TÉCNICAS DE BIOLOGÍA M0LECULAR APLICADAS EN ANATOMÍA PATOLÓGICA

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TÉCNICAS DE BIOLOGÍA M0LECULAR

APLICADAS EN ANATOMÍA PATOLÓGICA

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Título original: Técnicas de Biología Molecular aplicadas en Anatomía Patológica Autores: José Ángel Alzueta. T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología

Rogelio Soler Peinado. T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA

C/ Armengual de la Mota 37 Oficina 1 29007 Málaga Teléfono/fax 952 61 54 61 www.fesitessandalucía.es ISBN: 978-84-694-4221-0

Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas Edición Octubre 2011

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ÍNDICE

UNIDAD DIDÁCTICA I

PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO

7 1.1 Sistema de Cursos a Distancia

9 1.2 Orientaciones para el estudio

10 1.3 Estructura del Curso

12 UNIDAD DIDÁCTICA II

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

APLICADA EN ANATOMÍA PATOLÓGICA

15 2.1 Introducción

17 2.2 Estructura del ADN

18 2.3 Replicación del ADN

20 2.4 Enfermedades provocadas por errores genéticos.

20 2.5 Técnicas o métodos usados en biología molecular

21 2.6 Hibridación por sondas

22 2.7 Indicadores para el uso de sondas o pruebas en el laboratorio

22 2.8 Técnicas de amplificación

23 2.9 Técnicas y componentes de la pcr

24 2.10 Falsos positivos debidos a la contaminación

25 2.11 Conclusiones

25 UNIDAD DIDÁCTICA III

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

APLICADAS A LA HISTOPATOLOGÍA

27 3.1 Introducción

29 3.2 Aplicaciones en Anatomía Patológica

29 3.3 Obtención del ADN y separación de fragmentos de ADN.

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UNIDAD DIDÁCTICA IV

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

EN FASE LÍQUIDA Y CON MEMBRANA

35 4.1 Introducción

37 4.2 Métodos de Membrana

37 4.3 Blot invertido (BI)

39 4.4 El Dot/Spot Blot (DB)

39 4.5 Hibridación Sandwich (HS)

39 4.6 Hibridación Northern

39 4.7 Métodos de hibridación en la fase líquida

40 4.8 Métodos de amplificación genómica

40 4.9 Técnicas moleculares en el diagnóstico de la ETS

44 UNIDAD DIDÁCTICA V

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR IN SITU

49 5.1 Hibridación in situ

51 5.2 PCR in situ

52 5.3 Técnica mixta de amplificación LCR

54 5.4 Métodos de detección

55 5.5 Ligase Chain Reaction (LCR)

57 5.6 Variantes de la LCR

58 5.7 Conclusión

59 UNIDAD DIDÁCTICA VI

ANÁLISIS POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

61 6.1 Introducción

63 6.2 Componentes de la PCR

64 6.3 Adyuvantes de la PCR

66 UNIDAD DIDÁCTICA VII

FUTURAS TECNOLOGÍAS: BIOCHIPS

69 7.1 Aplicaciones de los biochips

71 7.2 Aplicaciones de los biochips

72 7.3 Secuenciación del ADN empleando microarrays

73 7.4 Citogenética

76 UNIDAD DIDÁCTICA VIII

TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE ADN EN GENÉTICA FORENSE

81 8.1 Evolución de las técnicas de estudio de los poliformismos DE ADN

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UNIDAD DIDÁCTICA IX

SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DEL ADN

87 9.1 Secuenciadores automáticos en geles / equipamiento

89 9.2 Reacción en cadena de la Polimerasa

92 9.3 Secuenciación de productos de PCR

93 9.4 Purificación del producto de PCR con columnas de Centricon‐100

94 9.5 Métodos clásicos de secuenciación

94 9.6 Secuenciación automática empleando el método enzimático

97 9.7 Secuenciadotes automáticos

99 9.8 Equipamiento

101 9.9 Glosario:

104 UNIDAD DIDÁCTICA X

105 NIVELES DE SEGURIDAD Y PELIGROSIDAD EN EL LABORATORIO

105 10.1 Seguridad en el Laboratorio de Anatomía Patológica

107 10.2 Niveles de seguridad

114 10.3 Tratamiento de residuos sanitarios

116 CUESTIONARIO

121 Cuestionario

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UNIDAD DIDÁCTICA I

PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO

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Técnicas de Biología Molecular aplicadas en Anatomía Patológica

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Presentación, normas y procedimientos de trabajo.

Introducción

Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción.

Presentación

1. Sistema de Cursos a Distancia

En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de formación que se van a seguir para el estudio.

2. Orientaciones para el estudio.

Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente índice:

Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente.

3. Estructura del Curso

Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test.

1.1 Sistema de Cursos a Distancia

1.1.1 Régimen de Enseñanza

La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas clínicos.

La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos Especialistas/Superiores Sanitarios.

1.1.2 Características del Curso y del alumnado al que va dirigido

Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos, debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se ajustará a sus intereses y capacidades.

Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente previstas.

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Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología

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1.1.3 Orientación de los Tutores

Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas sus consultas y plantear las dificultades.

Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado.

El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo electrónico exclusivamente.

Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores:

 Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico.

 Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico.

1.2 Orientaciones para el estudio

Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento.

Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los conocimientos de la materia del Curso:

Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana.

 Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento.

 Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio suficiente para extender apuntes, etc.

 Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo de resumen o esquema.

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a) Fase receptiva.

 Observar en primer lugar el esquema general del Curso.

 Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante.  Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a

otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no útiles.

 Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas.

 Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad.

 Completar el esquema con el texto.

 Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos.

 Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema.

 Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos.

b) Fase reflexiva.

 Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la elaboración del tema que puede ser de gran ayuda.

 Seguir paso a paso el desarrollo de los temas.  Anotar los puntos que no se comprenden.

 Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de los casos resueltos.

c) Fase creativa.

En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional.

 Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla.

 Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestión de la prueba.

 Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario del manual.

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1.3 Estructura del Curso

1.3.1 Contenidos del Curso

 Guía del alumno.

 Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test.  FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario.  ENCUESTA de satisfacción del Curso.

1.3.2 Los Cursos

Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades Didácticas.

1.3.3 Las Unidades Didácticas

Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de material educativo distinto:

 Texto propiamente dicho, dividido en temas.  Bibliografía utilizada y recomendada.

