Com afecta la llargada telomèrica
en el desenvolupament
de la Drosophila Melanogaster
Institut de
Biologia
Evolutiva
Clara Martínez
Estades Centre
de Recerca 2014
Introducció
Durant aquestes estades a l’Institut de Biologia Evolutiva he pogut viure la ciència de primera mà, treballant colze a colze amb els investigadors en la seva tasca diària. He gaudit d’una oportunitat única, gràcies a la qual he adquirit nous coneixements de la Drosophila Melanogaster i de tècniques de laboratori. Entre altres, he vist com creixien les mosques que jo cuidava, he assistit al naixement en directe de dues mosques, he après a fer disseccions de cervells de larves de mosca, he extret DNA genòmic, he treballat amb màquines que mai no hagués imaginat (Nanodrop, microscopi de fluorescència, etc), i he après que les mosques que tenen poques hores de vida no són mosques mutants!
Tot i el caire científic d’aquesta estada, fer experiments i investigar no ha estat tot durant aquests dies: he pogut conèixer altres investigadors de l’equip de l’Elena (la científica a càrrec) que m’explicaven coses interessants dels seus projectes. He vist que, a més de bons científics, també són molt bona gent i, davant de qualsevol dubte, sempre estaven disposats a ajudar. La tasca que he realitzat aquestes tres setmanes principalment és una col·laboració en una investigació científica que intenta estudiar l’impacte de la llargada telomèrica en el desenvolupament de diferents tipus de Drosophila Melanogaster. El fet de ser un projecte destinat a publicar-se en revistes de literatura científica, m’ha implicat estar molt concentrada en tots els procediments que feia, perquè els resultats eren decisius en la investigació. Segons el meu punt de vista, viure una experiència d’aquestes característiques ha estat una lliçó que no s’estudia: s’ha de superar la por a equivocar-se, s’ha de treballar metòdicament, entendre tot el que es fa i el perquè es fa.
Fitxa tècnica
Centre:
Institut de Biologia Evolutiva (UPF-CSIC)Adreça:
Passeig Marítim de la Barceloneta 37-49, 08003 BarcelonaLínies d’investigació:
Drosophila, telòmers i desenvolupamentÀrea o Departament:
Biologia evolutivaCientífic al càrrec:
Dra. Elena CasacubertaProjecte:
Com afecta la llargada telomèrica en el desenvolupament de la Drosophila MelanogasterPeríode de realització de l’estada:
3 setmanesObjectius del projecte
Aquest projecte té un objectiu principal molt concret, que és observar com afecta la llargada telomèrica dels cromosomes en el desenvolupament de diferents tipus de mosca Drosophila Melanogaster.
Per tal d’assolir aquest objectiu principal, ha calgut que primer assolíssim alguns objectius més específics:
• Comptar el nombre de mosques en cada fase de desenvolupament (larva, pupa i mosca) per observar si hi ha un retard en alguna soca.
• Fer disseccions dels cervells de les larves L2 o L3 per observar si hi ha fusions telomèriques en els neuroblasts.
• Extreure el DNA genòmic dels diferents tipus de Drosophila Melanogaster per fer una PCR Real Time.
Activitats desenvolupades
Manteniment
El manteniment de les mosques va ser un procediment que varem haver d’aprendre des del primer dia. Generalment, les mosques de laboratori viuen en uns tubs alts i estrets que a la part inferior tenen una “papilla” la base de la qual és suc de taronja. A la part superior, aquests tubs es tapen amb una mica de cotó.
Cada setmana i mitja o dues, agafàvem tots els tubs i els organitzàvem per soques (tipus de mosca). Llavors, per cada soca, preparàvem quatre tubs en bones condicions: la “papilla” neta, sense mosques mortes dins, etc. Alguns tubs els podíem aprofitar tal i com estaven perquè tenien larves i així en uns dies naixerien mosques joves. En la resta de casos, el que fèiem era passar les mosques dels tubs usats a tubs nous, aprofitant aquest procediment per regular la quantitat de mosques en cada tub (que no n’hi hagués massa ni massa poques).
Al principi varem aprendre a fer aquest procediment adormint les mosques amb CO2, tot i que també es pot fer amb les mosques despertes. Una avantatge de saber mantenir les mosques és que aprens com se les ha de tractar en cada ocasió i ets capaç d’extrapolar les tècniques per preparar els diferents experiments.
Delay
Delay és una paraula anglesa que significa “retard”. La finalitat d’aquesta activitat era saber si la llargada telomèrica de cada soca afecta al temps que tarda l’ou a ser mosca, provocant un retard en el desenvolupament.
Per dur a terme aquesta activitat, varem posar el mateix nombre de mosques, de cada soca, en uns tubs més amples anomenats “campanes”. En total teníem sis campanes, ja que teníem sis soques: G3, Oregon, White, 28171, 28255 i 25209.
A la part inferior de cada campana varem posar una placa de petri amb “papilla” i una mica de llevat. Varem posar totes les plaques el mateix dia i a la mateixa hora. Llavors les mosques van començar a pondre-hi ous. Al cap de quatre hores varem treure totes les plaques de petri, que estaven plenes d’ous i de larves en fase L1. Tot seguit varem aprendre a agafar larves i varem posar 30 larves de cada placa de petri en tubs nous. L’únic pas que faltava ara era comptar, cada dues o tres hores, el nombre de larves, pupes i mosques que hi havia en cada tub. Com totes les larves havien nascut el mateix dia en un rang de quatre hores, podíem observar clarament si alguna soca trigava més en passar d’una fase a una altra (larva – pupa – mosca).
