UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales
Tesis Doctoral
“Métodos alternativos para la extracción y purificación
de productos naturales de interés para la industria
farmacéutica”
Autora: Ing. Qca. M. Fernanda Barrera Vázquez
Directora: Dra. Ing. Susana Bottini
Métodos alternativos para la extracción y purificación
de productos naturales de interés para la industria
farmacéutica
por
Ing. Qca. M. Fernanda Barrera Vázquez
Dra. Ing. Susana Bottini
Directora
Comisión Asesora de Tesis
Dra. Raquel Evangelina Martini
Dra. Laura Comini
Tribunal Examinador de Tesis
Dra. Selva Pereda
Dr. Julio Zygadlo
Dr. Enrique Campanella
Cuida tus
pensamientos,
porque se
convertirán
en tus
palabras.
Cuida tus
palabras,
porque se
convertirán
en tus actos.
Cuida tus
actos
porque se
convertirán
en tus
hábitos.
Cuida tus
hábitos
Porque se
convertirán
En tu destino.
A mis hijos Santino, Pedro,
Primero y como más importante, me gustaría agradecer sinceramente a mi Directora de Tesis, Susana Bottini, por su esfuerzo y dedicación. Si bien, su dirección fue a la distancia sus conocimientos, sus orientaciones, sus consejos y su manera de trabajar, fueron una valiosa guía.
Al Dr Cabrera, un especial agradecimiento por abrirme las puertas de su laboratorio, por darme la oportunidad de poder realizar mi trabajo experimental, y por estar dispuesto a enseñar y transmitir todos sus conocimientos.
A Raquel por haber confiado siempre en mí, por estar siempre presente, por su persistencia, su paciencia y su motivación que han sido fundamentales para mi formación como investigadora y principalmente por su sincera amistad.
A Laura, por acompañarme en todo este periodo, por su amistad, por su apoyo, por sus conocimientos, su responsabilidad, por su meticulosidad y firmeza que han ayudado a completar mi formación como investigadora
A Alfonsina, por prestarme su tiempo, por su colaboración, su amistad y por su sabiduría que también ayudaron a completar mi formación.
A Susy por brindar sus conocimientos, por su responsabilidad y por su dedicación a mejorar mi formación
Quiero expresar mi más grande agradecimiento a Hugo, por estar siempre a mi lado, por creer en mí, por estar en los buenos y malos momentos y por ayudarme cada día a formar la mas bella familia.
incondicional en toda mi vida.
A mi abuela Raquel por alentarme cada día a que pueda superarme, y a mis hermanas Naty, Lilian, Caro, Agus y Estefi por estar siempre a mi lado. Y también a toda la familia tios, primos…que siempre me acompañan.
A mi amiga Anita, por darme siempre palabras de aliento y acompañarme en todos los momentos importantes de mi vida, y también a Naty, Eli, Fer, Andrea y Maricel por brindarme su amistad y estar siempre cuando las necesite.
A todos mis compañeros y amigos del grupo IDTQ, Martín, Luz , Juan, Juani, Alexis, José, Laura, Nico, Laura, Agostina, Noe, Iva, Analía, Seba y al resto que también forma parte, porque luchan y creen en un mismo sueño, porque hacen que el lugar de trabajo sea el lugar más lindo y cómodo, porque comparten sus conocimientos sin pedir nada a cambio, por ser tan buenos amigos, por su buen humor y hacer que la vida sea divertida.
A las chicas del grupo de Farmacognosia por brindarme su ayuda y hacerme sentir cómoda en su lugar de trabajo.
No puedo olvidar en mis agradecimientos a la gente de Plapiqui de Bahía Blanca, que me recibieron muy bien durante mi estancia.
RESUMEN
Las plantas con propiedades beneficiosas para la salud humana han acompañado al hombre desde sus orígenes. A pesar de la gran oferta de fármacos, existen todavía patologías que no cuentan con una cura definitiva y otras a las que su terapéutica provoca efectos indeseables. Por ello se hace necesaria la búsqueda de nuevos agentes terapéuticos. En este sentido, el reino vegetal constituye una fuente inagotable de compuestos bioactivos que merecen mayor investigación. Dentro de estos compuestos se encuentran las antraquinonas. Ellas constituyen el grupo más numeroso de quinonas naturales, ubicadas en la corteza y raíz de diversas especies vegetales. Algunas antraquinonas presentan la propiedad de ser fotosensibilizantes, actividad que despierta un especial interés en el área de las ciencias farmacéuticas por sus potenciales y diversas aplicaciones terapéuticas.
En esta tesis se aborda el estudio de métodos de extracción para obtener antraquinonas de los tallos y hojas de Heterophyllae Hook pustulata (Rubiaceae). Estas antraquinonas han manifestado ser altamente bioactivas y potencialmente útiles desde el punto de vista terapéutico, siendo sus posibles usos como agentes antimicrobianos, antivirales, antiparasitarios y/o antitumorales.
de utilizar tecnologías verdes en el procesamiento de productos naturales.
En el capítulo II se describen las características generales de la H. pustulata
(aspectos botánicos, propiedades biológicas, fototoxicidad, metabolitos secundarios aislados de la planta) y se detalla el método convencional de extracción. En el capítulo III se discuten los principios que rigen el funcionamiento de los métodos de extracción alternativos ensayados en esta tesis, sus ventajas y desventajas.
En los capítulos IV y V se reportan los resultados experimentales obtenidos en los ensayos de extracción con ultrasonidos y microondas, utilizando como solventes benceno, acetato de etilo y mezclas de etanol + agua. Se describe también la aplicación del diseño experimental de Taguchi para determinar las condiciones operativas óptimas de las extracciones con etanol + agua, basadas en el análisis de cuatro factores: concentración de solvente, relación solvente/muestra, temperatura y tiempo de extracción. El Capítulo VI, por su parte, muestra los resultados de las extracciones con agua subcrítica, en las que se utilizaron como solventes agua pura y mezclas de agua y etanol. Las variables analizadas en este caso fueron la temperatura, la presión y el caudal de operación. En el capítulo VII se comparan los resultados obtenidos con los distintos métodos, a fin de determinar cuál es el método con el que se obtiene un mayor rendimiento de antraquinonas.
