COOH CH 3 Ácido L-málico Ácido L-láctico

BACTERIAS LÁCTICAS Y FERMENTACIÓN MALOLACTICA (FML)

Aline Lonvaud

Faculté d'œnologie, 351 cours de la Libération, 33405 Talence - France

Tél. + 33 (0) 556846466, Fax. + 33(0) 556846468

¿A qué se llama FML en vinificación?

La FML aparece luego de la fermentación alcohólica en un periodo de tiempo que varía de algunos

días a varios meses. Se manifiesta por la presencia de dióxido del carbono, aunque en menor medida

que en la fermentación alcohólica. Debido a este parecido es que esta fase de la vinificación lleva el

nombre de fermentación.

En el sentido bioquímico, el fenómeno principal no es una fermentación (producción de energía a

partir de la oxido-reducción de substratos en ausencia de oxígeno), sino una reacción simple de

decarboxilación del ácido málico en ácido láctico.

COOH

|

HO–C-H

COOH

|

|

CH

HO–C–H + CO

|

|

COOH

CH

Ácido L-málico

Ácido L-láctico

El ácido málico presente en el mosto de uva (isómero L) es transformado molécula a molécula en

ácido láctico (isómero L).

En el vino, antes de la FML, la concentración en ácido málico es muy variable, desde 1 g/L como

mínimo hasta 8 g/L o más. La concentración de málico depende esencialmente del estado de

madurez de la uva en el momento de la cosecha, de las condiciones climáticas durante el verano, de

la cepa, de la tierra, etc. Las uvas de regiones más septentrionales son más ricas en ácido málico.

¿Cómo se sigue la puesta en marcha y la evolución de la FML?

La reacción de decarboxilación del ácido málico es el hecho prominente de la FML, por la cantidad de

substrato puesta en juego y por las repercusiones en los principales rasgos del vino (aumento del pH,

reducción de acidez total). El seguimiento de la FML se hace, por consiguiente, midiendo la

desaparición del ácido málico.

-

En la bodega: el método por cromatografía en papel (o en capa fina) es simple de

realizar y un fenómeno bien revelado. Las manchas de vino, sembradas en la base

de la hoja, son sometidas a una cromatografía gracias a la ascensión de un

solvente por capilaridad. La migración separa ácidos, en particular los ácidos málico

y láctico, cuya revelación es realizada con un indicador coloreado. Durante la FML,

la intensidad de la mancha del ácido málico disminuye, mientras que la mancha de

ácido láctico aumenta. Esta prueba no requiere de ningún equipo sofisticado y/o

costoso. Sin embargo, no es muy sensible ni precisa. Esto hace a la necesidad de

tener como recurso otros métodos analíticos, en caso de dudas en la puesta en

marcha de la FML e incluso al final del proceso.

-

En el laboratorio: la determinación del ácido málico a menudo se realiza por

métodos enzimáticos. El análisis es muy fiable y sensible. La FML degrada la

totalidad del ácido málico. A menudo, en la práctica, se considera que la FML ha

terminado cuando sólo existe cerca de 100-200 mg/L de ácido málico. De todas

maneras, en la mayoría de los casos, durante algunos días después del sulfitado se

mantiene una cierta actividad bacteriana y el deterioro continúa hasta el término de

la FML.

Como el ácido málico se transforma exclusivamente en ácido L-láctico, un buen método para detectar

el comienzo de la FML es, por lo tanto, determinar la presencia de este último. Si su concentración

es superior a 200-300 mg/L, es probable que la FML haya comenzado. Pero este proceso no sería

posible si no existiera algún tipo de actividad bacteriana durante la fermentación alcohólica.

¿Qué cambios provoca la FML?

Debido la degradación total del ácido málico (ácido dicarboxílico) en ácido láctico (monocarboxílico) y

a la liberación de CO

, el cambio esencial es la disminución de acidez. La FML es una

desacidificación biológica de vino. El pH se aumenta, la acidez total disminuye y la acidez del ácido

málico es reemplazada por un sabor más suave, debido al ácido láctico. Esta es la razón por la cual

se busca la FML, adaptándose bien para vinos blancos de regiones septentrionales, vinos base de

Champán, vinos blancos de Burgundy y, en general, vinos de la variedad Chardonnay. Además de las

características aromáticas varietales de los vinos, numerosos vinos blancos de ven beneficiados con

esta fermentación. Pero incluso a partir de Sauvignon, se han obtenido vinos más intensos,

complejos, estructurados y untuosos. En los vinos tintos la disminución de acidez, debida al FML, es

primordial por la suavidad y la redondez que aporta. Todos los vinos tintos, excepto ciertos casos,

requieren una FML.

