B4218 G1 E0533 (0450) H/W 1 Edition March 1999
Dade
®
Actin
®
Activated Cephaloplastin Reagent
Intended Use
Liquid rabbit brain cephalin with plasma activator for use in the determination of the activated partial throm-boplastin time and other coagulation procedures requiring an activated partial thromthrom-boplastin reagent
Summary and Principle
The activated partial thromboplastin time (APTT), a global screening procedure1 used primarily to evaluate
coagulation abnormalities in the intrinsic pathway, will also detect severe functional deficiencies in factors II, V, X, or fibrinogen. The APTT has also been widely advocated1-4 as a means to monitor the effectiveness
of heparin therapy where the clotting time is prolonged in proportion to the level of heparin. In patients receiving oral anticoagulants, the circulating levels of factors II, VII, IX, and X are depressed, therefore the APTT can be expected to be prolonged. The presence of non-specific inhibitors, such as the lupus-like anticoagulant,5 may prolong the APTT but this effect is variable and generally recognized as being related
more to the nature of the APTT reagent employed. In summary, the APTT is a clinically important scree-ning test with wide applicability for the diagnosis of coagulant disorders and therapeutic monitoring of both hemorrhagic and thrombotic disease.
Reagent
For in vitro diagnostic use
Actin® Activated Cephaloplastin Reagent: cephalin (extracted from dehydrated rabbit brain) in 1.0 x 10-4 M
ellagic acid with added buffer, stabilizers and preservative. No standard potency has been established and accepted for rabbit brain cephalin. Store capped at 2-8°C when not in use. Stability after opening is 7 days at 2-15°C. Do not freeze. A green ellagic acid/lipid sediment may form upon standing. Mix by inversion imme-diately before use. Care should be exercised during multiple pipetting to avoid contamination with plasma. Indication of deterioration: normal plasma or control will show deviations in results from the established laboratory range.
Specimen Collection and Preparation
Mix nine parts of freshly collected patient blood with one part of 0.11 or 0.13 mol/L (3.2 or 3.8%) sodium citrate. Evacuated tubes containing the desired anticoagulant are commercially available and may be used with caution in blood coagulation studies. For special studies, syringe technique may be preferred. Centrifuge the blood specimen for a minimum of 10 minutes at 1000 rcf as soon as possible after collec-tion. For alternative blood collection procedure see the NCCLS document H21-A2.9 If immediate testing is
to be done, the plasma may remain on the packed cells or separated. To separate the plasma, use a plastic transfer pipet, remove plasma to a plastic tube and keep refrigerated until ready to test. Do not store on ice. Patient plasma should be tested within two hours of blood collection. Samples should not stand at 37°C for more than five minutes.
Reagent Provided
Actin® Activated Cephaloplastin Reagent
Materials Required but Not Provided
1. Dade® Calcium Chloride, 0.02M or Behring Calcium Chloride, 0.025 M*.
2. Control material: Ci-Trol® Coagulation Control, Levels 1, 2 and 3,
Ci-Trol® Heparin Controls, Low and High.
3. 0.11 or 0.13 mol/L (3.2 or 3.8%) sodium citrate for blood collection or commercially available evacua-ted tubes.
4. Preservative-free distilled or deionized water. 5. Plastic tubes.
6. Pipetting devices capable of accurately measuring 1.0 and 0.1 mL.
* Note: Use either concentration of CaCl2. Do not interchange concentrations once ranges are esta-blished.
Procedure For APTT
1. Semi- or fully automatic processing:
Full details can be found in the instrument instruction manual. Special assay protocols for running the test on Dade Behring coagulation analyzers are available on request.
2. Manual Procedures: Prewarm Calcium Chloride at 37°C
Prewarm 0.1 mL Actin® for one minute at 37°C. (Mix before use)
Pipet into coagulation tubes as follows
Test Sample Control plasma
Actin® (prewarmed) 0.1 mL 0.1 mL
Plasma 0.1 mL
-Control Plasma - 0.1 mL
Mix well. Incubate at 37°C for 3 minutes.
prewarmed 0.1 mL 0.1 mL
Calcium Chloride simultaneously with addition of CaCl2 start stopwatch, mix well. After 20 secs. start to observe for clot formation. Note: Incubation times exceeding 5 minutes may cause loss of factors V and VIII and are not recommended. Each laboratory should determine the optimal heating-activation time for its particular assay system.
Heparin Monitoring with APTT
When using the APTT for this purpose, the factors influencing the test should be kept in mind. General considerations are listed below.
(A) Time of collection is important since the in vivo half-life of heparin is approximately 1.5 hours.6 When it
is administered, it has an immediate anticoagulant effect but the degree of this effect decreases rapidly with time. This is especially apparent with intermittent single intravenous injections.
(B) The anticoagulant used for sample collection can alter test results.
(C) Platelet factor 4, a heparin neutralizing factor in platelet alpha-granules, can be released by platelet aggregation or damage. To prevent this occurrence in vitro, the specimen should be collected with a minimum of trauma. Cold temperatures are known to induce platelet aggregation and release PF-4; therefore, centrifugation at room temperature is recommended for heparin studies.
(D) Using APTT to monitor heparin is time-dependent. Delay in testing samples will result in prolonged APTT determinations. Therefore, it is imperative that the testing on all samples be performed as soon as possible. (E) Increased contact activation times may result in prolonged APTT in plasma containing heparin. It is imperative that the optimal heating-activation time of the cephaloplastin-plasma mixture be rigidly stan-dardized.18
(F) Different test systems (i.e. manual, photo-optical, etc.) will exhibit variable heparin sensitivity. Inter-changing of test systems should be avoided.
(G)Baseline data on the APTT of each patient before the start of therapy should be established where feasible to determine the respective patient APTT as it relates to the normal range established for the test in that laboratory.
(H) Studies7 have shown variability in original estimates of heparin quality from different sources and
diffe-rent manufacturers. In vivo reactivity varies with the type of heparin administered, the metabolism of the individual and other co-administrated medications.
Quality Control
Controls such as Ci-Trol® Coagulation Control (Levels 1, 2 and 3) and, when monitoring heparin, Ci-Trol®
Heparin Controls, Low and High, should be tested at the initiation of testing, upon reagent changes, and at least once each 8 hour shift. The control material should be run in the same manner as the test sample. Each laboratory should establish a range for control values. This range is usually based on ±2.0 to ±2.5 standard deviations (SD) from the mean control value. If control values are outside of determined range check controls, reagents and instrument. It is recommended before reporting any patient data to document any actions taken to identify and correct the problem. New control ranges should be established for each lot of reagent or control material.
Results
Results of the activated partial thromboplastin time testing should be reported as the APTT in seconds. These results should be related to the normal range for APTT testing in each laboratory. It is suggested that the patient results be reported to the clinician in conjunction with the normal range. Control values for the reagent test system should never be used in place of a normal range. Furthermore, the reporting of APTT results in terms of an upper normal only may result in incorrect interpretation. Shortened APTT results may also indicate some abnormal condition in the patient’s coagulation system.
Limitations of Procedure
APTT testing encompasses the entire clotting process from contact activation to fibrin formation and is therefore more susceptible to variations than specific individual tests. The control and use of APTT is therefore subject to inherent limitations. Control of plasma sample conditions is strictly emphasized. Stu-dies in Dade Behring laboratories have shown that sample decomposition may occur more rapidly in stored samples that are not refrigerated. Extremely small plasma volumes (prior to testing) are to be avoided since pH changes in the plasma from physiological conditions may be encountered. Such chan-ges may lead to the decomposition of plasma components of the blood coagulation system. It should be noted that APTT time testing may be affected by a number of commonly administered drugs. Decrease in time of APTT determination in conjugated estrogen therapy in males and oral contraceptive administration in females has been reported.10,11 Increase in the APTT has been seen in
diphenylhydan-toin, heparin, warfarin, naloxone and radiographic agent administration.12-14 In addition, the choice of
anti-coagulant15,16 (i.e., citrate vs. oxalate) and the condition of the specimen17 (hemolyzed, lipemic,
chromoge-nic, etc.) may affect results. The latter is particularly true of optical instrumentation measurements of the APTT.