 Cuestionario tipo test.

Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica.

El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario.

Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos resulta muy útil para el alumno, ya que:

 Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos básicos del tema.

 Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del tema.

 Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el resultado de las respuestas.

 Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo. Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de cada caso.

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1.3.4 Sistema de Evaluación

Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo máximo de entrega para que pueda quedar incluido en la edición del Curso en la que se matriculó y siempre disponiendo de 15 días adicionales para su envío. Los tutores la corregirán y devolverán al alumno.

Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la posibilidad de recuperación.

La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado.

Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envío de las respuestas para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso.

1.3.5 Fechas

El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la recepción del material del curso, una vez pasado este plazo conllevará una serie de gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar.

La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso.

1.3.6 Aprendiendo a enfrentarse a preguntas tipo test

La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos tienen de “se me dan los exámenes tipo test”.

Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico.

Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora.

Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test:

 Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test.

 El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide recordar un dato que se diferencia de otros por

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ser el más frecuente, el más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los que hay que estudiar.

Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolución de la pregunta.

La utilidad de las preguntas test es varia:

 Acostumbrarse a percibir errores de conceptos.  Adaptarse a los exámenes de selección de personal.

Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad.

1.3.7 Envío

Una vez estudiado el material docente, se contestará la encuesta de satisfacción, la cual nos ayudará para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya cumplimentado la evaluación, envíe las respuestas a la dirección indicada.

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UNIDAD DIDÁCTICA II

INTRODUCCIÓN A LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA

MOLECULAR APLICADA EN ANATOMÍA PATOLÓGICA

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2.1 Introducción

El paradigma genético del cáncer –“que los tumores surgen como consecuencia de la acumulación de mutaciones genéticas en una misma estirpe celular”- está ya ampliamente aceptado. El análisis funcional de los productos de los diversos genes tumorales indica que éstos juegan papeles fundamentales en procesos de transducción de señales implicadas en control de la proliferación, diferenciación, o muerte celular. Estos estudios han esclarecido también cómo la progresión normal del ciclo celular es el resultado de una interacción cuidadosamente balanceada entre múltiples reguladores codificados por protooncogenes y genes supresores de diversos tipos. No es sorprendente, por tanto, que cualquier alteración funcional a nivel de uno de estos múltiples reguladores produzca un ciclo celular alterado que eventualmente desemboca en una progresión neoplásica. Esta simplificación conceptual, derivada del análisis de tumores a nivel molecular, ha dado lugar a la definición del cáncer como una "enfermedad genética del ciclo celular".

Los espectaculares avances registrados durante los últimos años en el estudio de los mecanismos moleculares del cáncer han supuesto un gran impulso en la comprensión de los procesos de proliferación celular, tanto normal como tumoral, así como la identificación de los diferentes componentes que constituyen los eslabones de los mismos y la interrelación de sus respectivas actividades.

2.1.1 Laboratorio de patología molecular orientado al diagnóstico

El diagnóstico morfológico del estudio celular y tisular con hematoxilina-eosina precisa en muchas casos de otras técnicas, como tinciones especiales, microscopia electrónica, inmunohistoquímica, citometría de flujo, citogenética, biología molecular. Aportando el resultado de cada una de estas técnicas, aspectos y características distintas al estudio morfológico de las enfermedades. La suma de todos estos resultados, junto con los datos morfológicos, las pruebas complementarias y la clínica, justifican y apoyan su utilización.

Hoy hablamos del concepto de diagnóstico morfológico integrado, en el que se reflejan características citoestructurales de una lesión y aspectos citogenéticos y moleculares, que apoyan al diagnóstico o aportan datos pronósticos y predictivos.

Demostrada su utilidad para el diagnóstico y/o pronóstico, se incorporan en los laboratorios de Anatomía Patológica. Al igual que otras técnicas sofisticadas se ven influenciadas por el tipo de hospital, tanto por volumen como por tipo de casos a estudiar. El futuro de las técnicas en biología molecular y citogenética corre la misma suerte que otras técnicas hoy imprescindibles como la Inmunohistoquímica.

Día a día la aplicación crece, se centra en ayuda en el diagnóstico y pronóstico de la patología oncológica tanto en tumores esporádicos, como en el diagnóstico precoz del cáncer familiar, en el estudio de enfermedad mínima residual y de micrometástasis, en patología infecciosa identificando agentes etiológicos y en la identificación de enfermedades y trastornos genéticos.

Las técnicas básicas utilizables en Anatomía Patológica son la PCR, RT-PCR, Souther blot y están estandarizadas no presentando dificultades en su realización, su coste no supera a la de un panel de anticuerpos de inmunohistoquímica.

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La puesta en marcha de un laboratorio de biología molecular, dentro del Servicio de Anatomía Patológica requiere del estudio previo del espacio para el mismo, de dotarlo de la instrumentación básica y de personal que realizará dichas técnicas.

2.1.2 Espacios

El laboratorio de biología molecular requiere de tres espacios separados, una zona de pretratamiento para realizar la manipulación de las muestras y la extracción de ácidos nucleicos, espacio que puede estar compartido en el laboratorio general. Una segunda zona limpia y separada del resto del laboratorio en donde prepararemos y realizaremos la amplificación y las técnicas de PCR. Y como tercera la zona oscura para realizar la electroforesis y la lectura de geles.

2.1.3 Instrumentación

La instrumentación básica puede ser compartida con otras técnicas; como material dispondremos al menos de:

 Frigorífico y congelador  Baño termostático

 Centrifuga y Microcentrifuga  Campana de flujo laminar

 Pipetas automáticas de seguridad  Termociclador

 Aparato de electroforesis

 Lector digital o fotográfico de geles

2.1.4 Personal

Profesionales Técnicos Superiores en Anatomía Patológica y Citología. En relación al personal adecuado y necesario para la realización, interpretación y puesta al día de las técnicas de biología molecular, debemos considerar una experiencia mínima en dichas técnicas. Se precisa capacidad de interpretación de los resultados y amplia resolución de problemas.

2.2 Estructura del ADN

La molécula de ADN está constituida por dos largas cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN, se mantienen unidas entre sí porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan enfrentadas.

