Histomorfometria da matriz orgânica do fêmur de ratas ovariectomizadas tratadas com alendronato de sódio

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Texto completo

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Artigo

Original

Histomorfometria

da

matriz

orgânica

do

fêmur

de

ratas

ovariectomizadas

tratadas

com

alendronato

de

sódio

Patricia

Tanios

Haddad,

Márcio

Salazar

e

Luzmarina

Hernandes

UniversidadeEstadualdeMaringá,Maringá,Paraná,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo: Recebidoem18deoutubrode2013 Aceitoem5dejaneirode2014 On-lineem26dejulhode2014 Palavras-chave: Ovariectomia Alendronato Osteoporose Matrizóssea

r

e

s

u

m

o

Objetivo:avaliaraefeitodeduasconcentrac¸õesdiferentesdealendronatodesódio(ALN) sobreaquantidadedematrizorgânicanofêmurderatascomsupressãoestrogênica provo-cadaporovariectomia.

Métodos:ratasWistar(Rattusnorvegicus)com60diasforamsubmetidasalaparotomia bila-teralpararemoc¸ãodosovários.Osanimaisforamdivididosemgrupocontrole,noqual osanimaisforamapenaslaparotomizados;grupoovariectomizado(OVX);grupo ovariec-tomizadotratadocom1mg/kgdeALN(OVX1mg);egrupoovariectomizadotratadocom 2mg/kg de ALN (OVX2mg). ReceberamALN duas vezes por semana durante 90 dias. Ofêmur esquerdofoi coletado,fixadoe processado parainclusão em parafina.Cortes semisseriadoscoradoscomH&Eforamusadosparaaobtenc¸ão,comumsoftwaredeanálise deimagens,daáreaocupadapormatrizósseaorgânica.Opesodosanimaisfoiobtidono inicioenofimdoexperimento.

Resultados:osanimaisovariectomizadoseaquelestratadoscom1mg/kgdeALNtiveramum aumentosignificativo(p<0,05)nopesocorporalquandocomparadoscomogrupocontrole. Aanálisehistomorfométricarevelouquenosanimaistratadoscom2mg/kgdeALNaárea (␮m2)ocupadapormatrizorgânica(181.900±18.130)foisemelhante(p>0,05)àquelados animaiscontrolenãoovariectomizados(204.800±9.590),oqueindicaumefeitopreventivo dessemedicamentosobreaperdademassaóssea.

Conclusão:amaiorconcentrac¸ãodomedicamentoadministradoduasvezesporsemanapor 90diasfoimaiseficazdoqueadosede1mg/kgnomesmoperíodo.

©2014SociedadeBrasileiradeOrtopediaeTraumatologia.PublicadoporElsevierEditora Ltda.Todososdireitosreservados.

TrabalhodesenvolvidonoLaboratóriodeHistotécnicaAnimaldaUniversidadeEstadualdeMaringá,Paraná,Brasil.

Autorparacorrespondência.

E-mails:lhernandes@uem.br,luzhernandes@gmail.com(L.Hernandes).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2014.01.021

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Histomorphometry

of

the

organic

matrix

of

the

femur

in

ovariectomized

rats

treated

with

sodium

alendronate

Keywords: Ovariectomy Alendronate Osteoporosis Bonematrix

a

b

s

t

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a

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t

Objective: toevaluatetheeffectoftwodifferentconcentrationsofsodiumalendronateon thequantityoforganicmatrixinthefemurofratswithestrogensuppressioncausedby ovariectomy.

Methods:sixty-day-oldWistarrats(Rattusnorvegicus)weresubjectedtobilaterallaparotomy toremovetheovaries.Theanimalsweredividedintoacontrolgroup,inwhichtheyonly underwentlaparotomy;anovariectomizedgroup(OVX);anovariectomizedgrouptreated with1mg/kgofalendronate(OVX1mg);andanovariectomizedgrouptreatedwith2mg/kg ofalendronate(OVX2mg).Theratsreceivedalendronatetwiceaweekfor90days.The leftfemurwasthenremoved,fixedandprocessedforembeddinginparaffin.Semi-serial sectionsstainedwithhematoxylinandeosinwereusedtodeterminetheareaoccupied byorganicbonematrix,bymeansofimageanalysissoftware.Theanimals’weightswere obtainedatthebeginningandendoftheexperiment.