Blood clotting factor deficiencies which should produce prolonged clotting times may be compensated for or made to appear normal by elevated levels of one or more different clotting factors. Similarly, the presence of active intermediates which would tend to reduce the clotting time may also mask conditions that would normally lead to prolongation of the APTT. Mild or minor deficiencies in several factors may have an additive effect on increasing the APTT. Unexpected abnormal APTT results should always be followed by additional coagulation studies to determine the source of abnormal results.
Action of heparin as an anticoagulant is related to its ability in conjunction with a plasma cofactor to interfere with several aspects of the coagulation mechanism, thus retarding the rate of fibrin formation. See section “Heparin Monitoring with APTT”.
Select one concentration of CaCl2 to establish reference interval of normal population and control ranges. Either concentration may be used, however, do not interchange concentration of CaCl2 once ranges are
established.
Expected Values
Values for healthy individuals vary from laboratory to laboratory depending on the technique used. Each laboratory must determine its own expected values based on the technique and instrumentation in use in that laboratory.
To illustrate this procedure, typical mean and standard deviation values are shown in Table 1 as esta-blished on a group of apparently healthy individuals at Dade Behring and at a major clinical institution using citrated plasmas. (Women on oral contraceptives included)
Table 1
Mean (secs.) Range for
±
2 SDManual Tilt Tube 30.1 25.5 - 34.7
Fibrometer* 27.0 23.4 - 30.6 Coagulyzer** 22.7 19.1 - 26.3 Electra 600*** 23.0 19.2 - 26.8 Electra 700 ◊ 25.4 22.6 - 28.2 Coag-A-Mate◊**** 28.9 23.5 - 34.3 Dual Channel
◊ Samples were collected in evacuated tubes
Actin® Activated Cephaloplastin Reagent may also be used with other automated and semi-automated
coagulation instruments; however, normal ranges have not been established with these instruments. Normal ranges for other populations such as pediatric groups should also be established where warran-ted. The normal range is usually set at ±2 or ±3 SD from the mean value obtained with APTT tests on normal individuals under laboratory conditions.8
Ranges should be established in the user’s laboratory. It should be kept in mind that no two analysts perform in exactly the same manner. Variations in technique and instrumentation may give somewhat different results. The range, SD and related statistical calculations may be found in most commonly used statistical analysis books.
Specific Performance Characteristics
Actin® Activated Cephaloplastin Reagent has been carefully prepared to perform according to the results
and within the limits described when used in the determination of activated partial thromboplastin time and in other coagulation procedures requiring an activated partial thromboplastin reagent.
Precision studies using the methodologies listed in this insert show that properly performed APTT tests should result in a standard deviation (SD) which corresponds to a coefficient of variation (CV) of less than 5% in the normal range. Additional studies demonstrating reproducibility between duplicate determinati-ons on the same sample indicate that the APTT should agree within 4% in the normal range when perfor-med properly.
Bibliography
General
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Drug Interference and Influencing Factors on the APTT
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This product is warranted to perform as described in the labeling and in the product literature, and Dade Behring disclaims any implied warranty of merchantability or fitness for any other purpose, and in no event shall Dade Behring be liable for any consequential damages arising out of the aforesaid express warranty.
* Becton, Dickinson and Co., Rutherford, NJ 07070 ** Sherwood Medical Industries, St. Louis, MO 63103 *** Medical Laboratory Automation, Pleasantville, NY 10570 **** Organon Teknika Corporation, Durham, NC 27704
Manufacturer: Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg/Germany USA Distributor: Dade Behring Inc.
B4218 G1 E0533 (0450) H/W 2 Ausgabe März 1999
Dade
®
Actin
®
Aktiviertes
Cephaloplastinreagenz
Anwendungsgebiet
Kaninchenhirncephalin-Suspension mit Plasmaaktivator zur Bestimmung der aktivierten partiellen Throm-boplastinzeit (aPTT) und für darauf basierende Gerinnungstests.
Zusammenfassung und Grundlagen
Die Bestimmung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) ist ein globaler Screening-Test1, der
primär zur Beurteilung des endogenen Gerinnungssystems eingesetzt wird, der jedoch ebenso einen schweren funktionellen Mangel an Faktor II, V, X oder Fibrinogen anzeigt. Die Bestimmung der aPTT ist darüber hinaus ein allgemein anerkannter Test1-4 zur Überwachung der Heparintherapie, wobei die
Ver-längerung der Gerinnungszeit proportional zum Heparinspiegel ist. Bei Patienten unter oraler Antikoagula-tion ist ebenfalls eine verlängerte aPTT zu erwarten, da bei diesen Patienten die zirkulierenden Faktoren II, VII, IX und X erniedrigt sind. Das Vorhandensein unspezifischer Hemmstoffe, wie Lupus-antikoagulans-ähnlicher Substanzen5, kann zwar eine Verlängerung der aPTT bewirken, allerdings ist dieser Effekt
varia-bel und wird in der Regel eher der Zusammensetzung des verwendeten aPTT-Reagenzes zugeschrieben. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die aPTT-Bestimmung ein klinisch wertvoller Scree-ning-Test mit breiten Anwendungsmöglichkeiten bei der Diagnose von Gerinnungsstörungen und bei der Therapieüberwachung von Patienten mit Blutungs- oder Thromboseneigung ist.
Reagenz
In-vitro-Diagnostikum
Actin®Aktiviertes Cephaloplastinreagenz: Cephalin (Extrakt aus dehydriertem Kaninchenhirn) in 1,0 x 10-4 M Ellagsäure, gepuffert, stabilisiert und konserviert . Standardwerte für die Aktivität von
Kaninchen-hirncephalin stehen nicht zur Verfügung. Nach Gebrauch verschlossen bei +2 bis +8 °C lagern. Haltbarkeit nach öffnen: 7 Tage bei 2-15°C. Nicht einfrieren. Wird das Reagenz stehen gelassen, kann es zur Bildung eines grünen Niederschlags aus Ellagsäure und Lipiden kommen. Vor der Anwendung durch Umdrehen mischen. Kontamination mit Plasma vermeiden.
Hinweis auf Verfall: Abweichungen vom Labornormalwert bei der Bestimmung von Normalplasma oder Kontrollen.
Probenabnahme und -vorbereitung
Neun Teile frisch abgenommenes Patientenblut mit einem Teil Natriumcitrat (0,11 oder 0,13 M bzw. 3,2 oder 3,8 %ig) mischen. Handelsübliche Blutentnahmesysteme für Gerinnungstests mit dem gewünschten Antikoagulans können verwendet werden. Für spezielle Studienreihen kann die Abnahme in der Spritzen-technik vorteilhaft sein.
Die Blutprobe möglichst rasch nach der Abnahme mindestens 10 Minuten bei RZB 1000 zentrifugieren. Alternativ kann die Blutabnahme nach dem NCCLS-Dokument H21-A2 durchgeführt werden.9 Erfolgt die
Analyse sofort, kann das Plasma auf dem Erythrozytensediment verbleiben oder separiert werden. Zum Separieren das Plasma mit einer Kunststoffpipette in ein Kunststoffröhrchen geben und bis zur Durchfüh-rung des Tests im Kühlschrank aufbewahren. Nicht auf Eis lagern. Das Patientenplasma sollte innerhalb von 2 Stunden nach der Blutabnahme verarbeitet werden. Bei 37 °C dürfen die Proben nicht länger als 5 Minuten stehen bleiben.
