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/Centro de Investigación Científica y de .w`\
Educación Superior de Ensenada
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DOCTORADO EN CIENCIAS
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CICESE
PROGRAMA DE POSGRADO EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA MARINA
DESARROLLO DE PROBIÓTICOS PARA LA CAMARONICULTURA
TESIS
que para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS
Presenta:
José Leonel Ochoa Solano
Y APROBADA POR EL SIGUIENTE COMITÉ
¿_ Joãš Olmoã Soto Director del Comité
GÉQM/vs tgå/mà
Dr. José de Jesús etyigía Michel Úr. Ferñãïxdo Díaz Herrera Miembro d Comité Miembro del Comité
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Dr. Saul Álvarez Bo ego Dra. us . ` ez Ac ña Miembro del Comité Miembro del Comité
Dr. Alexeüšd
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vish Licea Navarro Dr. Raúl R. Castro Escamilla Coordinador del programa de Director de Estudios de postgrado en Acuicultura y PostgradoBiotecnología Marina
México. Mayo del 2006.
DESARROLLO DE PROBIÓTICOS PARA LA CAMARONICULTURA
Dig. Jorgš Oh-nošSoto Director de Tesis
En un cultivo de camarón, el alimento constituye el insumo más costoso. La cantidad y la calidad de las dietas son factores principales que influyen sobre el crecimiento y La sobrevivencia del camarón, además, pueden contaminar el cultivo y la proliferación de enfermedades. En este estudio, se aislaron cepas de Bacíllus de origen marino. Los aislados fueron evaluados cualitativamente para la producción de proteasas, carbohidrasas y lipasas. Para la identificación de las cepas utilizamos técnicas de hibridación in situ fluorescente (FISH) y Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) utilizando el gene 16 rDNA, Además, las cepas fueron parcialmente secuenciadas e identificadas como B. subtilis y B. megaterium, (9b y 31) respectivamente. Posteriormente, las bacterias se crecieron en un caldo de cultivo económico, medio mineral soya (MMS) y fueron utilizadas para preparar una dieta practica artificial formulada sin harina de pescado y suplernentada con cepas bacterianas como probióticos. Se evaluó la composición proximal de la dieta. Después, la dieta se utilizó para la realización de un experimento con camarón blanco (Litopenaeus vannamei) en condiciones controladas y se comparó contra un alimento comercial. El experimento se realizó en CICESE, utilizando cinco tratamientos: 1. Basa] (B), 2. (B) + cepa probiótica 9 b, 3. (B) + cepa probiótica 31 4. (B) + cepas probióticas mezcladas 9b+3l y 5. (C) dieta Comercial. Se registró Sobrevivencia, Crecimiento, Factor de Conversión alimentario (FCA) y la salud del camarón. La calidad del agua se evaluó también.El tratamiento 2, (B) + cepa probiótica 9 b, influyo positivamente en el crecimiento y en el FCA, registrado por el camarón, sin mostrar diferencias significativas a la dieta comercial (p=0.70). La sobrevivencia y la salud de los camarones durante el experimento no mostraron diferencias estadisticas entre los tratamientos. La dieta sin probióticos, originó un crecimiento menor. En general, la calidad del agua de los cultivos que utilizaron alimento con probióticos fue mejor. La información generada de la presente investigación puede contribuir a la realización de alimentos económicos, sin harina de pescado para camarón.
Resumen aprobado por:
orientation in MARINE BIOTECHNOLOGY. Ensenada, Baja California, Mexico. May 2006.
DEVELOPMENT OF PROBIOTICS FOR THE SHRIMP CULTURE
In shrimp cultures, feed represents the most expensive production cost. The quantity and quality of diets are primary factors influencing shrimp growth, nitrogen loading of the culture system and disease proliferation. In this study, Bacillus strajns were isolated from marine environments. The isolates Were qualitafively assayed for proteases, carbohydrases and lipases using selective media. To identify the strains we applied Fluorescent in situ hybridization (FISH) and Polimerase Chain Reaction (PCR) by 16 rDNA gene analysis. In addition, the strains was partially secuenciated and identified as Bacíllus subtilis and B. megaterium, (Qb and 31) respectively. Subsequently the strains were grown in an inexpensive culture medium, soybean mineral medium (MMS) and they utilized to prepare an artificial practical diet formulated without fishmeal and supplement with bacterial strains as probiotics. The proximal analysis of the diets was evaluated. Subsequently, the diet was utilized for the realization of an experiment with white shrimp (Litopenaeus uannarnei] in conditions controlled and compared against a commercial food. The experiment was performed at CICESE, using five dietary treatments: l. Basal (B), 2. (B) + probiotic strain 9 b, 3. (B) + probiotic strain 31 4. (B) + mixed probiotic strain 9b+3l, and 5. (C) Comercial diet. Survival, Growth, Factor of Eating Conversion (FCA) and health of the shrirnp were tested. The quality of the water was evaluated during the experiment. The treatment 2, (B) + probiotic strain 9 b, influenced positively in the growth of the L. vannamei and in the Factor of Eating Conversion (FCA) and they was not different to the commercial diet (p=.70). Not supplementing the diet with probiotic, originated a smaller growth. The survival and the health was not statistical different in all the dietary treatments. In general, the quality of the water of the cultures where utilize feed with bacterial strains as probiotics was better. The information generated from the present investigation may contribute towards better feed formulations for shrimp without fishmeal at low cost, including bacteria] strains as probiotics.
Jorge Olmos Soto. Durante el desarrollo de este trabajo se contó con el apoyo económico de una beca de Doctorado en Ciencias otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyTj y con el proyecto
casos dificiles.
A mi madre y padre Carmen, por apoyarme durante toda mi vida.
A mi companera, amiga, novia, amante y esposa: Lorena, en las buenas, malas y peores, siempre ha estado conmigo.
A mis chiquitas Milery y Astery, energía de mi organismo.
A mi hermano Mauro, hombre de mi digo respeto y admiración. Miyova y mi sobrina Estefany mujeres de recio carácter pero noble corazón.
A mi Nana Chuy y al Yeyo que donde quiera que estén recibo su apoyo espiritual para continuar en mi vida.
A mis Tíos Linda y Manuel mis segundos padres,
A mis primos Barry, Panehita, Robei-tito, Lìndita y Rosita. A la familia García Ortiz por su cariño y estimación.
Al Raid y al Toñin por sus ensenanzas prácticas. A los Tijuana....por el gusto de haberlos conocido.
(CICESE) y al Departamento de Acuicultura y Biotecnología Marina por su apoyo incondicional y facilidades brindadas en el desarrollo de este trabajo.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACYT) por la beca crédito otorgada durante la realización de este trabajo.
A mi Director de tesis, Dr. Jorge Olmos Soto, por su confianza, apoyo y motivación al invitarme a esta nueva travesía de mi vida.
A mis sinodales por su atención, sugerencias y apoyo brindado,
A Rosalía, Maribel, Bily, Galdy y Ricardo, por su apoyo en la presente investigación.
A mis companeros Investigadores, Técnicos, Estudiantes, de todas las áreas del edificio (Acuicultura y Biotecnología Marina).
Al personal de mantenimiento por su apoyo en todo momento.
A Dolores, Miriam, Ma. Elena, Biby, Alejandrina y Cecy primeramente su amistad, tiempo y apoyo en todo momento.
ANTECEDENTES
II. l Historia del cultivo
II.2 La camaronicultura en el mundo II.3 Sistemas de cultivo
lI.4 Principales especies
II.5 Requerimientos nutrimentales II.6 Nutrición y enzimas digestivas 11.7 El alimento balanceado
II,8 La harina de pescado lI.9 La harina de soya
II. 10 Aditivos alimentarios y alimentos funcionales Il. 1 l Los Probióticos
II. 12 El género Bacíllus
JUSTIFICACIÓN
OBJETIVOS METODOLOGÍA
V. 1 Cepas bacterianas
V.2 Actividad enzimática en medios sólidos V. 2. l Proteasas
V.2.2 Carbohidrasas V.2.3 Lipasas
V.3 Curvas de crecimiento y medios de cultivo líquido V.4 Identificación molecular de las cepas
VI.
VII . VIII IX. X. XI.
V.7 Diseño experimental y evaluación del alimento
V.8
V.9 Análisis Estadístico
RESULTADOS
VI. l Cepas bacterianas Pruebas de estrés
VI. 2 Actividad enzimática en medios sólidos VI.2.l Proteasas
VI.2.2 Carbohidrasas VI _ 2. 3 Lipasas
VI.3 Curvas de crecimiento y medios de cultivo liquido VI.4 Identificación molecular de las cepas
VI.5
VI.6
Evaluación del probiötico en el alimento
Formulación y fabricación del alimento con probióticos VI.7 Diseño experimental y evaluación del alimento
VI.8 Prueba de estrés Discusión
Figura Pagina Invernadero utilizado para la realización de los
experimentos de la evaluación del alimento con probióticos bacterianos,
En la parte posterior, observamos las tinas utilizadas para la realización del bioensayo de evaluación del alimento con probióticos.