El capítulo VIII describe el trabajo realizado en el modelado termodinámico del equilibrio sólido-fluido de mezclas conteniendo cetonas aromáticas, utilizando para ello la ecuación de estado a contribución grupal GCA-EOS. Se definió un nuevo grupo funcional ACO para caracterizar a estos compuestos y se llevó a cabo un proceso de parametrización basado en información experimental de la literatura sobre presiones de vapor de cetonas aromáticas puras y datos de equilibrio entre fases de mezclas binarias. Los parámetros obtenidos proporcionaron una predicción satisfactoria de las condiciones de equilibrio de compuestos antraquinónicos.
ABSTRACT
Plants with beneficial properties for human health have accompanied man since his origins. Despite the wide range of drugs available, there are still diseases that do not have a cure and others for which this remedy causes undesirable effects. Therefore, the search for new therapeutic agents is required. In this sense, the plant kingdom is an inexhaustible source of bioactive compounds that merit further research. Anthraquinones are one of these families of compounds. They are the largest group of natural quinones, located in the bark and roots of various plant species. Some anthraquinones have the property to be photosensitizers; this activity generates a special interest in the area of pharmaceutical sciences for their potential and various therapeutic applications.
In this thesis we studied different extraction methods to obtain anthraquinones from the stems and leaves of Heterophyllae pustulata Hook (Rubiaceae). These anthraquinones have shown to be highly bioactive and potentially useful from a therapeutic point of view; they can be used as antimicrobial, antitumor, antiviral and antiparasitic agents.
technologies in the processing of natural products is discussed.
Chapter II presents the general characteristics of H. pustulata (botanical aspects, biological properties, phototoxicity, secondary metabolites isolated from plant) and describes the conventional extraction method. In chapter III the operating principles of the alternative extraction methods tested in this thesis are presented, and their advantages and disadvantages are discussed.
Chapters IV and V report the experimental results of the ultrasonic and microwave extractions, using benzene, ethyl acetate and ethanol + water mixtures. The use of Taguchi experimental design to determine the optimum operating conditions for the extractions with ethanol + water is also described, based on the analysis of four factors: solvent concentration, solvent/sample ratio, extraction temperature and time. On the other hand, Chapter VI shows the results of the extraction with subcritical water, using not only pure water, but also mixtures of water and ethanol. The variables analyzed in this case were temperature, pressure and solvent flow rate. In Chapter VII the results obtained with the different methods are compared in order to determine the method by which a higher yield of anthraquinone is obtained.
Chapter VIII describes the work done in modeling solid-fluid equilibria in mixtures containing aromatic ketones, with the GCA-EOS group-contribution equation of state. A new ACO functional group was defined to characterize these compounds, and a parameterization process was carried out, based on experimental data from the literature on vapor pressures of pure aromatic ketones and phase equilibrium data of binary mixtures. The parameters obtained provided a satisfactory prediction of equilibrium conditions in systems containing anthraquinones.
RESUMO
As plantas com propriedades benéficas para a saúde humana têm acompanhado o homem desde suas origens. Apesar da ampla variedade de drogas, ainda existem doenças que não têm uma cura e outros que as suas causas terapêuticos efeitos indesejáveis. Assim, é necessária a procura de novos agentes terapêuticos. Neste sentido, o reino vegetal é uma fonte inesgotável de compostos bioativos que merecem mais investigação. Dentro destes compostos são antraquinonas. Eles constituem o maior grupo de quinonas naturais, localizada na casca e raízes de várias espécies de plantas. Alguns antraquinona tem propriedade para ser fotossensibilizantes, atividade despertou um interesse especial na área das ciências farmacêuticas para as suas potenciais aplicações terapêuticas e diversos.
Neste estudo tese discute-se métodos de extração para obter antraquinona caules e folhas Heterophyllae pustulata Hook (Rubiaceae). Estes antraquinonas têm mostrado ser altamente bioactiva e potencialmente úteis sob o ponto de vista terapêutico, e as suas possíveis utilizações como antimicrobianos antitumoral, antiviral e/ ou antiparasitário.
Actualmente, estes AQs extracção é realizada usando métodos convencionais de tipo Soxhlet, em fases sucessivas, com solventes de polaridade crescente: começando com hexano para remover os componentes de clorofila e de gordura, seguindo-se o benzeno e finalmente com acetato de etilo. Esta técnica mostra um baixo rendimento de extração AQs e consome grandes quantidades de solventes e tempo. Por outro lado, eles têm aumentado nos últimos anos, os requisitos para os processos referentes ao consumo de solvente de extracção e prevenção da poluição ambiental. A este respeito, a utilização de métodos alternativos, tais como a extracção de ultra-som assistido, microondas assistida extracção e extracção com água subcrítica está presente como opções interessantes para a obtenção de antraquinonas a partir de produtos naturais.
Capítulo II descreve as características gerais do H. pustulata (aspectos botânicos, as propriedades biológicas, fototoxicidade, metabólitos secundários isolados de plantas) e método de extração convencional é detalhado. No capítulo III os princípios que regem o funcionamento dos métodos de extração alternativas testadas nesta tese, são discutidas suas vantagens e desvantagens
Resultados experimentais capítulos IV e V são relatados nos ensaios de extração ultra-som e microondas, utilizando benzeno solvente, acetato de etilo e misturas de etanol + água. A aplicação do delineamento experimental Taguchi é também descrito para a determinação das condições óptimas de extracções com etanol + água, a partir da análise de quatro factores: concentração de solvente, proporção de solvente / amostra, temperatura de extracção e de tempo. Capítulo VI, por sua vez, mostra os resultados da extracção com água subcrítico, que foram utilizados como solventes puros, água e misturas de água e etanol. As variáveis analisadas neste caso foram a temperatura, pressão e velocidade de fluxo operacional. No capítulo VII os resultados obtidos com os diferentes métodos são comparadas a fim de determinar o método pelo qual um maior rendimento de antraquinona é obtido.
Capítulo VIII descreve o trabalho feito na modelagem termodinâmica de misturas de fluidos-sólidos contendo equilíbrio cetonas aromáticas, usando a equação da contribuição do Estado para grupo GCA-EOS. ACO um novo grupo funcional foi definido para caracterizar estes compostos e realizado um parâmetro de processo com base em dados experimentais da literatura sobre as tensões de vapor de cetonas aromáticas puras e dados de equilíbrio de fases de misturas binárias. Os parâmetros obtidos desde um satisfatórios condições de equilíbrio previsão de compostos antraquinona.