Gelieferte Reagenzien
Actin® Aktiviertes Cephaloplastinreagenz
Erforderliche, jedoch nicht mitgelieferte Materialien
1. Dade® Calciumchlorid, 0,02M oder Calciumchlorid-Lösung 0,025 mol/l (Behring)*.
2. Kontrollen: Ci-Trol® Gerinnungskontrollen, Bereich 1, 2 und 3; Ci-Trol® Heparinkontrolle,
Konzentrati-onsbereich niedrig und hoch.
3. Zur Blutabnahme Natriumcitrat (0,11 oder 0,13 M bzw. 3,2 oder 3,8 %ig) oder handelsübliche Blutent-nahmesysteme verwenden.
4. Destilliertes oder entionisiertes Wasser ohne Konservierungsstoffe. 5. Kunststoffröhrchen.
6. Pipetten für das genaue Abmessen von 0,1 ml.
* Hinweis: Nur eine von beiden Calciumchlorid-Konzentrationen verwenden. Nach der Erstellung der Referenzbereiche darf die Konzentration nicht mehr gewechselt werden.
Testvorgang
1. Halb- oder vollautomatische Verfahren:
Ausführliche Hinweise sind in der Bedienungsanleitung zum Gerät enthalten.
Spezielle Vorschriften für die Abarbeitung an Gerinnungsanalzyern von Dade Behring sind auf Anfrage erhältlich.
2. Manuelles Verfahren: Calciumchlorid auf 37 °C vorwärmen
0,1 ml Actin® pro Teströhrchen auf 37 °C vorwärmen (vor Gebrauch mischen)
In Kunststoffröhrchen wie folgt pipettieren:
Zu untersuchende Probe Kontrollplasma
Actin®(vorgewärmt) 0,1 ml 0,1 ml
Plasma 0,1 ml
-Kontrollplasma - 0,1 ml
Gut mischen und 180 Sekunden bei 37°C inkubieren.
vorgewärmtes 0,1 ml 0,1 ml
Calciumchlorid Bei Zugabe des CaCl2 die Stoppuhr starten, gut mischen.
Nach 20 Sekunden erstmals die Gerinnung überprüfen. Hinweis: Eine Inkubationszeit von über 5 Minuten ist nicht zu empfehlen, da es sonst zu einem Faktor-V-und Faktor-VIII-Verlust kommen kann.
Die optimale Vorwärmzeit für die Aktivierung sollte von jedem Labor in Abhängigkeit vom verwendeten Testsystem festgelegt werden.
Heparinüberwachung mittels aPTT-Bestimmung
Bei der Überwachung der Heparintherapie mittels aPTT-Bestimmung sind die Faktoren zu berücksichti-gen, die Einfluß auf das Testergebnis haben können. Im folgenden sind einige allgemeine Hinweise zu-sammengefaßt:
A) Da die Halbwertszeit von Heparin in vivo ca. 1,5 Stunden beträgt, ist der Zeitpunkt der Blutentnahme von entscheidender Bedeutung.6 Verabreichtes Heparin besitzt eine sofort einsetzende
gerinnungs-hemmende Wirkung, die rasch wieder abnimmt. Dieser Effekt ist besonders deutlich bei intermittierend verabreichten Einzelinjektionen i.v. zu beobachten.
B) Das zur Blutabnahme verwendete Antikoagulans kann die Testergebnisse beeinflussen. C) Durch Aggregation bzw. Beschädigung der Plättchen kann der Heparin- neutralisierende
Plättchenfak-tor 4 aus den Alpha-Granula der Plättchen freigesetzt werden. Um derartige Prozesse in vitro zu vermeiden, sollten die Proben möglichst vorsichtig abgenommen werden. Da niedrige Temperatur bekanntlich die Plättchenaggregation und damit die Freisetzung von Plättchenfaktor 4 auslöst, sollten Proben für Heparintests bei Raumtemperatur zentrifugiert werden.
D) Die Heparinüberwachung mittels aPTT-Bestimmung ist zeitabhängig. Verzögerungen bei der Proben-bearbeitung können eine Verlängerung der aPTT bewirken. Die Proben müssen daher so bald wie möglich untersucht werden.
E) Eine verlängerte Kontaktaktivierung kann bei heparinhaltigem Plasma zur Verlängerung der aPTT führen. Die optimale Inkubationszeit des Cephaloplastin-Plasma-Gemischs ist daher einzuhalten.18
F) Da verschiedene Testmethoden (z.B. manuell, photo-optisch) eine unterschiedliche Heparinempfind-lichkeit besitzen, sollte ein Wechsel der angewendeten Methode vermieden werden.
G) Zur Ermittlung der patientenspezifischen aPTT sollte der aPTT-Basiswert des Patienten möglichst vor Therapiebeginn bestimmt werden und mit dem laboreigenen Normalbereich verglichen werden. H) Untersuchungen7 ergaben, daß die Eigenschaften von Heparinen verschiedener Hersteller bzw. aus
unterschiedlichem Ausgangsmaterial von den ursprünglich angenommenen Spezifikationen abwi-chen. In vivo hängt die Reaktivität vom Typ des verabreichten Heparins, vom Stoffwechsel des Patien-ten und von anderen, gleichzeitig angewendePatien-ten Arzneimitteln ab.
Qualitätskontrolle
Kontrollen, wie Ci-Trol® Gerinnungskontrolle (Bereich 1, 2 und 3) und bei der Heparinüberwachung
Ci-Trol® Heparinkontrolle, Konzentrationsbereich niedrig und hoch, sollten zu Beginn eines Testlaufs, bei
jedem Reagenzienwechsel und mindestens einmal während einer 8-Stunden-Schicht analysiert werden. Das Kontrollmaterial wie Patientenproben behandeln. Jedes Labor sollte seinen eigenen Vertrauensbe-reich für die Kontrollen ermitteln. Dieser beträgt in der Regel ± 2 bis ± 2,5 Standardabweichungen (s) vom mittleren Kontrollwert. Liegen die Kontrollwerte außerhalb des Vertrauensbereichs, sind die Kontrollen, Reagenzien und das Gerät zu überprüfen. Es wird empfohlen, vor der Ausgabe von Patientenwerten alle Maßnahmen zu dokumentieren, die zur Feststellung und Behebung des Problems ergriffen wurden. Bei jeder neuen Reagenzien- oder Kontrollencharge sollten neue Kontrollbereiche definiert werden.
Ergebnisse
Das Testergebnis sollte als aPTT in Sekunden ausgegeben werden und mit dem laboreigenen Normalbe-reich für aPTT-Bestimmungen verglichen werden. Es wird empfohlen, dem behandelnden Arzt die aPTT zusammen mit dem Normalbereich zu übermitteln. Für das Reagenzientestsystem ermittelte Kontrollwer-te dürfen nicht als Normalbereich für PatienKontrollwer-tenproben verwendet werden. Darüber hinaus sind FehlinKontrollwer-ter- Fehlinter-pretationen möglich, wenn lediglich erhöhte aPTT-Werte als auffällig ausgegeben werden, da auch eine zu kurze aPTT auf Anomalien im Gerinnungssystem hinweisen kann.