Las cuatro bases nitrogenadas del ADN se encuentran distribuidas a lo largo de la "columna vertebral" que conforman los azúcares con el ácido fosfórico en un orden particular. (la secuencia del ADN). La adenina(A) se empareja con la timina (T), mientras que la citosina (C) lo hace con la guanina. Las dos hebras de ADN se mantienen unidas por los puentes hidrógenos entre las base.

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19 La estructura de un determinado ADN está definida por la "secuencia" de las bases nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la información genética del ADN. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una cadena en el ADN es, por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las instrucciones del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir, secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético.

La estructura en doble hélice del ADN, con el apareamiento de bases limitado ( A-T; G-C ), implica que el orden o secuencia de bases de una de las cadenas delimita automaticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena , se deduce inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria. El modelo de la doble hélice de Watson y Crick ha supuesto un hito en la historia de la Biología.

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2.3 Replicación del ADN

Es la capacidad que tiene el ADN de hacer copias o réplicas de su molécula. Este proceso es fundamental para la transferencia de la información genética de generación en generación.

Las moléculas se replican de un modo semiconservativo. La doble hélice se separa y cada una de las cadenas sirve de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria. El resultado final son dos moléculas idénticas a la original.

2.4 Enfermedades provocadas por errores genéticos.

La disposición exacta (secuencia) de las bases de A, C, G y T en una cadena de ADN es la receta que codifica la secuencia exacta de una proteína. Si las recetas tienen bases adicionales o mal escritas, o si se suprimen algunas, la célula puede elaborar una proteína incorrecta, o bien demasiada o demasiado poca de la correcta. Estos errores resultan muchas veces en enfermedades. En algunos casos, una sola base fuera de lugar es suficiente para provocar una enfermedad.

Los errores en nuestros genes, nuestro material genético, son los responsables de aproximadamente entre 3.000 y 4.000 enfermedades hereditarias, entre las que se incluyen la enfermedad de Huntington, la fibrosis quística y la distrofia muscular de Duchenne. Aún más, actualmente se sabe que las alteraciones genéticas desempeñan una función en el cáncer, en las enfermedades cardíacas, en la diabetes y en muchas otras enfermedades comunes.

Los defectos genéticos aumentan el riesgo de que una persona desarrolle estos trastornos más comunes y complejos. Las enfermedades mismas son el producto de interacciones entre dichas predisposiciones genéticas y factores medioambientales, entre los que se incluyen la dieta y el estilo de vida.

Algunos expertos consideran que la mitad de las personas desarrollará una enfermedad que tiene un componente genético.

La comprensión del código genético no condujo directamente a los investigadores a los genes de las enfermedades. Su capacidad para descifrar los mensajes genéticos

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21 encapsulados en el ADN se vio obstaculizado por el extraordinario número de dichos mensajes transportados en el ADN de cada célula.

Una célula humana (excepto las células sexuales, de espermatozoides y óvulos, y algunas células sanguíneas que no tienen núcleo) contiene alrededor de 1,80 metros de moléculas de ADN enroscadas estrechamente y empaquetadas dentro de 46 cromosomas, que son estructuras con forma de huso que se encuentran en el núcleo de la célula y están formadas por ADN recubierto de proteínas.

Este ADN está formado por 3.000 millones de pares de bases. Si se imprimieran, esos pares de bases llenarían más de 1.000 directorios telefónicos. Sin embargo, cuando los investigadores trataron de dividir las moléculas de ADN en partes más manejables, terminaron con un caos de fragmentos aleatorios en los que se había perdido el orden del ADN original.

Los 46 cromosomas del núcleo de una célula humana guardan alrededor de 1,80 metros de ADN, el “mapa” genético de cada individuo, en este caso un hombre como denota la designación XY. Este ADN está formado por hasta 3.000 millones de pares de bases, información suficiente para llenar más de 1.000 directorios telefónicos.

2.5 Técnicas o métodos usados en biología molecular

Las ventajas de las técnicas moleculares han sido ampliamente publicitadas en los últimos 7 años, lo que sin duda ha aumentado la presión en los laboratorios clínicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades infecciosas, genéticas, oncológicas y neurológicas.

Actualmente existe una variedad de paquetes comerciales, especialmente en el área de las enfermedades infecciosas, que contienen todo lo necesario para realizar un examen, lo que obviamente ha estimulado a los laboratorios a incluir técnicas de biología molecular en el diagnóstico clínico. Sin embargo, y como veremos más adelante, estos métodos moleculares no están exentos de problemas tanto en su ejecución como en su interpretación, por lo que debieran estar reservados para aquellos laboratorios con personal familiarizado con estas técnicas y que tengan la infraestructura necesaria para su realización.

En general, las técnicas más usadas son las de detección directa por hibridación, usando un segmento de ADN marcado, y las técnicas de amplificación. Estas últimas han tenido una verdadera explosión en su metodología, como lo demuestra el que en la actualidad existan por lo menos seis técnicas diferentes, aunque todas tienen como finalidad la amplificación de un segmento de ADN o ARN que ha sido seleccionado como un marcador para una determinada patología.

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2.6 Hibridación por sondas

Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados con enzimas, sustratos antigénicos, quimioluminiscencia o radioisópotos, los que se pueden unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico. Estas sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o ARN seleccionado, que puede tener de veinte a miles de bases de largo. Las sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucleótidos y pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad por instrumentos comerciales actualmente disponibles.

Las sondas de oligonucleótidos tienen la ventaja de hibridar más rápidamente a las moléculas blanco (target) y pueden, bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico.

Existen varias condiciones que afectan el proceso de unión o hibridación entre la sonda y el segmento blanco, como temperatura, concentración de sal y pH de la reacción. Por ejemplo bajas concentraciones de sal y altas temperaturas permiten que sólo el segmento blanco se una a la sonda, mientras que, por el contrario, si la temperatura de la reacción es baja, segmentos no complementarios pueden unirse a la sonda. Por lo tanto, las condiciones deben ser cuidadosamente controladas para evitar falsos positivos.

La detección de la hibridación puede hacerse de varias maneras, dependiendo del método usado para marcar la sonda. Por ejemplo, si se usa una enzima, la hibridación se puede visualizar por un cambio de color y si se usa quimioluminiscencia, por emisión de luz un luminómetro.