Sin embargo, la desacidificación no es la única consecuencia. Las muy numerosas transformaciones

son implícitas en la evolución gustativa y aromática. Algunas substancias volátiles son sintetizadas y

ciertos componentes del color (en los vinos tintos) son modificados. Estos cambios se ponen en

evidencia por el análisis sensorial. Hasta ahora, no se han identificado todas estas sustancias.

Una de estas transformaciones es la del ácido cítrico cuya concentración inicial máxima es el orden

de 0,25 g/L. Ella conduce a la formación de diacetilo (molécula del aroma a manteca) que participa de

manera obvia al bouquet del vino, siempre que no se perciba de manera excesiva. Asimismo, las

moléculas carbonílicas formadas durante la FML conducen, a través de reacciones químicas con

aminoácidos, a la producción de sustancias aromáticas heterocíclicas. Finalmente, el metabolismo de

los aminoácidos, tales como metionina y cisteína, produce compuestos volátiles interesantes.

Durante la FML, el aumento de acidez volátil es débil, menos de 0,15 g/L. Este aumento proviene de

la fermentación de azúcares residuales de la fermentación alcohólica y de la degradación del ácido

cítrico.

La estabilidad microbiológica no debe ser considerada cómo estricta después del FML. La producción

de la substancia tóxicas y la utilización de nutrientes esenciales durante la FML pueden transformar

eficazmente al medio en hostil para las bacterias. Pero si el pH es demasiado elevado, tal inhibición

no se cumple y el medio se torna sensible a la contaminación.

¿Por qué ocurre la FML después de la fermentación alcohólica?

La FML es el resultado de la actividad de bacterias lácticas que se multiplican en el vino y alcanzan

una importante población.

Ácido cítrico rique

Ácido acético

Ácido oxálico

Ácido pirúvico

CO

Diacetilo

Acetoína

Butanodiol

Acetil-CoA

Ácidos grasos

Lípidos

Ácido acético

ATP

Taxonomía de las bacterias lácticas del vino

Géneros: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus

Especies: Lactobacillus plantarum, L. casei, L. hilgardii, L. brevis, L. fructivorans, L.

kunkei, L. nageli, L. diolivorans ...

Pediococcus damnosus, P. cerevisiae, P. parvulus

Leuconostoc mesenteroides

Oenococcus oeni

Oenococcus oeni

P. damnosus

_{L. hilgardii}

Las bacterias existen en el mosto de uva, pero las condiciones del vinificación son tales que

prácticamente no se desarrollan durante la fermentación alcohólica. En el mosto existe una gran

variedad de bacterias. El medio rico en azúcar, en aminoácidos y vitaminas sería muy favorable para

su crecimiento, si las levaduras no colonizaran primero el medio. En la competencia entre levaduras y

bacterias, son las primeras quienes ganan ya que están mejor adaptadas que las bacterias. El medio

« ocupado » por la masa de levaduras en fermentación se pone progresivamente más hostil para las

bacterias. La diversidad inicial de especies se reduce y la población disminuye hasta el final de la

fermentación alcohólica.

En este momento, el vino aloja, además de una población de levadura en fase de muerte y autolísis,

una población de bacterias lácticas débiles pero seleccionadas para tolerar numerosos inhibidores. La

composición del medio continúa cambiando porque, a pesar de la finalización de la fermentación de

los azúcares, otros fenómenos bioquímicos importantes continúan, entre ellos la autólisis de

levaduras que libra factores de crecimiento y nutrientes para las bacterias lácticas. Por su lado, las

bacterias, debido a la acción de proteasas y glucanasas, aceleran esta autólisis. En suma, la totalidad

de fenómenos bien conducidos lleva al crecimiento de bacterias. Cuando la población alcanza 10

UFC/mL, el deterioro del ácido málico comienza, iniciándose así la FML. Una vez que esta se pone en

marcha, avanza hasta su término, excepto en raros casos donde ocurre un enfriamiento brusco.

¿Qué bacterias intervienen y cuáles son los factores para su desarrollo?