Grenzen des Verfahrens
Die Bestimmung der aPTT umfaßt den gesamten Gerinnungsprozeß von der Kontaktaktivierung bis hin zur Fibrinbildung und ist daher gegenüber modifizierten Arbeitstechniken empfindlicher als spezifische Einzeltests, weshalb die Kontrolle und Bestimmung der aPTT speziellen Einschränkungen unterliegt. Von besonderer Bedeutung sind die Lagerungsbedingungen der Plasmaproben. Untersuchungen in Dade Behring Labors ergaben, daß ungekühlte Proben einer rascheren Zersetzung unterliegen. Da es bei ex-trem geringen Plasmavolumina zu physiologisch-bedingten Veränderungen des pH-Werts und infolge dessen zur Zersetzung der Plasmabestandteile des Blutgerinnungssystems kommen kann, ist von einer Portionierung in sehr kleine Volumina vor der Testung abzuraten.
Zu beachten ist, daß das aPTT-Testergebnis durch eine Reihe häufig verordneter Medikamente beeinflußt werden kann. Laut Veröffentlichungen führen die Therapie mit konjugiertem Östrogen bei Männern und die Einnahme oraler Kontrazeptiva bei Frauen zu einer Verkürzung der aPTT .10,11 Eine Verlängerung der
aPTT wurde bei der Verabreichung von Diphenylhydantoin, Heparin, Warfarin, Naxolon und Röntgenkon-trastmitteln beobachtet.12-14 Die Ergebnisse können außerdem durch das gewählte Antikoagulans15,16 (z.B.
Oxalat anstelle von Citrat) beeinflußt werden sowie durch die Beschaffenheit der Probe17 (hämolytisch,
lipämisch, usw.), welche insbesondere bei der optischen Bestimmung der aPTT von Bedeutung ist. Ein Mangel an Blutgerinnungsfaktoren, der eine Verlängerung der Gerinnungszeit bewirken würde, kann durch einen erhöhten Spiegel eines oder mehrerer anderer Gerinnungsfaktoren teilweise oder sogar voll-ständig überlagert werden, sodaß u.U. normale Werte gemessen werden. Ebenso können durch das Vorliegen aktiver Intermediate, welche tendenziell die Gerinnungszeit verkürzen, Zustände überlagert werden, die sonst zu einer Verlängerung der aPTT führen würden. Ein leichter oder mäßiggradiger Man-gel verschiedener Faktoren kann additiv eine Verlängerung der aPTT bewirken. Bei fragwürdigen aPTT-Werten sollten diese stets durch weitere Gerinnungstests überprüft und die Ursache hierfür ermittelt wer-den.
Die Wirkung von Heparin als Antikoagulans hängt mit dessen Eigenschaft zusammen, in Verbindung mit Plasmakofaktoren auf verschiedene Teilbereiche des Gerinnungssystems einzuwirken, was letztlich zur einer verzögerten Fibrinbildung führt (siehe Abschnitt "Heparinüberwachung mittels aPTT-Bestimmung"). Für die Bestimmung des Referenzbereiches und der Sollwerte darf nur eine Calciumchlorid-Konzentration ausgewählt werden. Jede der beiden Konzentrationen kann verwendet werden. Nach Erstellung der Re-ferenzbereiche darf die Konzentration jedoch nicht mehr gewechselt werden.
Zu erwartende Werte
Die Werte gesunder Personen variieren von Labor zu Labor in Abhängigkeit von der angewendeten Me-thode. Daher sollte jedes Labor auf der Grundlage der jeweils angewendeten Methoden und Geräte eige-ne Normalbereiche ermitteln.
Um das Vorgehen zu verdeutlichen, werden in Tabelle 1 typische Mittelwerte und 2s-Bereiche aufgelistet. Diese wurden von Dade International und von einer größeren Klinik aus Citratplasmen offenbar gesunder Menschen ermittelt. (Frauen, die orale Kontrazeptiva einnehmen, wurden nicht ausgeschlossen).
Tabelle 1
Mittelwert (Sek.) Bereich
±
2 sManuelle Methode nach Lee-White 30,1 25,5 - 34,7
Fibrometer * 27,0 23,4 - 30,6 Coagulyzer ** 22,7 19,1 - 26,3 Electra 600 *** 23,0 19,2 - 26,8 Electra 700◊ 25,4 22,6 - 28,2 Coag-A-Mate◊**** 28,9 23,5 - 34,3 Zweikanal
◊ Die Proben wurden mit Blutentnahmesystemen gewonnen.
Actin® Aktiviertes Cephaloplastinreagenz ist auch für andere halb- oder vollautomatische
Gerinnungstest-systeme geeignet; allerdings wurden für diese Geräte noch keine Normalbereiche ermittelt. Für andere Patientengruppen, wie z.B. pädiatrische Patienten, sollten gegebenenfalls eigene Normalbe-reiche ermittelt werden. Als Normalbereich wird in der Regel eine Standardabweichung von ±2s oder ±3s von einem Mittelwert angesehen, der durch aPTT-Tests an gesunden Personen unter Laborbedingungen ermittelt wurde.8
Jedes Labor sollte eigene Normalbereiche ermitteln, wobei zu berücksichtigen ist, daß wechselnde Unter-sucher sowie unterschiedliche Methoden und Geräte gegebenenfalls differierende Werte zur Folge ha-ben können. Normalbereiche, Standardabweichungen und diesbezügliche statistische Berechnungen können einschlägigen statistischen Fachbüchern entnommen werden.
Spezifische Testcharakteristika
Actin® Aktiviertes Cephaloplastinreagenz wurde sorgfältig hergestellt, sodaß es bei der Bestimmung der
aPTT und der darauf basierenden Gerinnungsfaktoren innerhalb der Grenzen des Verfahrens die be-schriebenen Ergebnisse liefert.
Untersuchungen der Präzision mit den aufgeführten Methoden ergeben im Normalbereich eine Standard-abweichung (s), die einem Variationskoeffizienten (VK) von weniger als 5 % entspricht. Aus weiteren klinischen Studien zur Reproduzierbarkeit von Doppelbestimmungen geht hervor, daß im Normalbereich der VK unter 4 % liegt.
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Garantie
Es wird garantiert, daß die Wirkungsweise dieses Produkts den Angaben auf der Packung und in der Produktliteratur entspricht. Dade Behring haftet nicht für die handelsübliche Qualität oder die Eig-nung des Produkts, falls dieses für irgendwelche anderen als die angegebenen Zwecke verwendet wird, noch für irgendwelche Folgeschäden, die sich aus den vorstehenden vertraglichen Gewähr-leistungen ergeben.
* Becton, Dickinson and Co., Rutherford, NJ 07070, USA ** Sherwood Medical Industries, St. Louis, MO 63103, USA *** Medical Laboratory Automation Inc., Pleasantville, NY 10570, USA **** Organon Teknika Corporation, Durham, NC 27704, USA
Hersteller: Dade Behring Marburg GmbH Emil-von-Behring-Str. 76 D-35041 Marburg
B4218 G1 E0533 (0450) H/W 3 Edition Mars 1999
Actin
®
Réactif Céphaline
activée Dade
®
Utilisation
Céphaline liquide de cerveau de lapin avec activateur plasmatique à utiliser pour la détermination du temps de céphaline activée et dans les autres tests d’hémostase nécessitant un réactif céphaline activée.
