+ (Grohmann et al., 2003).
2.1. Modelo de transferencia de DNA por conjugación
El modelo actual de conjugación bacteriana se define como la combinación de un mecanismo de replicación de DNA por círculo rodante (Fig. 1) y un sistema de secreción de macromoléculas de tipo IV. Así, el proceso conjugativo puede considerarse, según las proteínas que intervienen, como integrado por tres módulos especializados: el relaxosoma (Dtr, DNA transfer replication), el sistema de secreción de tipo IV (T4SS, Type IV Secretion System) y la proteína acopladora (CP, Coupling Protein). En base a este modelo, los plásmidos transferibles pueden distinguirse en: i) plásmidos conjugativos (también denominados autotransferibles), en los que existe un módulo con todos los genes implicados en la transferencia por conjugación, y ii) plásmidos movilizables, portadores solamente del origen de transferencia (oriT) y del gen que codifica la relaxasa, de manera que solamente se transfieren cuando co-residen en la misma célula con algún elemento móvil autotransferible, que aporta el resto de la maquinaria (CP y T4SS). En este segundo grupo se encuentra el plásmido pMV158, objeto de estudio de esta tesis.
El relaxosoma está compuesto por las proteínas que preparan el DNA para ser transferido. La proteína iniciadora (relaxasa) introduce un corte específico dentro del origen de transferencia (oriT) solamente en la cadena que se va a transferir. Esta cadena es posteriormente desplazada de manera similar a la replicación por círculo
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rodante. En este sentido, los mecanismos de replicación por círculo rodante y de transferencia por conjugación son equivalentes ya que comparten una serie de características que pueden interpretarse como una solución común a la propagación vertical y horizontal del DNA plasmídico (Espinosa et al., 2005; Novick, 1998). En ambos procesos, el primer paso consiste en la relajación del DNA superenrollado (actividad relaxasa) por la acción de proteínas (Rep y Tra-Mob) codificadas en el propio plásmido, que comparten motivos catalíticos y que reconocen sus respectivos sitios de unión, el dso (replicación) o el oriT (conjugación).
El relaxosoma se conecta con el dominio citoplasmático de varios componentes del sistema T4S a través de la proteína acopladora (CP), la cual participa con el T4SS en el bombeo del DNA hacia la célula receptora. El sistema T4S es un conjunto de proteínas que se ensamblan para formar un canal transmembrana que, tras establecer los contactos intercelulares, es capaz de bombear el complejo Relaxasa-T-DNA desde una célula a otra. Este tipo de transportador es empleado por la bacteria Agrobacterium tumefaciens para transferir el plásmido pTi a células de plantas (Christie, 2001) y por patógenos animales para inyectar factores de virulencia en células diana (Ding et al., 2003; Llosa et al., 2009).
2.2. Bases moleculares de la conjugación
Los mecanismos moleculares que ocurren durante la conjugación se han estudiado detalladamente en varios sistemas, sobre todo en plásmidos conjugativos de bacterias G- y en el transporte de T-DNA del plásmido pTi desde A. tumefaciens a plantas leguminosas. A pesar de las particularidades que comprenden cada uno de estos sistemas, se podrían enumerar una serie de reacciones comunes que ocurren durante el proceso de transferencia:
I. Expresión de los genes implicados en la transferencia conjugativa: Los plásmidos de la familia Ti poseen un sistema de regulación transcripcional de tipo “Quorum-sensing”, que responde de forma jerárquica a varias señales. Así, ciertos nutrientes liberados por células de plantas infectadas por el DNA plasmídico (denominados “opinas”), favorecen la síntesis de una hormona producida por la propia bacteria. A su vez, esta hormona activa a la proteína TraR, un inductor de la expresión de los genes implicados en la transferencia (Oger & Farrand, 2002). En la familia de plásmidos de tipo F se ha observado que la expresión génica está controlada mediante un sistema
9 complejo, donde TraJ es el activador inicial de la transcripción de los genes tra y de los reguladores TraM y TraY (Fig. 3).
Figura 3. Circuito regulador de los genes de transferencia de plásmidos tipo F.
Los efectos positivos o negativos en la transcripción se indican, respectivamente, mediante líneas continuas que acaban en puntas de flecha, o mediante líneas discontinuas que acaban en barra (ver los detalles del mecanismo en el texto).Tomado de Will & Frost, 2006a.
