Laboratorio de
Microbiología General II
Técnicas de colecta y tinción de
parásitos
Blanco Blanco Ivón Galicia López Susana Verónica Laguna Morales Juan Carlos Mogollan Marín Luis Jonatan
Aprender
a
colectar
material
parasitario
de
animales
de
experimentación y domésticos.
Conocer utilizar las diferentes
técnicas de tinción, utilizadas en
Es la manipulación sobre un ser vivo, o bien
sobre parte de él, que tiene por objeto mantener toda su arquitectura tanto estructural como química lo más inalterada posible.
Los fijadores se dividen en 2: Físicos: Calor Frío Criodesecación (liofilización) Químicos Líquido de Bouin
Solución Fijadora de PVA Solución de Schaudinn Gelatina-Glicerol
Formalina AFA
Se hace a la llama, con lo que se obtiene una
coagulación rápida de las proteínas y por tanto su estabilización.
Fijador de
Protozoarios y
Helmintos.
Ácido pícrico,
saturado con agua.
Formaldehído
Ácido Acético
Cloruro de
mercurio, saturado
con agua
Alcohol etílico,
95%
A esta solución se le agrega ácido acético glacial en proporciones de 1 parte de Ác, acético glacial por 19 partes de la preparación, antes de usarla.
Fijador de quistes,
trofozoitos,
Fijador de trofozoitos y
quistes
(combinación
Schaudinn más resina).
PVA
Ácido acético
glacial
Glicerina
Solución de
Schaudinn
Sirve en preparaciones permanentes de nematodos Componentes: Gelatina Agua destilada Glicerina Fenol (cristales)
Sirve para preservar quistes, helmintos y
protozoarios
Componentes:
Formaldehido 0.5%
Solución salina (NaCl 0.85%)
Se utiliza para preservar trematodos y cestodos Componentes: Etanol(96%) Formaldehido Agua destilada Acido acético
La mezcla de etanol, formaldehido y agua
destilada durar varios meses. Cuando se agrega el acido acético dura un mes.
Es un método en el cual se utilizan
colorantes especiales para pintar o teñir a una célula que ha sido procesada, esto con la finalidad de poder observarla al microscopio.
Para obtener buenos resultados en una
tinción esta se realiza lo más rápido posible después de la fijación.
Las tinciones se clasifican en:
Simples: Utilizan solo un colorante.
Y se pueden realizar de dos formas:
Progresivas: Son aquellas en las que el material
se coloca en colorante diluido durante el tiempo necesario para colocar la tinción hasta la intensidad deseada.
• Regresiva: Son las tinciones en las que el material
o preparaciones se colocan en colorante concentrado hasta lograr una sobre tinción y posteriormente decolorar hasta lograr la intensidad deseada.
Parásitos
Coloración de Giemsa Tinción Wright
Tinción Indica Eosina 5%
Tinción de Gram
Tiñe protozoarios,
hemáticos e intestinales.
Para protozoarios se
lava con buffer fosfatos pH 6.8. Flagelos, cilios y núcleos (rojo), citoplasma y esporozoitos (azul) Reactivos:
Giemsa II-Eosina (Azul de
Metileno-Eosina)
Giemsa II (Azul de
Metileno)
Giemsa B (Azur B,
formado por la oxidación del Azul de Metileno)- Eosina (colorantes)
Glicerina (humectante) Metanol absoluto
Leishmania infantum
Tinción de tipo
Romanowsky, debido a que se produce una
separación de
colores:
Tiñe de púrpura núcleos
y gránulos neutrofilicos.
De rosa a los Eritrocitos.
De azul a proteínas ácidos nucleicos y citoplasma. Reactivos: Tinción de Wright Eosina Y Eosina B Azul de Metileno Glicerina Alcohol metílico absoluto
Melanoma maligno del perro
Útil para evidenciar segmentos grávidos
entre Taenia solium y Taenia saginata.
Reactivos:
Tinta india (colorante)
Etanol al 50% o 70% (deshidratante) Xilol (aclarante)
Observación de parásitos en heces ya que,
estos y sus quistes se resisten a su
coloración y la materia fecal se tiñe rosa.
(protozoarios es fondo blanco al igual que
sus quiste)
Reactivos:
Ésta es una tinción diferencial usada para
demostrar las propiedades tintoriales de bacterias de todos los tipos.