En una FML espontánea, las bacterias lácticas provienen de la contaminación natural del mosto de

uva. Hasta ahora, más de diez especies de lactobacilos y cocos se han identificado en el mosto y en

el vino.

Los principales factores que actúan sobre el crecimiento bacteriano son la graduación alcohólica, el

tenor de dióxido de azufre, la temperatura y el pH. El efecto de cada uno de ellos debe ser

considerado en función del nivel de los otros tres. En la práctica, se ha demostrado que el vino no se

debe sulfitar después de la fermentación alcohólica, y que la temperatura se debe controlar. El

contenido de SO

libre debe ser lo más bajo posible; este, en general, es nulo porque la cantidad

agregada en la vendimia se combina. La temperatura óptima para conseguir el arranque de la FML es

20 a 22°C. Un enfriamiento ulterior generalmente disminuye la velocidad del proceso, mientras que un

calentamiento la realza.

Diversidad de las cepas de Oenococcus oeni durante la fermentacion maloláctica

A

A

B

B

C

D

E

F

G

Perfil de restricción de 18 aislamientos de una curva de FML

El etanol se vuelve apreciablemente inhibitorio para las bacterias a partir del 10%. La FML es, por

consiguiente, más difícil en vinos de tenor de volumen alcohólico elevado. No obstante, el factor más

importante es el pH. En el rango de 3.00 a 4.00, mientras más elevado sea el pH, más próspero es el

medio para el crecimiento bacteriano. Debajo del pH 3.00, en vinos muy ácidos, la FML es

particularmente difícil y, a la inversa, si el pH es mayor la FML es más fácil. Pero asimismo, esto

significa que a mayor pH, mayor es la variedad de bacterias capaces de multiplicarse. La sección

exclusiva de las especies Oenococcus oeni se limita a las condiciones de pH.

Se considera que las especies Oenococcus oeni son favorables para la calidad de los vinos. En todo

caso, es la especie predominante durante el FML porque, probablemente, es la mejor adaptada al

vino, luego de la fermentación alcohólica.

Pero en una FML espontánea son varias las especies que intervienen en forma simultánea.

En vinos de pH elevado, aunque O. oeni es la especie predominante durante la FML, no es la única.

Todas las otras especies también transforman el ácido málico en láctico. En estos vinos, donde la

selección es menos eficaz, los pH se acercan a menudo a 4.00 al final de la FML permitiendo el

desarrollo de lactobacilos o pediococos, cuyos efectos a veces son nocivos.

¿Cómo dominar a las bacterias lácticas?

Para prevenir la FML: el método más usual es el sulfitado del vino luego de la fermentación

alcohólica. El SO

libre es muy eficaz contra las bacterias lácticas, tanto más cuando el pH es bajo.

De hecho, es el SO

molecular (o SO

« activo ») quien ejerce el efecto tóxico. En vinos blancos, que

no deberían sufrir una FML, o en casos particulares de vinos tintos, son sulfitados al final de la

fermentación alcohólica en dosis para su conservación definitiva, con 20 a 30 mg/L de SO

libre.

Para retardar la FML: la velocidad de crecimiento bacteriano no es fácil de reducir si la FML ya ha

comenzado

.

En la práctica, después de la fermentación alcohólica, si el vino es mantenido o llevado a

una temperatura de 18-20°C, hay pequeñas variaciones en los inicios de la FML. Por lo tanto, las

bajas temperaturas pueden retardar el fenómeno momentáneamente previniendo la multiplicación de

bacterias. Un calentando posterior permite recuperar las condiciones óptimas para la FML. Otra forma

de lograr un retraso de la FML puede ser la destrucción de una parte de la flora bacteriana. Esto

puede lograrse por el agregado de lisozima que, por hidrólisis de la pared celular de las bacterias,

lleva a la muerte de la célula. Dosis de 10 a 25 g/hls, después de que ha comenzado fermentación

alcohólica, permite retardar (o prevenir) la FML. Su eficacia, sin embargo, es menor para los vinos

tintos por causa de la reacción de los polifenoles con la enzima. La acción de la lisozima

probablemente disminuye con el tiempo por desnaturalización de la proteína. Las lisozimas también

pueden ser útiles en el encuvado al evitar la picadura láctica, resultado de la fermentación alcohólica

y FML simultánemente.