Résumé et principe
Le temps de céphaline activée (TCA), test global de dépistage1 utilisé principalement pour évaluer les
anomalies de la voie intrinsèque de la coagulation permet également de détecter les déficits fonctionnels sévères en facteur II, V, X ou en fibrinogène. Le TCA a également été largement préconisé1-4 comme outil
de surveillance de l’efficacité des traitements par l’héparine au cours desquels le temps de coagulation est allongé de façon proportionnelle au taux d’héparine. Chez les patients sous traitement anticoagulant par voie orale, les taux circulants de facteur II, VII, IX et X sont diminués, donc le TCA peut être allongé. La présence d’inhibiteurs non spécifiques, tels que les anticoagulants de type lupique,5 peut allonger le TCA
mais cet effet est variable et généralement reconnu pour être plus en relation avec la nature du réactif TCA utilisé. En résumé, le TCA est un test de dépistage important sur le plan clinique, ayant de très larges applications dans le diagnostic des désordres de la coagulation et dans la surveillance thérapeutique des maladies thromboemboliques et des hémorragies.
Réactif
Diagnostic in-vitro
Actin® Réactif céphaline activée: céphaline (extraite de cerveau de lapin déshydraté) en acide ellagique
1,0 x 10-4 M additionnée d’un tampon, d’agents stabilisants et d’un conservateur. Aucun titre standard n’a
été déterminé et accepté pour la céphaline de cerveau de lapin. Conserver fermé à 2-8°C hors utilisation. La stabilité est de 7 jours à 2-15°C. Ne pas congeler. Un précipité vert d’acide ellagique/lipides peut se former lors de la conservation. Mélanger par inversion juste avant utilisation. Prendre soin de ne pas contaminer le réactif avec du plasma lors du pipetage.
Signe de détérioration: déviation des résultats obtenus pour un plasma normal ou un contrôle par rap-port au domaine des valeurs établies par le laboratoire.
Recueil et préparation des échantillons
Mélanger neuf volumes de sang fraîchement prélevé avec un volume de citrate de sodium 0,11 ou 0,13 mol/l (3,2 ou 3,8%). Des tubes sous vide contenant un anticoagulant approprié sont disponibles sur le marché et peuvent être utilisés avec précaution dans les études d’hémostase. Pour les études spéciales, utiliser de préférence la technique à la seringue.
Centrifuger l’échantillon sanguin pendant 10 minutes minimum à 1000 rcf aussitôt que possible après le prélèvement. Consulter le document H21-A2 pour une autre technique de prélèvement.9 Si le test est
réalisé immédiatement, le plasma peut resté au contact du culot globulaire ou être séparé. Pour séparer le plasma, utiliser une pipette en plastique, transférer le plasma dans un tube en plastique et le conserver réfrigéré jusqu’au moment du dosage. Ne pas le conserver dans la glace. Le plasma du patient doit être testé dans les 2 heures suivant le prélèvement. Les échantillons ne doivent pas rester plus de 5 minutes à 37°C.
Réactif fourni
Actin® Réactif céphaline activée
Matériel nécessaire mais non fourni
1. Chlorure de calcium Dade®, 0,02 M ou Chlorure de calcium Behring, 0,025 M*.
2. Matériel de contrôle: Ci-Trol® Contrôle de coagulation, Niveaux 1, 2 et 3, Contrôles Héparine Ci-Trol®,
faible et élevé.
3. Citrate de sodium 0,11 ou 0,13 mol/l (3,2 ou 3,8%) pour prélèvement sanguin ou tubes sous vide disponible sur le marché.
4. Eau distillée ou désionisée sans conservateur. 5. Tubes en plastique
6. Pipettes de précision de 1,0 et 0,1 ml.
* Remarque: Soit utiliser la concentration de CaCl2. Ne pas modifier la concentration une fois que les limites de mesure ont été établies.
Procédure pour TCA
1. Protocole semi ou entièrement automatique :
Se reporter à la notice d’utilisation de l’automate utilisé. Les protocoles spécifiques aux automates de coagulation Dade Behring sont envoyés sur demande.
2. Procédures manuelles:
Préchauffer le chlorure de calcium à 37°C.
Préchauffer 0,1 ml d'Actin® 1 minute à 37°C (mélanger avant utilisation).
Distribuer les réactifs dans les tubes de coagulation de la façon suivante:
Echantillon testé Plasma contrôle
Actin® (préchauffé) 0,1 ml 0,1 ml
Plasma 0,1 ml
-Plasma contrôle - 0,1 ml
Bien mélanger. Incuber 3 minutes à 37°C.
Chlorure de calcium 0,1 ml 0,1 ml
préchauffé Déclencher le chronomètre en même temps que l’addition
de CaCl2 bien mélanger. Après 20 secondes, commencer à observer la formation du caillot.
Note: il n’est pas recommandé que les temps d’incubation soient supérieurs à 5 minutes car cela peut entraîner la perte des facteurs V et VIII.
Chaque laboratoire doit déterminer le temps optimal d’activation-chauffage pour son propre système de dosage.
Surveillance des héparinothérapies par TCA
Lors de l’utilisation du TCA dans ce contexte, il faut prendre en compte les facteurs influençant le test. La liste des considérations générales à prendre en compte est donnée ci-dessous.
A) L’heure du prélèvement est importante car la demi-vie de l’héparine in-vivo est d’environ 1 heure 1/2.6
Lors de son administration, l’héparine a un effet anticoagulant immédiat mais cet effet diminue rapide-ment dans le temps. Ceci est particulièrerapide-ment évident avec les injections intraveineuses intermitten-tes.
B) L’anticoagulant utilisé pour le prélèvement peut fausser les résultats.
C) Le Facteur 4 plaquetaire, facteur neutralisant de l’héparine contenu dans les granules alpha des pla-quettes, peut être libéré s’il y a agrégation plaquetaire ou lésion. Pour éviter son apparition in-vitro, le prélèvement de l’échantillon doit être fait de façon non traumatique. Le froid est connu pour induire l’agrégation plaquetaire et la libération du FP-4; donc il est recommandé de centrifuger les échantillons pour dosage de l’héparine à température ambiante.
D) L’utilisation du TCA pour la surveillance des héparinothérapies dépend du temps. Un délai entre le prélèvement et le dosage entraînera un allongement du TCA. Il est donc impératif de tester les échan-tillons le plus rapidement possible.
E) Un allongement du temps d’activation peut provoquer un allongement du TCA sur les plasmas conten-ant de l’héparine. Il est impératif de standardiser très rigoureusement le temps d’activation-incubation du mélange céphaline-plasma.18
F) La sensibilité à l’héparine est variable suivant les différents systèmes de test utilisés (manuel, photo-optique, etc.). Le changement entre ces différents systèmes doit être évité.
G) Le TCA de base doit être établi chez chaque patient avant le début d’une héparinothérapie si possible pour déterminer si la valeur de TCA du patient est située à l’intérieur des valeurs normales du labora-toire.
H) Des études7 ont montré que la qualité de l’héparine variait suivant l’origine et le fabricant. La réactivité
in-vivo varie suivant le type d’héparine administrée, le métabolisme de l’individu et les autres médica-ments associés.
Contrôle de qualité
Des contrôles tels que le contrôle de coagulation Ci-Trol® (Niveaux 1, 2 et 3) et des Contrôles Héparine
Ci-Trol® faible et élevé, dans la surveillance de l’héparinothérapie, doivent être testés au début de chaque
série de tests, lors de changement de réactif et au moins une fois toutes les 8 heures. Le matériel de contrôle doit être traité de la même manière que les échantillons cliniques. Chaque laboratoire doit établir un intervalle de valeurs pour les contrôles. Ce domaine correspond généralement à ± 2,0 à ± 2,5 déviati-ons standards (DS) par rapport à la valeur moyenne du contrôle. Si les valeurs des contrôles sont en-dehors des limites, vérifier les contrôles, les réactifs et l’appareil. Il est recommandé avant de rendre les résultats des patients, de documenter toute action prise pour identifier et corriger le problème. De nou-veaux intervalles de valeurs doivent être établis pour chaque nouveau numéro de lot de réactif ou de contrôles.