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
1.1.El Reino Vegetal como Fuente de Productos Farmacéuticos………...1
1.1.1. Antecedentes sobre los derivados antraquinónicos de interés………..4
1.2.Química Verde………6
1.2.1. Antecedentes de Aplicación de Tecnologías Verdes en la Extracción del Principio Activo de Interés………8
1.3. Objetivos………..……….10
1.3.1. Objetivo General……….……….10
1.3.2.Objetivos Particulares………...…11
Referencias………..11
CAPÍTULO II:
ASPECTOS GENERALES DE
HETEROPHYLLAEA PUSTULATA
HOOK. F. (Rubiáceas) Y
SUS PRINCIPIOS ACTIVOS
2.1. Características Generales de la Heterophyllaea pustulata Hook. f. ……….172.1.1. Fototoxicidad ………...……….17
2.1.2. Consideraciones Botánicas………...………….19
2.2. Metabolitos Secundarios Aislados de la Heterophyllae pustulata ...………21
2.3. Método de Extracción Convencional y Composición Química de los Extractos………...………...23
2.4. Actividad Biológica de los Extractos de H. pustulata………..26
TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN ESTUDIADAS
3.1. Introducción……….31
3.2 Extracción Asistida con Microondas (MAE)………33
3.2.1. Teoría y Principios de la EAM………34
3.2.2. Parámetros que afectan el proceso MAE………...…38
3.3 Extracción Asistida con Ultrasonido (EAU)……….41
3.3.1. Principios de la Extracción Asistida con Ultrasonido………....41
3.3.2. Parámetros que afectan el proceso UAE.………...43
3.4. Extracción con Agua Subcrítica (PHWE)………....45
3.4.1. Principios y Mecanismos de la Extracción con agua Subcrítica …………...46
3.4.2. Parámetros que afectan el proceso PHWE……….47
Referencias………..50
CAPÍTULO IV:
EXTRACCIÓN ASISTIDA CON ULTRASONIDO Y
EXTRACCIÓN ASISTIDA CON MICROONDAS DE
ANTRAQUINONAS DE HETEROPYLLAE PUSTULATA
(RUBIACEAE) UTILIZANDO SOLVENTES ORGÁNICOS
4.1 Introducción………..574.2. Materiales……….………58
4.2.1 Material Vegetal………..………58
4.2.2 Solventes……….58
4.3. Procedimiento seguido en los ensayos de extracción……...………58
4.3.1. Extracción Convencional con Soxhlet ………...58
4.3.2. Extracción Asistida con Ultrasonido (EAU)………..…60
4.3.3. Extracción Asistida con Microondas (EAM)……….64
4.4. Análisis por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)………...…66
4.5. Resultados……….70
4.5.2.1. Selección del tiempo óptimo de extracción EAU………..76
4.5.3. Extracción Asistida con Microondas (EAM)……….………78
4.6. Conclusiones……….81
Referencias………..………81
CAPÍTULO V:
EXTRACCIONES EAU Y EAM UTILIZANDO
MEZCLAS DE AGUA-ETANOL COMO SOLVENTE
5.1 Introducción……….……….845.2. Materiales………...…..85
5.3. Procedimientos de extracción……… ………85
5.3.1. Extracción Asistida con Ultrasonido (EAU)……….………….85
5.3.2. Extracción Asistida con Microondas (EAM)……….………....86
5.3.3. Extracción Convencional con Soxhlet ………..…………87
5.4. Diseño Experimental………88
5.5. Análisis Estadístico…….………..92
5.6. Resultados de la optimización de la extracción EAU………...94
5.6.1. Análisis de la relación S/N……….….………...95
5.6.2. Análisis ANOVA………...………98
5.6.3. Efecto de la composición del solvente………...99
5.6.4. Efecto del tiempo de extracción……….…..101
5.7. Optimización de la Extracción Asistida con Microondas (EAM)………..102
5.7.1. Análisis de la relación S/N ………..…103
5.7.2. Análisis ANOVA ………105
5.7.3. Efecto de las variables operativas en la extracción EAM………....106
5.8. Conclusiones ………..107
Referencias………...………….108
CAPÍTULO VI:
EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS DE
H.
PUSTULATA
CON AGUA SUBCRÍTICA
6.1 Introducción……….……….…….1136.5. Resultados Experimentales de las extracciones PHWE……….………118
6.5.1 Efecto de la presión………..……….………119
6.5.2. Efecto de la temperatura………...121
6.5.3. Efecto del caudal de agua ………...……….123
6.5.4. Efecto del Agregado de Etanol……….125
6.6. Modelado de las curvas de extracción………....127
6.7.Conclusiones………....130
Referencias ………..……….130
CAPITULO VII:
COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS DE
EXTRACCIÓN DE ANTRAQUINONAS
7.1. Introducción………..…..1357.2. Comparación de los métodos de extracción con benceno y acetato de etilo…...136
7.3. Comparación de los métodos de extracción con mezclas de etanol-agua……...140
7.4. Comparación general de los métodos de extracción……….….143
Referencias………146
CAPÍTULO VIII:
MODELADO TERMODINÁMICO DEL
EQUILIBRIO ENTRE FASES EN SISTEMAS ANTRAQUINONAS +
SOLVENTES
8.1 Introducción………...……..1498.2. Ecuación de Estado a Contribución Grupal con Asociación (GCA-EOS)……...150
8.3 Equilibrio de fases en sistemas sólido-fluido………..155
8.4. Parametrización del modelo GCA-EOS……….158
8.5. Predicción del equilibrio sólido-fluido de mezclas que contienen cetonas aromáticas………..170
8.6.Conclusiones……… …..174
Referencias…………..……….……….175
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
1.1.
El Reino Vegetal como Fuente de Productos Farmacéuticos
El uso de las plantas medicinales para el alivio o cura de enfermedades se remonta a los orígenes de la humanidad. Este conocimiento se ha ido trasmitiendo de generación en generación, conservando además algunas de las connotaciones mágicas que eran atribuidas a las propiedades curativas de las plantas.