Coloración azul mostrada por las colonias bacterianas que confirma la producción de enzimas tipo amilasas.
En la parte superior izquierda se observa la coloración naranja alrededor de la colonia bacteriana producto de la actividad de enzimas tipo lipasas. Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 31, utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos. 0 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), ¡Medio Mineral Soya (MMS), -Medio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
(MMG),
Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 9 a, utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos. 0 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), lMedio Mineral Soya (MMS), ¢Medio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
(MMG).
Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 9 b utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos, 0 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), ¡Medio Mineral Soya (MMS), 0Medio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 2l b, utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos. 9 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), ¡Medio Mineral Soya (MMS), lMedio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
(MMG).
Cinética de crecimiento con 4 cepas en Mineral Melaza Soya (MMMS) 0 Cepa 33 I Cepa 34 A Cepa
46.
Aplicación de la metodologia de FISH, para la identificación bacteriana de probióticos del genero Bacillus.
Fermentador utilizado para alcanzar la biomasa bacteriana utilizada en la elaboración de las dietas analizadas.
Grafico de barras que detalla la distribución de frecuencias de los valores alcanzados por la variable
peso.
Peso final alcanzado por juveniles de Litopenaeus varmamei durante el experimento de alimentación. Factor de conversión alimentario obtenido con los 5 tratamientos por juveniles de Litopenaøus uannamei durante el experimento de alimentación.
Concentración de amonio registrada del agua utilizada durante el experimento de alimentación.
4 1
42
45
47
49
49
51
Concentración de nitrito registrada del agua utilizada durante el experimento de alimentación.
Concentración de nitrato registrada del agua utilizada durante el experimento de alimentación. Concentración de fosfatos registrada del agua utilizada durante el experimento de alimentación. Porcentaje de sobrevivencia alcanzado por los camarones alimentados con diferentes dietas y expuestos paulatinamente a bajas concentraciones de oxigeno.
56
57
58
Tabla Pagina I
II
Ill
IV
V
VI
VII
VIII
IX X
XI
Diferentes sustratos utilizados para la evaluación de las actividades enzimáticas mostradas por las cepas bacterianas, además, se describe la simbología de categorización utilizada.
Compuestos utilizados en la elaboración de los medios de cultivo analizados.
Oligonucleótidos utilizados para la identificación ftlogenêtica de las cepas
Diseño de los tratamientos experimentales utilizados durante la evaluación del alimento, a escala invernadero.
Diferentes observaciones realizadas para el análisis de patología en fresco [Lig'thner, 1993).
Resultados mostrados por las diferentes cepas al utilizar sustratos que contienen inhibidores de proteasas.
Resultados arrojados por las diferentes cepas para la actividad de proteasas extracelulares.
Cepas con actividad enzimática específica a los enlaces o~l,4 (amilosa) y (1 - 1,6 (amilopectina).
XIII
XIV
XV
XVI XVII
XVIII
XIX
XX
XXI
cepas.
Secuencia del oligonucleótido, tipo de fluorocromo y longitudes de onda empleados en la técnica de FISH, para la identificación del probiótico (Bacillus).
Composición proximal de los alimentos utilizados en los experimentos.
Análisis de varianza realizado a los datos de la variable peso de juveniles de camarón blanco Litopenaeus vannamei.
Factor de conversión alimentario registrado por los juveniles de camarón blanco Litopenaeus vannamei. Análisis de varianza realizado a los datos del factor de conversión alimentario, en el experimento de alimentación
Análisis de varianza realizado a los datos de sobrevivencia, registrado por los juveniles de camarón blanco Litopenaeus vannamei en el experimento de alimentación,
Valores promedios de los parámetros del agua de mar utilizada en los cultivos de Lítopenaeus 1/annamei (D.S.). Análisis de varianza realizado a los datos de concentración de amonio con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación..
XXIII
XXIV
concentración de nitrato con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación,
Análisis de varianza realizado a los datos de concentración de fosfatos con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación.
Análisis de varianza realizado a los datos de porcentaje de sobrevivencia, registrado en el experimento de bajas concentraciones de oxígeno.
58
Hoy en día, la pesca esta llegando a sus limites máximos permisibles de explotación, algunas especies muestran un estancamiento en sus volúmenes de captura, además, de el alto costo de los combustibles y energéticos dificulta y en algunos casos impide la rentabilidad de esta industria (Tacon y Foster, 2000; Tacon et al., 2002; Tacon et al,, 2005a,b; Boehmer, 2005).
En México, desde el año 2000 hasta el 2004, la producción pesquera ha registrado un crecimiento del 8%, en cambio, la acuicultura mantuvo una tendencia de incremento del 12%, incluso, se pronostica que en los próximos cinco años representará el 50 por ciento de la producción pesquera nacional. En el caso del camarón, principal pesquería del pais, su producción mediante la camaronicultura, supera ya a la que se obtiene por pesquerias (SAGARPA, 2003),
Dentro de los insumos utilizados para la producción de camarón, el alimento balanceado representa entre el 35 y 40 % de los costos de producción, por este motivo es fundamental que la formulación del alimento se realice con ingredientes de calidad y con un costo-beneficio rentable (Cruz-Suárez, 1998; Zendejas-Hernández, 1998; Berger, 2000; Meza, 2001; Bautista-Teruel et al., 2003).
Uno de los principales ingredientes en la formulación de alimentos para los organismos cultivados, pa.r†.icula.rmente en alimentos para camarón es la harina de pescado (Smith et al., 2000]. Sin embargo, el costo, el impacto negativo que produce sobre las poblaciones de peces en el mundo y los metabolitos tóxicos derivados de su procesamiento, son factores determinantes que han aumentado el interés por identificar ingredientes alternos a la harina de pescado dentro de la formulación de alimentos para organismos acuáticos, es decir, que los ingredientes que componen las dietas contarninen menos y en gran medida, no dependan de los productos pesqueros (Hardy, 2000; Naylor et al., 2000).
mantenido estable (Lim et al., 1998; Hardy, 1999; Storebakken et al., 2000; Divakaran et al., 2000; Swick, 2002). Sin embargo, aumentar el porcentaje de inclusión de ingredientes vegetales en el alimento balanceado para camarón, puede reducir la digestibilidad de la dieta y por lo tanto, la biodisponibilidad de los nutrimentos del alimento disminuye. Por estas razones, es necesario utilizar aditivos para intentar convertir a estas dietas con una base vegetal en un alimento rentable para el cultivo de camarón, es decir, un alimento mas asimilable y menos contaminante, que por consiguiente incida en un mejor crecimiento y una mayor sobrevivencia de los organismos.
La nutrición funcional es una de las áreas de investigación de mayor interés en el campo nutricional y de los aditivos biológicamente activos que últimamente han recibido mayor atención son los probióticos (Hasler, 2002; Hong et al., 2004).
II. ANTECEDENTES
II.1 Historia del cultivo
Varias especies de camarones marinos han sido cultivadas en el Sureste Asiático desde hace siglos, pero intentos para tecnificar esta actividad comenzaron en la década de 1930 (Jory, 2001]. En Japón, Fujinaga en 1934 inició los experimentos para el cultivo de camarón Penaeus japonicus y fue hasta 1959 cuando bajo su dirección se empiezan a operar las primeras granjas de ciclo completo de este crustáceo (Orbe y Arias, 1987). Las técnicas modernas para el cultivo de camarón se iniciaron hace aproximadamente 20 años (Rosenberry, 2004].
II. 2. La camaronicultura en el mundo
El cultivo de camarones Peneídos es el sector acuícola de mayor crecimiento, debido a su alto precio, lo que genera en la mayoría de los casos, divisas a los paises productores. Por consiguiente, constituye una actividad en desarrollo constante de biotecnologias de cultivo (Yusoff et al., 2001). Actualmente la camaronicultura se practica en 50 paises de todo el mundo. En el hemisferio este, Tailandia, Vietnam y China son lideres en producción, mientras que India, Indonesia, Malasia, Taiwán, Bangladesh, Sri Lanka, Filipinas, Australia y Myanmar participan con sus producciones, En el hemisferio oeste, México, Ecuador y Brasil son los principales productores, existiendo además granjas en Honduras, Belice, Panamá, Colombia, Guatemala, Venezuela, Nicaragua y Perú. En Medio Oriente, se registran importantes producciones de camarón en Arabia Saudita e Irán (Rosenberry, 2004).