Para activar la FML : la FML no comienza espontáneamente si las bacterias indígenas no alcanzan

una población de 10

UFC/ml. Esto significa que la importancia de los cuatro parámetros principales,

temperatura, etanol, pH y SO

, es incompatible con el crecimiento. Esto es suficiente la mayoría de

las veces para intervenir actuar sobre ellos con el objeto de invertir la situación. Si el vino no recibe un

sulfitado después de la fermentación alcohólica, y como uno no puede actuar sobre el grado

alcohólico, por consiguiente, los únicos factores que pueden manejarse siguen siendo la temperatura

y el pH.

La primera precaución a tomar es evitar un descenso excesivo de la temperatura del vino después de

la fermentación alcohólica. El vino debe calentarse hasta 18-20°C si el ácido málico no comienza a

ser degradado. En casos de vinos ácidos, la desacidificación química con carbonato de calcio de un

volumen pequeño del tanque permite conseguir un pie de cuba. Una vez que la FML se activó en esta

porción es reincorporada en el tanque. Esto también es beneficioso en ciertos casos como en los

vinos de prensa donde la FML, generalmente, suelta muy fácilmente. Pero la incorporación del vino

de prensa al vino de gota necesariamente no es una buena solución en este estadio del desarrollo del

vino.

¿Qué es un fermento maloláctico?

La mejor solución, cuando la FML no comienza a pesar de una temperatura apropiada y la ausencia

de SO

libre, es, hasta el momento, el agregado de fermentos malolácticos. Se trata así de

compensar la deficiencia de la población indígena. El agregado macivo de bacterias permite superar

una fase de crecimiento problemática. A menudo estas preparaciones se usan cuando el fenómeno

de la FML no comienza espontáneamente en varias semanas o meses después de la fermentación

alcohólica. Un hecho, sin explicación, es que un retraso en el agregado de los fermentos lácticos

después de la fermentación alcohólica aumenta aún más su eficacia en las disminuciones.

Los fermentos malolácticos son preparaciones concentradas y liofilizadas de cultivos de Oenococcus

oeni. Se comercializan varios tipos de preparaciones para el inoculado o sembrado de vinos ya sean

directamente o después de la reactivación. El primer criterio para su selección es su capacidad de

sobrevivir después de la inoculación en el vino. El protocolo de utilización puede variar según las

preparaciones comerciales. En todos los casos la inoculación tiene como meta alcanzar una

población de 10

UFC/mL para degradar el ácido málico, sin esperar que la microflora indígena

aumente. Incluso, hasta en las mejores preparaciones, las bacterias no son capaces de multiplicarse

en vinos difíciles. En este caso la biomasa agregada, tanto como la que guarda viabilidad, degrada el

ácido málico activamente. Aunque el aumento de la población sea débil o nulo, no impide la FML.

Pero los vinos de tanques donde la FML fue iniciada de esta manera no deben ser considerados a

partir de los fermentos eficaces para otros vinos difíciles. Contrariamente a los fermentos de levadura

de LSA (levadura seca activa) que pueden multiplicarse en tanques de fermentación, los fermentos

malolácticos no son muy posibles de esparcir en todas los tanques de un sótano.

Los fracasos de los años 1975 - 1980 muestran que es mucho más difícil de preparar un fermento

maloláctico eficaz que un fermento « LSA ». De hecho, las levaduras están muy bien adaptadas al

crecimiento en la uva molida, mientras que las bacterias deben encontrar su adaptación al vino, la

cual perdió durante su aislamiento y multiplicación. De este hecho se justifica que no existan más que

un número muy pequeño de fermentos malolácticos comerciales.

Las incidencias organolépticas de las diferentes cepas son probables, pero ningún resultado fiable y

aplicable permite escoger un fermento actualmente para una contribución aromática dada. El

desarrollo de fermentos malolácticos debe someterse a un mejor estudio de medios puesto

espontáneamente en obra por la bacteria para adaptarse al ambiente. Luego, sería importante valorar

objetivamente los cambios aromáticos y gustativos según las cepas bacterianas utilizadas y

variedades de vid.

¿En qué momento debe agregarse un fermento maloláctico?