2.7 Indicadores para el uso de sondas o pruebas en el

laboratorio

Las pruebas de hibridación a menudo disminuyen el tiempo necesario para identificar organismos fastidiosos. Además, permiten que los laboratorios puedan aumentar el número de patógenos que pueden ser identificados. En el estudio de costos, debe considerarse que aunque los exámenes que usan sondas son más caros que los métodos tradicionales, el hecho de tener un resultado en un mínimo de tiempo puede significar un ahorro para el paciente y el hospital.

Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de una muestra clínica (expectoración, orina, etcétera) o para confirmar la identificación de un cultivo que por otros métodos tarda varios días (Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etcétera). Además, las sondas pueden ser usadas para hibridación in situ para evaluar la respuesta del huésped a un agente infeccioso en particular y también para determinar la extensión de la infección mediante el estudio de muestras de tejidos de varios órganos.

La Tabla 1 enumera algunos de los exámenes con sondas disponibles comercialmente. Muchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y sólo se diferencian en la secuencia a la cual está dirigida la sonda.

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Técnicas de Biología Molecular aplicadas en Anatomía Patológica 23 Tipo de prueba Organismo Detección directa de la muestra Bacterias Streptococci grupo A Legionella pneumophila Chlamydia trachomatis Neisseria gonorrheae Tricomonas vaginalis Virus Papiloma humano Confirmación de cultivo Bacteria Enterococci Streptococci grupo B Haemophilus influenzae Listeria monocytogenes Neisseria gonorrhoeae Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium avium Otras especies de mycobacteria Hongos Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Blastomyces dermatidis Coccidioides immitis Virus Papiloma humano

Tabla 1 ejemplos de organismos que pueden ser detectados por medio de sondas de ácidos nucleicos disponibles comercialmente.

2.8 Técnicas de amplificación

Las técnicas de hibridación pueden tener una baja sensibilidad debido a que en algunos casos existe una sola copia de la secuencia en blanco. Por esta razón las técnicas de amplificación, que pueden producir millones de copias de un determinado segmento de ADN o ARN, han tenido un impacto extraordinario en muchas áreas del diagnóstico clínico.

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Como fue mencionado anteriormente, existen varias técnicas de amplificación las cuales varían ligeramente en su método de amplificación. Unas de las técnicas de amplificación más usadas en la actualidad, tanto elaboradas en el propio laboratorio como comercialmente, es la reacción de la polimerasa en cadena o PCR. Otra técnica que ha sido evaluada para el diagnóstico es la reacción de la ligasa en cadena o LCR, en la cual pequeños segmentos amplificados son posteriormente ligados.

Ambas técnicas se encuentran disponibles comercialmente y pueden ser adquiridas en varios formatos de automatización. Otras técnicas de amplificación, la mayoría sin nombre traducido al español, son strand displacement amplificatión (SDA), isothermal RNA self sustaining sequence replication. reaction, nucleic acid sequence-based amplification (TMA) y la amplificación por QB replicasa.

2.9 Técnicas y componentes de la pcr

Esta técnica es una amplificación enzimática in vitro que resulta en una acumulación de la secuencia blanco (target). La PCR consiste de un número de ciclos cambios de temperatura que producen:

 separación de las hebras de ADN;

 unión del oligonucleótido (partidor o primer) al segmento ADN;

 extensión que permite a la ADN polimerasa sintetizar el resto de la hebra complementaria.

Estos ciclos se repiten habitualmente 30 ó 40 veces para obtener un producto que puede ser fácilmente detectado por medio de un gel de agarosa o por hibridación en microplacas.

Con esta técnica, prácticamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicación clínica que podría tener la detección de un determinado organismo, así como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparación con las técnicas tradicionales.

En general, las técnicas de diagnóstico molecular están indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos períodos de incubación.

Un organismo que cumple los requisitos descritos es el Mycobacterium tuberculosis y es por ello que existen numerosas técnicas de amplificación disponibles comercialmente, algunas de ellas aprobadas por la oficina de Administración de Drogas y Alimentos (FDA) en EE.UU. La sensibilidad de estos exámenes en expectoración varía de 85 a 95% y la especificidad entre 95 y 97%.

Otros organismos que pueden ser detectados directamente de una muestra clínica mediante técnicas de amplificación comerciales son Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Candida, Tricomonas, virus VIH, virus herpes, virus hepatitis C, enterovirus y virus papiloma. Actualmente se encuentran en evaluación exámenes de amplificación para una variedad de otros organismos.

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2.9.1 Interpretación

Debido a la alta sensibilidad de estos exámenes, la interpretación es en algunos casos difícil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todavía ser amplificado. Además, la presencia de un organismo en una determinada muestra no siempre significa infección.

Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinación de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo

2.10 Falsos positivos debidos a la contaminación

Uno de los problemas más graves que enfrenta las técnicas de amplificación para su aplicación en diagnóstico, es la falsa positividad debido a la contaminación con ácidos nucleicos, la que puede provenir de tres frecuentes:

 de otras muestras clínicas que contienen un número elevado se secuencias blanco (contaminación entre muestras),

 de la contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores

 y la más grave de todas, de la acumulación de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia.

Por estas razones, los laboratorios que usan técnicas de amplificación deben tener normas estrictas de control de calidad. El Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico de USA tiene un documento de regulación provisorio que es bastante especifico.

En nuestro país no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mínimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el procesamiento de la muestra y otro para la amplificación y tener además el personal adecuado para realizar estas técnicas.

2.11 Conclusiones

A pesar del innegable poder de las técnicas de biología molecular en el diagnóstico, es erróneo pensar que van a reemplazar a los exámenes convencionales para detección de agentes patógenos. Sin embargo, la capacidad de estas técnicas para proporcionar un diagnóstico definitivo en corto tiempo tendrá sin duda, un efecto en el manejo del paciente y nos ayudarán a entender mejor la patogénesis de la infección.

Aunque existe la posibilidad de usarlas en todos los microorganismos, las técnicas de diagnóstico molecular tendrán un mayor impacto en algunos patógenos. Es así que exámenes rápidos para la identificación de Micobacterias y la detección de resistencia a las drogas de primera línea, dará la base para que se tomen más oportunamente las decisiones clínicas adecuadas. También, la identificación rápida de virus Herpes simplex en el LCR de un paciente con encefalitis dará la oportunidad de comenzar oportunamente la terapia adecuada, eliminando otros procedimientos más invasivos.