IL3. Sistemas de cultivo
IL4. Principales especies
Existen unas 2.500 especies de camarones en el mundo, pero sólo una docena son explotadas comercialmente. En general, todo el camarón de cultivo pertenecen a la familia Penaeìdae y la producción en granjas está representada por unas pocas especies. La especie "tigre negro" (Penaeus monodon) domina la producción en granjas del Sudeste Asiático, contribuyendo con más de la mitad de la producción de cultivo en los últimos años. El camarón blanco del Pacifico (L. varmamei] prevalece en mas del 90% de la producción en granjas de America. Existen otras especies que son también explotadas comercialmente, blanco chino (Fenneropenaeus chinensis), japonés 0 kuruma (Marsupenaeus japonicus), blanco indico (Fenneropenaeus indicus), azul (L. stylirostris).
ILS. Requerimientos nutrimentales
Los requerimientos nutrimentales de diversas especies de camarones Peneidos han sido estudiados extensamente por numerosos investigadores. Información detallada sobre el tema, se puede obtener consultando Akiyama et al., (1991, 1992) y D'Abramo et al., (1997).
Los carbohidratos son considerados como la forma más barata de energía dietética, pero su utilización y metabolismo por el camarón son limitados, dado que su sistema digestivo no cuenta con las enzimas necesarias para desdoblar a los carbohidratos utilizados en la elaboración de alimentos balanceados. Los disacáridos como la sacarosa y polisacáridos como el glucógeno, la dextrina y almidón son más utilizados por el camarón que los monosacáridos (D'Abramo et al., 1997).
Las vitaminas hidrosolubles requeridas en las dietas para camarón son: tiamina (Bi), riboflavina (B2), piridoxina (B3), ácido pantoténico, niacina, biotina, inositol, colina, acido fólico, cianocobalamina (B12) y ácido ascórbico y las liposolubles son: A, D, E y K. Los minerales esenciales son el calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg), sodio (Na), potasio (K), cloro (C1), cobre (Cu), azufre (S), hierro (Fe), selenio (Se), zinc (Zn), manga-meso (Mn) y cobalto (Co) (Lim y Akiyarna, 1998).
11.6. Nutrición y enzimas digestivas
organismos la digestión comienza en la cavidad cardiaca del estómago y se continúa en los túbulos del hepatopáncreas. Este órgano, a diferencia del intestino y estómago, presenta una mayor actividad enzimática, de ahí, la importancia de éste órgano en la síntesis y secreción de enzimas digestivas (Guillaume y Ceccaldi, 2001). En Lítopenaeus vannameí al igual que en otras especies de Peneidos, se ha determinado la presencia de enzimas endógenas tales como, tripsina, quimotripsina, aminopeptidasa, lipasas, amilasas, carboxìpeptidasa A y B. La quitinasa y celulasa, son enzimas también identificadas pero se cree que son de fuente exögena (Ceccaldi,
1997; Cruz-Suárez, 1998).
IL7. El alimento balanceado
IL8. La harina de pescado
Tradicionalmente, la harina de pescado ha sido la principal fuente de proteina en la formulación de alimentos para organismos cultivados (Dersjant-Li, 2002) particularmente en la fabricación de alimentos para camarón, constituye uno de los ingredientes más importantes, en los que se agrega entre el 20 y 30%. Su inclusión es fundamental por su alto contenido de proteina, (Smith et al. 2000), sin embargo, el uso de altos niveles de proteína animal en las dietas, incrementa considerablemente el costo, favorece la eutrofización e impacta directamente en la calidad del agua, por lo que su uso en altas concentraciones no es rentable (Le Chevalier y van Wormhoudt, 1998).
IL9. La harina de soya
bacterias, mismos que son nocivos a camarones (Berger, 2000; Francis et al., 2001). La harina de soya es utilizada en la formulación de alimentos balanceados para cerdos, aves, peces y camarones (Swick, 2002). La fracción proteica que contiene va desde 45 al 48% para las harinas comunes, mientras que la de grado “premium” supera el 50%. Referente a su composición de carbohidratos, la harina de soya contiene entre 33 y 35%, niveles considerables de oligosacáridos, un 4-5% son sacarosa, l›2% de rafinosa, 3.5-4.5% estaquiosa, además de pequeñas cantidades de melibiosa y verbascosa, los cuales componen hasta el 12% de la fracción de carbohidratos. La fracción restante son polisacaridos no derivados del almidón, mismos que comprenden del 14 al 18% restante de la fracción correspondiente de carbohidratos (Francis et al., 2001).
11.10. Aditivos alimentarios y alimentos funcionales
Un aditivo alimentario esta definido como una materia pura o mezclas, agregados a los alimentos para realizar una o varias funciones específicas (Chong-Carrillo y Vega-Villasante, 2002). La investigación y uso de estos, se agrupa principalmente en aquellos que estimulen el crecimiento y pudieran clasificarse de la siguiente forma: l) actúan fisiológicamente (hormonas, aminoácidos, péptidos) y 2) indirectamente antibióticos, inmunoestimulantes, probióticos, antioxidantes, enzimas, atractantes y estimuladores del apetito.
dirigida y especifica, beneficien una 0 varias funciones en el organismo. Además, de que exhiba un efecto fisiológico más allá de los efectos aportados por el alimento, es decir, ayude a conservar el estado de bienestar y salud del organismo y/ o participe en la prevención o reducción de enfermedades.
II. 11. Los Probiôticos
La palabra probiótico deriva del griego y significa "para la vida". En un concepto general, podemos definir a un probiótico como: un suplemento microbiana vivo formado por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados, los cuales son adicionados con la finalidad de beneficiar al hospedero (Fuller, 1992; Gatesoupe, 1999).
II. 12. El género Bacillus
III. JUSTIFICACION
En nuestro Pais, el cultivo de camarón requiere ser más rentable y competitivo. El desarrollo de esta industria, enfrenta la caída de los precios de comercialización y las regulaciones ambientales. Como una solución, el alimento tiene un papel muy importante, es el insumo mas caro, debido principalmente al aumento constante del precio de la harina de pescado, puede constituir la principal fuente de contaminación de los efluentes y puede modificar la calidad e inocuidad del producto terminado. Por lo tanto, la calidad y el costo del alimento son factores críticos para la rentabilidad de un cultivo de camarón. En este sentido, podemos decir que la información generada en la presente investigación apoyaría en gran medida al sector productivo con alternativas económicas de solución al costo del alimento, Además, la utilización de dietas funcionales a base de insumos vegetales y probióticos bacterianos podrían resultar una solución de fondo, innovadora y exitosa, para elevar la rentabilidad y el desarrollo sustentable del cultivo de camarón en México,
Hipótesis
IV. OBJETIVOS
IV.1. Objetivo general
Caracterizar y producir microorganismos con potencial probiótico para su incorporación en alimentos funcionales y evaluar su rentabilidad, mediante la realización de un cultivo con camarón blanco (Litopenaeus
varmamez] bajo condiciones controladas. IV.2. Objetivos específicos
IV.2.1. Seleccionar y caracterizar cepas bacterianas del género Bacillus, que produzcan enzimas tipo proteasas, carbohidrasas y lipasas.
IV.2.2. Implementar biotecnologías para la incorporación del probiótico a un alimento formulado para juveniles de camarón.
IV.2.3. Identificar y cuantificar el probiótico en el alimento.
IV.2.4. Valorar la salud de los organismos durante el desarrollo del cultivo, mediante el análisis patológico del camarón.
IV.2.5. Determinar el porcentaje de sobrevivencia, crecimiento y el factor de conversión alimentario (FCA), registrado por los organismos alimentados con las diferentes dietas formuladas.
IV.2.6. Medir la resistencia de los camarones alimentados con las diferentes dietas mediante una prueba de estrés inducida por bajas concentraciones de oxigeno.
v. 1v1E'roDoLoeíA
V.1. Cepas bacterianas
Para el aislamiento y selección de las cepas bacterianas utilizadas en el estudio, se utilizaron sedimentos, agua, sustratos de origen marino, entre otros y fueron señaladas como 33, 44, 9 a, 1, 2lb, 49, 10a, 31, 46, 42, 30, 9b, 36, 43, 32, 48, 19, 3, 34, 20 a, Z y R. Dichos microorganismos fueron preservados a -70 °C en tubos eppendorf de 1.5 ml con medio de cultivo rico Luria-Bertani (LB) y glicerol, en el Laboratorio de Microbiología Molecular, Biotecnología Marina, (CICESE). Para la reactivación de las bacterias, se utilizaron cajas Petri con LB sólido y fueron crecidas durante 24 horas a 37°C. Posteriormente, los microorganismos fueron estriados en 2.5 ml de LB sólido, contenido en viales de 4 ml y se denominaron cepas de trabajo, mismas que fueron utilizadas para la realización de los bioensayos posteriores descritos a continuación.