Résultats
Les résultats des temps de céphaline activée doivent être rendus sous forme de TCA en secondes. Ces résultats doivent être rendus par rapport à l’intervalle des valeurs normales de TCA déterminé dans cha-que laboratoire. Il est suggéré de rendre à la fois la valeur de TCA du patient et le domaine des valeurs normales. Les valeurs des contrôles pour le système de réactif utilisé ne doivent jamais être utilisées à la place de l’intervalle des valeurs normales. De ce fait, le rendu des résultats sous forme de limite supérieu-re de la normale peut aboutir à une interprétation incorsupérieu-recte. Des TCA raccourcis peuvent êtsupérieu-re aussi le signe d’une atteinte du système de la coagulation chez le patient.
Limites de la technique
Le test TCA englobe tout le processus de la coagulation depuis l’activation par contact jusqu’à la fibrinofor-mation et est donc plus sensible aux variations qu’un test individuel spécifique. Le contrôle et l’utilisation du TCA sont donc soumis à des limites, de par la nature de ce test. Il faut donc insister sur le contrôle des conditions du prélèvement plasmatique. Des études réalisées par les laboratoires Dade Behring ont mon-tré que la décomposition de l’échantillon pouvait apparaître plus rapidement dans les échantillons qui ne sont pas conservés au réfrigérateur. Il faut éviter d’avoir de trop faibles échantillons (avant dosage) car il peut y avoir des variations du pH par rapport aux valeurs physiologiques. De telles variations peuvent provoquer la décomposition des composants plasmatiques du système de la coagulation sanguine. Il faut noter que les temps de TCA peuvent être affectés par un certain nombre de médicaments couram-ment administrés. Une diminution des valeurs de TCA a été notée chez les hommes traités par des oestro-gènes et chez les femmes sous contraception orale.10, 11 Une augmentation du TCA est notée lors de
l’administration de diphénylhydantoïne, d’héparine, de warfarine, de naloxone et d’opacifiants radiogra-phiques.12-14 De plus, le choix de l’anticoagulant 15, 16(citrate versus oxalate) et l’apparence de
l’échantillon17 (hémolysé, hyperlipémique, chromogène, etc.) peuvent affecter les résultats. Ce dernier fait
est particulièrement vrai lors de l’utilisation des appareils photo-optiques pour la détermination du TCA. Les déficits en facteur de coagulation qui doivent entraîner des allongements du temps de coagulation peuvent être compensés ou donner des valeurs normales par la présence d’un taux élevé d’un ou plu-sieurs autres facteurs de la coagulation. De la même façon, la présence d’intermédiaires actifs qui tendrai-ent à réduire le temps de coagulation peut aussi masquer des situations qui devraitendrai-ent tendrai-entraîner un allon-gement du TCA. Des déficits modérés ou mineurs de nombreux facteurs peuvent avoir un effet additi-onnel sur l’allongement du TCA. Des résultats anormaux inattendus de TCA doivent toujours être suivis par d’autres tests d’hémostase pour déterminer l’origine des résultats anormaux.
L’action de l’héparine comme anticoagulant est due à sa capacité de se lier à un cofacteur plasmatique et d’interférer à différents niveaux du mécanisme de la coagulation, ce qui retarde la fibrinoformation. Voir le paragraphe «Surveillance de l’héparinothérapie par le TCA».
Sélectionner une concentration de CaCl2 pour définir l'interval de référence d'une population normale et
les limites de mesure. Une concentration peut être utilisée, cependant, ne pas modifier la concentration de CaCl2 une fois que les limites de mesure ont été établies.
Valeurs normales
Les valeurs obtenues chez les sujets sains varient d’un laboratoire à l’autre suivant la technique utilisée. Chaque laboratoire doit déterminer ses propres valeurs normales suivant la technique et l’appareil utilisé dans ce laboratoire.
Pour illustrer cette procédure, des valeurs types de moyenne et de déviation standard obtenues chez un groupe de sujets apparemment sains chez Dade Behring et dans un important hôpital sur des plasmas citratés sont données dans le Tableau 1. (Des femmes sous contraception orale ont été inclues)
Tableau 1
Moyenne (secondes) Intervalle (
±
2 DS)Test manuel en tube 30,1 25,5 - 34,7
Fibromètre* 27,0 23,4 - 30,6 Coagulyzer** 22,7 19,1 - 26,3 Electra 600*** 23,0 19,2 - 26,8 Electra 700 ◊ 25,4 22,6 - 28,2 Coag-A-Mate Dual Channel ◊ **** 28,9 23,5 - 34,3
◊ Les échantillons ont été prélevés dans des tubes sous vide.
Le Réactif Céphaline activée Actin® peut aussi être utilisé avec d’autres appareils de coagulation
automa-tiques ou semi-automaautoma-tiques; donc, des valeurs normales ont été établies avec ces appareils. Les valeurs normales pour d’autres populations telles que les enfants doivent également être détermi-nées. L’intervalle des valeurs normales correspond généralement à ± 2 ou ±3 DS par rapport à la valeur moyenne obtenue pour les TCA réalisés chez des individus normaux dans les conditions du laboratoire.8
Les valeurs normales doivent être établies dans le laboratoire de l’utilisateur. Il faut garder en mémoire que deux techniciens différents ne manipulent pas exactement de la même manière. Des variations de l’appareillage et de la technique peuvent entraîner des résultats quelque peu différents. Le calcul de l’intervalle des valeurs, de la DS et des autres données statistiques peuvent être trouvés dans la plupart des livres de statistiques couramment utilisés.
Critères de qualité
Le Réactif Céphaline activée Actin® a été soigneusement préparé afin de donner des résultats se trouvant
à l’intérieur des limites établies lorsqu’il est utilisé pour les déterminations du temps de céphaline activée et dans les autres tests d’hémostase nécessitant un réactif céphaline activée.
Des études de précision réalisées en utilisant les méthodes citées dans ce mode d’emploi montrent que des tests TCA correctement réalisés doivent donner, à l’intérieur des valeurs normales, une déviation standard (DS) correspondant à un coefficient de variation inférieur à 5%. D’autres études démontrant la reproductibilité des dosages faits en plusieurs exemplaires indiquent que le TCA ne doit pas varier, à l’intérieur des valeurs normales, de plus de 4% quand il est correctement réalisé.
Bibliographie
Générale
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Ce produit est garanti à condition de l’utiliser selon les indications des étiquettes et de la documentation fournie par Dade Behring. Dade Behring décline toute garantie implicite de qualité marchande, ainsi que toute garantie relative à un usage autre que celui mentionné sur l’étiquetage. Dade Behring ne pourra en aucun cas être tenu pour responsable des dommages indirects qui pourraient survenir dans le cadre de cette garantie.
* Becton, Dickinson and Co., Rutherford, NJ 07070 ** Sherwood Medical Industries, St Louis, MO 63103 *** Medical Laboratory Automation, Pleasantville, NY 10570 **** Organon Teknika Corporation, Durham, NC 27704
France: Fabriqué par Dade Behring Marburg GmbH, Marburg (Allemagne), et commercialisé en France par Dade Behring S.A., Immeuble Berkeley, 19/29 rue du Capitaine Guynemer, 92081 Paris-La Défense
B4218 G1 E0533 (0450) H/W 4 Edizione Marzo 1999
Dade
®
Actin
®
Reagente
Cefaloplastina Attivata
Uso Previsto
Cefalina liquida da cervello di coniglio con attivatore plasmatico, da utilizzare nella determinazione del tempo di tromboplastina parziale attivata ed in altre procedure coagulative richiedenti come reagente tromboplastina parziale attivata.