Cromosomes dels neuroblasts
Quan es dóna el cas que els telòmers són massa llargs o massa curts, de vegades es produeixen fusions telomèriques i, per tant, dos o més cromosomes queden units pels seus telòmers. Ens interessava observar aquestes fusions al microscopi de fluorescència, i per això, havíem d’observar els cromosomes de cada soca.
El procediment consistia en agafar larves en fase L3 i, després de fer una dissecció amb cura, separar el cervell de la larva i llençar-ne la resta. Després de seguir un protocol concret, obteníem unes preparacions amb neuroblasts, que són les cèl·lules dels cervells de larva. Un cop al microscopi de fluorescència, es podien observar perfectament els nuclis dels neuroblasts. La part de dins de cada nucli era com un núvol difuminat ja que el DNA estava en forma de cromatina. Alguns nuclis, però, estaven en un punt del cicle cel·lular en que el DNA està condensat en forma de cromosomes: aquests eren els nuclis que ens interessava observar. Aquest, doncs, és el motiu pel qual buscàvem neuroblasts que estiguessin en metafase o anafase.
La raó per la qual fèiem aquest procediment amb cervells de larva en fase L3 és perquè la larva és una fase de desenvolupament molt activa a nivell cel·lular i el cervell és una de les parts de la larva en que les cèl·lules es divideixen més. Per tant la raó és clara, els neuroblasts de les larves L3 són les cèl·lules en les quals teníem més probabilitats de trobar nuclis en metafase o anafase.
PCR Quantitativa
Per tal de poder treure conclusions clares de les proves del delay i de l’observació de neuroblasts ens calia comprovar quines soques tenien els telòmers molt llargs i quines els tenien molt curts. Per tal de fer-ho, varem preparar una PCR Quantitativa (qPCR), també anomenada, PCR Real Time. Aquest procediment és com una PCR habitual, però afegint unes substàncies amb fluoròfors; per aquest motiu, la màquina de qPCR té uns sensors que detecten la fluorescència.
Per fer les preparacions per la qPCR, varem seleccionar 20 mosques de cada soca. Generalment escollíem 10 mascles i 10 femelles. Després de congelar-les a -20ºC, varem iniciar un protocol per aconseguir extreure el DNA genòmic de la mosca. Amb aquest procediment varem obtenir els tubs sense cap altra estructura o molècula que no fos el DNA. Tot seguit varem fer una electroforesi i unes proves al Nanodrop per comprovar la concentració de DNA per µl de cada mostra. En un primer moment, totes les mostres de DNA tenien una concentració molt alta però, després d’unes quantes dilucions, ja varem obtenir la concentració desitjada i adequada per fer la qPCR.
Els resultats d’aquesta prova consistien ens unes taules on s’indicava el primer i l’últim cicle en el qual es va detectar fluorescència en cada mostra; aquests nombres coincidien amb els cicles en els quals el DNA s’amplificava exponencialment (en els primers cicles hi ha massa poc DNA i en fa falta una mica més per ser un augment exponencial; en els últims cicles hi ha massa DNA i l’amplificació no es fa exponencialment; per tant, als resultats mai no surten tots els cicles sinó uns de concrets). Si comparàvem els resultats de les soques control (de les quals en coneixíem la llargada telomèrica) amb les altres soques, podíem saber quines soques tenien els telòmers molt llargs, i quines els tenien molt curts. Això es pot deduir perquè cada llargada telomèrica sol donar com a resultat un rang de cicles diferents.
A més de la importància en sí de realitzar aquest experiment, la qPCR també ha tingut molta importància a nivell personal ja que és una manera molt bona per aprendre a llegir dades, nombres o resultats i interpretar-ne el seu significat. No és tan sols veure uns números, sinó saber què vol dir cada número.
Valoració
L’experiència d’aquest estiu, ha estat una de les més emocionants i interessants relacionada amb la ciència que he viscut mai. Cal dir que l’experiència ha estat tan positiva en gran part gràcies a l’Elena, la científica a càrrec. Ella ens explicava com es feien els procediments, però ens els deixava fer a nosaltres en comptes de fer-los ella i nosaltres només mirar. Ens deixava treballar tranquil·les i concentrades, sense estar permanentment al costat mirant. Lògicament, ens equivocàvem, perquè ningú no neix ensenyat; però llavors, l’Elena ens feia entendre què havíem fet malament i com ho podíem arreglar. Com diu la dita, en varem aprendre molt dels nostres errors!
També m’agradaria destacar el paper que han tingut totes les persones que treballen amb l’Elena. Tothom ens va acollir molt bé! Cal dir que un ambient de treball agradable, on predomina la companyonia i l’ajuda mútua, s’agraeix molt! Per exemple, hi havia moments en que ens entraven dubtes i no sabíem què havíem de fer ni com havíem de continuar. Si en aquell moment l’Elena havia anat a buscar alguna cosa i no la trobàvem, o si estava en una reunió, doncs aquestes persones ens ajudaven i ens resolien els dubtes que teníem. Crec que gràcies a ells varem salvar més d’una mostra d’acabar degradada!
No sé si em deixo alguna cosa! Per acabar, només m’agradaria dir que espero que puguem fer més estades allà, perquè van ser tres setmanes, però tres setmanes que se’m van passar massa de pressa. Com crec que el que pertoca no és repetir-ho sinó deixar pas a la següent generació de Joves, doncs espero que ells també tinguin la mateixa oportunitat que hem tingut la Carme Crous i jo, perquè, des de la meva opinió personal, jo ho recomano! Val molt la pena!