A medida que se automaticen, con un costo menor y con regulaciones más precisas, los laboratorios podrán incorporar estos exámenes en el funcionamiento de rutina y los facultativos podrán familiarizarse aún más con la interpretación y con las ventajas que proporcionan las técnicas de biología molecular en el diagnóstico.

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UNIDAD DIDÁCTICA III

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

APLICADAS A LA HISTOPATOLOGÍA

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3.1 Introducción

Este conjunto de técnicas, que han sido tomadas tanto de la genética molecular como de la bioquímica, nos permite analizar fenómenos biológicos y patológicos en el nivel molecular. Al igual que la microscopía electrónica y la inmunohistoquímica, estas técnicas pueden aplicarse para refinar el diagnóstico en Anatomía Patológica.

Pueden enumerarse las siguientes técnicas: hibridación in situ, reacción en cadena de polimerasa (PCR), in situ-PCR, análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción, Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las técnicas mencionadas pueden aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia e incluso muestras citológicas.

La técnica de Southern blot permite el análisis de ADN genómico o fragmentos definidos de ADN después de digestión con endonucleasas de restricción. La técnica de Northern blot permite estudiar ARN en forma análoga. El Western blot es una técnica inmunológica derivada , que se utiliza para analizar antígenos proteicos. Las proteínas se separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana sólida o membrana o filtro.

La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con sondas marcadas radioactivamente o con enzimas

3.2 Aplicaciones en Anatomía Patológica

Las aplicaciones actuales de la biología molecular para el diagnóstico clínico son muy variadas:

 Diagnóstico y clasificación de neoplasias y establecimiento de un pronóstico

 Detectar reordenamientos de genes

 Detectar reordenamientos en tumores humanos con anomalías consistentes cariotípicas

 Detectar reordenamientos moleculares/anomalías de expresión genética en ausencia de alteraciones del cariotipo

 Estudio de la estructura/expresión de oncogenes

 Detección de amplificación genética/resistencia a drogas  Diagnóstico de cell lineage en base a la expresión genética

3.3 Obtención del ADN y separación de fragmentos de ADN.

A un laboratorio de Biología Molecular de tipo clínico llegan distintos tipos de muestras, cada una con sus peculiaridades a la hora de analizar y obtener su ADN. “A priori” se plantean dos situaciones diferentes.

Si lo que se pretende es conocer la ubicación física del ADN/ARN de interés en un corte histológico se deberá proceder a estudios “in situ”, mientras que si no es necesario conocer dicha ubicación será suficiente con obtener el ADN celular en solución.

El ADN en solución es una mezcla de ADN mitocondrial, nuclear eucariota y viral/bacteriano si estuvieran presentes en la muestra virus/bacterias.

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Centrándose en la obtención de ADN en solución existen diferentes métodos de lisis: lisis diferencial, lisis neutra... Una vez realizada la lisis, la solución de ADN obtenida no siempre es apta para utilizar en las reacciones posteriores de amplificación, restricción, marcaje o secuenciación, por lo que es conveniente por un lado separar el ADN del resto de macromoléculas que lo acompañan, preferentemente proteínas, proceso que suele realizarse con ayuda de solventes orgánicos (fenol y cloroformo) y, por otro separar el ADN de aquellas moléculas de pequeño tamaño con actividad inhibidora presentes en la solución de ADN.

El ADN una vez limpio de proteínas y/o pequeñas moléculas puede ser utilizado directamente, si bien en la mayoría de las situaciones es necesario concentrarlo mediante ultrafiltración o precipitación con alcohol.

El sistema de valoración de la concentración de ADN será función de cuales han sido los tratamientos y, por tanto, del grado de pureza del ADN obtenido.

Pueden emplearse desde métodos altamente sensibles y exactos como la espectrofotometría y fluorometría, hasta métodos aproximativos, tales como la comparación del grado de fluorescencia respecto a un control de concentración conocida.

Una vez conocida la concentración del ADN, éste será utilizado básicamente con el propósito de amplificar determinadas secuencias del mismo mediante PCR.En ciertos casos la simple detección del fragmento amplificado tiene valor diagnóstico por sí mismo. La metodología empleada para la detección puede ser:

 Separación y visualización de dicho fragmento en geles adecuados de agarosa o poliacrilamida (Ej. detección de infección por virus de la hepatitis, SIDA, HPV oncogénicos...). En otros casos el valor diagnóstico se obtiene por comparación de la movilidad del fragmento en un gel, respecto a un fragmento de características conocidas (Ej. movilidad de un exon mutado del gen supresor p53 en relación al mismo exon normal...), o bien,

 _{Detección del fragmento amplificado mediante ELISA con revelado} colorimétrico o quimioluminiscente.

Por el contrario, en otros casos el valor diagnóstico se alcanza una vez que el fragmento amplificado se analiza mediante cualquiera de las siguientes técnicas:

 _{Corte con enzimas de restricción. Los fragmentos generados en la} restricción se separan en geles de agarosa o poliacrilamida adecuados (Ej. Tipificación HPV, genotipado ApoE...).

 _{Hibridación. Los fragmentos generados en el PCR se separan en gel de} agarosa, se transfieren a un soporte adecuado (nitrocelulosa, nylon), y finalmente se hibridan con un ADN sonda marcado (Ej. Tipificación de los genes HLA Clase II...).

 _{Secuenciación. Los fragmentos generados durante la reacción de} secuenciación se separan en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (Ej. Secuenciación de genes mitocondriales mutados implicados en ciertas enfermedades...).

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3.4 Técnicas de análisis genético

Seguidamente describiremos las técnicas genéticas, tanto citogéneticas como estrictamente moleculares, sus características, ventajas y limitaciones, sólo de aquellas que se han incorporado como rutina diagnóstica: cariotipo, hibridación in situ con fluorescencia (FISH convencional), y reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y de algunas de las que todavía son utilizadas como investigación: hibridación genómica comparada (CGH), cariotipo espectral (SKY-FISH) y multiplex-FISH (M-FISH).