V.2. Actividad enzimática en medios sólidos
V.2.1. Proteasas: Para la detección de actividad proteolitica se utilizaron cajas Petri con medio “Salt Water Complete” (SWC) y leche descremada 2.5% (peso/volumen). Además, para aumentar y complementar las finalidades investigadas en el estudio, se utilizaron diversos ingredientes derivados de compuestos basados en harina de soya, esto con la finalidad de perfilar la búsqueda de enzimas tipo proteasas, especificas para proteina vegetal (soya). De igual forma, también se diseñaron diferentes bioensayos en los cuales se utilizaban los componentes del frijol soya crudos, es decir, sin haber pasado por algún tratamiento térmico o químico de alguna índole. Lo anterior con la finalidad de observar algún efecto significativo que pudieran presentar los inhibidores de proteasas presentes en el frijol soya crudo,
MMG con melibiosa y rafinosa. Las colonias que se seleccionaron fueron aquellas que mostraron el mayor tamaño de halo de degradación degradaron el sustrato especifico con la presencia de coloración azul (Arellano-Carbajal y Olmos-Soto, 2002).
V.2.3. Lipasas: La producción de enzimas tipo lipasas, se observó mediante la utilización de MMG con aceite de oliva 2.5% (peso/volumen) y la solución de Rodamina B 0,00 1% (peso/volumen). La presencia de la actividad se observó, mediante la irradiación de los cultivos con luz UV (350 nm) (Jaeger y Kouker, 1987), además, de la coloración naranja mostrada por las colonias.
Tabla I. Diferentes sustratos utilizados para la evaluación de las actividades enzimàticas mosüadas por las cepas bacterianas, además, se describe la simbología de categorización utilizada. Enzima: Medio de Cultivo Sustrato especiflco Proteasas Carbohidrasas Glucosidasas Galactosidasas Lipasas Símbolo +++ ++ +
"Salt Water Complete"
(SWC)
Medio Mineral Glucosa
(MMG)
MMG con ci-X-Glu. MMG con ci-X-Gal MMG con Rodamina B
Categoria excelente muy bien
bien nula
Leche descremada, leche de soya, soya texturizada, harina de soya, pasta de soya y aislado de soya.
Harina de soya tostada, H. soya cruda, H. maiz, H. trigo H. microalga y almidón.
Amilosa y amilopectina Melibiosa y Rafinosa.
Aceite de olivo, Margarina de soya, lecitina de soya, aceite de soya, mezcla ácidos grasos y aceite de pescado,
Halo de degradación (cmzl)
0,75 - 1 cm”
0.50 - 0.75 cm? 0.10 - 0.50 cm2
sin halo V. 3. Curvas de crecimiento y medios de cultivo líquido
crecimiento bacteriano barato, para la formulación de un medio de cultivo económico. Además, que después de los procesos de fabricación del alimento peletizado, el número de colonias recuperadas (UFC) sea al menos de 1 X 104 células por gramo, Para lo anterior, se realizaron diferentes formulaciones utilizando medio mineral (MM) y algunas modificaciones de los sustratos (Tabla II),
Tabla II. Compuestos utilizados en la analizados.
elaboración de los medios de cultivo
Medio Componentes Concentración
Medio Mineral (MM)
Medio Mineral Melaza Soya (MMMS)
Medio Mineral Soya (MMS)
Medio Mineral Sacarosa (MMSA] Medio Mineral Glicerol (MMG)
lg/L1
4
5.3
(NH4)2SO4
KQHPO4
KHQPO4 6.4
MgSO4.7H2O 0.4
[mg/L]
5
40
30
Ml'lCl2
CaC12
F€SO4.7H20
MM + Melaza de [g/L]
Caña + Pasta de 2 + 2 Soya
MM + Pasta de 2 Soya
MM + Sacarosa 2
V.4. Identificación molecular de las cepas.
Se llevó a cabo una tinción de Gram con las cepas seleccionadas para determinar si eran Gram positivas (Priest, 1993). Para la extracción de ADN cromosomal, las cepas se crecieron por 12 horas (37°C y 300 rpm) con 4 ml de medio de cultivo Luria Bertani. Los fermentos bacterianos (lrnl c / ul, se colocaron en tubos eppendorf y fueron centrifugados a 16,000 rpm durante 3 min., el sobrenadante fue eliminado. Las células se resuspendieron en 567 ul de una solución amortiguadora de TE (10 mM. Tris-HCI; 0.1 mM EDTA). Estos "botones"ce1ulares, fueron utilizados para el aislamiento del ADN cromosomal, mediante el método de lisis alcalina y fenol-cloroformo (Olmos y Contreras, 2003). La presencia del ADN fue verificado en un gel de agarosa al 1.2 %.
min. a 72°C y un ciclo a 72°C por 10 min. (Arellano-Carbajal y Olmos~Soto, 2002). Además, el producto de PCR de las cepas 9b, 31 y 33, fue posteriormente purificado por el método de fenol-cloroformo (Sambrook et al., 1989] y resuspendido en agua destilada estéril, se verificó en un gel de agarosa al 1.2% y se realizó el análisis de las secuencias en San Diego State University, Microchemical Core Facility. Por último, sus secuencias fueron comparadas con secuencias conocidas y registradas en el "Gen Bank", del "National Center Biotechnologf".
Tabla III. Oligonucleótidos utilizados para la identificación filogenética de las cepas.
Oligonucleótido Tamaño Secuencia
l6S fDNA universal para 17 pb GAG-'1`TT-GAT-CCT-GGC-TC procariotas
V. 5. Evaluación del probiótico en el alimento
Para confirmar la presencia de las bacterias probióticas en el alimento peletizado, se realizó el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC/gj, Una muestra de 0.1 g de alimento, se incubó por 30 min a 30°C en lml de medio de cultivo mineral melaza soya (MM). Posteriormente, a partir de una serie de diluciones, 50 ul del fermento bacteriano, se "perleo" en cajas Petri con MM con agar, se incubo por 24 horas a 30°C, pasado ese tiempo se contaron las colonias en las cajas y los valores se extrapolaron al contenido de un gramo de alimento. Además, este tipo de bioensayos fueron repetidos para evaluar la presencia del probiótico en el alimento un año después de haber sido fabricada la dieta.
V. 6. Formulación y fabricación del alimento con probiótico Las dietas se formularon con ayuda de un programa computacional, tomando en cuenta el análisis bromatológico de los ingredientes y los requerimientos nutricionales recomendados por Akiyama et al., (l99l;
1992) y Cruz-Suarez et al. (1998).
Se elaboraron 4 diferentes dietas (Tabla IV) en el laboratorio de nutrición del departamento de acuicultura-biotecnología del CICESE. Los ingredientes utilizados fueron molidos y tamizados hasta que el tamaño de la partícula fue menor a las 250 micras y asi, obtener un buen mezclado. Los ingredientes menores se agregaron poco a poco a la mezcla, el aceite de pescado se adicionó previamente calentado a 25°C y se mezclaron en una batidora Kitchen Aid de 4 litros de capacidad. Por otro lado, concomitante a las actividades descritas anteriormente, las cepas bacterianas se crecieron hasta alcanzar volumenes entre 750 ml y 1000 ml. El tiempo de crecimiento bacteriano estuvo entre las 4 y 7 horas, según la cepa utilizada. Posteriormente, la bacteria fue incorporada al resto de los ingredientes, con un porcentaje de inclusión del 20 al 30%.
El alimento elaborado se colocó en bolsas de polietileno previamente etiquetadas para su uso posterior, dejando muestras para evaluar la persistencia del probiótico (vida de anaquel).
Para el análisis proximal de la dieta se utilizó el método Kjeldahl (N X 6.25) para estimar el contenido de proteínas y el método de Soxhlet para calcular los lípidos. El contenido de carbohidratos se estimó indirectamente por diferencia en peso. El contenido de humedad del alimento se cuantificó de manera gravimétrica, con la desecación en estufa a 60°C por 24 horas de muestras con el peso conocido. El contenido de cenizas, fue calculado de manera similar al contenido de humedad, pero se utilizó una mufla a 460°C para calcinar las rnuestras.Tabla IV. Diseño de los tratamientos experimentales utilizados durante la evaluación del alimento, a escala invernadero.