Mientras que la proteína de unión a RNA del huésped (Hfq) reprime la síntesis de TraJ y TraM mediante desestabilización de sus respectivos mRNAs (Will & Frost, 2006a), la proteína asociada a nucleoide (H-NS) reprime el operón tra. Así, se piensa que la activación de la expresión se debe a que TraJ bloquea la acción de H-NS (Will & Frost, 2006b). Por otro lado, los niveles de TraJ dependen de un sistema inhibidor denominado FinOP. FinP es un RNA contratranscrito complementario al mRNA_traJ y FinO es una chaperona que estabiliza este híbrido, bloqueando la síntesis de TraJ a nivel traduccional (Gubbins et al., 2003). Además, según se ha observado en el plásmido de virulencia pLST (Salmonella enterica serovar Typhimurium), tanto finP como traJ están regulados a nivel transcripcional por una DNA metilasa de adeninas, elevando el nivel de complejidad en la regulación de este circuito plasmídico (Camacho et al., 2005a; Camacho & Casadesús, 2005b). Curiosamente, en el caso específico del plásmido F se ha observado que el gen finO no es funcional debido a una inserción de un elemento transponible (IS3a) dentro de la región codificante. Por ello, los niveles de conjugación del plásmido F son muy elevados, exhibiendo unas frecuencias de transferencia cercanas a 1.
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II. Formación del par conjugativo: Una vez que se han sintetizado las proteínas necesarias, la conjugación plasmídica comienza cuando las dos células implicadas (donador y receptor) entran en contacto físico. Si la formación del par conjugativo ocurre entre dos células que contienen el mismo plásmido (o similar) se activa el sistema de exclusión de entrada (revisado en Garcillán-Barcia & de la Cruz, 2008), bien mediante proteínas de superficie (TraT de F) que probablemente impiden la unión del pili (Riede & Eschbach, 1986) o bien mediante proteínas de la membrana interna (TraS de F o TrbK de RP4) que bloquean la entrada del DNA (Haase et al., 1996). En bacterias G+ la interacción celular parece ocurrir mediante proteínas de adhesión (Grohmann et al., 2003), y en bacterias G- se lleva a cabo a través de la extensión del pilus conjugativo desde la célula donadora (Anthony et al., 1994). Mientras que en el plásmido F de E. coli, el pilus se retracta para juntar las células implicadas (Lawley et al., 2003), los sistemas pTi, RP4, R388 y pKM101 carecen de esta capacidad de contracción (Zechner et al., 2000), y probablemente funcionan como estructuras de adhesión que promueven la agregación celular, de forma similar al sistema pCF10 en E. faecalis (Dunny & Leonard, 1997). Así, dependiendo de que el medio de conjugación sea sólido o líquido, este factor supone un condicionante en la eficiencia de la transferencia plasmídica de unas células a otras (Tabla 1).
Tabla 1. Plásmidos conjugativos modelo de bacterias Gram-negativas.
Grupo de Incompatibilidad
(Familia*) Prototipo Pili
Medio de Conjugación
IncF (MOBF) F/R1/R100 Flexible líquido
IncI (MOBP) ColIb-P9/R64 Rígido-Flexible semisólido-líquido
IncN (MOBF) R46/pKM101 Rígido sólido
IncP (MOBP) RP4/RK2 Rígido sólido
IncW (MOBF) R388 Rígido sólido
IncX (MOBP) R6K Flexible semisólido
Extraído de Zechner et al., 2000 (*según Garcillán-Barcia et al., 2009).