Hay numerosos documentos que relatan cómo las plantas se utilizan con fines terapéuticos en todo el mundo y desde tiempos remotos. Después de siglos de uso empírico de preparaciones herbarias, recién a comienzos del siglo XIX se obtuvo la idea de utilizar como medicamento un compuesto químicamente puro obtenido a partir de una planta con acción terapéutica; surgiendo asi, la primera separación de un compuesto químico (morfina) de una droga natural (“opio”) por parte del farmacéutico alemán Friedrich W.A. Sertürner [1]. Este hecho marcó una nueva era en el uso de las plantas medicinales y el nacimiento de una moderna línea de investigación sobre las especies vegetales, encaminada a la extracciòn, purificación e identificación de los compuestos químicos responsables de sus actividades biológicas.
naturaleza, ya sea porque no son fáciles de sintetizar o bien porque el costo de su síntesis es mayor que su producción a partir del vegetal.
En la última década, el interés por las drogas naturales ha sufrido un crecimiento progresivo. Entre las principales razones se pueden nombrar: el surgimiento y desarrollo de la ecología como una forma de vida que permitió modificar y adoptar costumbres o hábitos acordes a una vida más saludable, originando un movimiento naturista que revaloriza las plantas como instrumentos para aliviar o curar distintas enfermedades o afecciones; la creciente demanda de terapias no clásicas debido a la insatisfacción por los tratamientos médicos tradicionales, que en algunos casos no brindan expectativas de cura y/o producen efectos secundarios temibles; además, se ha demostrado científicamente la eficacia de un gran número de preparaciones fitofarmacéuticas, usando los mismos estándares científicos que se aplican para drogas sintéticas; a lo que se suma, el interés de muchas compañías farmacéuticas que visualizan las plantas como una fuente inexplorada de nuevas estructuras potencialmente activas [2].
Las plantas son una fuente potencial de nuevas compuestos bioactivos y aunque son muchos los esfuerzos que se han realizado en la búsqueda de nuevos compuestos útiles desde el punto de vista medicamentoso, el mundo vegetal está lejos de haber sido completamente explorado. Hasta ahora los científicos han sometido a prueba aproximadamente sólo el 1% de las plantas que se estima que hay en el planeta (promedio estimado de 250.000) en busca de propiedades medicinales, pero los beneficios han sido enormes. Esto indica que el terreno a investigar es inmenso y se puede afirmar que existen todavía tesoros terapéuticos insospechados por descubrir [3].
Si bien actualmente disponemos de técnicas avanzadas para la purificación e identificación de compuestos químicos desde productos naturales, como así también de rápidos ensayos biológicos para la detección de muchas actividades farmacológicas, que aceleran y facilitan la búsqueda de nuevos compuestos químicos, el camino que debe transitar una droga para que llegue a ser aprobado su uso en humanos es largo. El proceso puede durar entre 10 y 20 años con un costo aproximado de unos 300 millones de dólares [5], y sólo 1 de cada 10.000 compuestos químicos que se estudien como nuevas drogas, pasarán al mercado. A pesar de estos riesgos un solo compuesto puede generar ganancias en el mercado de alrededor de 1000 millones de dólares y, lo que es más importante, conducir a la posible cura de enfermedades [6].
El proceso que se inicia con la recolección de la planta hasta obtener un principio químico puro con una determinada actividad farmacológica es largo y laborioso, requiere de la colaboración multidisciplinaria de botánicos, químicos, farmacólogos y toxicólogos. En grandes rasgos, involucra los siguientes pasos:
a) Recolección e identificación botánica del material vegetal.
b) Preparación de extractos y análisis químico preliminar, que involucra la realización de reacciones de coloración y ensayos cromatográficos.
c) Análisis biológicos y farmacológicos simples de extractos crudos con el fin de dirigir el trabajo de aislamiento hacia los metabolitos potencialmente bioactivos.
d) Consecutivos pasos de separación y purificación de los principios activos.
e) Dilucidación estructural de los compuestos aislados, mediante métodos espectroscópicos, químicos y otros.
f) Síntesis parcial o total como confirmación de la estructura propuesta para las sustancias aisladas por primera vez.
g) Determinación de la actividad farmacológica y toxicológica de los compuestos puros aislados e identificados.
1.1.1.
Antecedentes sobre los derivados antraquinónicos de interés
La identificación de principios activos a partir de plantas de uso tradicional, continúa siendo uno de los caminos más promisorios para la obtención de nuevos fármacos [6]. En la búsqueda de metabolitos con actividad biológica, la selección de la especie vegetal a estudiar es un factor decisivo para obtener el resultado esperado. La elección se puede hacer sobre la base de relaciones quimiotaxonómicas o teniendo en cuenta la información etnofarmacológica [7]. El primero de ellos considera que las especies vegetales de un mismo grupo taxonómico poseen los mismos y/o similares compuestos químicos, que permiten emparentarlas y agruparlas bajo el mismo taxón. Por lo tanto, si se conoce que una planta contiene, por ejemplo, cumarinas con actividad antitrombótica, es presumible que otra especie de su mismo género posea similares compuestos químicos con igual o semejante actividad biológica. El segundo criterio, la etnofarmacología, tiene en cuenta los conocimientos que tienen las personas que habitan un determinado lugar, sobre las plantas que habitualmente utilizan como agentes medicinales En este marco, se pueden seleccionar aquellas plantas tradicionalmente usadas en la medicina popular como así también, aquellas reconocidas como tóxicas. Esto es así, ya que normalmente se considera que ambos grupos de plantas ofrecen compuestos químicos con efectos biológicos potencialmente útiles desde el punto de vista terapéutico. Existen numerosas evidencias de plantas tóxicas cuyos metabolitos se usan en el tratamiento o cura de una enfermedad a una dosis adecuada [8, 9].
Dentro de este grupo de plantas tóxicas, tenemos las llamadas plantas fototóxicas,
cuyos principios activos son comúnmente denominados agentes fotosensibilizantes, que desencadenan sus efectos nocivos bajo la acción de la luz [10].
Cabe destacar que los agentes fotosensibilizantes utilizados en forma controlada, pueden ser inducidos a producir efectos dirigidos; por ejemplo, de acción tóxica para microorganismos o células patógenas y con un efecto mínimo o nulo sobre células huésped. Así utilizados, se transforman en una importante herramienta terapéutica en su accionar como agentes antivirales, antibacterianos o antifúngicos, como así también en terapias contra ciertos tipos de cáncer.
