Aislamiento y caracterización de bacterias ácido lácticas de intestino de cerdos con potencial probiótico

Texto completo

(1)

Facultad de Ciencias Veterinarias

-UNCPBA-

Aislamiento y caracterización de bacterias ácido

lácticas de intestino de cerdos con potencial

probiótico.

Eyeralde, Ludmila; Alonso, Mónica; García, Cecilia.

Julio, 2018

(2)

Aislamiento y caracterización de bacterias ácido lácticas de intestino de cerdos con potencial probiótico.

Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del estudiante Eyeralde Ludmila Daiana.

Directora: Dra.; Alonso, Mónica Zulema

Codirectora: Dra.; García, María Cecilia.

(3)

Agradecimientos:

En primer lugar agradezco al Laboratorio de Fisiología Celular perteneciente al Departamento de Fisiopatología de la Facultad de Ciencias Veterinarias que me dio la posibilidad de realizar las prácticas para formarme profesionalmente.

En segundo lugar agradezco a mi directora, Alonso Mónica y a mi codirectora García Cecilia que me guiaron y trabajaron junto a mí para que pueda adquirir prácticas de laboratorio que enriquecieron mi formación.

A mi familia, quien siempre me apoyó y acompañó en este largo camino e hizo todo para que yo pudiera terminar mi carrera.

A mis amigos Gelfgoth Eric y Pal Silvina, quienes conocí en esta carrera y fueron parte de ella, formando entre los tres un gran grupo de estudio pudiendo salvar todos los obstáculos que se nos fueron presentando.

(4)

Índice General:

1. Introducción………....1

2. Objetivos……….3

3. Antecedentes………..4

4. Materiales y métodos………7

4.1 Muestreo………...7

4.2 Aislamiento y caracterización fenotípica………...7

4.3 Evaluación de la capacidad probiótica in vitro………...9

5. Resultados y discusión………...…....12

5.1 Aislamiento de BAL del tracto gastrointestinal de cerdos…………...12

5.2 Características fenotípicas de las colonias individuales………...12

5.3 Pruebas bioquímicas básicas de las colonias individuales……….14

5.4 Evaluación de la capacidad probiótica in vitro………..16

5.5 Actividad antimicrobiana contra patógenos productores de ETA’s..19

6. Conclusión……….20

(5)

Índice de tablas:

(6)

Resumen:

La producción porcina a nivel mundial es de aproximadamente 5 millones de toneladas, siendo la carne de mayor consumo. En el caso de Argentina se producen 552.428 toneladas y se registra un consumo de 12.88 kg/hab/año. En este tipo de producción intensiva se utilizan los antibióticos como promotores de crecimiento entre otras aplicaciones, lo que produce cierta inquietud en los consumidores, ya que el uso prolongado genera residuos en la carne. Una de las alternativas para sustituir el uso de éstos es el empleo de probióticos: como las bacterias ácido láctica (BAL) del género Lactobacillus, ya que poseen la ventaja de no dejar residuos en la carne destinada al consumo. Por lo tanto, los objetivos de este trabajo de Tesis fueron aislar y caracterizar cepas del género Lactobacillus spp. con posible potencial probiótico, identificar fenotípicamente las cepas obtenidas y evaluar la posible capacidad probiótica

in vitro. Se tomaron muestras de 8 cerdos de una granja de la zona de la ciudad de Tandil, mediante hisopados de distintas porciones del intestino (ciego, colon e íleon). Posteriormente, se realizó el aislamiento y la caracterización fenotípica mediante las pruebas bioquímicas básicas. En las cepas que presentaron características fenotípicas del género Lactobacillus, se evaluó el potencial probiótico, mediante algunas determinaciones in vitro como: el pH, sales biliares y temperaturas extremas. Además, se realizó la prueba de inhibición contra Salmonella Enteritidis. La cepa obtenida presentó características del género Lactobacillus, probióticas y actividad inhibitoria contra la bacteria productora de ETA´s.

(7)

1

1. Introducción:

La producción porcina a nivel mundial es de aproximadamente 5 millones de toneladas, siendo el tipo de carne de mayor consumo. En Argentina se producen 522.428 toneladas y registra un consumo de 12,88 kg/hab/año (MINAGRI, 2016).