Dietas Descripción Referencia 1 Basal (B) Cruz-Suárez, et al.2000 2 (B) + Cepa probiótica 9 b
3 (B) + Cepa probiótica 31 4 (B) + Mezcla 9b+3l
V.7. Diseño experimental y evaluación del alimento
Condlclones de Invefnn erod
Se utilizaron 15 tinas de plástico de forma oval, de 120 l y 0.5 mi (Fig. 1). El período de tiempo del bioensayo fue de 4 semanas y consistió en 5 tratamientos (dietas) con 3 repeticiones de cada uno (Tabla IV).
al
mi
¡i
h
'
-Figura 1. Invernadero utilizado para la realización de los experimentos de la evaluación del alimento con probióticos bacterianas.
De cada tratamiento con sus 3 repeticiones, se registró el peso húmedo de todos los organismos. La sobrevivencia se estimo como el valor promedio del número de organismos presentes en las tinas al final del experimento. El factor de conversión alimentario (FCA) fue calculado dividiendo el total de g de alimento suministrado entre el peso húmedo total de los organismos.
L4" '_ ~ mh__
uf/¬/¬
,-\i«,',,' vá/
H 'H /1%/
Durante el experimento se utilizó agua íiltrada a 20 micras y la temperatura del agua se mantuvo por las condiciones ambientales en el interior del invernadero. Las lecturas de temperatura se tomaron con un termómetro de mercurio de precisión de ± 0. l°C.
La salinidad del agua se midió con un refractómetro marca Fisher brand modelo 8601 y el pH con un potenciómetro marca Corning con una resolución de ± 0,01. Se utilizaron piedras de aireación de 5.08 x 1.27 cm, para difundir el aire y mantener el oxígeno disuelto de agua de las tinas entre 6 y 7
mgl'1-El oxigeno se midió con un oxímetro marca YSI 52. mgl'1-El recambio diario de agua en cada una de las tinas fue aproximadamente el 3%.
La cuantificación de los parámetros amonio, ninfito, nitrato y fosfato se realizó basados en reacciones colorimétricas y cuantificadas con un espectrofotómetro marca HACH.
Tabla V. Diferentes observaciones realizadas para el análisis de patología en fresco (Ligthner, 1993).
Observación Características Branquias Intestino Lípidos Túbulos del hepatopancreas Necrosis de exoesqueleto Pigmentación de exoesqueleto
Flacidez del músculo
Coloración del telson
Segmentación de
antenas
Ausencia de protozoarios parásitos
Menos del 10% cubiertas por protozoarios parásitos Menos del 50% cubiertas por protozoarios parásitos
El 100% cubiertas por protozoarios parásitos
Ausencia de gregarinas
Menos de 10 gregarinas adultas Entre 10 y 50 gregarinas adultas
50 o mas gregarinas adultas
Ausencia total de esferas de lípidos
Leve presencia de esferas de lípidos
El 25% de cada túbulo con esferas de lípidos
El 50% de cada túbulo con esferas de lípidos Todos los túbulos llenos de lípidos
'Hìbulos lisos y con grado 4 de lípidos
Presencia leve de tübulos estrangulados
El 25% de los túbulos estrangulados en varias partes El 50% de los túbulos estrangulados y secos
Túbulus secos, sin lípidos y con necrosis
Sin necrosis
Pequeñas manchas negras en el exoesqueleto Grandes manchas negras que cubren del 20 al 50%
Cromatóforos de color café claro Cromatöforos de color rosado claro
Cromatóforos de color rojizo
El tejido del abdomen está firme El tejido está blando al ser presionado
Los urópodos del telson tienen color café claro
Los uröpodos tienen un color rojizo ligero
Los urópodos tienen color rojo intenso y estan ampollados
Las antenas tienen una textura lisa y son suaves Las antenas estan ligeramente rugosas al tacto
V.8. Pruebas de estrés
V.8.1. Bajas concentraciones de oxigeno
A1 finalizar el experimento de evaluación de los 5 diferentes alimentos (tratamientos), 4 camarones de 12 (± 0.27] gramos, fueron colocados en acuarios de acrílico de 20 1 con tres repeticiones. Los acuarios fueron llenados con agua de mar con una concentración inicial de oxígeno disuelto de 6.7 mg/1. Los acuarios no se taparon y no se le suministro aireación, ni tampoco alimento. Se registro la concentración de oxigeno en los diferentes acuarios a intervalos de 2 h durante 24 horas. Al final se reportó la concentración final de oxigeno y la sobrevivencia final alcanzada por los camarones en cada acuario.
V. 9. Análisis Estadístico
VI. RESULTADOS
VL 1. Cepas bacterianas.
En general, de los sustratos y sedimentos de origen marino, se eligieron 19 cepas como candidatas potenciales para producir enzimas tipo proteasas, carbohidrasas y lipasas.
VI. 2. Actividad enzimática en medios sólidos VI. 2. 1. Proteasas
Se observó que las cepas seleccionadas 33, 34 y 31, crecieron en cajas preparadas con extracto de frijol soya crudo, es decir que el tipo de proteasas producidas por La bacteria no se afectaron por los inhibidores de tripsina presentes en el frijol soya crudo (Tabla VI).
Tabla VI, Resultados mostrados por las diferentes cepas al utilizar sustratos que contienen inhibidores de proteasas.
Salt Water Complete (SWC) con: CEPA Frijoly Y Pasta V
soya Frljol soya soya Pasta soya Selec Crudo desnaturalizad cruda desnaturalizada
o
33 +++ + ++ + 33
93 ++ ++ ++ + 9a
1 + + ++ +
211) + +++ +i-t ++ 21])
3 ++ ++ ++ +++ 3
34 +++ 31 +++
Z _
++ +++
+++ +++
+ 34
En la Tabla VII, se aprecia el comportamiento de las cepas analizadas, utilizando diferentes ingredientes que contienen proteína de soya. Las cepas 33, 9a, 2lb, 31, 3 y 34, mostraron mayor actividad proteolítica.
Tabla Vil. Resultados referentes al halo de degradación producido por las diferentes cepas para la actividad de proteasas extracelulares.
Salt Water Complete (SWC) con:
Leche Leche de Soya Aislado Selec Descremada
33 + 44 ++ 9 a +++
1 +++
21b +++ 49 ++ 10 a ++ 31 +++
46
+
42 -30 ++ 9b ++ 36 -43 › 32 ~ 48 + 19 + 3 +++ 34 +++ 20 a soya texturiz + +++ ++ + +++ + +++ +++ +++ +++ +4- + ++ + +++ +++ + +1' ++ + ++ + + + + + +++ +++ +++ +++ada proteico de
soya ++
+
+++ 9 3
+ 1 † 211: ++ + +++ + 33 31 + + + + + 3 +++ 34 + + + +
Z + + + +
R + + + +
VI. 2.2. Carbohidrasas .Amìlasas 1 glucosidasas
Los microorganismos con actividad enzimática de hidrólisis de almidón fueron los siguientes 33, 9a, 2lb, 49, 10a, 46, 42, 9h, 34, 31, Z, R. Posteriormente, se corroboraron utilizando un indicador específico cualitativo (Fig. 3) y de esta forma se determinó la actividad de hidrólisis especifica a los enlaces (1-1,4 y o~l,6 del almidón (Tabla VIII). Además, se observó que algunas cepas no pudieron degradar tales fuentes, lo que nos permite afirmar que su crecimiento fue debido al metabolismo de otro tipo de sustrato, por lo que no fueron seleccionadas.
Tabla VIII. Cepas con actividad enzimática específica a los enlaces oi-1,4 (amilosa) y a~ 1,6 (amilopectina).
Medio Mineral Glucosa (MMG)
Amilosa + Amilopectina + Selección por X - oi - glu X - on - glu actividad
33
+
9 a +
21b ›
49 +
10 a +
46 +
42
-9b
+
34
-31 +
Z _
R _
+ 33
+ 9a
+++++
49 10 46 9b
+ 31
Galactosidasas
En los bioensayos planteados para la selección de bacterias con actividad referente a la degradación bacteriana de los oligosacáridos presentes en la harina de soya (Tabla IX). Cabe mencionar, que el crecimiento bacteriano de las cepas analizadas fue inapreciable, por lo que, el criterio de selección de las cepas fue los resultados positivos para la producción enzimática de oz-galactosidasas. Se observó que solo las cepas 33, 31 y 42 mostraron la actividad.