III. Señales inductoras de la conjugación: Se asume que el relaxosoma se encuentra ensamblado en el oriT y sólo se activa en función a señales inductoras la conjugación (Lanka & Wilkins, 1995). En ausencia de estas señales, la molécula plasmídica seguiría su ciclo replicativo y el relaxosoma sería desplazado por la maquinaria de replicación vegetativa. A pesar de que actualmente se desconoce la naturaleza de estas señales efectoras, se ha observado que la proteína TraM (codificada en los
11 plásmidos F y R1), intensifica la actividad relaxasa e interacciona con la proteína acopladora tras unirse al oriT (Beranek et al., 2004; Ragonese et al., 2007). En el plásmido F hay otras dos proteínas auxiliares implicadas en la formación del relaxosoma: el factor de integración del huésped IHF (integration host factor) y la proteína TraY, codificada por el propio plásmido. Ambas proteínas se unen en varios sitios del oriT y distorsionan el DNA (Luo et al., 1994) para generar un sustrato adecuado de corte para la relaxasa TraI (Fig. 4A). Aunque TraM no es esencial para la formación del relaxosoma, su unión específica alrededor de las regiones de reconocimiento de IHF supone un estímulo para la actividad relaxasa (Ragonese et al., 2007). En el caso del plásmido R388, el relaxosoma está formado por la unión de relaxasa TrwC y las proteínas accesorias IHF y TrwA (Fig. 4B). Mientras que TrwA estimula el proceso conjugativo (Moncalián et al., 1997), IHF se une específicamente a dos sitios del oriT y reprime la reacción de corte por TrwC. Por ello, se piensa que el inicio del procesamiento conjugativo del DNA en R388 puede estar mediado por el abandono de IHF del oriT (Moncalián et al., 1999a). Por otro lado, algunos plásmidos conjugativos de Enterococcus faecalis responden a feromonas peptídicas codificadas en el cromosoma de células potencialmente receptoras (Clewell et al., 2002). Concretamente, la proteína tetramérica PrgX del plásmido pCF10 se desestabiliza tras unirse a una feromona peptídica, de manera que se desencadenan los cambios estructurales necesarios en el oriT para iniciar la conjugación (Shi et al., 2005).
Figura 4. Ensamblaje de proteínas del relaxosoma de los plásmidos F y R388.
A) Se muestra una representación del oriT de F en la que aparecen las zonas de unión de las proteínas accesorias IHF (amarillo), TraM (verde) y TraY (naranja), el sitio nic (flecha) y la relaxasa TraI (azul). Los sitios de reconocimiento de cada proteína se representan en el mismo color. Modificado de Ragonese et al., 2007. B) Modelo de la arquitectura del relaxosoma de R388, donde la unión de IHF bloquea la apertura del sitio nic y se inhibe la actividad relaxasa de TrwC. Por el contrario, la proteína TrwA (en rojo), homóloga a TraY de F, estimula el proceso conjugativo. Modificado de Moncalián et al., 1999a.
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IV. Actividad relaxasa: La proteína iniciadora de la conjugación es una endonucleasa que corta específicamente en una de las cadenas del oriT, de manera que el plásmido superenrollado pasa a estar topológicamente relajado. Por esta razón, estas proteínas con actividad topoisomerasa-I se han definido genéricamente como relaxasas. Los contactos que la relaxasa establece con el oriT tienen lugar en la región que incluye el sitio de corte y el brazo proximal de una repetición invertida ubicada a 5‟ del mismo. Los detalles bioquímicos y estructurales de esta reacción se conocen muy bien en varios sistemas, y en todos ellos serequiere que el DNA que contiene el sitio de corte esté desapareado, en forma monocatenaria (Pansegrau & Lanka, 1996a; Guasch et al., 2003; Datta et al., 2003; Larkin et al., 2005).
Figura 5. Mecanismo catalítico de TrwC en el inicio de la transferencia.
En azul se indican los aminoácidos que conforman el sitio activo; en violeta, el dinucleótido de corte (5‟-TpA-3‟). Tomado de Boer et al., 2006.
El sitio activo de la proteína se compone por un residuo Tyr y un motivo HUH (residuos: His-hidrofóbico-His) capaz de coordinar un catión divalente conjuntamente con otro residuo His y un residuo Asp. El metal favorece la unión del ssDNA con la proteína y es el responsable del posicionamiento correcto del enlace fosfato para que el oxígeno del residuo catalítico Tyr ejerza su ataque nucleofílico. La interacción con el metal aumenta la electronegatividad de uno de los oxígenos del grupo fosfato, de forma que el fósforo, parcialmente más positivo, es una buena diana para el ataque nucleofílico. Además, la combinación de las tres His y el Asp permiten una alta afinidad por el metal sin comprometer la interacción con el ssDNA, a pesar de encontrarse muy cerca de un residuo ácido (el residuo catalítico). Se piensa que el
13 residuo Asp, aparte de formar un puente de hidrógeno con una de las His del motivo HUH, podría actuar como base para extraer el protón del grupo hidroxilo de la Tyr catalítica y potenciar el ataque sobre el enlace fosfato (Fig. 5). Además, se ha demostrado que este residuo Asp modula la afinidad del metal coordinado a pesar de encontrarse a una distancia considerable (Larkin et al., 2007).