Results: theovariectomizedanimalsandthosetreatedwith1mg/kgofalendronate presen-tedsignificantincreasesinbodyweight(p<0.05),incomparisonwiththecontrolgroup. Histomorphometricanalysisrevealedthatintheanimalstreatedwith2mg/kgof alendro-nate,thearea(␮m2)occupiedbyorganicmatrix(181,900±18,130)wassimilar(p>0.05)to thatofthenon-ovariectomizedcontrolanimals(204,800±9,590),whichindicatesthatthis medicationhadapreventiveeffectwithregardtobonemassloss.

Conclusion: thehigherconcentrationofthemedication,administeredtwiceaweekfor90 days,wasmoreeffectivethanthedoseof1mg/kgoverthesameperiod.

©2014SociedadeBrasileiradeOrtopediaeTraumatologia.PublishedbyElsevierEditora Ltda.Allrightsreserved.

Introduc¸ão

Aosteoporosepós-menopausaéumadoenc¸a caracterizada peladeteriorac¸ão da microarquitetura e reduc¸ão da massa ósseaemfunc¸ãodoaumentonareabsorc¸ãopelos osteoclas-tos,comconsequenteaumentonasusceptibilidadeafraturas, cujaprevalênciaémuitoalta,maisfrequentedoqueasoma doscasosdeinfartodomiocárdio,câncerdemamaeacidente vascularcerebral.1Aosteoporosedeveserconsideradacomo umproblemadesaúdepública,2porqueafetaoindivíduoem suafunc¸ãosocial,físicaelaborale,portanto,provocaimpacto socioeconômico.3Aprincipalcausadaperdademassaóssea nasmulhereséadeficiênciadeestrogênionamenopausa.4

Os bifosfonatos tornaram-se na última década a pedra angularnotratamento da osteoporose.5 Sãousados parao tratamentoeaprevenc¸ãodessadoenc¸aededoenc¸as onco-lógicasqueresultamnoaumentoderemodelac¸ãoóssea.6Os bifosfonatostêm umaestruturaquímicaquetem forte afi-nidadecomofosfatodecálcio,oquefacilitasualigac¸ãoao osso.Duranteareabsorc¸ãoóssea,7ofármacoéabsorvidopelos osteoclastoseprovocaorompimentodocitoesqueleto,perda da borda pregueada, inibic¸ão das enzimas lisossomais, perdadaatividadereabsortivaemorteporapoptose.8Dessa forma,há umadiminuic¸ão da atividade osteoclástica, sem interferênciadiretanaatividadeneoformadora.9

OALNéumaminobifosfonatodesegundagerac¸ão,potente inibidordareabsorc¸ãoosteoclástica.10OusodoALNsuprimea remodelac¸ãoóssea11,12eaumentaadensidademineralóssea

(DMO),oquecontribuiparaevitarasfraturasvertebraisenão vertebrais. Como uso doALN, os marcadoresde turn over

ósseoapresentam-sereduzidos.12Ousodeumadose espe-cíficadeALNparaotratamento daosteoporoseresultaem desacelerac¸ãoimportantenaprogressãodadoenc¸a.8

Omodeloanimalmaisusadoparaoestudoda osteopo-rosepós-menopausaéaovariectomia,porqueemumperíodo relativamente curto pós-ovariectomia já se obtém um estadodeosteopeniamuitosemelhanteàhumana.13,14Com o usode animaistambém épossível investigaras diferen-tesformasdetratamentoedemedicamentosexistentesno mercado.Entretanto,nãoháumconsensoarespeitodadose adequadaparatestesemanimais.Oobjetivodestetrabalhoé avaliararespostadotecidoósseoemratasovariectomizadas frenteaduasconcentrac¸õesdistintasdeALN,umdos fárma-cosdisponíveisnomercadomaisusadosparaotratamentoda osteoporose.