Es importante señalar que una gran diversidad de metabolitos aislados de plantas, como así también de microorganismos y animales, son poderosos fotosensibilizantes y que muchos de ellos han demostrado ser altamente bioactivos y con potencial aplicación no sólo desde el punto de vista farmacológico, sino también desde el punto de vista tecnológico.
Entre las estructuras conocidas y asociadas a esta característica se incluye, entre otros compuestos químicos, a numerosos derivados antraquinónicos los cuales son ampliamente encontrados en las plantas [12,13]. Estos derivados han sido extensamente estudiados en conexión con sus características de absorción en el UV-Visible y sus potenciales propiedades fotosensibilizantes en reacciones fotodinámicas [14-19].
En consecuencia a lo anteriormente expuesto, el estudio de plantas, animales o microorganismos que contengan metabolitos fotosensibilizantes, despierta promisorias expectativas, ya que estos compuestos representan un grupo de nuevas drogas con variados efectos biológicos beneficiosos para los organismos vivos y con importantes aplicaciones terapéuticas y tecnológicas
Entre las especies vegetales reconocidas como plantas fototóxicas, se encuentra la especie vegetal Heterophyllaea pustulata Hook f. (Rubiaceae), popularmente conocida como
A partir de estos antecedentes, y en función del interés que despiertan estos compuestos, en cuanto a sus actividades biológicas y su amplia gama de aplicaciones potenciales que podrían tener en la industria farmacéutica, es de gran interés en esta tesis encontrar un procedimiento adecuado para extraer estos compuestos a partir de la especie vegetal H.pustulata.
1.2 Química Verde
Desde la prehistoria, el hombre ha estado consciente o inconscientemente acompañado por procesos químicos. Muchos de los descubrimientos que le han posibilitado su desarrollo tecnológico y la mejora de su calidad de vida, son todos procesos químicos que el hombre aprendió a utilizar para su provecho.
Los avances científicos debidos a la química y a otras disciplinas, han permitido el aumento de la expectativa de vida, con el consecuente incremento de la población mundial, así como la mejora de la calidad de vida, mediante innumerables adelantos. Este desarrollo ha ido acompañado de un enorme crecimiento de la industria química a nivel mundial.
En tal sentido, la “Química verde” se define como: "La utilización de un conjunto de principios que reduzcan o eliminen el uso o la generación de sustancias peligrosas en el diseño, fabricación y aplicación de productos químicos”. Es
decir que la filosofía de la química verde es desarrollar e incentivar la utilización de tecnologías que puedan obtener los mismos productos que la química tradicional, pero de manera menos contaminante, reduciendo o eliminando el uso o producción de sustancias peligrosas, con el fin de conservar el ambiente natural y sus recursos y limitar los efectos negativos del desarrollo humano.
Su metodología se basa en la aplicación de 12 principios propuestos por Anastas y Warner [26,27]:
1. Prevención: Es preferible evitar la producción de un residuo, que tratar de limpiarlo una vez que se haya formado.
2. Economía atómica: Los métodos de síntesis deberán diseñarse de manera que incorporen al máximo todos los materiales en el producto final.
3. Uso de metodologías que generen productos con toxicidad reducida: Siempre que sea posible, los métodos de síntesis deberán utilizar y generar sustancias que tengan poca o ninguna toxicidad, tanto para el hombre como para el medio ambiente.
4. Generación de productos eficaces pero no tóxicos: Los productos químicos deberán ser diseñados de manera que mantengan la eficacia a la vez que reduzcan su toxicidad. 5. Reducción del uso de sustancias auxiliares: Se evitará, en lo posible, el uso de
sustancias que no sean imprescindibles (disolventes, reactivos para llevar a cabo separaciones, etcétera), y, en el caso de que se utilicen, deberán ser lo más inocuas posible.
6. Disminución del consumo energético: Los requerimientos energéticos deberán ser catalogados por su impacto medioambiental y económico, reduciéndose su consumo todo lo posible. Se intentará llevar a cabo los métodos de síntesis a temperatura y presión ambientes.
8. Reducción de derivados: Los procesos deben minimizar o evitar derivaciones innecesarias, ya que cada nueva etapa requiere reactivos y energía adicional, además de producir más desechos
9. Potenciación de la catálisis: Se emplearán catalizadores lo más selectivos posible, preferiblemente reutilizables, en lugar de reactivos estequiométricos.
10. Generación de productos biodegradables: Los productos químicos se diseñarán de manera tal que, al finalizar su función, no persistan en el medio ambiente sino que se transformen en productos de degradación inocuos.
11. Desarrollo de metodologías analíticas para la monitorización en tiempo real: Las metodologías analíticas deberán permitir una monitorización y control en tiempo real del proceso, previo a la formación de sustancias peligrosas.
12. Productos inherentemente más seguros: Deben seleccionarse las sustancias y su forma de uso de manera de minimizar el potencial de accidentes, incluyendo escapes, explosiones e incendios.
Los métodos tradicionales comúnmente utilizados en la extracción de principios activos de productos naturales (Soxhlet, maceración, decocción, infusión, etc.) generalmente requieren largos tiempos de extracción y uso intensivo de disolventes orgánicos que pueden tener potenciales efectos negativos sobre el medio ambiente y la salud humana. Por otra parte, los disolventes orgánicos son caros y su eliminación del producto final es muy costosa. Por lo tanto, el uso de tecnologías verdes para reducir y/o eliminar el uso o la producción de materiales peligrosos es altamente deseable.
1.2.1. Antecedentes de Aplicación de Tecnologías Verdes en la Extracción del
Principio Activo de Interés
baja selectividad. Por otra parte, los solventes utilizados representan un riesgo medioambiental, debido a su toxicidad, a su poder inflamable y a los residuos que generan.
En la actualidad se imponen mayores restricciones sobre las técnica extractivas, incluyendo la disminución de los tiempos de extracción, el consumo reducido de solventes y energía, la prevención de la contaminación ambiental y el cuidado especial en el tratamiento de compuestos termolábiles. Por lo tanto, es de interés estudiar técnicas alternativas que permitan aumentar los rendimientos y pureza de los extractos, y reducir los tiempos y riesgos de la extracción. Dentro de las técnicas alternativas propuestas en la literatura se incluyen la extracción asistida con microondas (MAE), ultrasonido (EUA) y el uso de fluidos presurizados (PLE).