En este tipo de producción la sanidad de los animales se puede ver afectada por distintos tipos de enfermedades, las cuales se propagan rápidamente y provocan pérdidas, principalmente económicas.

En el año 1940, Stokestad y Jukes descubrieron, mediante la alimentación de pollos, que el uso de antibióticos como promotores de crecimiento generaban ciertos cambios beneficiosos como: mayor ganancia de peso, mejor resistencia a infecciones y rápida conversión alimentaria.

Desde ese momento, el uso de antibióticos como promotores de crecimiento se extendió en la alimentación de diversas especies con producción intensiva, como por ejemplo, la producción porcina (Gutiérrez et al, 2013).

Entre los fármacos que se utilizan principalmente para prevenir enfermedades se encuentran los coccidiostaticos y los agentes promotores del crecimiento (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, 2000). Éstos son utilizados como aditivos que aumentan la eficiencia de los alimentos y, por ende, generan mejoras en el peso aumentándolo significativamente. El motivo por el que sucede es porque se producen modificaciones en los procesos digestivos y metabólicos de los animales (Gutiérrez et al, 2013).

Sin embargo, la resistencia a ciertas cepas bacterianas se debe al uso excesivo de antibióticos que se acumulan en la carne y esta problemática preocupó a los consumidores. A raíz de esta situación, se buscó una alternativa reemplazando los antibióticos por probióticos, siendo éstos producto naturales y sin riesgos para el consumidor (Carro y Ranilla, 2011).

Entre ellos se encuentran las bacterias ácido lácticas (BAL) del género

(8)

2

(9)

3

2. Objetivos

Objetivo general:

 Aislar y caracterizar cepas del género Lactobacillus spp. con posible potencial probiótico.

Objetivos específicos:

 Identificar fenotípicamente las cepas obtenidas.

(10)

4

3. Antecedentes:

La porcicultura moderna, caracterizada por la explotación intensiva de la producción, no está exenta de factores causantes de desequilibrios en los animales. La alta densidad de población, vacunación, altas o bajas temperaturas, humedad inadecuada, incidencia de gases tóxicos, alta carga de microorganismos patógenos e inmunodepresión, son algunas de las problemáticas causantes de altos niveles de estrés en los cerdos. Estas situaciones constantes traen consigo la aparición frecuente de diversas enfermedades y la disminución de los niveles de producción de los cerdos (Carro y Ranilla, 2011). Para contrarrestar estas problemáticas, la producción porcina implementó el uso de antibióticos como promotor de crecimiento, lo que generó cierta inquietud en los consumidores, obligando a los productores a buscar otras alternativas para sustituir el uso de los mismos. Por ejemplo el uso de probióticos.

Un probiótico se define como un “organismo vivo que ingerido en cantidades adecuadas confiere un beneficio al huésped” (FAO/OMS, 2002). Para que un microorganismo sea considerado probiótico debe cumplir ciertos requisitos como: tolerancia al pH gástrico, temperaturas y sales biliares. Además, pueden tener actividad inhibitoria contra microorganismos productores de ETA`S, entre otros. Se entiende por ETA`s al conjunto de síntomas originados por la ingestión de agua y/o alimentos que contengan agentes biológicos, que afectan la salud del consumidor (FAO/OMS, 2002). Por ejemplo, los microorganismos del género Salmonella, son causantes de graves problemas en la Salud Pública.

El uso de los probióticos se sugiere como coadyuvantes dietéticos porque benefician la fisiología del huésped al modular la inmunidad, así como mejorar el balance nutricional y microbiano en el tracto gastrointestinal (TGI) (Basualdo, 2006).

Existen numerosos microorganismos con características probióticas, dentro de los cuales se encuentran las BAL que, según el criterio taxonómico, pertenecen a la familia Lactobacillaceae, phylum Firmicutes y comprenden 20 géneros:

(11)

5

Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Devlieghere et al, 2004).

Éstas también pueden clasificarse por un criterio taxonómico fenotípico que incluye la descripción morfológica y fermentación de hidratos de carbono (Fox

et al, 2005). Se trata de bacilos largos, aunque pueden observarse bacilos cortos y cocos que, generalmente, son inmóviles y Gram positivos.

