Artículo Original
Resumen
1Cátedra de BiologíaDocentes Facultad de Ciencias Agrarias Universidad Nacional de Rosario
CC14, (S 2125 ZAA) Zavalla. Santa Fe. Argentina. 2Consejo de investigaciones de la UNR
E-mail: [email protected]
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo de regeneración directa de Spartina argentinensis a partir de meristemas. Se utilizaron dos tratamientos de desinfección de explantos: (1) aspersión con etanol 90% y (2) 1 minuto en etanol 90% y 20 minutos en hipoclorito de sodio (NaClO) al 2,5% más tensioactivo Tween 20. El medio utilizado fue el de Murashige and Skoog (MS) y las vitaminas propuestas por Gamborg, suplementados con diferentes concentraciones de reguladores vegetales 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) y BAP (6-bencilaminopurina). El mayor porcentaje de regeneración (23 %) se obtuvo en el medio sin agregado de reguladores. La presencia de altas concentraciones de auxinas (2,4-D) inhibió la proliferación celular en los meristemas, los cuales necrosaron y murieron. El análisis histológico mostró que la regeneración fue vía organogénesis directa. Esta es la primera mención en la literatura de un protocolo de regeneración directa de S. argentinensis, siendo una metodología válida que podría utilizarse en otras especies.
Palabras claves:
Cultivo in vitro, espartillares, organogénesis, regeneración directa.
MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS DE
Spartina argentinensis
A PARTIR
DE MERISTEMAS
1 1 1, 2
Summary
The objetive of this work was to develop a protocol for in vitro direct regeneration of Spartina argentinensis. Two explant disinfection procedures were compared: (1) 90% ethanol spray, and 1 minute inmersion in 90% ethanol plus 20 min inmersion in 2.5% sodium hypochlorite plus Tween 20. The medium used for regeneration of meristems was the Murashige & Skoog (MS) medium with vitamins according to Gamborg, supplemented with different concentrations of 2, 4 dichlorophenoxy acetic (2, 4-D) and bencyl aminopurine (BAP). The highest regeneration percentage (23%) was recorded in the medium without growth regulators. High concentrations of 2, 4-D inhibited cell proliferation in meristems, which became necrotic and died. Histological analysis showed that shoot regeneration was via direct organogenesis. This is the first time that a protocol for S. argentinensis in vitro plant direct regeneration is mentioned in the literature. This methodology could be used with other species.
Key words:
Cordgrass, in vitro culture, direct regeneration, organogenic culture.
Introducción
El género Spartina (Poaceae) comprende especies que crecen en ambientes salinos continentales o costeros, denominados marismas, ubicados en ambas márgenes del océano Atlántico y en las costas americanas del océano Pacífico. Son plantas perennes, cespitosas o rizomatosas, robustas, que pueden alcanzar hasta 3 m de altura, erectas, con espigas unilaterales formadas por espiguillas unifloras, dispuestas en panojas alargadas, frecuentemente espiciformes y glumas caducas a la madurez del Antemio (Burkart, 1969; Cabrera, 1973).
S. argentinensis es casi la única componente de pastizales denominados espartillares o pajonales, que ocupan grandes extensiones de áreas deprimidas, con suelos salino-sódicos y frecuentes inundaciones. Estas características impiden incorporar estas áreas a la agricultura o reemplazar el tapiz vegetal por especies forrajeras de mayor palatabilidad y digestibilidad. S. argentinensis es una planta con metabolismo C4 que presenta altas tasas fotosintéticas después de disturbios como el fuego o remoción mecánica de sus hojas, aún bajo condiciones de déficit hídrico (Feldman et al. 2004). Los disturbios, tales como el corte o el fuego, disminuyen inicialmente la dominancia de S. argentinensis en la comunidad, pero en poco tiempo y debido a la alta tasa de emergencia de vástagos aéreos y rizomas (Feldman y Lewis, 2007), recupera el canopeo y los altos valores de abundancia cobertura que la caracterizan (Feldman y Lewis, 2005). Las poblaciones naturales de S. argentinensis, en estado vegetativo, presentan altos tenores de lignina foliar (7-12%) (Bueno, 2006).