Dentro de este último grupo de procesos, la utilización de agua subcrítica constituye una alternativa interesante para la obtención y purificación de compuestos bioactivos a partir de productos naturales. Esta nueva técnica se basa en el uso de agua, a temperaturas entre 100 ºC y 374 ºC y a presiones lo suficientemente altas para que se mantenga en estado líquido [28]. En estas condiciones el agua disminuye su polaridad, por lo que aumenta la solubilidad de los compuestos orgánicos al reducirse su constante dieléctrica. La ventaja más importante con respecto a las técnicas de extracción convencionales es que los tiempos de extracción son más cortos, además de producirse un extracto de alta calidad, con un agente extractor de bajo costo [28]. En la literatura se ha reportado la extracción de antraquinonas de Morinda citrifolia (Noni) utilizando agua subcrítica [28-30], con un alto porcentaje de recuperación en comparación con las técnicas convencionales.
Otra técnica que ha cobrado interés en los últimos años es la extracción asistida por ultrasonido (EUA), principalmente por su eficiencia, bajo costo, y por la posibilidad de realizar extracciones a bajas temperaturas, utilizando menores cantidades de disolvente que los procesos tradicionales [38]. En esta técnica se utiliza alta potencia y baja frecuencia para poder separar el soluto de interés de la matriz vegetal. Las ondas sonoras que se propagan en el medio disolvente resultan en la alternancia de ciclos de alta y baja presión, que produce burbujas de cavitación. La energía generada a partir del colapso de las burbujas de cavitación proporciona una mayor penetración del disolvente en el material celular y mejora la transferencia de masa hacia y desde las interfases [39]. Entre las nuevas técnicas de extracción, la EUA es la más económica y la que tiene menos requerimientos instrumentales [40]. Diferentes extractos de plantas y metabolitos bioactivos se han obtenido con esta técnica [40,42]; entre ellos, se aislaron AQs de Morinda citrifolia [43].
El diseño de los procesos antes discutidos depende fuertemente del escenario de fases, el cual es altamente sensible a cambios en las condiciones de operación. Por lo tanto, la ingeniería del equilibrio entre fases juega un rol fundamental en el diseño de esos procesos [44]. Dependiendo del sistema bajo estudio y del objetivo de la aplicación, se requerirá la existencia de sistemas homogéneos y/o heterogéneos para el desarrollo de los procesos. En este sentido, la medición experimental de los datos de equilibrio de los principales sistemas estudiados es de gran importancia para determinar las condiciones de extracción y/o fraccionamiento. Por otro lado, la capacidad de modelar dicho equilibrio resulta una herramienta fundamental, ya que permite predecir y explorar el comportamiento del sistema en regiones donde no existe información experimental.
1.3
Objetivos
1.3.1
Objetivo General
alternativas que permitan aislar y purificar compuestos naturales de interés para la industria farmacéutica, basándose en nuevas tecnologías, más respetuosas con el medio ambiente, que no representen riesgo para la salud y que garanticen una calidad superior de los productos.
En particular, se han seleccionado estructuras químicas pertenecientes a la familia de las antraquinonas como compuestos de interés y las técnicas alternativas de extracción incluyen la extracción asistida con microondas (MAE), extracción asistida con ultrasonido (EUA) y el uso de fluidos presurizados (PLE).
1.3.2. Objetivos particulares
* Extracción y purificación de AQs con propiedades fotosensibilizantes y potencial aplicación terapéutica, presentes en la planta Heterophyllaea pustulata mediante la aplicación de las diferentes técnicas antes detalladas (convencionales y no convencionales). Comparación de metodologías. .
* Analisis de la influencia de las diferentes variables operativas (temperatura, presión, caudal, potencia, relación muestra/solvente, concentración de solvente, tiempo) sobre la calidad de los productos obtenidos, en términos de recuperación y concentración de los componentes activos.
* Utilización de un modelo a contribución grupal (ecuación GCA-EoS) para correlacionar y predecir las condiciones de equilibrio entre fases que gobiernan los procesos de separación estudiados.
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CAPÍTULO II
ASPECTOS GENERALES DE
HETEROPHYLLAEA
PUSTULATA
HOOK. F. (Rubiáceas) Y SUS PRINCIPIOS
ACTIVOS
2.1. Características Generales de la
Heterophyllaea pustulata
Hook. f.
2.1.1. Fototoxicidad
El reino vegetal ha sido tradicionalmente el proveedor de materia prima para la industria farmacéutica, ya que ofrece un gran abanico de posibilidades para la búsqueda de nuevos compuestos químicos para aplicaciones biológicas y / o tecnológicas [1-3].
Con el objetivo de encontrar nuevas estructuras químicas naturales bioactivas el grupo de trabajo de Farmacognosia (Departamento de Farmacia – Fac. de Ciencias Químicas – UNC – IMBIV-CONICET) estudió químicamente una especie vegetal denominada científicamente
Heterophyllaea pustulata Hook. f. [4], conocida vulgarmente como “cegadera”, reconocida como especie con antecedentes de fototoxicidad [5].
especie vegetal fototoxica Heterophyllaea pustulata Hook. f. es un arbusto que crece en la regiones montañosas de Argentina y Bolivia, a 1.000 metros sobre el nivel del mar. En Argentina su ubicación se da en las provincias de Jujuy, Salta y Tucumán (Figura 1).
Figura 1. Distribución de la Heterophyllaea pustulata en la República Argentina (adaptado de Ragonese y Milano,1984).
Esta especie es la causante de numerosas intoxicaciones en el ganado ovino, bovino, mular y equino de pelaje blanco en las provincias donde habita, ya que produce lesiones dérmicas y en casos severos puede causar ceguera, sin llegar a ocasionar la muerte en los animales que la ingieren. Se la conoce también con otros nombres vulgares: “ciegadera” o “saruera” [8].
similares a los producidos en la intoxicación natural, es necesario exponer los sujetos a la acción de la luz natural o rayos solares para que éstos actúen como factor desencadenante. Cabe destacar que estos autores definieron la toxicidad de esta planta como una reacción típica de fotosensibilización, ya que provoca las reacciones fototóxicas características y no exhibe ictericia ni anemia en su presentación clínica. Sin embargo, no identificaron los compuestos químicos responsables de su fototoxicidad, por lo que la búsqueda de las sustancias causantes de la misma representó un importante desafío.