Históricamente, las BAL se incorporaban a los alimentos para prolongar la viabilidad de éstos e inhibir el crecimiento tanto de microorganismos patógenos, como de los microorganismos que producen el deterioro de los alimentos. Este efecto conservador de los productos alimenticios, se debe a la producción por parte de las BAL de sustancias inhibidoras de crecimiento como ácidos orgánicos, etanol, diacetilo, peróxido de hidrogeno (H2O2) y bacteriocinas (Pineda et al., 2012). Todos ellos con propiedades bacteriolíticas y/o bacteriostáticas que inhiben el crecimiento de otros organismos, entre ellos los patógenos (Leroy y De Vuyst, 2004).

Las BAL representan un alto potencial biotecnológico, dada su presencia en diversos procesos fermentativos de alimentos destinados al consumo humano y animal. Estas bacterias no sólo contribuyen al desarrollo de las características organolépticas de los alimentos, sino que generan ambientes poco favorables para el desarrollo de microorganismos patógenos, debido a su marcada capacidad antagonista. La mayor parte de las BAL obtienen la energía a partir del metabolismo de azúcares por lo que sus hábitats están restringidos a lugares donde estos están presentes (Agudelo, 2014). Dependiendo del tipo de catabolismo que lleven a cabo, se puede dividir este grupo de bacterias en dos subgrupos:

 Homofermentativos: realizan glucólisis y originan ácido láctico como producto final.

 Heterofermentativos: utilizan la vía de la 6 fosfo-cetolasa, generando etanol, acetato y CO2 (Parra, 2010).

(12)

6

nutricionales y de crecimiento complejo como la utilización de aminoácidos, péptidos, derivados de ácidos nucléicos, vitaminas, sales, ácidos grasos y carbohidratos fermentables. Generalmente estos requerimientos están presentes en un medio de cultivo como el MRS (Garcia Ibarra, 2007). En este medio se observan colonias blancas mucosas características. Además se ha comprobado que son beneficiosas para la salud tanto humana como animal. Sin embargo, para utilizarlos como probióticos es necesario realizar una adecuada evaluación de cepas de acuerdo con diferentes criterios de selección, de forma tal que los microorganismos colonizadores lleguen en estado viable y en cantidades suficientes una vez que han superado las barreras ácida y biliar en el tracto digestivo. De ahí que, el éxito de un probiótico depende en gran medida de realizar una buena selección de cepas que posean la capacidad de sobrevivir y adherirse a la mucosa intestinal. Por ello es importante investigar dentro de las prácticas de alimentación de los animales, la incorporación de diferentes productos biológicos que contrarresten los efectos negativos anteriormente citados.

(13)

7

4. Materiales y métodos:

4.1 Muestreo:

El ensayo se realizó en el Laboratorio de Fisiología Celular del Departamento de Fisiopatología de la Facultad de Cs. Veterinarias, UNCPBA. Se tomaron muestras en un ensayo previo de 8 cerdos de una granja de la zona de la ciudad de Tandil, mediante hisopados de distintas porciones del intestino (ciego, colon e íleon). Cada hisopo se colocó en 5 ml de caldo MRS y se incubó durante 48 hs a 37ºC en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se tomaron alícuotas de cada uno de los cultivos y se conservaron en glicerol al 30% a -70ºC (congelado inicial) (Ávila et al, 2010).

4.2 Aislamiento y caracterización fenotípica:

A partir del congelado inicial, se tomó una ansada, se sembró en placas con agar MRS y se incubaron a 37ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas básicas:

 Morfología de colonias.

 Tinción de Gram y observación en microscopio óptico.

 Prueba de la catalasa.

 Capacidad fermentativa.

 Reducción del nitrato.