Las bacterias grampositivas retienen el
colorante de cristal violeta después de la decoloración se ven azul oscuro.
Las bacterias gramnegativas no son capaces
de retener el colorante violeta cristal después de la decoloración y se contratiñen de color rojo con el colorante de safranina.
Las características tintoriales pueden ser
atípicas en cultivos muy jóvenes, viejos, muertos o en degeneración.
Tinción de formas quísticas de Pneumocystis
Tinciones permanentes
:I. Tinción de Heidenhain con hematoxilina
férrica.
Utilizada para la detección e identificación de
protozoos fecales.
Preparación de hematoxilina I. Hematoxilina
II. Alcohol etílico de 95° III. Agua destilada
La hematoxilina primero debe ser oxidado
para dar hemateína.
Algunos agentes químicos oxidantes que se
pueden usar son: yodato de sodio, permanganato de potasio, peróxido de hidrógeno y oxido de mercurio.
La fase de la coloración (solución de
alumbre de hierro y amonio al 2% ) es de mucha importancia. El propósito es disolver gradualmente algo del color negro de la preparación y se continúa hasta que la estructura nuclear de las amebas y flagelados sea perfectamente visible.
Es una alternativa a la hematoxilina férrica
para la tinción de protozoos.
Permite visualizar las características de los
I. 10mL de ácido acético glacial a 6 g de
cromotropo 2 R, 3g de verde brillante y 7g de ácido fosfotúngstico.
II. Mover y dejar la mezcla por 30 min.
III. Agregar 1000mL de agua destilada y
Los protozoos tienen citoplasmas de color
entre verde azulado y violeta
Núcleos y cuerpos de inclusión de color entre
rojo y rojo purpúreo
Las tenias adulto están
formadas por una serie
de
segmentos
rectangulares
planos
denominados
proglótidos
Cada proglótide maduro
contiene ambos órganos
reproductores
Los proglótidos se lavan con formol
Se escoge uno de los proglotidos terminales del gusano y se coloca entre dos portaobjetos
Con un hilo en cada extremo se presionan los portaobjetos, se deja uno
de los hilos mas largos
Sujetando el hilo largo se sumerge en lactofenol, se
extrae hasta que se aclare
Se abren los
portaobjetos, se toma el proglótido y se coloca en un portaobjetos limpio
Las filarias son nematodos que se localizan
en tejido subcutáneo, sangre, ojo y cavidades de animales y humanos; su forma larvaria es conocida como Microfilaria, la cual es ingerida por mosquitos hematófagos, en estos evolucionan hasta larva III (infectante) para ser inoculados por picadura a otros animales.
1.Alumbre de amonio Agua destilada
2.Hematoxilina Alcohol 95%
Mezclar y agregar la solución 1. 3.Glicerina
Alcohol metílico
Reactivos:
Azul de cresilo al 75% en solución salina Azul de metileno al 1% es solución salina
Se usa para teñir microfilarias vivas, tiñe el
núcleo y provee un contraste entre el portaobjetos y el m.o.
Tipos de muestra Cuidados de la muestra Técnicas Parásitos Sangre Heparina Azida de sodio Recién extraída Gota gruesa Gota fina Hemoparásitos,in tra/extra eritrocitarios Ectoparásito Vivo Sacrificado
Fraccionado
Garrapata Materia Fecal Frasco boca
ancha, limpio y seco, ausencia de orina y rotulado
Varios procesos Parásitos intestinales
Sólidas Cerradas( evitar desecación) y refrigeradas 2° C Cps Flotación Concentración Huevos y/o quistes nemátodos Líquidas 37° C recién obtenidas Observación en fresco Trofozoitos y quistes
Tejidos frascos con fijador
•formalina
Impregnación que se produce al ejercer
presión con un porta objetos sobre el tejido que va a ser examinado.
Técnica de Gota
En la molleja o proventrículo suele atacar el
Tetrameres americana.
En el intestino delgado la Ascaridia galli y la
capillaria obstinta.
También pueden detectarse: o Davainea proglotina
o Amoebotonea
En el ciego (parte del intestino) suele
alojarse el Heteraquis gallinae, Capillaria
anulata.
Parásito
Localización
Trypanosoma sp.