Tabla IX. Selección de bacterias productoras de ot- galactosidasas. MMG
Melibiosa + X - Gal Rafinosa + X - C1-al Selec
as
+
+
aa
44
_
-9 a l 2 lb
49 10 a
46 42 9b 36 43 32 48 19 3 34 31
Z R
+
+
+ 42
+ 31
VI. 2.3. Lipasas
La búsqueda de cepas que produjeran enzimas denominadas lipasas (Figi 4) es mostrada en la tabla X, Se pudo observar que las mismas cepas (33, 9a, 1, 3 y 9b], presentaron buena secreción de tales enzimas, ademas, cabe agregar, que las cepas (Z y R) también presentaron un buen nivel de producción.
Tabla X. Diferentes sustratos e indicadores utilizados durante la búsqueda de cepas productoras de enzimas tipo lipasas.
__ _ __CEPAS _
33 9a 21b 1 3 34 46 9b Z R Margarina +++ ++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ de soya
Leeitina de +++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ soya
Aeeite de soya +++ + +++ + + + ++ ++ ++ ++ Mezcla ácidos
grasgede +++ + ++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ origen marino
Aceite de + + + + ++ ++ ++ + ++ ++ pescado
Sgyaimçegral ++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ Aeeitede +++ ++ _ ++ ++ _ _ ++ ++ ++ olivo+
Rodamina
Selección 33 9 a 1 3 9h Z R Halo de degradación (cm2) +++ 0.75-1, ++ 0.50-0.75, + 0.10-0.50; 0.0
Tabla XI. Degradación de algunos ingredientes que integran una dieta para camaróni 33 9 a 1 21b 49 10" 46 42 9b 3 34 20 a 31 Z
Salt Water Complete (SWC) con: __ H. soya H. alga H. maíz H. trigo Selección
++-++ †+ ++ + + ++ + + +++ +++ + +++ + ++ + ++ + + +++ + + + + +++ ++ + +++ +++ +++ + + ++ ++ + + ++++++ ++ +4-+ + ++ ++ +++ + +++ + +++ + ++ +
R + + + +
33 21 b 46 911 3 34 31 Halo de degradación (cm2) +++ 0.75-1, ++ 0,50-0.75, + 0.10-0.50; 0.0
En la Tabla XII, se resume las diferentes actividades enzimáticas observadas de las diferentes cepas bacterianas analizadas.
Tabla XII. Actividades enzimàtícas observadas de las diferentes cepas.
CEPA A(7.l`IVIDAD I OBSERVACIONES
Í iï, im mn Ífm ,am
33 9 b 34 3 21b 9 a 46 42 31 Z R DESCARTADA
Galactosidasas, CHO y Lipasas Glucosidasas, Proteasas y Lipasas Proteasas, Lipasas y CHO
Proteasas, Lipasas y CHO Proteasas y CHO
Proteasas, Lipasas y CHO Glucosidasas
DESCARTADA
Proteasas, Lipasas y CHO. Lipasas
Figura 3. Coloración azul mostrada por las colonias bacterianas que confirma la producción de enzimas tipo amilasas.
VL3. Curvas de crecimiento y medios de cultivo líquido
El medio de cultivo compuesto por medio mineral melaza y soya (MMMS), fue el que origino un mayor crecimiento para las cepas bacterianas analizadas. En cambio, los medios compuestos por medio mineral y sacarosa [MMSA) y medio mineral glicerol (MMG) el crecimiento fue inferior en relación con las otras 2 curvas, con un valor promedio a las 8 horas entre 1.5 y 2 de D,O. (Fig. 5, 6, 7 y 8).
5
4,5
._ 4
densidadóptica(600nm
N 1»
9'oi
3
2 'uu
1 O`5
0 ¬ . i i i . - . CI 2 4 S B 10 12
tiempo (11)
Figura 5: Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 31, utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos. 0 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), ¡Medio Mineral Soya (MMS), oMedio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
La cepa 9 a (Fig, 6) y 9 b (Fig. 7] mostraron un comportamiento similar, pero el valor alcanzado a las 8 h con MMMS superó las 4.5 D.O., un crecimiento superior a la cepas 31. Cabe agregar, que posiblemente la cepa 9 b, presentó ciertas ventajas metabólicas con las demas, puesto que los valores alcanzados con MMSA y MMG superaron a el crecimiento de las otras 3 cepas (31, 9 a y 21h). De este grupo se seleccionó la cepa 9 b, como candidata potencial para fabricación de la dieta.
5
4.5
densidadóptica(600nm)
5.
Za
3.5 3
\¡//-¡_-1
2 1 0.5
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U 2 4 6 B 1 D 12
tiempo (h)
5 4,5
densidadóptica (600nm]
G
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3,5 3
2
l 0,5
9 ,
o z 4 s a 1o 12
tiempo (h)
Figura 7: Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 9 b utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos. 4 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), ¡Medio Mineral Soya (MMS), oMedio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
(MMG).
aporte e
significativo para el crecimiento bacteriano. Por lo tanto, se decidió que el nergético generado por la melaza de caña de azúcar resultó
MMMS sea utilizado para evaluar las siguientes 3 cepas (33, 34, 46].
5 4,5
densidadóptica(600nm) esa
N “oi 2
"ui
1
0,5 3'*un
0 , 1 › , , i ,
Figura 8:
o 2 4 s s 1o 12
tiempo (lil
Cinética de crecimiento mostrada por la cepa 21 b, utilizando el medio mineral suplementado con diferentes sustratos. 9 Medio Mineral Melaza Soya (MMMS), ¡Medio Mineral Soya (MMS), øMedio Mineral Sacarosa (MMSA), AMedio Mineral Glicerol
5
45 -9-CB7AS33 -I~(ÉA34 4 -A~%A46
densidadóptica(600nm
â
2L.~J
2
1 0,5
0¬ . _ , . . ~ , , O 2 4 6 8 10 12
tiempo (11)
Figura 9. Cinética de crecimiento con 4 cepas en Mineral Melaza Soya (MMMS) 0 Cepa 33 I Cepa 34 A Cepa 46.
VL4. Identificación molecular de los cepas
Las cepas seleccionadas con base a sus caracteristicas mostradas en las cajas Petri y en los medios de cultivo liquido, todas figuraron como bacterias Gram positivas, sin embargo, mediante la utilización de técnicas moleculares, se amplificó un fragmento de 640 pb del gen l6S rDNA con un oligonucleótido especifico para el genero Bacíllus y se encontró que la cepa 1 no pertenece al género Bacillus y por consiguiente fue descartada. También, la cepa 42 fue descartada, pero la razón fue que en la mayoría de los experimentos presentó dificultad para su crecimiento (Tabla XII), Después de haber sido identificadas molecularmente como Bwcillus, los productos de PCR del gene l6S rRNA de 3 cepas candidatas, fueron purificados y secuenciados. El análisis comparativo de las secuencias mostró un porcentaje de homologia mayor o igual al 97 %, por lo cual ya podemos mencionarlas agrupadas a una misma especie (Hagström el al., 2002), quedando la cepa 31 y 33, Bacíllus megateríum y la cepa 9b, Bacillus subtílís.
VL5. Evaluación del probiótico en el alimento
encontró que los valores de la cuenta de colonias en placa, fueron similares a los anteriores, 1.15 (0.07)X105 UFC/ g de alimento.
Mediante la técnica de FISH fue posible identificar el grupo bacteriano correspondiente a bacterias Gram positivas bajas en G + C (Tabla XIII), en el cual, se encuentran clasificados organismos del género Bwcillus. En este sentido en la figura 10 a) se observó como las bacterias que se encuentran en el alimento, después de 2 horas de incubación a 30°C mostraron un metabolismo activo. En la misma figura se describe un control positivo, este consistió en seguir una curva de crecimiento bacteriano y tomar muestras a diferentes tiempos. Se Observö que a las 4 horas el crecimiento bacteriano fue mayor, sin embargo la actividad metabólica mostrada por la bacteria (fluorescencia) va disminuyendo (Figura 10 b).
Tabla XIII. Secuencia del oligonucleótido, tipo de fluorocromo y longitudes de onda empleados en la técnica de FISH, para la identificación del probiótico (Bacillus).
Grupo Oligonucleótldo Fluorocromo Bacteriano Color Emitido
¿th/Efly›_(Lm)
¬
Gram positivas ACG-GTC-TAT-AGT-CCC Carboxirodamina bajas en G+C Rojo
H)
b) 2 horas c) 4 horas
VI.6. Formulación y fabricación del alimento con probióticos El alimento basal analizado presentó una valor proteico de 27.41% (Tabla XIV), una concentración inferior a los valores recomendados para la especie L. vannamei y al mostrado por el alimento comercial Agribrands Purina (36.39%). El contenido de lípidos de la dieta basal fue de 6.46%, el cual se encuentra en el intervalo de 6 al 10 % reportado para L. vannamei (Tacon, 1999]. E1 contenido de carbohidratos fue de 49.50%, un valor mayor al mostrado por el alimento comercial. La humedad y las cenizas fueron el 11.34% y 5.29%, respectivamente.