Los espartillares se encuentran ampliamente distribuidos en la República Argentina (Cabrera y Willink, 1973). En la provincia de Santa Fe ocupan los Bajos Submeridionales, que comprenden aproximadamente 20.000
2
km , áreas deprimidas que rodean algunos esteros de la Cuña Boscosa y hacia el centro y sur se extienden a lo largo de valles de inundación de cursos de agua y cañadas, llegando hasta el departamento Rosario (Collantes y Lewis, 1980; Lewis, 1996).
Desde mediados de la década del 80, hay gran interés a nivel internacional en el uso de pastos perennes para la producción de biocombus-tibles, debido a la doble ventaja que presentan: (i) altas tasas de crecimiento produciendo tejidos ricos en celulosa y lignina (10-20.000
-1 -1
kg materia seca ha año ) y (ii) bajo impacto ambiental por no requerir laboreos anuales. Asimismo, el combustible que se puede obtener a partir de las mismas, etanol, presenta menores emisiones de CO , respecto 2 a otras fuentes de energía, lo cual se ajusta a las necesidades de morigerar el efecto invernadero, tal cual se estableció mediante el Protocolo de Kyotto de 1997. Los incrementos en el precio internacional del petróleo, han impulsado nuevamente estudios acerca de este tipo de biocombustibles, tanto por parte de organismos oficiales como privados (Gray et al., 2006; Rabinovich, 2006).
La posibilidad de obtener bioetanol a partir de materiales lignocelulósicos se ve restringida por la presencia de altos contenidos de lignina, ya que se encarece el proceso de degradación enzimática (Sticklen y Oraby, 2005; Sticklen, 2006).
Se ha informado la regeneración in vitro de plantas del género Spartina, S. patens, S. cynosuroides (Li et al., 1995 y Li and Gallagher, 1996, respectivamente) y S. alterniflora (Wang et al. 2003), (Bueno et al. 2007), por medio del cultivo de diferentes explantos y la generación de callos. A s i m i s m o , m e d i a n t e t é c n i c a s d e regeneración indirecta in vitro se ha obtenido una variante somaclonal de S. argentinensis que presenta bajo tenores de lignina a partir del cultivo de inflorescencias inmaduras (Bueno et al., 2005). El cultivo de tejidos es una herramienta útil para el mejoramiento de especies vegetales y se ha utilizado en con éxito en especies forrajeras nativas (Echenique et al., 2001). Sin embargo para poder mantener en el tiempo estos genotipos diferenciales, es necesario desarrollar protocolos in vitro contrario al desarrollado para promover la variación, consistente en desarrollar plantas entera por la vía de regeneración directa, sin formación de callos que pueden promover la aparición de variantes, considerando que las Poaceae, presenta dificultades para la regeneración in vitro a partir de yemas (Aguado-Santacruz et al. 2004).
El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo eficiente de micropropagación de plantas de S. argentinensis a partir de meristemas del vástago aéreo, sin pasar por estadio de callo y de esta forma minimizar las posibles variaciones en el genotipo original. Micropropagación de plantas de Spartina argentinensis a partir de meristemas
Se transplantaron ejemplares de una población natural ubicada en la depresión del arroyo Ludueña, cerca de la localidad de Pérez, Santa Fe (32º 45' S; 60º 35' W), a la Facultad de Ciencias Agrarias, UNR. Hasta el momento de remoción de vástagos, las plantas se mantuvieron en niveles de disponibilidad hídrica cercana a capacidad de campo. Como explanto se utilizaron ápices de 2 a 3 mm obtenidos a partir de vástagos aéreos (macollos con hojas y raíces). Los meristemas se extrajeron de las bases de esos vástagos, cortando previamente hojas y raíces, para evitar la deshidratación de los explantos, se los envolvió en papel húmedo hasta su cultivo.