V. Replicación conjugativa en el donador: Tras la reacción de corte se genera un enlaceentre el extremo 5‟ del DNA y el residuo Tyr de la relaxasa, de manera que la proteína queda unida de forma covalente al DNA. Consecuentemente, el extremo 3‟-OH generado queda libre (Pansegrau & Lanka, 1996a; Pansegrau & Lanka, 1996b; Guzmán & Espinosa, 1997) y, a modo de cebador, es susceptible de ser extendido mediante replicación por círculo rodante. No obstante, algunos autores han apuntado que la síntesis de la cadena complementaria en la célula donadora no es un requisito indispensable. En el caso del plásmido RSF1010 las copias que se transfieren por conjugación podrían ser reemplazadas fácilmente mediante replicación vegetativa (Meyer, 2009). Por otro lado, ciertos plásmidos conjugativos codifican proteínas bifuncionales, con actividad relaxasa en la región N-terminal y actividad helicasa en la región C-terminal. De esta forma, la misma proteína puede desenrollar de forma activa (consumiendo ATP) el dsDNA en sentido 5‟→3‟, mientras la cadena no transferida actuaría de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. Ejemplo de proteínas con actividad relaxasa/helicasa son TrwC y TraI, codificadas en los plásmidos R388 y F/R1, respectivamente. Se ha observado que un mutante de TrwC en un motivo del dominio helicasa tiene un efecto negativo en conjugación, lo que sugiere que TrwC actúa en el proceso conjugativo como un multímero seguramente asociado a su función helicasa (Llosa et al., 1996). Sin embargo, muchos otros plásmidos, incluidos todos los plásmidos movilizables, no codifican proteínas con actividad helicasa, por lo que deberían reclutar la helicasa del huésped para separar las hebras del DNA. Cabe destacar que existen pocas evidencias experimentales que demuestren la replicación conjugativa en la célula donadora. En R1162 se ha definido dos regiones distintas dentro del oriT, una de ellas esencial para el inicio de la conjugación y la otra para la terminación (Erickson & Meyer, 1993). Empleando un vector con dos oriTs: i) oriTini, solo eficiente en iniciación y ii) oriTter, solo eficiente en terminación (y situado a 3‟ del primero), se observaron moléculas plasmídicas en las células receptoras de mayor longitud respecto a la original. Necesariamente, este fenómeno implica replicación conjugativa en la célula donadora, iniciada en el oriTini y terminada en oriTter.
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VI. Interacción entre el relaxosoma y la proteína acopladora: La proteína acopladora (CP) es una pieza clave en todos los sistemas de transferencia conjugativa conocidos hasta el momento. Experimentalmente se ha demostrado que la CP es el factor determinante de la funcionalidad de la maquinaria conjugativa, incluso en sistemas heterólogos compuestos por un relaxosoma y un T4SS que provienen de dos plásmidos diferentes (Llosa et al., 2003). Generalmente, parece existir una correlación entre la fuerza de esta interacción y la eficiencia de transferencia. En RP4 se ha observado una interacción directa entre la CP y la región C-terminal de la relaxasa (Schröder et al., 2002), mientras que en otros sistemas como en F la CP contacta con otras proteínas del relaxosoma, concretamente con TraM (Disque-Kochem & Dreiseikelmann, 1997). Por otro lado, se ha demostrado que la región citoplasmática de la CP de R388 (TrwB) interacciona, además de con la relaxasa TrwC, con la proteína accesoria TrwA (Cabezon & de la Cruz, 2006). La estructura cristalográfica del dominio citoplasmático de TrwB consiste en un hexámero de subunidades idénticas y un canal central de 20 Å (Fig. 6A; Gomis-Rüth et al., 2001). Se sabe que TrwB interactúa con el DNA de forma no específica y preferentemente con moléculas monocatenarias. Además, TrwB tiene capacidad de unión de nucleótidos tri- (NTPs) y bi-fosfato (NDPs), y presenta una actividad ATPasa que es sensible a pH y a la concentración de sales. Esta actividad está relacionada con la translocación del sustrato desde una célula a otra y se ha sugerido que el T-DNA podría atravesar la membrana a través del canal central de TrwB (Fig. 6B) hacia el sistema T4S.
Figura 6. Características estructurales de TrwB.