Material

e

métodos

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética emExperimentac¸ãoAnimalda Universidade Estadual deMaringá(protocolon◦033/2009).

Procedimentoexperimental

RatasWistar(Rattusnorvegicus)com60diasforam anestesi-adascomumainjec¸ãointramusculardecloridratode2-(2,6 xilidino)-5,6-dihidro-4H-1,3-tiazina(Ronpun®)ecloridratode

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Figura1–FotomicrografiadofêmuresquerdoderataWistar.(A)Asáreasmarcadasindicamoscamposmicroscópicosque foramcapturadospelosotwareImageProPlus,paraaanálisemorfométricadaáreaocupadaporcolágeno.Aumentooriginal 4×.(B)Representaaformacomofoiobtidaamedidadaáreaocupadaporcolágeno:aáreatotalfoideterminadaeasáreas dosespac¸osvaziosforamsomadaseposteriormentesubtraídasdaáreatotal.Aumentooriginal20×.Hematoxilinaeeosina.

quetamina (Ketalar®) na relac¸ão 1:1. Empregou-se dessa

associac¸ão1mL.Kg–1 depesocorporalparaalaparotomiae

a remoc¸ão dos ovários.Aguardou-se até que desapareces-semosreflexosinterdigitaleocular.Aventilac¸ãopulmonar foi mantidade maneira espontânea.Até a recuperac¸ãoda anestesia os animais foram observados quanto ao reflexo ocular(pelaestimulac¸ãoda pálpebrasuperiorcom gaze),à frequênciarespiratória (observac¸ão direta dos movimentos torácico-abdominais)eàfrequênciacardíaca(verificadacom estetoscópiopediátricofixadonaregiãoanteriordotórax).

Osanimaisforamdivididosemquatrogruposdeoitocada: umgrupocontrole,noqualosanimaisforam apenas lapa-rotomizados; um grupo ovariectomizado (OVX); um grupo ovariectomizadotratadocom1mg/kgdeALN(OVX 1mg);e umgrupoovariectomizadotratadocom2mg/kgdeALN(OVX 2mg). Após arecuperac¸ão da anestesia, os animais foram mantidosemnúmerodequatroporgaiolasobatemperatura de20◦C,ciclodeclaro/escurode12horaselivreacessoaágua

ealimentac¸ãodurantetodooperíodoexperimental.Todosos animaisforampesadosnoinícioenofimdoexperimento.

Nasemanaseguinteàovariectomiaeduranteos90dias seguintesosgrupostratadosforaminjetados porvia intra-muscular com ALN 1mg/kg ou 2mg/kg duas vezes por semana,semprenamesma hora. Apóso períodode trata-mentoosanimaisforamsacrificadoscomumasobredosede cetamina. O fêmur esquerdo de cada animal foi removido e fixado emsoluc¸ão de paraformaldeído4% por 48 horas. Procedeu-se então à dissecc¸ão dos tecidos moles e poste-riordesmineralizac¸ãodoossoemácidofórmicopor21dias. Aseguir asamostras foram lavadas em água corrente por seishoras eprocessadaspara inclusãoemparafina.Foram feitoscortessemisseriadosde7␮maolongodomaioreixo dofêmur.Oscortesforamcoradoscomhematoxilinaeeosina (H&E)paraanálise.

Paraadeterminac¸ãodaáreaocupadapelamatrizorgânica, foram capturadas duas imagensde uma área padronizada nadiáfiseproximal,logoabaixododiscoepifisáriodofêmur esquerdo(figs.1A-B).Asimagensforamobtidasdetrês cor-tesporlâmina, emquatrolâminasporanimal, totalizando 24imagensporanimal.Foiusadoumsistemadecapturade

imagenscompostopormicroscópioOlympusBX41(Tóquio, Japão)comcâmaraQ.Color3RTOlympus(Tóquio,Japão) aco-plada.Asimagensforamobtidascomobjetivade20×.