Tabla XIV. Composición proximal de los alimentos utilizados en los experimentos.
PORCENTAJE (%]
Componente Alimento basal Älimento comercial Í
Proteina 27.41 36.39
Lípidos 6.46 3.98
Carbohidratos 49.50 38.42
Humedad 11.34 9.88
Cenizas 5.29 11,33
volúmenes de 500 ml. El tiempo de crecimiento bacteriano fue de 8 h, posteriormente, la bacteria fue incorporada al resto de los ingredientes del alimento, con un porcentaje de inclusión del 25 al 30%.
Figura 11. Fermentador utilizado para alcanzar la biomasa bacteriana utilizada en la elaboración de las dietas analizadas.
V'l.1. Diseño experimental y evaluación del alimento
Crecimiento
Los valores registrados por los pesos individuales de los organismos al concluir el experimento de evaluación del alimento presentaron una
distribución normal (Fig. 12). El análisis estadístico (ANDEVA) encontró
Bacillus subtilís 9b (B + 9b) fueron los que alcanzaron el mayor crecimiento y no tuvieron diferencias significativas con el crecimiento de los organismos alimentados con la dieta comercial (C) (p=.70), ni tampoco con la dieta B+9b+3l, en la cual se incluyeron ambas cepas bacterianas Bi subtilis y B. megateríum (p=0.055). El crecimiento de los camarones alimentados con la dieta basal (B) y La dieta suplementada con la bacteria Bwcillus megatermm (B + 31) no presentaron diferencias significativas (p>0.05) (Fig. 13)
Tabla XV. Análisis de varianza realizado a los datos de la variable peso de juveniles de camarón blanco Lítopenaeus vannamei.
Efecto Suma de g.l. Cuadrados F p
Cuadrados Medios _
60
5°
Á*
oBsERvAc¡omzs 8S8
10 i
/
' l
` / i , / 0 _
5 6
LM iì _
7 B 9 10 ll 12 13 14 FEH)
Figura 12. Gráfico de barras que detalla la distribución de frecuencias de
11,5 11,0 10,5
Pasogg) .- .OO
9,5
9,0
8,5
los valores alcanzados por la variable peso, durante el experimento de alimentación, en condiciones controladas..
Basalffin B+ai B+9b«-ai (qommfan mas 'mxrammvm
Factor de conversión alimentario [FCA]
El menor valor registrado para el FCA fue para el tratamiento B + 9 b, 1.5 (± 0.07) y los valores correspondientes a los 5 tratamientos se detallan en la tabla XVI. Mediante el análisis de varianza realizado para el valor producido de FCA de las diferentes dietas, encontramos diferencias significativas entre los tratamientos [p<0.05] (Tabla XVII). Las pruebas de Duncan, nos indicaron que los tratamientos Basal y B + 9 b, son diferentes entre si, a la vez que ambos tratamientos son diferentes a los otros 3 tratamientos, en cuanto al FCA se refiere. El FCA derivado de la utilización de las dietas B + 31, B + 9b+31 y C, no mostraron diferencias significativas (p>0.05) (Fig. 14).
Tabla XVI. Factor de conversión alimentario registrado por los juveniles de camarón blanco Litopenaeus uannameí.
Tratamiento Promedio Desviación estándar
Basal (B) 2.6 ±O.52
B + 9 b 1.5 ±0.08
B + 31 2.09 ±0.l0
Tabla XVII. Análisis de varianza realizado a los datos del factor de conversión alimentario, en el experimento de alimentación de camarón blanco Litopenaeus vannameí.
Efecto Suma de g. 1. Cuadrados F p Cuadrados __ Medios V
Tratamiento 1.50
4
0.37
' 4.87
' ` 110192
FACTORDECONVERSION 2,8 2,6 N -›
.Ñrs
3° o 'oo `o«
Figura
Error 0,769 10 0.07
1,4 1,2
Bsalfa B+s1 B+eb+:s1 (qtimmfial B+9b rRArAi\/Jnmro
14. Factor de conversión alimentario obtenido con los 5 tratamientos por juveniles de Lítopenaeus vannamei durante el experimento de alimentación.
Sobrevivencla
presentaron diferencias significativas (p=0.655) en la sobrevivencia final. (Tabla XVIII). Sin embargo, podemos decir que los juveniles de L.vannamei, alimentados con el tratamiento correspondiente a dieta basal + Bacillus subtilis, no registró mortalidad, La sobreviencia obtenida de los camarones alimentados con las otras 4 dietas, fue 93.33 (±3.84).
Tabla XVIII. Análisis de varianza realizado a los datos de sobrevivencia, registrado por los juveniles de camarón blanco Litopenaeus
uannameien el experimento de alimentación.
Efecto Suma de g.l. Cuadrados F p Cuadrados _ _ Medios ,_ _ Tratamiento 29.6 4 7,4 0.62 0,655 Error 118.5 10 11.9
Patología en fresco
Las condiciones relacionadas con la concentración de lípidos y el estado de salud de los túbulos del hepatopancreas presentaron un aspecto normal, lo que se traduce como una óptima alimentación de los organismos. En lo referente a necrosis y pigmentación del exoesqueleto, flacidez del músculo del abdomen, coloración del telson y segmentación de las antenas, no se observaron diferencias entre los juveniles de camarón provenientes de los tratamientos, por lo que podemos suponer ausencia de factores de estrés en los cultivos.
Calidad de agua
Los parámetros del agua utilizada en los experimentos se muestran en la Tabla XIX y fueron similares para todos los tratamientos y sus repeticiones.
Tabla XIX. Valores promedios de los parámetros del agua de mar utilizada en los cultivos de Lítopenweus vannamei (D,S.].
PARÁM ETRO PROMEDIO Oxígeno (mg/1] 6.4 (±0.20) Temperatura (°C) 28.5 (±2.22j Salinidad (ppm) 36.2 (±l. 19)
pH 7.6 (±0,46)
tratamientos (Tabla XX). Sin embargo, cabe mencionar que en el agua de los organismos alimentados con el tratamiento B + 9b (B. subrilis) su concentración promedio fue 0.013 mg/l (Fig. 15).
Tabla XX. Análisis de varianza realizado a los datos de concentración de amonio con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación.
Efecto Suma de g.l. Cuadrados F p Cuadrados _ Medios p
Tratamiento 0.55 4 0.138 1.78 0.208
Error 0.77 10 0.077
1,2 1,0
ii Hi Mi
ana (B1 ia + si s › cbfsi (c) comercial B « en TRM-AnicwroAmaiaff@/u _°PPii0.Q
Los valores de nitritos obtenidos por la utilización de las diferentes dietas, en el experimento de alimentación de juveniles de camarón blanco Lítopenaeus vannamei tuvieron diferencias significativas entre ellos (Tabla
XXI).
Los valores registrados de nitritos, provocados por el uso de la dieta Basal, fueron estadísticamente diferente a los tratamientos que utilizaron bacterias probióticas, B + B. megateríum (p=0.026) y B + B. subtilis (p=0.01j. Los nitritos derivados del uso de alimento comercial mostró diferencias con respecto al tratamiento B + B. subtilís, mientras que los valores de nitritos originados por el tratamiento que utilizó la mezcla bacteriana B + B. megaten`um+ B. subtilís, no mostró diferencias con ninguno de los tratamientos (Fig. 16].
Tabla XXI. Análisis de varianza realizado a los datos de concentración de nitrito, con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación
Efecto Suma de g.1. Cuadrados F p Quad:-ados__ V Medios _ _V _' V _
Tratamiento 0.328 4 0.082 3.844 0.038
047 ds as
ll t i fi
' Emu us) E + si B › 9b+31 ¡C1 comet-tia! B + en TRATAMIENTONin-¡tomg/
P2
Figura 16. Concentración de nitrito registrada del agua utilizada durante el experimento de alimentación de juveniles de camarón blanco Lítopenaeus vannamei.
Tabla XXII. Análisis de varianza realizado a los datos de concentración de nitrato con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación.
Efecto Suma de g.l. Cuadrados F p
__ Cuadrado; Medios _ _ _
Tratamiento 0.55 4 0.138 1.78 0.208
Error 0.77 10 0.077
7 s 5
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Basal ¡By B + 31 B › 9b›31 [CJ Comercial B + 91;TRATAMIENTO
Nnnwmg/n
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Figura 17. Concentración de nitrato registrada del agua utilizada durante el experimento de alimentación de juveniles de camarón blanco Lítopenaeus vannamei.