A) Hexámero visto desde la cara citoplasmática, con cada uno de los protómeros en diferente color. B) Modelo de TrwB integrada en la membrana celular mediante las hélices-α de la región
15 VII. Secreción activa del complejo T-DNA-Relaxasa: El plásmido pTi de A. tumefaciens representa el prototipo de los sistemas T4S. Las proteínas que conforman este canal de secreción se denominan VirB y suman un total de once (Cascales & Christie, 2004a; Chen et al., 2005). Recientemente se ha resuelto la estructura del sistema T4S del plásmido pKM101 mediante crio-microscopía electrónica (Fronzes et al., 2009). En este caso, el complejo central está constituido por 14 monómeros de las proteínas TraN, TraO y TraF (VirB7, VirB9 y VirB10, respectivamente), mientras que el homólogo a VirB8 no forma parte del mismo.
Figura 7. El sistema T4S.
A) En la figura se esquematiza el transporte del complejo T-DNA-Relaxasa a través del sistema T4S de A. tumefaciens (VirB/D4). La interacción está mediada por la proteína acopladora VirD4, de manera que el complejo DNA-proteína contacta sucesivamente con los componentes del canal VirB11, VirB6 y VirB8, y finalmente con VirB9 y VirB2. Los tres elementos con actividad ATPasa (VirD4, VirB4, VirB11) componen el motor del sistema y VirB10 actúa como sensor del estado energético, para bombear el DNA hacia la el exterior. Modificado de Chen et al., 2005. B) Reconstrucción tridimensional del sistema T4S del plásmido pKM101 por crio-microscopía electrónica. Modificado de Fronzes et al., 2009. C) Modelo estructural y funcional del canal del sistema T4S, donde la proteína VirB10 es responsable de la apertura del canal formado por VirB7 y VirB9 en función al estado energético de las ATPasas citoplasmáticas. Modificado de Llosa et al., 2009.
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Según se indica en la Figura 7A, el complejo intermediario T-DNA-Relaxasa establece, a través de la CP, una serie de contactos secuenciales con cinco proteínas VirB del sistema T4S. La CP (VirD4 en pTi), junto con dos proteínas del T4SS (VirB4 y VirB11) compone un motor dependiente de NTPs para translocar el sustrato T-DNA-relaxasa hacia la célula receptora. Concretamente, VirD4 transfiere el sustrato hacia la proteína VirB11, ubicada en la cara interna de la membrana citoplasmática, que posteriormente entra en contacto con los componentes transmembrana VirB6 y VirB8. En este punto, VirB6 ejerce de canal hidrofílico a través del cual se controla la secreción del sustrato. El poro o canal interno, compuesto por VirB7 y VirB9, tiene un diámetro mínimo en la zona de la membrana externa de 10 Å (Fig. 7B). Así, según se representa en la Figura 7C, la apertura de esta región durante la traslocación del sustrato estaría mediada por una serie de cambios conformacionales de VirB10, en función al estado energético de las ATPasas VirB4, VirB11 y VirD4 (Cascales & Christie, 2004b; Llosa et al., 2009).
VIII. Recircularización del DNA mediante transesterificación: Después de que el sustrato se haya transferido por completo a la célula receptora, es la propia relaxasa la que llevaría a cabo una segunda reacción de transesterificación que resulta en la recircularización del T-DNA. Numerosos trabajos han demostrado la capacidad de corte y cierre que tienen las relaxasas sobre oligonucleótidos que contienen el sitio nic. La reacción de cierre se lleva a cabo mediante una segunda tirosina, que puede estar ubicada en la misma molécula de proteína (como en TrwC, TraH y TraI_F) o bien por la tirosina de otra unidad de proteína (como MobA y TraI_RP4). Uno de los sistemas mejor estudiados en este sentido es el plásmido R388, en el que se ha demostrado que la relaxasa TrwC entra en la célula receptora y mantiene su actividad catalítica (Draper et al., 2005). Además, cuando se emplean células receptoras que expresan anticuerpos Anti-TrwC se ha observado una inhibición específica de la transferencia conjugativa del plásmido R388 (Garcillán-Barcia et al., 2007). Un estudio reciente de los intermediarios de reacción con oligonucleótidos modificados ha permitido definir un modelo detallado del mecanismo de procesamiento del DNA durante la transferencia conjugativa del plásmido R388 (González-Pérez et al., 2007). En este modelo, el residuo Tyr ubicado en la posición 18 (Y18) corta el DNA para iniciar la transferencia desde la célula donadora, mientras que el residuo Y26 cierra el DNA mediante transesterificación en la célula receptora, tras reconocer la horquilla IR2 (Fig. 8).