Figura 2. Animales que presentan lesiones irreversibles: dermatitis crónica y pérdida total de la visión
2.1.2. Consideraciones Botánicas
Heterophyllaea pustulata Hook. f. pertenece a un género sudamericano de la familia de las Rubiáceas. Esta familia se compone de unos 500 géneros y alrededor de 6000 especies, con una distribución cosmopolita, pero especialmente en áreas intertropicales. Para la Argentina, hay descriptos 41 géneros y aproximadamente 123 especies [4].
El género Heterophyllaea Hook. f. está representado por sólo dos especies con hábitat en la región andina de Argentina y Bolivia.
1) H. pustulata Hook. f., con hábitat en Bolivia y noroeste de Argentina.
2) H. licyoides (Rusby) Sandwich, distribuida principalmente en Bolivia y Perú [8].
dentadas, opuestas, con estípulas interpeciolares. Las flores tienen corola rojiza por fuera y blanca por dentro. El fruto es una cápsula subglobosa apergaminada. Inicia su brotación cuando los pastos naturales no lo hacen, induciendo a los animales a ingerirlas [8].
Figura 3. Ejemplar de H. pustulata Hook. f. en estado vegetativo
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De las partes aéreas de H. pustulata se aislaron, purificaron e identificaron diez antraquinonas (AQs) (Fig. 5), tres flavonoides (Fig. 6) y un iridoide (Fig. 7) [9,10]. Los compuestos aislados fueron:
AQs-aglicones: soranjidiol, 1-metil éter soranjidiol, rubiadina, 1-metil éter rubiadina, damnacantal, damnacantol, heterophyllina, pustulita, 5,5-antraquinona bisoranjidiol y 2-hidroxi-3-metil antraquinona.
Flavonoides: quercetina, isoquercitina, quercetina-3-O-α-D-glucosil-6"acetato
Iridoide glicosido (asperuloside)
1,6-dihidroxi-2-metil-7-metoxi antraquinona,AQ-1
2-hidroxi-7-metil-3-metoxi
antraquinona, AQ-2 5-5´-bis
(1,6-dihidroxi-2-metil antraquinona), AQ-3
1,6-dihidroxi-2-metil antraquinona (soranjidiol),
AQ-4
6-hidroxi-2-metil-1-metoxi antraquinona (1-metil éter
de soranjidiol) AQ-5
1,3-dihidroxi-2-metil antraquinona (rubiadina),
AQ-6
3-hidroxi-2-metil-1-metoxi antraquinona (1-metil éter
de rubiadina), AQ-7
2-hidroxi-3-metil antraquinona, AQ-8
3-hidroxi-1- metoxiantraquinona-2-aldehído (damnacanthal), AQ-9 3-hidroxi-2-hidroximetil-1-metoxi antraquinona (damnacanthol), AQ-10
CH3 OCH3 OH 10 9 8 7 6
5 4 3
2 1 H H H H H O O HO OCH3 O O CH3 O O OH HO CH3 O O OH H3C OH 1 2 5 6 1´ 2´ 5´ 6´ A C A C O O OH CH3
HO 4 3
quercetina isoquercitrina
3-O--D-(6”-acetilglucosil) quercetina
Figura 6. Flavonoides aislados de H. pustulata
Asperulósido
Figura 7. Iridoide aislados de H. Pustulata
2.3. Método de Extracción Convencional y Composición Química
de los Extractos
El método convencional para obtener los distintos extractos a partir de los cuales fueron aislados e identificados los metabolitos secundarios antes detallados, fue el Soxhlet.
La elección del método extractivo y del disolvente está determinada por la naturaleza fisicoquímica de los metabolitos que se quieren aislar y por la restricción de no producir alteraciones en los mismos.
Debido a que los compuestos de interés son sólidos y el disolvente es un líquido, la técnica convencional más adecuada para realizar la extracción es el Soxhlet, cuyo equipo de extracción se detalla en la Figura 9.
En el equipo Soxhlet se combinan los procesos de extracción – destilación, haciendo que el solvente cumpla ciclos continuos de extracción y purificación. La purificación del
O OH OH OH O OH HO O OH OH O OH HO
O OHOH
OH CH2OH
" 4" " O O OH OH O OH HO
O OHOH OH
O
CH2
solvente se realiza por destilación del extracto obtenido en la etapa previa, de manera que el material sólido siempre está en contacto con solvente puro.
.
Condensador
Solvente Soxhlet
Cartucho de papel de filtro
Figura 9. Equipo Soxhlet
El proceso de extracción comprende las siguientes etapas:
1) La muestra vegetal, desecada y finamente dividida, se introduce en un cartucho de papel que se ubica en el Soxhlet.
2) El solvente elegido (con una polaridad acorde con la polaridad de la sustancia a extraer) se coloca en el balón de destilación y se lleva a ebullición.
3) Los vapores del solvente de extracción ascienden por el tubo lateral del Soxhlet y condensan en la parte superior del aparato.
4) El condensado caliente cae sobre la muestra, produciendo su lixiviación mientras se va llenando el cartucho.
5) Cuando la cámara se ha llenado, el lixiviado (solvente de extracción + solutos disueltos) sifona y vuelve al balón de destilación para comenzar un nuevo ciclo.
Al finalizar una extracción, se obtiene un residuo (material vegetal agotado) y un extracto que es una mezcla de las sustancias disueltas en el disolvente usado.
En el procesamiento de H. pustulata se utilizan cuatro solventes de polaridad creciente, según el esquema que se muestra en la Figura 10. Luego cada extracto es concentrado a 40ºC y presión reducida, hasta sequedad.
Material Vegetal Seco y Fragmentado
1º-Ext. con Éter de Petróleo
2º-Ext. con Benceno
3º-Ext. con Acetato de Etilo
Extracto de Éter de Petróleo
4º-Ext. con Etanol
Extracto de Benceno
Extracto de Acetato de Etilo
Extracto de Etanol
Figura 10. Esquema de la extracción con solventes de polaridad creciente en Soxhlet
En la Tabla 2.2 se muestra la composición de los distintos extractos obtenidos con Soxhlet a partir de hojas y tallos de H. pustulata, utilizando los cuatro solventes orgánicos indicados en la Figura 10. Para cada uno de los extractos analizados, la tabla indica las AQs identificadas y su grado de abundancia en el extracto. [11]. Cada una de estas AQs puras fueron separadas y purificadas de los extractos obtenidos mediante Soxhlet
implicando la combinación de diferentes métodos cromatográficos: cromatografía en columna (CC) de adsorción y geles filtrantes, cromatografía circular y cromatografía de capa fina (TLC) [11].