El agregado de fermentos aporta una población de O. oeni del orden de 5*10

a 10

UFC/mL, este es

un número de bacterias suficiente para degradar el ácido málico si las células permanecen viables. La

reacción maloláctica es independiente del crecimiento. Una célula bacteriana de O. oeni, aunque

esté en un medio que prohíba su crecimiento, continúa la transformación del ácido málico. Al pH del

vino, el ácido pasa al interior de célula, donde la enzima asegura la reacción maloláctica. Las únicas

condiciones para la actividad es que la célula conserve su sistema de membranas intacto, aislar el

sistema enzimático del ambiente, mantener el pH cercano al óptimo y asegurar la presencia de

coenzimas indispensables. La integridad de la membrana está estrictamente correlacionada a la

viabilidad celular, esto habla del costo de que una sola célula viable esté activa. Por consiguiente, un

fermento maloláctico es eficaz si las células conservan su viabilidad. La concentración de inóculo

suficiente para asegurar la FML es la misma que si la levadura no se multiplica más pero sobrevive.

Sembrado en vino, O. oeni metaboliza un número importante de substratos; el ácido málico no es solo

el único. Esta transformación que genera la energía « transmembrana » participa de la vida de la

célula. Esto es fácil si el substrato es abundante. El ácido cítrico también es una fuente de energía.

Pero entre todos los substratos, los azúcares no transformados por las levaduras son los más

energéticos. Se trata de glucosa, fructosa y pentosas presentes en cientos de mg/L, hasta más de

1g/L en un vino « seco ». La ruta metabólica utilizada por O. oeni (y de otras bacterias del vino) es la

fermentación heteroláctica cuyo efecto principal es la producción de ácido acético. Por esta razón es

importante no agregar los fermentos malolácticos después de que la fermentación alcohólica ha

terminado.

El uso de fermentos consiste en agregar bacterias, en grandes cantidades, bacterias cuya primer

actividad es la de metabolizar todos los substratos de los que pueden tomar la energía necesaria.

Antes de que la fermentación alcohólica termine, los azúcares serán fermentados y el ácido málico

descarboxilado. Si el número de generaciones que desarrollan se limitara, la cantidad de azucares

fermentados también lo sería. Uno puede observar entonces que todo el ácido málico se degrada sin

un aumento excesivo del ácido acético. Pero esta situación no es completamente controlable. El

equilibrio más conveniente de obtener depende de un número importante de factores en los que el

enólogo no tiene ninguna toma de decisión. Los inconvenientes se presentan porque la población

bacteriana alcanza una concentración muy elevada (> 10

_{UFC/mL). El ácido málico se degrada pero}

los daño y perjuicios son importantes: detenimiento de la fermentación alcohólica por eliminación de

la población de levadura en fase de declive, y el aumento de acidez volátil. Uno puede esperar esto

en los vinos de pH favorable donde el inóculo se multiplica a partir de los azúcares, pero también

puede ser el caso de vinos más ácidos. De hecho, la fermentación maloláctica no sólo se liga al pH

sino que integra otros factores cuyos límites son interdependientes y que no son posibles de

modificar.

Muchas pruebas describen el éxito del agregado de fermentos en los diferentes estadios de la

fermentación alcohólica. Ellas demuestran la competencia de levaduras y bacterias por los azúcares y

la viabilidad que podría ser compatible con la calidad del vino. Pero el equilibrio es demasiado frágil,

incluso para el par levaduras/bacterias descrito cómo óptimo, y completamente imprevisible, porque

todos los datos del sistema en interacción no pueden ser conocidos para cada vino. La ausencia de

inconvenientes en los casos experimentales descritos permite realmente no aconsejar esta práctica;

el costo de los riesgos no lo justifican. Por último, se debe señalar que existen pocas pruebas sobre

usos de fermentos al inicio de la vinificación, serán combinaciones de la verificación de la identidad de

las cepas bacterianas responsables de las FML , es decir del agregado o implantado del fermento.

¿En conclusión?

Los fermentos malolácticos disponibles son muy eficaces. La industria ha adquirido conocimientos,

desde luego empíricos, pero reales para la preparación de estas biomasas. No hay razón para

arriesgarse a una picadura láctica mientras se inoculen los vinos precozmente. Por otra parte, jamás

ha sido correctamente demostrado que un vino verdaderamente "resistente” a la FML es más fácil de

vinificar por el agregado de fermentos durante la fermentación alcohólica.

Verificación de implantación de un fermento maloláctico

A : fermento

B et C : fermento bien implantado