Universidad Nacional Autónoma de
México
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Práctica 5 “Extracción y análisis de lípidos en la
yema de huevo”
Equipo 10
Grupo 2401
Laboratorio de Bioquímica Celular y de los
Tejidos I
Objetivos
Analizar las propiedades de los lípidos.
Extraer los lípidos de la yema de huevo.
Cuantificar fosfatos de lípidos fosforilados y no fosforilados.
Analizar la importancia biológica de los lípidos presentes en la yema de huevo.Resultados
Tabla 1. Datos curva estándar
# de Tubo Blanco L.F basico L.F acido N.F básico N.F acido 1 2 3 4 5
Solución problema de lípidos (mL)
- 1 1 1 1 - - - -
-Solución patrón de fosfatos (mL) - - - 0.2 0.6 1.0 2.0 3.0
H2O destilada 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Reactivo 1 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
Reactivo 2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Concentración fósforo (mg) -Absorbancia a 640 nm 0.00
Lípidos Concentración (μg) Absorbancia a 615nm
0 0 2 0,033 6 0,048 10 0,115 20 0,189 30 0,292 Acido (Fosforilados) 14,10526316 0,139 Básico (Fosforilados) 14,10526316 0,139 Acido (No Fosforilados) 6,842105263 0,07 Básico (No Fosforilados) 7,894736842 0,08
0 5 10 15 20 25 30 35 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.14 0.070.08 f(x) = 0.01x + 0 R² = 0.99
Curva Estandar Fosforo
Absorbancia a 615nm Linear (Absorbancia a 615nm) Linear (Absorbancia a 615nm) Muestra problema Concentración (μg) Absorbancia
Calculo para la concentración de fosforo en lípidos fosforilados y no fosforilados.
x= Concentración de fosforo
x=y−b
m
Lípidos Concentración de fosforo (μg) Absorbancia a615nm
Acido (Fosforilados) 14,10526316 0,139 Básico (Fosforilados) 14,10526316 0,139 Acido (No Fosforilados) 6,842105263 0,07 Básico (No Fosforilados) 7,894736842 0,08
Lípidos fosforilados en medio acido
0.139−0.005
Lípidos fosforilados en medio básico
0.139−0.005
0.0095 =14,10526316
Lípidos no fosforilados en medio acido
0.07−0.005
0.0095 =6,842105263
Lípidos no fosforilados en medio básico
0.08−0.005
0.0095 =7,894736842
Factor de corrección para la concentración de lípidos en la yema de huevo Lípidos fosforilados en medio acido
14,10526316 μg
50 ml =0,282105263μg ml
Lípidos fosforilados en medio básico
14,10526316 μg
50 ml =0,282105263μg ml
Lípidos no fosforilados en medio acido
6,842105263 μg
50 ml =0,136842105μg ml
Lípidos no fosforilados en medio básico
7,894736842 μg
50 ml =0,157894737μg ml
Porcentaje de fosfato en el fosfatomonopotásico
0.4394 g
(
1000 mg439.4 mg
1000 ml =0.4394mg ml
Multiplicado por el factor de dilución
0.4394mg
ml
∗1
10 =0.04394mg ml
Si el la masa de fosfatomonopotásico es de 136g y esto corresponde al 100% entonces los 31g que pertenecientes al fosforo dentro de esta molécula equivalen a: 136 g KH 2 P 04−−−−−−−100 31 gP−−−−−−−−−−22.79 Si 0.04394mg/ml equivalen al 100% el 22.79% es: 0.04394mg ml KH 2 PO 4−−−−100 0.01mg ml P−−−−−−−−22.79
Multiplicando el valor obtenido por el volumen de las alícuotas se obtiene. Volumen de alícuota (ml) Producto entre el volumen y el factor de corrección. Concentración de fosforo (mg) Concentración de fosforo en μg 0.2 0.2 ml∗0.01mg ml 0.002 2 0.6 0.6∗0.01mg ml 0.006 6 1 1∗0.01mg ml 0.01 10 2 2∗0.01mg ml 0.02 20 3 3∗0.01mg ml 0.03 30 Concentración de Absorbancia a