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Figura 8. Procesamiento del DNA durante la transferencia de R388.
TrwC (en verde) reconoce el oriT del plásmido R388 (1) y la Y18 corta en el sitio nic, uniéndose al extremo 5‟ del DNA (2). El complejo proteína-DNA pasa a la célula receptora y TrwC se une al nuevo oriT, reconstituido por replicación RC (3). Y26 corta en el sitio nic del segundo oriT y el extremo 3‟-OH generado ataca al complejo Y18-DNA (4). Tras la reacción de transesterificación la molécula de DNA queda libre (5).Modificado de González-Pérez et al., 2007.
IX. Replicación conjugativa en el receptor: Se piensa que la síntesis de la cadena complementaria ocurre de forma simultánea a la entrada del T-DNA en la célula receptora (Lanka & Wilkins, 1995). Debido a la polaridad 5‟→3‟ del T-DNA, la síntesis debería ser discontinua y el inicio de la misma requeriría uno o varios cebadores, dependiendo del tamaño del plásmido (Fig. 9). La eficiencia de este proceso es importante para evitar el acúmulo de formas monocatenarias de DNA, y reducir la probabilidad de daños irreparables como supone la rotura de un DNA de cadena sencilla. El plásmido R1162 representa el modelo mejor estudiado en este sentido, y se ha observado que existen diferentes mecanismos de síntesis de cadena complementaria dependiendo del huésped bacteriano (Parker & Meyer, 2005a). Concretamente, la relaxasa de R1162 contiene un dominio con actividad primasa en la región C-terminal, que es capaz de sintetizar un pequeño cebador de RNA, desde el cual se inicia la síntesis de la cadena complementaria. Este dominio primasa no solo está implicado en la replicación vegetativa sino que también actúa en la síntesis de la cadena complementaria durante la conjugación del plásmido R1162 hacia la bacteria Salmonella enterica. Sin embargo, esta actividad primasa es prescindible cuando la
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bacteria receptora es E. coli, de manera que deben existir mecanismos alternativos de síntesis que aún no se han caracterizado.
Figura 9. Modelo de replicación conjugativa en la célula receptora.
La cadena transferente (T-DNA) entra en estado monocatenario y se recubre de proteínas de unión a DNA (SSB). Esta cadena actúa de molde para la síntesis de la cadena complementaria en la célula receptora a partir de un cebador. Modificado de Willetts & Wilkins, 1984.
X. Terminación de la conjugación: Por último, la copia plasmídica de doble cadena recién generada es superenrollada mediante actividad girasa. En este punto acabaría el proceso conjugativo, de manera que a partir de la nueva molécula plasmídica que hay en la célula receptora se sintetizan todas las proteínas y RNAs implicados en la replicación activa del plásmido, aumentando el número de copias para asegurar su estabilidad y segregación, además de expresar factores de virulencia, resistencia a antibióticos y/o proteínas de exclusión de entrada.
2.3. Orígenes de transferencia y relaxasas
El origen de transferencia (oriT) es el único elemento que se requiere en cis para la transferencia de un plásmido por conjugación. Dependiendo del plásmido, la longitud del DNA que incluye el oriT puede variar entre 38 y 500 pb, pero en todos ellos se pueden definir una serie de características comunes. La parte más importante del oriT es una secuencia específica que incluye el sitio de corte para la relaxasa. A su vez, los oriTs presentan elementos implicados en la interacción DNA-proteína, tales como repeticiones directas (DR) o invertidas (IR), y regiones ricas en A+T que facilitarían formación de estructuras de tipo cruciforme y la fusión de la doble cadena en el DNA superenrollado, generando el sustrato adecuado para que la relaxasa introduzca el corte específico.
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Figura 10. Esquema de las relaciones entre las diferentes familias de relaxasas.
Las relaxasas que contienen una sola tirosina activa en el centro catalítico se agrupan en un mismo cluster (fondo gris oscuro). Las relaxasas con dos tirosinas forman un segundo cluster (fondo gris claro). Las relaxasas que no forman un grupo definido (fondo blanco) no presentan homologías significativas. Las relaxasas implicadas en replicación tipo RC, las transposasas de tipo IS91, o las hidrolasas HD solapan parcialmente con algunas de las familias MOB. El área de cada círculo es proporcional al número de relaxasas. Tomado de Garcillán-Barcia et al., 2009.