Se utilizaron dos tratamientos de desinfección de explantos: (1) aspersión con etanol 90% y (2) 1 minuto en etanol 90% y 20 minutos en hipoclorito de sodio (NaClO) al 2,5% más tensioactivo Tween 20. Se enjuagaron con tres lavados de agua destilada esterilizada.
Los medios de cultivo utilizados consistieron en la base salina MS (Murashige y Skoog, 1962) y las vitaminas propuestas por Gamborg et al. (1976), suplementados con diferentes concentraciones de reguladores vegetales 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) y BAP (6-bencilaminopurina) (Tabla 1). Como fuente
-1 de energía se utilizó sacarosa 30 g. L . Los
-1 medios de cultivo se solidificaron con 7 g. L agar-agar, previo ajuste del pH a 5,8. La esterilización de los medios en tubos de 2 cm de diámetro se realizó en autoclave durante 20 min a 1 atm.
Los porcentajes de meristemas que regeneraron vástagos aéreos bajo los distintos medios de cultivo se evaluaron a los 21 días del inicio de los cultivos. Los resultados obtenidos, se compararon mediante las pruebas no paramétrica de Kruskal Wallis y Dunn (Hollander & Wolfe, 1973; Siegel, 1980).
Cuando las plantas regeneradas in vitro alcanzaron una altura de 10 cm, se transfirieron a macetas con una mezcla tierra:vermiculita (70:30). Previo a ello se lavaron sus raíces con agua corriente para
extraer el medio con agar-agar adherido. Se mantuvieron en invernadero, con condiciones controladas de agua (riegos frecuentes de manera de mantener condiciones cercana a capacidad de campo) y temperatura.
Se realizaron análisis histológicos periódicos, con el objeto de caracterizar el tejido en estudio, establecer la zona de regeneración de vástagos y comprobar el origen (directo o indirecto) de los vástagos regenerados. Los meristemas en cultivo se fijaron e una solución de formol: ácido acético: alcohol (FAA), posteriormente de lo cual se realizó una deshidratación con una marcha ascendente de etanol (alcohol), durante 1 h. en cada uno de los siguientes concentraciones: 70°; 80°; 90°, 96° y 30 minutos en 100°.
Previo a la inclusión en parafina, las muestras se clarificaron con xilol, realizando un paulatino desplazamiento del alcohol de 100° por el xilol. Para ello se mantuvo al material en cada una de las siguientes mezclas de alcohol 100°: xilol: 3:1; 1:2; 1:3 durante una hora y, finalmente, 30 minutos en xilol. La impregnación en parafina se hizo en estufa a 60º C, primero en una mezcla xilol:parafina (1 hora) y luego durante 24 horas en parafina. Una vez incluidos en parafina, se realizaron cortes con micrótomo tipo Minot (18-20 µm de espesor). Posteriormente se desparafinó colocando los preparados en cubetas Koplin por un lapso de 30 minutos en xilol a 28-30º C, 30 minutos en xilol, 5 ´ en alcohol 100° y finalmente, 5 minutos en alcohol 96°. Luego se colorearon con safranina (inmersión durante 30 minutos) y fast-green (inmersión durante sólo 1 minuto), que tiñe de color azul-verdoso a las zonas celulósicas y de color fucsia a las zonas lignificadas (Dizeo de Srittmater, 1979; Johansen, 1940). Finalmente se realizó un pasaje rápido en alcohol 100° y se los colocó en xilol. Los preparados se montaron con bálsamo de Canadá y se observaron con microscopio óptico (x 10). Cuando se consideró necesario los preparados se fotografiaron con una cámara Olympus de 8.0 MPixel.
Medios de cultivo
BAP 2,4-D
A 0,01 0,1
B 0,1 0,01
C 0,5 0,5
D 0 0
Reguladores vegetales, (mg.L-1)
1
Los ápices caulinares poseen una plasticidad morfogenética tal que se los puede manipular, mediante la incorporación de reguladores exógenos, para producir uno o más vástagos independientes, como producir embriones somáticos (Sticklen y Oraby, 2005).