Sangre
Trypanoplasma
sp.
sangre
Hexamita sp.
Tracto digestivo
NOM-062-ZOO-1999 NOM-033-ZOO-1995 NOM-051-ZOO-1995 NOM-059-ECOL-1994
Microscopio Estereoscopio
1 Pliego de papel absorbente Un estuche de disección
Localice y obtenga los ectoparásitos de los animales asignados Haga observaciones de diferentes porciones del artrópodo Sacrifique los ectoparásitos
Observe con ayuda del microscopio y estereoscopio las muestras Realice diversas preparaciones en solución salina utilizando lugol
Coloque en el portaobjetos limpio
una gota de sangre extendiéndola a 1.5 cm
Mueva rápido el portaobjetos de manera
suave para no lisar los eritrocitos y teñir con el
método de Wright
Deposite una gota de sangre en uno de los extremos y realizar una extensión de la sangre Observar en 10x, 40x y 100x en el microscopio Se hace un lacado o lisado de eritrocitos en agua destilada, seca y teñir con el método de Giemsa
El frotis de sangre se cubre con unas gotas
de la tinción de Wright; se deja durante 1 minuto.
Este método solo sirve para frotis delgados
El exceso de
colorante se quita con agua amortiguada, se escurre con rapidez y se deja secar al aire.
Se tiñe durante 3-5 minutos o
hasta por 15 minutos Se agrega unas gotas
de agua amortiguada (pH 6.8 a 7.2); se debe soplar sobre el portaobjetos para
mezclar el agua con el colorante.
Fijar los preparados en metanol absoluto durante unos 30 segundos por inmersión o por goteo del alcohol sobre el frotis colocado en un ángulo de 30° a 45°.
Secar los frotis en posición vertical. Lavarlos brevemente en agua amortiguada neutra o bajo corriente. Teñirlos unos 20 minutos en una disolución de Giemsa 1:20 o 45 minutos en una disolución 1:50. Dejar que sequen.
Sacrificar mediante incisión todo lo largo de la línea
media ventral
Buscar en la superficie de los órganos internos y las membranas serosas
la presencia de quistes
Abrir los órganos huecos con una tijera y los
esponjosos se desmenuzaran en busca de helmintos. Y en el intestino en busca de helmintos y protozoarios Extraer órgano por órgano, los que se colocan en placas con solución salina
Realizar impronta con una pequeña y delgada porción de algunos órganos del
animal Se limpiara de
moco y resto de tejido a los
helmintos
Conservar los helmintos limpios en AFA y fijar
Lawrence Ash. Atlas de Parasitología
Humana. Editorial Panamericana. 5ta. Edición. México 2010. Pág. 455
Markell Edward K. Parasitología, Diagnóstico,
Prevención y Tratamiento. Editorial el Manual Moderno. 5ta. Ed. México 1984. Pág. 411
1. Secar los frotis durante varias horas o
hasta el día siguiente. No fijarlos.
2. Teñirlos durante 45 minutos con una
disolución 1:50 del colorante de Giemsa.
3. Lavarlos en agua amortiguada neutra o
bajo agua corriente por 3-5 minutos.
1. Fijar solo los frotis delgados en metanol absoluto
aproximadamente durante 30 segundos por inmersión o por goteo del alcohol sobre el frotis colocado en un ángulo de 30° o 45°.
2. Dejar que se sequen
3. Teñir ambos frotis simúltaneamente durante 45 minutos con
una dilución Giemsa 1:50.
4. Enjuagar brevemente los frotis delgados por inmersión en agua
amortiguada neutra. Lavar el frotis grueso durante 3-5 minutos adicionales por inmersión en agua amortiguada sin dejar que el frotis delgado se ponga en contacto con el agua de lavado.
5. Secar los frotis en posición vertical con el frotis delgado hacia
1. Fijar los frotis de sangre en alcohol metílico
absoluto durante 1 minuto.
2. Dejar secar los portaobjetos.
3. Sumergir los portaobjetos en una solución de
Giemsa en proporción de una parte de ésta con 30-50 partes de agua amortiguada (pH 6.8 a 7.2). Teñir durante un lapso de 30 minutos a 1 hora.
4. Mojar brevemente los portaobjetos con agua
amortiguada, después se escurren con rápidez y se dejan secar al aire.