Aáreaocupadaporcolágenofoisubmetidaaumsoftware

deanálisedeimagem(ImagemPro-Plus®,versão4.5,Media Cibernética,SilverSpring,MD),queobteveaáreaem micro-metrosquadrados.

Aáreaavaliadaeracompostaporossotrabeculareparao cálculodaáreaocupadapelamatrizorgânicaaseguinte meto-dologiafoi adotada:emprimeirolugarfoi calculadaaárea totaldaimagemcomaobjetivade20×;aseguirasáreasvazias decadacorte,quecorrespondemaotrabeculadoocupadopor medulaóssea,forammensuradasesomadasparaser poste-riormentesubtraídas daárea total(fig.2).O resultadofinal correspondeàáreaocupadapelamatrizorgânica.Todosos cálculosforamfeitosnoprogramaExcel(Microsoft Corpora-tion).Foiobtidaaáreamédiaem␮m2decadaanimalparaa

comparac¸ãoestatística. ** ** * 0 20 40 60 80 100 120

Controle OVX OVX 1mg OVX 2mg

Diferença entre o peso inicial e final (g)

Grupos

Figura2–Diferenc¸aentreopesocorporalinicialefinalde ratascontrole,ovariectomizadas(OVX)eovariectomizadas tratadascom1mg/kg(OVX1mg)ou2mg/kg(OVX2mg)de alendronatodesódio.Resultadossãoexpressoscomo média±DP.P<0,05quandocomparados*com**.

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**

**

*

0 50.000 1.00.000 1.50.000 2.00.000 2.50.000

Controle OVX OVX 1mg OVX 2mg

Grupos

Á

rea ocupada pela matriz orgânica (um)

Figura3–Área(m2)ocupadapormatrizósseaorgânicade ratascontrole,ovariectomizadas(OVX)eovariectomizadas tratadascom1mg/kg(OVX1mg)ou2mg/kg(OVX2mg) dealendronatodesódio.Resultadossãoexpressoscomo média±DP.P<0,05quandocomparados*com**.

Análiseestatística

FoifeitacomoprogramaGraphPadPrismR3.1.Osdados obti-dosforamrepresentadoscomomédia±desviopadrão.Oteste deanálisedevariânciausadofoioAnova.OtestedeTukey foiusadocomopós-testeparacomparac¸ãoentreasmédias. Oníveldesignificânciaadotadofoi5%.

Resultados

Opeso (g) iniciale finaldosanimais está representado na

figura2.Afigura3apresentaosresultadosdaanálisedaárea (␮m2)ocupadapelamatrizósseaorgânica.

Discussão

A ovariectomia experimental éum modelo de estudoque permiteavaliar,emanimais,asconsequênciasda perdade massaósseaemdiversassituac¸ões.15Omaisfrequenteéo estudodaeficáciademedicamentosdisponíveisnomercado paraotratamentodaosteoporose.4,8,10,16 Nessemodeloum períodode trêsmesesapósaremoc¸ãodosovários é sufici-enteparaqueocorraumasignificanteperdademassaóssea nofêmurderatasovariectomizadas.17

A ovariectomia leva a um progressivo e importante aumentono peso corporal.18 Neste estudo ratas ovariecto-mizadasforamtratadaspor90diascomduasconcentrac¸ões diferentesdeALN.Houveumaumentonopesocorporalnas ratas ovariectomizadas não tratadas e naquelas que rece-beram 1mg/kg de alendronato de sódio. Os animais que receberam2mg/kgnão tiveram alterac¸ãono peso corporal quandocomparadoscomogrupocontrole.Essesresultados demonstram que a dose de 2mg/kg foi mais eficiente na prevenc¸ãodoganhodemassacorporal.