3.4.1 Análisis Citogénico

3.4.1.1 Citogenética convencional (cariotipo de bandas G)

El análisis citogenético convencional consiste en el estudio de las alteraciones cromosómicas en las metafases de las células neoplásicas obtenidas tras el cultivo "in vitro", a corto plazo y sin mitógenos de células de médula ósea, sangre periférica, ganglios, biopsias, etc. El estudio de la morfología de los cromosomas, teñidos fundamentalmente con bandas G (Tripsina-Giemsa), permite detectar en un único experimento, tanto las alteraciones numéricas (monosomías, trisomías, etc.), como las estructurales (translocaciones, inversiones, deleciones, etc.) presentes en todo el genoma.

3.4.1.2 Citogenética molecular (hibridación "in situ" con fluorescencia)

Las técnicas de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se basan en la hibridación de una sonda de ADN marcada con una sustancia fluorescente sobre su secuencia complementaria del genoma, bien en la metafase cromosómica o en el núcleo en interfase. Las técnicas de FISH vienen utilizándose desde los años 8028, si bien no se han incorporado en todos los laboratorios de genética como rutina. La alta sensibilidad y especificidad del FISH y la rapidez de los ensayos han hecho de esta técnica una importante estrategia diagnóstica con numerosas aplicaciones. Por otra parte, otras técnicas derivadas del FISH han progresado hasta tal punto que hoy es posible, como veremos más adelante, utilizar simultáneamente 24 sondas de pintado cromosómico, consiguiendo identificar cada cromosoma por su color. Entre las técnicas derivadas del FISH convencional, cabe destacar, la hibridación genómica comparada (CGH), de enorme utilidad en tumores sólidos y el cariotipo multicolor (SKY-FISH y M-FISH). Todas ellas, constituyen una nueva disciplina a la que se ha denominado "citogenética molecular", que complementan, pero nunca excluyen al análisis citogenético convencional (cariotipo de bandas G).

3.4.1.3 FISH convencional

Los dos componentes principales de la técnica de FISH convencional son la sonda de ADN marcada con fluorescencia y la secuencia diana en la muestra tumoral para la cual es específica. Es muy importante destacar que no es una técnica de búsqueda de nuevas alteraciones cromosómicas, sino que detecta únicamente aquello que buscamos. El resto del genoma permanece oculto.

Podemos utilizar sondas de ADN de distintos tipos: centroméricas (marcan únicamente las zonas centrómericas), de pintado cromosómico (marcan todo un cromosoma) o de secuencias específicas de locus ( marcan regiones cromosómicas de secuencia única).

Esta técnica complementa perfectamente a la citogenética convencional en todas aquellas situaciones en las que no ha sido posible realizar un cariotipo: al disponer de metafases de poca calidad, o no haber obtenido metafases, o bien en los casos en los que

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las alteraciones cromosómicas asociadas a un diagnóstico son crípticas no visibles en el cariotipo, como el caso de la t(12;21) en leucemia aguda linfoblástica infantil.

3.4.1.4 CGH (hibridación genómica comparada)

Como ya se ha mencionado, uno de los mayores problemas a los que se enfrenta la citogenética convencional, es la ausencia de metafases y su gran ventaja reside en ser una técnica que permite analizar todo el genoma. La técnica de FISH convencional ha resuelto el primer problema, ya que permite analizar núcleos en interfase, pero en cambio su gran limitación es que no es una técnica de screening, como el cariotipo, ya que sólo detecta las alteraciones que buscamos. A principio de los 90, y con especial aplicación en tumores sólidos, en donde obtener metafases de calidad es a menudo complicado, se describió una nueva técnica de citogenética molecular: la hibridación genómica comparada (CGH). Esta técnica emplea ADN del tumor y, además, no analiza metafases, obviando la necesidad de células en crecimiento.

Esta técnica derivada del FISH se basa en la hibridación competitiva de dos ADNs, (tumoral y control normal) marcados con distintos fluorocromos, sobre cromosomas normales. En resumen: se marca el ADN del tumor con un fluorocromo verde y un ADN normal (control) con un fluorocromo rojo. Ambos ADNs se mezclan en cantidades equimolares y se realiza una hibridación in situ sobre cromosomas metafásicos normales. Ambos ADNs compiten por hibridar en los mismos lugares cromosómicos. En condiciones normales (tumor sin alteraciones genéticas), como la cantidad de ADN marcado en rojo y verde es la misma, el resultado final son cromosomas amarillos (mezcla 1:1 de rojo y verde). En condiciones patológicas, si el tumor contiene alguna ganancia cromosómica, la cantidad de ADN tumoral disponible para hibridar es mayor, y la hibridación de esa zona resultará en una mayor proporción de fluorocromo del tumor (verde). Al contrario, si el tumor contiene una deleción (pérdida), la región delecionada del tumor aparecerá en rojo, ya que habrá más cantidad de ADN normal (rojo) para hibridar en esa región cromosómica. La CGH permite, por tanto, la detección de ganancias y pérdidas de regiones cromosómicas en todo el genoma del tumor por la comparación de las intensidades de las señales de hibridación.

La CGH ha contribuido significativamente al conocimiento actual de las alteraciones genómicas en las neoplasias humanas. Además de definir patrones de ganancias y pérdidas específicas de tumor, proporciona información para la identificación de nuevos genes implicados en el cáncer. Actualmente esta técnica se utiliza sobre todo para detectar alteraciones cromosómicas en tumores sólidos, donde la obtención de metafases presenta muchas dificultades técnicas. En sólo 8 años desde su aparición, se han publicado más de 3.900 trabajos de CGH en tumores, de los que sólo 1/10 corresponden a leucemias y linfomas. En neoplasias hematológicas, la CGH está casi restringida a síndromes linfoproliferativos crónicos, ya que en éstos, el índice mitótico de las células tumorales es generalmente muy bajo.

Todas las alteraciones cromosómicas, ganancias y pérdidas, descritas en cáncer por CGH pueden ser consultadas en la base de datos actualizada de la Universidad de Helsinki

(http://www.helsinki.fi/~lgl_www/CMG.html).

3.4.1.5 Cariotipo multicolor (SKY‐FISH y M‐FISH)

El cariotipo espectral (SKY-FISH)38 y el multi-FISH (M-FISH) son técnicas de citogenética molecular desarrolladas recientemente, y de momento sólo se utilizan en el campo de la investigación. Su fundamento técnico es sencillo. En resumen: consiste en

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33 marcar el ADN de cada cromosoma con uno o varios fluorocromos, de manera que el espectro de emisión de cada cromosoma sea único y diferenciable de los demás. Esta técnica, por tanto, pinta a cada cromosoma de un color. Con el "cocktail" de 24 sondas de pintado cromosómico obtenido tras el marcaje, se hibrida sobre los cromosomas de las metafases del tumor, el cromosoma anómalo aparecerá no uniforme, sino con los colores de los cromosomas que intervienen en la translocación. Por tanto, es una forma de realizar un cariotipo, pero teñido no con bandas G sino con colores, de forma que podamos clasificar las alteraciones de forma unívoca.