lípidos del patrón (μg) 615nm 0 0 2 0,033 6 0,048 10 0,115 20 0,189 30 0,292 y=mx +b m=n Σxy−ΣxΣy nΣ x2−(Σx )2 b=ΣyΣ x 2 −ΣxΣxy n Σ x2−(Σx )2 Σ x=68 Σy=0,677 Σ x2=1440 Σxy=¿ 14.044 x promedio=11,33333333 y promedio=0,112833333 m=6 (14.044)−0.677∗68 6∗1440−682 =9.518924303 x 1 0 −3 b=0,677∗1440−68∗14.044 6∗1440−(68)2 =4.952191235 x 1 0 −3
Absorbancia (y) y-y promedio (y− ypromedio)2
0 -0,112833333 0,012731361
0,033 -0,079833333 0,006373361
0,048 -0,064833333 0,004203361
0,115 0,002166667 4,69444E-06
0,189 0,076166667 0,005801361 0,292 0,179166667 0,032100694 Σ( y− ypromedio)2=¿ 0,06121483 y promedio=0,112833333 S=
√
Σ ( y− ypromedio) 2 n−1 S=√
0,06121483 6−1 =0.1106479402 CV = S ypromedio= 0.1106479402 0,112833333 =0.9806316707Calculo coeficiente de correlación
r= σxy σx∗σy σxy=Σxi∗ yi n −xpromedio∗ypromedio σx=
√
Σx i 2 n −(xpromedio) 2 σy=√
Σ yi2 n −(ypromedio) 2 x promedio=11,33333333 y promedio=0,112833333 Σ x2=1440 Σxy=¿ 14.044 Σ y2=0.137603σxy=14.044 6 −11,33333333∗0,112833333=1.061888893 σy=
√
0.137603 6 −(0,112833333) 2 =0.1010072883 σx=√
1440 6 −(11,33333333) 2 =10.56198635 r= 1.061888893 0.1010072883∗10.56198635=0.9953613302 r2=0.9907441776Análisis de Resultados
La presente curva estándar se realizó con seis valores de absorbancia y concentración respectivamente, de los puntos generados por estos valores, solo dos puntos concuerdan con la línea de tendencia, a pesar de esto los demás puntos están muy próximos a la línea de tendencia, por lo cual se pretende dar por buena esta curva, ya que lo observado es
respaldado por los cálculos estadísticos, pues se obtiene un valor de r2 muy próximo a uno, este fue de 0.9907 lo cual es un valor bastante aceptable, además que los valores de concentración de la muestra problema caen dentro de la curva estándar.
Se obtuvieron cuatro valores, dos para los fosforilados uno en medio básico y otro medio acido, así como de los no fosforilados de los cuales al igual que en los fosforilados se tenían básicos y ácidos. Para el caso de los fosforilados tanto acido como básicos se obtuvo un mismo valor de absorbancia (0.139), lo cual no indica que no necesariamente se debe tener un determinado pH para realizar la lectura pues al parecer este no afecta en nada. Para el caso de los no fosforilados lo ideal sería tener una absorbancia igual a cero pues no se esperaba hallar lípidos fosforilados, debido a que durante la separación de fosforilados y no fosforilados, algunos lípidos fosforilados pudieron colarse con los no fosforilados,
apareciendo así como impurezas y por lo tanto haciéndose presentes en la curva estándar. A pesar de esto la concentración de estos fue menor a la de los fosforilados. Tal vez se debió esperar un poco más durante el baño de hielo, para dar oportunidad a que la mayor cantidad de lípidos fosforilados precipitaran y estos no se fueran junto con los no fosforilados al decantar.
Conclusiones
Gracias a la oxidación de la materia orgánica, seguida de la formación del complejo fosfomolibdato, se pudo cuantificar la cantidad de lípidos fosforilados y no fosforilados contenidos en la yema de huevo, pues el color del complejo nos permitió medir la
absorbancia en cada muestra. Al extrapolar los datos obtenidos en las muestras problema dentro de la curva estándar, fue posible conocer la concentración real de lípidos en la muestra.
Bibliografía
Aguilar-Santelises L, García-del Valle A, Corona-Ortega MT, et al. Antología del laboratorio de Bioquímica Celular y de los tejidos I (complemento). Material en CD e impreso México: FES Zaragoza; 2007.