De forma genérica, se pueden definir las relaxasas como proteínas con actividad endonucleasa (DNA transferasa), implicadas en la iniciación de la replicación tipo círculo rodante (Rep) o bien en el inicio de la transferencia conjugativa (Mob, Tra). Estas proteínas contienen dos o más dominios funcionales y, normalmente, tanto la actividad endonucleasa como el dominio de unión a DNA se localizan en la región N-terminal, mientras que la región C-terminal podría contener dominios con actividad helicasa o primasa, además de dominios de oligomerización e interacción con otras proteínas. Las relaxasas presentan dos características comunes (Ilyina & Koonin, 1992). La primera es el motivo HUH (His-residuo hidrofóbico-His) que, junto a un tercer residuo His (HxDx4HUH, donde x es cualquier residuo), participa en la coordinación de un catión divalente esencial para el corte del DNA. La segunda característica de las relaxasas es el residuo catalítico, normalmente Tyr, el cual ejerce un ataque nucleofílico en el enlace fosfodiéster de un dinucleótido específico del oriT. Cabe destacar que los motivos encontrados en las relaxasas de tipo Rep o de tipo Mob presentan permutación circular, es decir, que el orden está invertido. Así, el motivo de coordinación de metal está más próximo al extremo N-terminal que el residuo catalítico
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en la familia Rep, mientras que las relaxasas de tipo Mob ocurre lo contrario (Francia et al., 2004). Un trabajo reciente ha agrupado todos los plásmidos que poseen módulos de transferencia conjugativa en base a la secuencia y propiedades de sus correspondientes relaxasas (Garcillán-Barcia et al., 2009). Concretamente, se han definido seis familias MOB distintas: MOBF, MOBH, MOBC, MOBQ, MOBP (que incluye la subfamilia MOBHEN) y MOBV (Fig. 10).
2.3.1. Familia MOB
FLas relaxasas de esta familia son proteínas grandes que contienen dos dominios claramente diferenciados. Mientras que el dominio relaxasa se encuentra en la región N-terminal, el dominio C-terminal presenta actividad helicasa. Los sistemas de conjugación mejor estudiados pertenecen a esta familia y están representados por las proteínas TrwC (Llosa et al., 1996; (Guasch et al., 2003; González-Pérez et al., 2007) y TraI (Larkin et al., 2005; Hekman et al., 2008) de los plásmidos R388 y F, respectivamente, ambos aislados originalmente de E. coli. En la proteína TrwC se ha identificado una región con actividad recombinasa sitio-específica entre diferentes copias del oriT del plásmido R388 in vivo (Llosa et al., 1994b; Cesar et al., 2006). Las estructuras tridimensionales de la región N-terminal de TrwC y TraI muestran un plegamiento similar, consistente en un núcleo central formado por una lámina de cinco cadenas-β antiparalelas, flanqueado por hélices-α (Fig. 11). Una característica típica es la presencia de dos tirosinas catalíticas en el centro activo (Grandoso et al., 2000). En TrwC, Y18 y Y26 actúan de forma secuencial en la reacción de corte y cierre del DNA durante el proceso de transferencia plasmídica (González-Pérez et al., 2007). El centro catalítico también se compone por la triada de histidinas H150, H161 y H163, junto con el residuo D85, que abstrae un protón de Y18 para convertirlo en un potente nucleófilo (Guasch et al., 2003). De igual forma, se ha observado que los residuos Y16 e Y23 de TraI_F son esenciales para el corte eficiente de ssDNA, aunque no influyen en su unión (Street et al., 2003). Además, mediante análisis por mutagénesis se ha demostrado que la contribución de las histidinas en la coordinación del metal es asimétrica, y que la unión del metal supone un aumento en la afinidad de TraI por el DNA (Larkin et al., 2007). La función helicasa de TrwC y TraI_F está relacionada con una actividad ATPasa dependiente de ssDNA e iones Mg2+. Esta actividad requiere la presencia de ssDNA para que se produzca el desenrollamiento, ya que las proteínas son incapaces de abrir DNA de cadena doble con extremos romos. El desenrollamiento de las cadenas se produce en dirección 5‟ a 3‟, lo que sugiere que la