A deficiência de estrogênio pode estar relacionada à diminuic¸ão de receptores de leptina no hipotálamo e provocadiminuic¸ãodasaciedade,19maioringestaalimentar econsequenteganhodemassacorpórea.Poroutrolado,há

tambémpossibilidadedediminuic¸ãodogastoenergéticoem fêmeascomdeficiência deestrogênio,fato quefacilitariao ganhodemassacorpórea.20

Asratasovariectomizadasreceberamtratamentocom1ou 2mg/kgdeALNduasvezesporsemana.Éimportanteressaltar queoiníciodotratamentoaconteceuumdiaapósa ovariec-tomiae,portanto,asfêmeasnãoapresentavamumquadro deperdaósseainstalado.Pormeiodaanálise histomorfomé-tricadamatrizorgânicaconstatou-sequeotratamentocom 2mg/kgdeALNteve umefeitopreventivosobreaperdade massa óssea. Os animais que receberam 1mg/kg apresen-taram diminuic¸ão da matriz óssea semelhante àquela dos animaisovariectomizados.

Osbisfosfonatosdiminuemograudecrescimentoósseo sem,porém,interferirnaqualidadederesistênciamecânica doosso,21ouseja,háumaprevenc¸ãodareabsorc¸ãopeloALN, masoossomantémsuascaracterísticasestruturaise mecâni-casnormais.22Osbifosfonatostornamoturnoverósseomais lentoeproporcionammaistempoparaaorganizac¸ão estrutu-ralóssea,semprejudicaroualteraraspropriedadesmecânicas dotecido.23

Em humanos, a posologia recomendada de ALN é de 1mg/kgdepesocorporal,umavezporsemana.Entretanto, osratostêmummetabolismoduasvezesmaisrápidodoque oshumanoseporessarazãoaadministrac¸ãodofármacofoi feitaduasvezesporsemana.Adosede1mg/kgfoiescolhida porseassemelharàquelaaplicadaaoshumanose,poroutro lado,adosede2mg/kgfoiescolhidaparaseradosetestada.

Não háconsensoentreosautoresarespeitoda dosede ALNquedeveseradministradaaosanimais.Itoetal.16 cons-tataram, em seu trabalho em ratas ovariectomizadas, que a administrac¸ão diária de 0,2mg e 1mg/kg, por 12 sema-nas, provocou um aumento significativona quantidade de matriz orgânica, em comparac¸ão com os animais ovaric-tomizados nãotratados; a densidade mineral óssea(DMO) do grupo ovariectomizado foi 24,2% menor do que a do grupo controle.Allen24 avaliouasconcentrac¸oes de0,1,0,2 e1mg/kg/diadeALNduranteotratamentodeumano. Cons-tatouqueosmelhoresresultadosforamobtidoscommaiores concentrac¸õesdomedicamento.

Diversosoutrosautorestestaramdiferentesconcentrac¸ões deALN,emtemposdiferentes,comassociac¸ãoounãocom outrassubstâncias,comovitaminaK,25vitaminaD3,16cálcio26 eestradiol.4 Os resultadosdessesestudosdemonstram, de maneirageral,queoALNapresentaumefeitoanabólicosobre aperdademassaósseaemanimaisovariectomizados.

Nossosresultadosmostraramqueadosede1mg/kgduas vezes semana não foi suficiente para estimular um efeito anabólico.Entretanto, Masayaet al.16 eAllen24 demonstra-ramnessamesmaconcentrac¸ão,comotratamentodiário,um aumentonadensidademineralósseaemratas ovariectomi-zadas,após12semanaseumano,respectivamente.

Conclusão

Aomenostrêsparâmetrosdevemserlevadosemconsiderac¸ão quando se usa o ALN em modelos animais: a dose, o tempo de tratamentoe aposologia. Assim,para as meno-res concentrac¸ões do medicamento, as doses devem ser

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mais frequentes e o tratamento deve ser por um período maior,paraquesealcanc¸emresultadosdesejáveis,eparaas concentrac¸õesmaioresafrequênciadeadministrac¸ão pode sermenor.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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