(C), fueron estadísticamente diferente a los valores que se registraron de la utilización de los otros 4 tratamientos (Fig. 18).
Tabla XXIII. Analisis de varianza realizado a los datos de concentración de fosfatos con referencia a calidad de agua durante el experimento de alimentación.
Efecto Suma de g. l. Cuadrados F p Cuadrados Medios
Tratamiento 9.79
'
' 4 '
2.447
s.š94
0.003 '
Error 2.91 10 0,291
3,5 3,0
2,5
íìiil
sm! (B) s + 31 e ¢ ami (c) com«m=|i
s › suT RATAMTENTO
retratamg/ _”_” 0.0
VL8. Prueba de estrés
Para probar el aporte proporcionado por las diferentes dietas a los camarones se realizó La prueba de resistencia provocada por la exposición paulatina a bajas concentraciones de oxigeno, reportándose una concentración inicial de oxígeno de 6.8 mg/ 1. y al finalizar el experimento [24 h) la concentración de oxigeno fue de 0.3 (± 0.1) mg/ l.
Los valores registrados cada 2 horas de concentración de oxígeno disuelto en los acuarios durante el desarrollo del experimento no mostraron diferencias significativas entre las 5 diferentes dietas (tratamientos) ni en sus repeticiones a lo largo del experimento (p=0.229), por lo que podemos decir que el efecto sobre la sobrevivencia fue aportado únicamente por el tratamiento (Dieta). En este sentido encontramos diferencias significativas para la sobrevivencia registrada de los camarones colocados en los acuarios (Tabla XXIV).
Tabla XXIV. Análisis de varianza realizado a los datos de porcentaje de sobrevivencia, registrado en el experimento de bajas concentraciones de oxígeno.
Efecto Suma de g.l. Cuadrado! F p Clmdx-ad0s__ _ Medios
Tratamiento 5416.67 4 1354.17 6.500 77 0.0076 Error 2083.33 10 208.33
120 1 10 100
soBREvivENc1A(% 83$388
30 20
10
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aaa@ amb a+a1 B+9i›+a1 (damas
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vn. Discusión
“Cepas bacterianas" Proteasas
Los microorganismos constituyen una excelente fuente productora de enzimas que presentan una gran diversidad bioquímica [Godfrey y West, l996). Las proteasas, son enzimas que catalizan la hidrólisis de proteinas y específicamente las de Bacillus, son las de mayor importancia comercial. Se utilizan en muchas áreas, tales como detergentes, alimentos, fotografia, industrias de la piel, entre otras (Kalisz, 1988); asimismo, muchas de estas enzimas se han identificado con productos a base de soya. Ogbadu, et al. (1990) identificó diferentes especies de Bacillus (B. sublilis, B. laterosporus, B. pumílus, B. breuis, B. macerans, B. licheniformís, B. polymyxa, y B. coagulans) en fermentos de frijol soya.
son generalmente altos en proteína, alrededor del 45% para harina de soya y sobre 70% para los concentrados (Hardy, 1999). La harina de soya, además de su composición proximal y bioquímica, presenta la ventaja de ser resistente a la oxidación y putrefacción, mismas que dan origen a la proliferación de hongos y bacterias que son nocivos al cultivo de camarón
(Swick, et al. 2002).
En la presente investigación mediante la utilización de cajas Petri con medio sólido agar “Salt Water Complete” (SWC) y leche descremada (“skim milk"), la actividad proteolítica de las bacterias se detectó mediante la presencia de una zona clara (halo). Las colonias que tuvieron un halo que excede 2 veces el área de crecimiento bacteriano, un halo de aproximadamente 0.90 cm?, fueron consideradas como buenas productores de enzimas tipo proteasas,
Carbohidrasas
El género Bacillus secreta una amplia variedad de enzimas que son utilizadas para hidrolizar carbohidratos, algunas presentan gran importancia económica (Debabov, 1982; Mountain, 1989; Sonnenschein et al. 1993). En nuestros estudios, para evaluar la producción de carbohidrasas, nosotros utilizamos algunos ingredientes característicos de una dieta para camarón (harina de algas, harina de maiz y harina de trigo). Cabe mencionar, que en alimentos formulados para organismos acuáticos y en especial para camarón, el principal ingrediente utilizado como fuente de energia son productos derivados de trigo. Además, el gluten de trigo, aporta proteina al organismo y constituye el mejor aglutinante natural en la fabricación de alimentos peletizados para camarón.
para el procesamiento de productos alimenticios de soya se ha demostrado (Garro et al. 1996; King et al. 1998), inclusive con enzimas producidas por Bacíllus (Delente et al. 1974; Pederson y Goodman 1980; Ganter et al.
1988; Janz etal. 1991).
Arellano y Olmos (2002), seleccionaron cepas de Bacíllus productoras de enzimas termoestables tipo glucosidasas, utilizando almidón como sustrato inductor para la producción enzimática. Cabe mencionar que Bacillus es una bacteria capaz de secretar u~ami1asa y ci-galactosidasa en medios que contienen almidón y rafinosa (Jin et al. 2001) lo que nos manifiesta la diversidad metabólica del género bacteriano. Con los bioensayos referentes a la selección de bacterias productoras de carbohidrasas, se observó que las cepas 31 y 33 son productoras de ambas enzimas, presentando la coloración azul caracteristica de la degradación del sustrato específico <1~X-Glu (Overbeeke et al., 1990). Dado lo anterior, tales cepas son consideradas como potenciales para ser utilizadas en la fabricación de dietas funcionales para camarón.
por la harina de soya, pudieran ser utilizados como un prebiótico, además de aportar energía para el camarón al ser digeridos por la bacteria. El término prebiótico, fue introducido por Gibson y Roberfroid (1995). Ellos lo definieron como “un ingrediente no~digerible del alimento que beneficia al consumidor al estimular selectivamente el crecimiento y/ o la actividad de uno o de un numero limitado de bacterias”. Puede ser inducido por la ingestión de sustancias tales como fructooligosacáridos e inulina (Gibson y Roberfroid 1995; Gibson et al. 1995) y oligosacáridos (Hayakawa et al.
l990y
posible efecto que pudieran tener sobre la proteina dietética en P, monodon. Los resultados indicaron que los camarones alimentados con almidón o dextrina mostraron mayor ganancia en peso, mayor tasa de conversión alimenticia y mejor eficiencia proteica que los organismos alimentados con glucosa. Por esta razón, muchos investigadores han sugerido el uso de carbohidratos más complejos tales como el almidón, componente que experimenta la hidrólisis enzimática antes de la asimilación, en dietas de camarón. La glucosa proveniente de almidón presenta una tasa mayor de absorción que la glucosa libre (Pascual et al.
1983; Alava y Pascual 1987; Shiau y Peng 1992; Shiau 1998),
carentes en el camarón. En este sentido, la utilización de estas bacterias en alimentos para camarón, pudieran ayudar a incrementar la digestibilidad y asimilación del alimento, ademas, el contenido energético del almidón sería utilizado en su totalidad para el metabolismo del organismo, mientras que la proteína de la dieta será biodepositada en músculo. Aunado a lo anterior, la digestibilidad total del almidón ayudaría a reducir el costo de alimento por una inclusión de proteína menor en las dietas y consecuentemente una baja cantidad de nitrógeno por alimento no consumido, disminuyendo la contaminación del cultivo.
Lipasas
1993; Jaeger et al. 1994; Svendsen et al. 1995; Gotz et al. 1998; Sharma, 2002)
En el presente estudió, se analizaron 19 cepas bacterianas, mediante un ensayo sensitivo y específico en placa (Kouker y Jaeger, 1987) con la finalidad de elegir aquellas que produjeran mayor cantidad de lipasas verdaderas, Después de 24 horas de incubación las colonias bacteriales empezaron mostrar una coloración naranja y conforme pasó el tiempo se formaron gotas del mismo color alrededor de la colonia. Las cepas que no produjeron lipasas acumularon la rodamina B y formaron colonias color rosa, pero sin la íluorescencia naranja (Fig. 4).
aceite de maiz. Lo anterior confirma que el aspecto más importante en la nutrición del camarón es el requerimiento de ácidos grasos poliinsaturados y fosfolípidos (Shiau 1998; Gonzá1ez~Félíx y Perez-Velazquez 2002).
La mayoría de los fabricantes de alimentos para organismos acuáticos utilizan ingredientes caros a base de calamar, harina de pescado, aceites/ solubles de pescado para cubrir los requisitos energéticos de los organismos. Sin embargo, la existencia de lipasas verdaderas en el hepatopáncreas de camarón todavía es un asunto de discusión entre los investigadores (Deering et al. 1996; Del Bosque 2002; Del Bosque 2003).