Generalità e Principio
Il tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT), una procedura di screening globale1 utilizzata
princi-palmente per valutare anormalità della via intrinseca, può rilevare anche gravi carenze funzionali dei fattori II, V e X oppure del fibrinogeno. L’APTT é stato ampiamente propugnato1-4 anche come mezzo per
monitorare l’efficacia della terapia eparinica in cui il tempo di coagulazione risulta allungato in proporzione al livello di eparina. Nei pazienti trattati con anticoagulanti orali, i livelli circolanti dei fattori II, VII, IX e X sono depressi, pertanto ci si può aspettare che l’APTT risulti prolungato. La presenza di inibitori non specifici, come gli anticoagulanti di tipo lupus5, può prolungare l’APTT ma questo effetto é variabile ed in
genere ritenuto in maggiore correlazione con il tipo di reagente per APTT utilizzato. In sintesi, l’APTT é un test di screening clinicamente importante con ampia applicabilità per la diagnosi dei disordini della coagu-lazione e per il monitoraggio terapeutico sia degli stati emorragici che di quelli trombotici.
Reagente
Per uso diagnostico in vitro
Actin® Reagente Cefaloplastina Attivata: cefalina (estratta da cervello di coniglio disidratato) in acido ellagico 1,0 x 10-4M con aggiunta di tampone, stabilizzanti e conservante. La potenza standard non é stata
definita né accettata per la cefalina da cervello di coniglio. Conservare chiuso a 2-8°C quando non in uso. Stabilita' dopo apertura: 7 giorni a 2-15°C.
Non congelare. Durante la conservazione può formarsi un sedimento verde di acido ellagico e lipidi. Mescolare per capovolgimento immediatamente prima dell’uso. Erogazioni ripetute devono essere attua-te con cura per evitare la contaminazione con plasma.
Indice di deterioramento: il plasma normale o di controllo mostra deviazioni dei risultati rispetto all’intervallo definito dal laboratorio.
Raccolta e Preparazione dei Campioni
Miscelare nove parti di sangue prelevato di fresco con una parte di sodio citrato 0,11 oppure 0,13 mol/l (3,2 oppure 3,8%). In commercio sono disponibili provette sottovuoto, contenenti l’opportuno anticoagulante, che possono essere utilizzate con la dovuta cautela nello studio della coagulazione. Per studi particolari, può essere preferibile la tecnica in siringa.
Centrifugare i campioni di sangue per un minimo di 10 minuti a 1000 rcf al più presto possibile dopo il prelievo. Per procedure di prelievo alternative, fare riferimento al documento NCCLS H21-A2.9 Se l’analisi
deve essere eseguita immediatamente, il plasma può rimanere a contatto con le cellule oppure venirne separato. Per separare il plasma, utilizzare una pipetta di plastica, trasferire il plasma in una provetta di plastica e conservare in frigorifero fino al momento dell’esecuzione. Non conservare in ghiaccio. Il plasma dei pazienti dovrebbe essere analizzato entro 2 ore dal prelievo. I campioni non devono stare a 37°C per più di cinque minuti.
Reagente Fornito
Actin® Reagente Cefaloplastina Attivata
Materiali Richiesti ma non Forniti
1. Dade® Calcio Cloruro, 0,02M oppure Calcio Cloruro Behring, 0,025 M*.
2. Materiale di Controllo: Controlli Ci-Trol®, Livelli 1, 2 e 3; Controlli Ci-Trol® Heparin, Low e High.
3. Sodio citrato 0,11 oppure 0,13 mol/L (3,2 oppure 3,8%) per il prelievo del sangue oppure provette sottovuoto disponibili in commercio.
4. Acqua distillata o deionizzata priva di conservanti. 5. Provette di plastica.
6. Sistemi di precisione capaci di dispensare con accuratezza volumi pari a 1,0 mL e 0,1 mL. * Nota: Utilizzare indifferentemente le due concentrazioni di CaCl2. Non variare le concentrazioni dopo
definizione degli intervalli di riferimento.
Procedura per APTT
1. Procedure Automatiche o Semiautomatiche:
Fare riferimento al manuale operativo degli strumenti per istruzioni dettagliate.
Sono disponibili, su richiesta, protocolli speciali per gli analizzatori per coagulazione della Dade Behring. 2. Procedura Manuale:
Preriscaldare Calcio Cloruro a 37°C
Preriscaldare 0,1 mL di Actin® per 1 minuto a 37°C. (Mescolare prima dell'uso)
Pipettare in provette da coagulazione come indicato:
Campione in esame Plasma di controllo
Actin® (preriscaldato) 0,1 mL 0,1 mL
Plasma 0,1 mL
-Plasma di controllo - 0,1 mL
Mescolare bene. Incubare a 37°C per 3 minuti.
Calcio Cloruro 0,1 mL 0,1 mL
preriscaldato Contemporaneamente all’aggiunta di CaCl2 avviare il crono-metro, mescolare bene. Dopo 20 sec. iniziare l’osservazione della formazione del coagulo.
Nota: Tempi di incubazione superiori a 5 minuti possono causare diminuzione dei fattori V e VIII e non sono consigliati.
Ogni laboratorio dovrebbe determinare il tempo ottimale di incubazione/attivazione per il proprio particola-re sistema analitico.
Monitoraggio dell’Eparina con APTT
Quando si utilizza l’APTT per questo scopo, bisogna tenere presenti i fattori che influenzano il test. Le considerazioni generali sono elencate di seguito.
(A) Il tempo di prelievo é importante perché l’emivita in vivo dell’Eparina é pari a circa 1,5 ore.6 Dopo
somministrazione, essa ha un immediato effetto anticoagulante ma l’entità di tale effetto diminuisce rapidamente nel tempo. Questo é particolarmente evidente per iniezioni endovenose singole interval-late.
(B) L’anticoagulante utilizzato per il prelievo del campione può alterare i risultati del test.
(C) Il Fattore piastrinico 4, fattore neutralizzante l’Eparina contenuto negli alfa-granuli, può venire rilasciato a seguito di aggregazione o danneggiamento delle piastrine. Per prevenire questa possibilità in vitro, i campioni dovrebbero essere raccolti in maniera atraumatica. È noto che le basse temperature induco-no aggregazione piastrinica e rilascio di PF-4; pertanto, si raccomanda la centrifugazione a temperatu-ra ambiente per gli studi sull’Eparina.
(D) L’utilizzo dell’APTT per il monitoraggio dell’Eparina é tempo-dipendente. Un ritardo nell’esecuzione dei test si traduce in un allungamento dell’APTT. Quindi, é fondamentale che tutte le analisi vengano eseguite al più presto possibile.
(E) L’aumento dei tempi dell’attivazione da contatto può tradursi in un allungamento dell’APTT nei campio-ni di plasma contenenti Eparina. È imperativo che il tempo ottimale di incubazione/attivazione della miscela cefaloplastina-plasma sia rigidamente standardizzato.18
(F) Sistemi analitici diversi (es., manuale, foto-ottico, ecc.) mostreranno variabilità della sensibilità all’Eparina. L’interscambio tra sistemi analitici dovrebbe essere evitato.
(G)Prima dell’inizio della terapia, bisognerebbe definire i dati basali dell’APTT di ciascun paziente, ove possibile, per determinare gli APTT individuali poiché tali valori si correlano con l’intervallo di normalità definito dal laboratorio per quel test.