La siembra in vitro de meristemas permite regenerar plantas libres de virus, por la gran asepsia que presentan estos explantos (Roca, 1984). Sin embargo en S. argentinensis, la metodología de aspersión solo con alcohol no fue suficiente debido a la presencia de patógenos que y hubo que complementarla con el agregado de hipoclorito de sodio.
Discusión
En los trabajos donde la regeneración es indirecta, es necesario repicar los vástagos obtenida un medio con ácido naftalen acético (ANA) para regenerar raíces (Li y Gallagher, 1996). Cuando la regeneración es a partir de meristemas, la organogénesis es completa por lo que se forman directamente todos los órganos de la planta sin necesidad de repicar a diferente medio de cultivo (Hicks, 1980).
La vía de regeneración indirecta ha resultado exitosa para numerosos planes de mejora-miento de especies forrajeras incorporando variabilidad a caracteres de interés agronómico como altura, macollaje, floración y fertilidad del grano (Oono, 1983; Jung, 1989). El asperjado con etanol no fue efectivo ya que
el 98% de los ápices desarrolló una contaminación evidente. Por otro lado, la combinación de etanol con hipoclorito de sodio y Tween 20 permitió bajar este nivel de contaminación al 13,6% (Figura 1).
El porcentaje de explantos que regeneraron vástago se vio afectado por las relaciones de reguladores vegetales utilizadas en los medios de cultivo. La presencia de altas concentra-ciones de auxinas (2,4-D) inhibió la prolifera-ción celular en los meristemas, los cuales se necrosaron y murieron. El mayor porcentaje de regeneración (23 %) se obtuvo en el medio sin agregado de reguladores, las diferencias entre este medio y los otros dos en los que se
observó regeneración, no fueron estadística-mente significativas (medios B, C y D: 13,3; 11,4 y 24,0%, respectivamente; prueba de Krukal Wallis y Dunn, p<0.05; Fig. 2).
En al análisis histológico se evidenció el desarrollo de tejidos de conducción y crecimiento celular. No se observan embrio-nes ni proliferación celular característica de callos, por lo cual se puede afirmar que la vía de regeneración es por organogénesis directa.
En la aclimatación de las plantas obtenidas in vitro no se observaron muertes por desecación, todas las plantas transferidas se mantuvieron en invernadero.
a b 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Etanol Etanol + NaClO Tratamientos de desinfección
% d e c o n ta m in a c ió n
Figura 1: Porcentaje de contaminación de explantos en función del tratamiento de desinfección: asperjado con etanol y etanol más inmersión en hipoclorito de sodio (NaClO) y Tween 20.
b a a a
0 5 10 15 20 25 30
A B C D
Medios de cultivo
% d e m e ri s te m a s q u e r e g e n e ra ro n
Figura 2: Porcentaje de explantos que regeneraron vástagos aéreos en los diferentes medios de cultivo (columnas con letras iguales no difieren, Kruskal Wallis & Dunn, p<0.05).
Resultados
Micropropagación de plantas de Spartina argentinensis a partir de meristemas
sp., Tripsacum dactyloides, Eragrostis curvula, respectivamente, con el consiguiente aumento de la digestibilidad.Bueno (2006)obtuvo una variante de Spartina argentinensis con bajo contenido de lignina.
El protocolo desarrollado permitió regenerar planta entera, sin pasar por estado de callo y aunque las diferencias no sean estadística-mente significativas, es posible obtener plantas sin el agregado exógeno de auxina sintética. Esto posibilidad podría deberse a que los explantos utilizados son sitio de síntesis de auxinas (Buchanan et al. 2000), por lo cual poseen una concentración endógena
organogénesis directa a partir de la regeneración de yemas asegura la estabilidad genética de las plantas regeneradas y es útil cuando el objetivo es la propagación clonal a gran escala (Olmos et al., 2004).
La multiplicación in vitro por regeneración directa, abre una posibilidad promisoria para los programas de mejoramiento de Spartina. Los resultados obtenidos permitirían multipli-car sin inconvenientes materiales élites y/o plantas experimentales obtenidas in vitro para su posterior uso en programas de mejo-ramiento.
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