El cariotipo multicolor se ha mostrado muy útil en neoplasias hematológicas, donde no es difícil obtener metafases tumorales. Se han podido caracterizar correctamente translocaciones complejas, y también detectar alteraciones cromosómicas crípticas en cariotipos aparentemente normales. Esto ha permitido identificar un gran número de nuevas alteraciones cromómicas (Fig. 1), lo que ha facilitado la búsqueda de nuevos genes implicados. Su uso en tumores sólidos es más limitado por la necesidad de obtener metafases de calidad, aunque de todo lo expuesto, es la única técnica que permitirá averiguar el origen de las múltiples alteraciones cromosómicas que habitualmente aparecen en los cariotipos de tumores sólidos. No obstante, las aplicaciones de esta técnica son crecientes, y ya son cerca de 700 casos las neoplasias humanas analizadas por SKY-FISH, de las cuales 410 son leucemias y linfomas y 146 tumores sólidos. La dirección: http://www.spectral-imaging.com, proporciona información técnica, un sumario de aplicaciones y una lista actualizada de publicaciones relevantes sobre el cariotipo espectral.

Las mejoras técnicas del cariotipo multicolor avanzan con gran rapidez y ya se está optimizando el M-FISH con bandas multicolor.

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3.4.2 Análisis molecular

La técnica que habitualmente se emplea, a nivel no sólo diagnóstico, sino en la monitorización de pacientes con neoplasias es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Cuando los genes son de gran tamaño con puntos de rotura variables o en aquellos casos de genes muy promiscuos (MLL y BCL6, entre otros), se prefiere el Southern Blot o el FISH convencional.

3.4.2.1 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Desde su descripción en 1985 por Kary Mulis, la PCR probablemente representa uno de los más importantes avances metodológicos en biología molecular. Esta técnica, que tiene multitud de aplicaciones, permite amplificar secuencias específicas de ADN o ARN multiplicando por 106 el número de copias que podemos obtener de un determinado fragmento de ADN.

Una de las aplicaciones más frecuentemente empleadas de la PCR en neoplasias es detectar translocaciones. La caracterización molecular de las translocaciones cromosómicas observadas en el cariotipo y asociadas a determinados tipos de tumor, ha permitido la identificación de los genes responsables. La posterior clonación y secuenciación de dichos oncogenes permiten el estudio de las translocaciones a nivel molecular, mediante el análisis de ADN o fundamentalmente ARN con la técnica de la RT-PCR (RT-PCR reversa).

Un ejemplo característico sería analizar la reordenación Bcl2-IgH asociada a linfoma folicular. Actualmente, su uso es necesario como complemento al cariotipo o al FISH convencional en el diagnóstico y en la monitorización de pacientes con neoplasias.

Aunque la mayor parte de los análisis mediante PCR son cualitativos, indicando sólo ausencia o presencia de la alteración, en la monitorización de la respuesta al tratamiento o de la EMR es importante la cuantificación de ésta mediante PCR en tiempo real (real-time PCR)45, en la que se detecta el producto específico a medida que se produce, de manera que la comparación de su nivel de amplificación con los estándares adecuados proporciona una medida cuantitativa del grado de afectación.

Además de la PCR utilizada en la rutina diagnóstica para la detección de translocaciones, existen otras muchas técnicas moleculares de gran interés en la genética del cáncer. Entre ellas, el análisis de mutaciones de genes supresores tumorales y oncogenes o la tecnología de microarrays que, aunque de momento, se utilizan como investigación, en un futuro no muy lejano con la aplicación de nuevos sistemas robotizados como los chips o microarrays de ADN, permitirán el análisis simultáneo de un gran número de genes y de sus niveles de expresión en una muestra. La aplicación de estos nuevos sistemas diagnósticos permitirá establecer terapias específicas, de acuerdo a la alteración molecular detectada.

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UNIDAD DIDÁCTICA IV

TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

EN FASE LÍQUIDA Y CON MEMBRANA

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4.1 Introducción

Las técnicas de biología molecular que utilizan membranas o las que utilizan sondas y ADN diana en medio líquido están poco extendidas en los laboratorios de Anatomía Patológica. La razón fundamental es que, a pesar de sus muchas ventajas, no permiten visualizar la morfología del espécimen.

4.2 Métodos de Membrana

Describiremos los más utilizados en Anatomía Patológica:

4.2.1 Hibridación in situ con filtro (HISF)

Este método no precisa de extracción de ADN y analiza muestras obtenidas por raspado o con torunda o cepillo. Las células se aplican directamente sobre un filtro el cual se trata con sustancias alcalinas para la lisis celular y la desnaturalización del ADN. El método HISF es de muy fácil ejecución, rápido y barato es ,sin embargo, poco específico y, a menudo, resulta difícil separar las señales positivas del fondo. Su uso se limita a trabajos con gran cantidad de especimenes.

Hibridación Southern Blot (SB)

O hibridación con sondas. Necesita de la extracción del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminación de ARN y proteínas de la misma por digestión enzimática. Con la aplicación de endonucleasas de restricción-la enzima Pst I es la mas utilizada, pues corta los genomas de HPVs en fragmentos de diferentes tamaños ofreciendo un patrón característico en el gel de agarosa-el ADN se rompe, realizándose una separación electroforética de los fragmentos en gel de agarosa los cuales pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una membrana realizándose una hibridación. El SB es el método de referencia actual para el tipaje de HPVs. La especificidad de esta técnica es superior a cualquier otra debido a la purificación extra del ADN por electroforesis. Además es el único método que permite conocer si el genoma viral está en situación episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su gran complejidad técnica, duración de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados, puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy notablemente.

Esta técnica consta básicamente de las siguientes etapas:

 Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un ADN de alta molecularidad.

 Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa.

 Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados.

 Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o nylon y fijación de las mismas por medio de calor (80ºC).

 Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares de unión inespecíficos que pudiera haber en la membrana.

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 Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.

 Revelado en placa radiográfica e interpretación de los resultados. El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:

- Sondas Mono-locus (SLP): son específicas para una región de un

determinado cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucleótidos y presentan mayor variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado se observan una o dos bandas por individuo, según sea homocigoto o heterocigoto. El patrón de bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o “DNA profiling”

- Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatélites presentes

en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucleótidos que se repiten múltiples veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas por persona. Este patrón de múltiples bandas se conoce como huella genética multilocus o “DNA fingerprint”.

Sondas multilocus Sondas unilocus

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes con respecto a una serie de parámetros como son:

 Información aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad discriminativa al aparecer múltiples bandas. No obstante, las mono-locus son más específicas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de mayor tamaño.

 Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el

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39 caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento complementario a la sonda esté intacto.

 Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso sobre el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las mono-locus son exclusivas de ADN humano.

4.3 Blot invertido (BI)

Es una variante del SB. El ADN celular es marcado e hibridado con diferentes DNA-HPVs, previamente digeridos y dispuestos en un filtro. El BI requiere una reacción individual para cada espécimen, de sensibilidad inferior al SB (detecta 10 copias HPV/célula), se suele utilizar para tipar muchos genotipos en un espécimen.

4.4 El Dot/Spot Blot (DB)

Consiste en la extracción del ADN celular total y en su desnaturalización, después se fija a una membrana por medio de presión negativa en un aparato manifold. También se puede realizar la desnaturalización en la misma membrana. Una vez realizada la hibridación se produce la autorradiografía, si se emplearon sondas calientes o el revelado enzimático, si se utilizaron frías. Con el DB se pueden analizar de una vez más de 100 especimenes mientras que el SB no admite más de 15. Uno de los problemas más importantes del DB es el "fondo" provocado por las hibridaciones inespecíficas. Este problema se puede minimizar con el uso de sondas de ARN ya que los híbridos ARN-ADN tienen una Tm superior a los ADN-ADN y las hibridaciones inespecíficas pueden eliminarse con la aplicación de ARNasa.

4.5 Hibridación Sandwich (HS)

No necesita extracción del ADN. Esta técnica utiliza una sonda con dos fragmentos separados, cada uno con una región complementaria con el ácido nucleico diana. Un fragmento se une al filtro y fija la secuencia específica de HPV al mismo. El segundo de los fragmentos está marcado y se fija al híbrido anclado en la membrana permitiendo su detección. La HS es un método con una especificidad estimada en 1-5 X 105 _{moléculas de} ADN HPV (1 a 5 veces mas que el DB) y muy sensible (3 veces el DB).La HS tiene varios inconvenientes, por una parte solo un tipo de HPV puede ser analizado por muestra, además, para obtener buenos resultados se necesita un volumen importante de muestra, superior a 5 X 105_(3).

4.6 Hibridación Northern

Se utiliza para la detección de RNA de HPVs. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel desnaturalizante que contiene formaldehído. Seguidamente se hibridan con sondas ARN antisense o ADN.

En todos los sistemas de hibridación descritos anteriormente el ácido nucleico diana está localizado en un soporte sólido, bien una membrana o una biopsia o extendido citológico, en los procedimientos que seguidamente describiremos el ácido nucleico se encuentra disuelto en un líquido.

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4.7 Métodos de hibridación en la fase líquida

En la hibridación en fase líquida, la sonda y el HPV diana están en solución. La hibridación en fase líquida ha sido utilizada para estimar la relación genética entre los diferentes HPVs, hoy día es de escaso uso.

El sistema de captación de híbridos también se realiza en medio líquido. Primero se desnaturaliza el espécimen, posteriormente se hibrida el HPV ADN con la correspondiente sonda. Los híbridos son capturados por la superficie del recipiente, cubierta con anticuerpos anti-híbridos que reaccionan con fosfatasa alcalina, haciéndose visibles tras la aplicación de un sustrato quimioluminiscente.

Los sistemas captación de híbridos están todavía en fase experimental, las pruebas iniciales permiten suponer una elevada sensibilidad y fácil manejo de la técnica.

4.8 Métodos de amplificación genómica

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utiliza una enzima, la polimerasa, para copiar a una determinada molécula de un ácido nucleico, habitualmente un ADN. La repetición de este proceso origina la producción de un gran número de moléculas hijas puesto que las nuevas moléculas son utilizadas por la polimerasa como moldes.

El proceso se inicia con la separación de las dos cadenas que configuran la molécula de ADN o por el calentamiento de solución en la que encuentra el ADN a unos 90º. Tras un descenso térmico de la solución se produce el "anillamiento" o hibridación de dos secuencias diferentes de nucleótidos, denominados "primers" o "cebadores" que delimitan el fragmento de ADN a amplificar. Con el concurso de la polimerasa se van añadiendo los nucleótidos presentes en la solución, fase denominada de "extensión" de los cebadores. Cada uno de estos ciclos se repite un número determinado de veces en un aparato denominado termociclador que permite ascensos y descensos térmicos programables.

El hecho de que las moléculas hijas sirven a su vez de molde para sintetizar nuevos ADNs produce un efecto multiplicador, produciéndose aproximadamente 106 copias de ADN en unos 30 ciclos. El ADN amplificado se puede detectar por medio de una reacción de hibridación o bien por medio de una electroforesis en gel con bromuro de etidio y una fuente de luz ultravioleta para su identificación.

El avance que hizo posible la técnica de la PCR fué el descubrimiento de polimerasas capaces de actuar a temperaturas elevadas. La primera de ellas fué la que contienen las bacterias denominadas Thermus aquaticus o polimerasa Taq y que se hallan en manantiales donde las aguas termales están a menudo a temperaturas superiores a 90º.

Antes del descubrimiento de esta polimerasa se realizaban técnicas de amplificación de ADN con el fragmento de Klenow como polimerasa ADN, pero esta enzima es inestable a temperaturas superiores a los 37º,con lo que era necesario añadir una dosis de enzima en cada ciclo de amplificación lo cual resultaba extraordinariamente tedioso a la par que se acumulaban grandes cantidades de enzima degradada.

El descubrimiento de la Taq polimerasa evitó la necesidad de añadir enzima en cada ciclo de amplificación, facilitando así la automatización del proceso.