Derivados antraquinónicos
Hojas Tallos
EP B Ac Et EP B Ac Et
AQ-1 1,6-dihidroxi-2-metil-7-metoxi-AQ + ++ +++ AQ-2 2-hidroxi-7-metil-3-metoxi-AQ +/- + + AQ-3 5,5´-bis (1,6-dihidroxi-2-metil-AQ) ++ ++ + AQ-5 6-hidroxi-2-metil-1-metoxi-AQ +/- ++ +++
AQ-4 1,6-dihidroxi-2-metil-AQ + ++ +++ + + ++ +++
AQ-6 1,3-dihidorxi-2-metil-AQ + ++ ++ + + +++ ++ +
AQ-7 3-hidroxi-2-metil-1-metoxi-AQ +/- + + ++ + +
AQ-8 2-hidroxi-3-metil-AQ +/- + +/- + +/-
AQ-9 3-hidroxi-1-metoxi-2-aldehído-AQ +++ ++
AQ-10 3-hidroxi-2-hidroximetil-1-metoxi-AQ ++ +
Extractos de: (EP) Eter de petróleo, (B) Benceno, (Ac) Acetato de etilo, (Et) Etanol.
Abundancia: (+++) muy abundante, (++) abundante, (+) cantidad considerable, (+/-) en trazas.
2.4. Actividad Biológica de los Extractos de
H.
pustulata
y de
sus metabolitos fotosensibilizantes
H. pustulata contiene compuestos químicos (AQs) que desencadenan sus efectos nocivos bajo la acción de la luz, a través de un fenómeno de fotosensibilización [6]. Estos metabolitos, como otros fotosensibilizantes, en presencia de luz y oxígeno molecular dan origen a especies reactivas del oxígeno (EROs). Básicamente, pueden ocurrir dos tipos de mecanismos de fotoactivación del FS, uno de ellos involucra la generación de radicales libres del oxígeno, tales como el radical anión superóxido (O2
▬
) (reacción fotodinámica tipo I) y otro mecanismo implica la producción de oxigeno singlete (1O2 ) (reacción fotodinámica tipo II)
herramienta terapéutica en su accionar como agentes antivirales, antibacterianos o antifúngicos, como así también en terapias contra ciertos tipos de cáncer.
A partir de dichos antecedentes y debido al interés que despiertan estos compuestos, el grupo de Farmacognosia (Departamento de Farmacia – Fac. de Ciencias Químicas – UNC – IMBIV-CONICET) llevo a cabo el estudio fotoquímico, fotofísico y fotobiológico de cada una de las AQs aisladas de H. pustulata aportando nuevos datos sobre las propiedades fotosensibilizantes de las mismas. Así, se pudo demostrar que nueve AQs poseen propiedades fotosensibilizantes (soranjidiol, 1-metil éter soranjidiol, rubiadina, 1-metil éter rubiadina, damnacantal, damnacantol, heterophyllina, pustulita, 5,5-antraquinona bisoranjidiol), mediadas por la generación del anión superóxido (O2.-; mecanismo de tipo I) y / o singlete de
oxígeno molecular (1O
2; mecanismo tipo II) [16,17].
En estudios posteriores, estas estructuras fotosensibilizantes, fueron evaluadas como agentes antibacterianos y anticancerígenos. En este sentido, se estableció que, cuatro de las nueve AQs estudiadas (damnacantal, rubiadina, soranjidiol y 5,5´-bisoranjidiol) poseen una importante actividad inhibitoria in vitro sobre Staphylococcus aureus, efecto que se relacionó con la estimulación del metabolismo oxidativo mediado por anión superóxido y oxígeno singlete. Además, se demostró que en presencia de luz, este efecto antibacteriano se incrementa hasta alcanzar un efecto bactericida para rubiadina, soranjidiol y 5,5´-bisoranjidiol, lo cual estaría ligado al aumento en la producción de ambas especies reactivas del oxígeno que provocan estas AQs en la bacteria, en presencia de luz [18,19] .
En este marco conviene destacar, la nula incidencia de estos compuestos sobre las células huésped (African green monkey kidney cells – Vero-) cuando son aplicados en las dosis efectivas como antibacterianos, lo que aumenta su factibilidad en el uso terapéutico [20].
Resultados similares se obtuvieron en ensayos in vitro sobre células de cáncer de mama humano, mediante los cuales se demostró que cinco de las seis AQs ensayadas (damnacantal, soranjidiol, damnacantol, 1-metil eter de rubiadina y 1-metil eter de soranjidiol), presentaron una importante actividad sobre células cancerígenas bajo irradiación, sin presentar una significativa toxicidad sobre células normales [19].
Además, es importante destacar que extractos bencénicos enriquecidos de AQs obtenidos a partir de H. pustulata poseen importante actividad antibacteriana, antifúngica y antiviral in Vitro, sin mediar un fenómeno de fotosensibilización [9,21]. Asi, frente a las distintas cepas bacterianas probadas, estos extractso presentaron actividad bacteriostática selectiva frente a
Micrococcus luteus ATCC 9341, Staphylococcus aureus sensible a la oxacilina y
Staphylococcus aureus resistente a la oxacilina. Con respecto a la actividad antifúngica los extractos demostraron tener un amplio espectro de actividad frente a varias especies de hongos de diferentes lesiones corporales como; Candidas spp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus
flavus y Trychophyton mentagrophytes [9]. En adicion, los extractos bencénicos y acetato de etilo ricos en AQs obtenidos de hojas y tallos mostraron actividad antiviral contra el Virus Herpes Simplex tipo I (HSV-1) [21].
A partir de estos antecedentes, y en función del interés que despiertan estos compuestos, en cuanto a sus actividades biológicas y su amplia gama de aplicaciones potenciales que podrían tener en la industria farmacéutica, es de gran interés en esta tesis encontrar un procedimiento adecuado para extraer estos compuestos a partir de la especie vegetal H. pustulata
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