(H) Appositi studi7 hanno evidenziato variabilità delle valutazioni dell’Eparina in base alla fonte di origine
ed ai differenti produttori. La reattività in vivo varia a seconda del tipo di Eparina somministrato, del metabolismo individuale e della somministrazione contemporanea di altri medicamenti.
Controllo di Qualità
Controlli, come ad esempio i Controlli per Coagulazione Ci-Trol® (Livelli 1, 2 e 3), ed i Controlli Ci-Trol®
Heparin Low e High per il monitoraggio dell’Eparina, dovrebbero essere analizzati all’inizio del ciclo opera-tivo, quando cambia il lotto di reagente ed almeno una volta ogni 8 ore. Il materiale di controllo deve essere trattato con le medesime modalità dei campioni in esame. Ogni laboratorio deve definire l’intervallo di accettabilità per i valori di controllo. Tale intervallo é generalmente pari a ± 2,0 fino a ± 2,5 deviazioni standard (DS) rispetto al valore medio del controllo. Se i valori di controllo sono al di fuori dell’intervallo predefinito, verificare i controlli, i reagenti e lo strumento. Si raccomanda di documentare ogni azione effettuata per identificare e correggere i problemi prima di refertare i dati dei pazienti. Per ogni lotto di reagente o di materiale di controllo bisognerebbe definire i nuovi intervalli di accettabilità.
Risultati
I risultati del tempo di tromboplastina parziale attivata devono essere espressi come APTT in secondi. Tali risultati dovrebbero correlarsi con l’intervallo di normalità dell’APTT in ciascun laboratorio. Si suggerisce di trasmettere al clinico i risultati del paziente insieme con l’intervallo di normalità. I valori dei controlli per lo specifico sistema analitico non dovrebbero mai essere utilizzati in luogo dell’intervallo di normalità. Inoltre, refertare i risultati dell’APTT solo nei riguardi del limite superiore normale può comportare errata interpre-tazione. Risultati di APTT accorciati possono indicare alcune condizioni anormali del sistema coagulativo del paziente.
Limiti della Procedura
Il test APTT spazia sull’intero processo coagulativo dall’attivazione da contatto alla formazione di fibrina e pertanto é più suscettibile di variazioni rispetto ai singoli test specifici. Quindi, il controllo e l’utilizzo dell’APTT sono soggetti alle conseguenti limitazioni. Il controllo delle condizioni del campione di plasma é vivamente raccomandato. Studi eseguiti nei laboratori Dade Behring hanno dimostrato che la degradazio-ne del campiodegradazio-ne può verificarsi più rapidamente per i campioni conservati non in frigorifero. Bisogna evitare l’utilizzo di campioni estremamente ridotti di plasma perché si potrebbero riscontrare variazioni del pH del plasma rispetto alle condizioni fisiologiche. Tali variazioni possono portare al degrado dei compo-nenti plasmatici del sistema della coagulazione.
È da notare che il test APTT può essere influenzato da una quantità di farmaci di uso comune. È stato documentato un accorciamento del tempo di APTT nei maschi in terapia con estrogeni e nelle femmine in terapia contraccettiva orale.10,11 Un incremento dell’APTT é stato osservato a seguito di somministrazione
di Difenilidantoina, Eparina, Warfarin, Naloxone e mezzi di contrasto radiografici.12-14 Inoltre, la scelta
dell’anticoagulante15,16 (es.: citrato versus ossalato) e le condizioni del campione17 (emolizzato, lipemico,
con presenza di colorazione, ecc.) possono influenzare i risultati. Quest’ultimo fatto é particolarmente vero per le determinazioni di APTT eseguite con strumentazione ottica.
Le carenze di fattori della coagulazione che possono produrre tempi di coagulazione allungati possono essere compensati o fatti apparire normali da livelli elevati di uno o più degli altri fattori coagulativi. In maniera similare, la presenza di sostanze intermedie attive che tenderebbero ad accorciare il tempo di coagulazione può mascherare condizioni che di norma porterebbero ad allungamento dell’APTT. Carenze lievi o minime a carico di parecchi fattori possono avere un effetto di accumulo sull’allungamento dell’APTT. Risultati di APTT inaspettatamente anormali dovrebbero sempre essere seguiti da ulteriori studi della coagulazione per determinare la causa dell’anormalità dei risultati.
L’azione anticoagulante dell’Eparina é correlata alla sua capacità di interferire, in unione con un cofattore plasmatico, in parecchi aspetti del meccanismo della coagulazione, diminuendo in tal modo la velocità di formazione della fibrina. Vedere la Sezione «Monitoraggio dell’Eparina con APTT».
Scegliere la concentrazione di CaCl2 con cui definire gli intervalli di riferimento della popolazione normale e gli intervalli dei controlli. Le due concentrazioni possono essere usate indifferentemente, tuttavia si consiglia di non variare la concentrazione del CaCl2 dopo che gli intervalli siano stati definiti.
Valori Attesi
I valori per i soggetti sani variano da laboratorio a laboratorio a seconda della tecnica impiegata. Ogni laboratorio deve determinare i propri valori attesi in base alla tecnica ed alla strumentazione in uso. Per illustrare questa procedura, in Tabella 1 sono riportati i valori tipici di media e di deviazione standard determinati per un gruppo di volontari apparentemente sani della Dade Behring e di un’importante istitu-zione clinica che utilizza plasmi citratati (incluse donne in terapia contraccettiva orale).
Tabella 1
Media (sec.) Intervallo per
±
2 DSMetodica Manuale 30,1 25,5 - 34,7 Fibrometer* 27,0 23,4 - 30,6 Coagulyzer** 22,7 19,1 - 26,3 Electra 600*** 23,0 19,2 - 26,8 Electra 700◊ 25,4 22,6 - 28,2 Coag-A-Mate◊**** 28,9 23,5 - 34,3 Dual Channel
◊ I campioni sono stati raccolti in provette sottovuoto.
Actin® Reagente Cefaloplastina Attivata può essere utilizzato con altri strumenti per coagulazione
automa-tici e semiautomaautoma-tici; tuttavia, gli intervalli normali per tali strumenti non sono stati definiti.
Ove necessario, devono essere definiti anche gli intervalli di normalità per altre popolazioni quali i gruppi pediatrici. L’intervallo di normalità é solitamente impostato a ± 2 o ± 3 DS rispetto al valore medio ottenuto con l’APTT su individui normali nelle consuete condizioni del laboratorio.8
Gli intervalli devono essere definiti nei singoli laboratori. Bisogna tenere presente che due diversi Opera-tori non agiranno mai nella stessa, identica maniera. Variazioni nella tecnica e nella strumentazione pos-sono dare risultati differenti. Gli intervalli, la DS ed i calcoli statistici correlati pos-sono reperibili nella maggior parte dei testi di analisi statistica.
Caratteristiche Analitiche
Actin® Reagente Cefaloplastina Attivata é stato preparato per comportarsi secondo i risultati ed entro i
limiti descritti quando venga utilizzato per la determinazione del tempo di tromboplastina parziale attivata ed in altre procedure coagulative che utilizzino come reagente tromboplastina parziale attivata. Studi di precisione eseguiti con l’impiego delle metodologie elencate nel presente documento mostrano che i test APTT correttamente eseguiti dovrebbero dare una deviazione standard (DS) corrispondente ad un coefficiente di variazione (CV) inferiore al 5% nell’intervallo normale. Ulteriori studi di dimostrazione della riproducibilità tra determinazioni in duplicato dello stesso campione hanno indicato che i valori dell’APTT dovrebbero variare entro il 4% se correttamente eseguiti.
Bibliografia
Generale
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