4.2.1 Morfología de colonias:

(14)

8

4.2.2 Tinción de Gram y observación en microscopio óptico:

Se tomó una ansada de una colonia, se la extendió en un cubreobjetos y se la fijó en el mechero de Bunsen. Se le agregó el primer colorante, violeta de Genciana, y se lo dejó actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, se lavó con abundante agua eliminando el exceso del colorante. Luego, se le agregó lugol para fijar el colorante y se lo dejó 1 minuto, se lavó con agua y se le agregó alcohol-acetona para realizar la decoloración, dejándolo actuar 20 segundos. Se volvió a lavar con agua y por último, se colocó el segundo colorante también nombrado como colorante de contraste, fucsina o safranina; se lo dejó actuar 1 minuto y se lavó con abundante agua. Finalmente, se secó con calor. Para la observación en el microscopio óptico, se colocó una gota de aceite de inmersión y se realizó la observación con un aumento de 100 X.

Según las características de la pared, se pueden observar bacterias teñidas de color violeta, indicando que son Gram positivas o teñidas de color fucsia indicando que son Gram negativas (Mac Faddin, 1980).

4.2.3 Prueba de la catalasa:

(15)

9

4.2.4 Capacidad fermentativa:

Una ansada se colocó en un tubo con caldo MRS modificado sin citrato con campana de Durham y se incubó a 37 ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia.

Si el microorganismo es homofermentativo, no se observa burbuja en la campana, ya que solo produce ácido láctico. Si es heterofermentativo, produce burbuja, ya que genera además dióxido de carbono y ácido acético (Mac Faddin, 1980).

4.2.5 Reducción del nitrato:

Cada colonia se sembró por punción en agar nitrato-glucosa y se incubó a 37ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia.

Si el medio cambia su color de verde a amarillo indica que utiliza glucosa. Posteriormente, se añadieron los reactivos (α-naftilamina y ácido sulfanílico) y se observó si varió la coloración de los mismos. La desnitrificación es un proceso metabólico que usa el nitrato como aceptor terminal de electrones. Si el microorganismo reduce el nitrato a nitrito, los reactivos adquieren una coloración rojo intenso, de lo contrario no se observa cambio de color (Mac Faddin, 1980).

4.3 Evaluación de pruebas que indicarían capacidad probiótica in vitro:

(16)

10

4.3.1 Crecimiento a diferentes temperaturas:

Se tomó una ansada del CR y se sembró en tubos con caldo MRS e incubó a 15ºC, 37ºC y 45ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se evaluó la turbidez de cada tubo y se determinó viabilidad sembrando una alícuota en agar MRS durante 48 hs, en condiciones de microaerofilia (Rondón et al, 2008). Se utilizaron diferentes temperaturas para evaluar la viabilidad bacteriana a temperatura óptima y a temperaturas extremas.

4.3.2 Crecimiento a distintos pH:

Se tomó una ansada de cada CR, se colocó en caldo MRS ajustado con HCl a pH 2 y pH 4 e incubó a 37ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se observó si los tubos presentaban turbidez y se determinó la viabilidad mediante siembra en placa en agar MRS a 37ºC, durante 48, hs en condiciones de microaerofilia (Rondón et al, 2008).

4.3.3 Tolerancia a sales biliares:

Se tomó una ansada del CR y se la colocó en tubos con caldo MRS con una concentración de sales biliares al 0,15%. Estos tubos se incubaron a 37ºC durante 24 hs en condiciones de microaerofilia. Posteriormente, se observó turbidez y se determinó la viabilidad de las colonias, sembrando una alícuota en placa con agar MRS incubando 48 hs a 37ºC en condiciones de microaerofilia (Rondón et al, 2008).

4.3.4 Actividad antimicrobiana contra patógenos productores de ETA’s:

(17)

11

La cepa de S. Enteritidis se suspendió en una solución salina con una turbidez de 1 de la escala de Mc Farland. Se sembró masivamente en agar nutritivo y se realizaron los cilindros en el agar solidificado.

Las cepas de Lactobacillus se reactivaron en caldo MRS a 37ºC durante 48 hs en condiciones de microaerofilia (cultivo bacteriano: CB). Una alícuota del CB, se centrifugó a 10.000 rpm durante 15 minutos para obtener el resuspendido libre de células (RLC). Posteriormente, se sembró una alícuota de 100 µl del CB y del RLC en cada cilindro por duplicado. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 hs en condiciones de aerobiosis.

(18)

12

5 Resultados y discusión:

5.1. Aislamiento de BAL del tracto gastrointestinal de cerdos:

Todos los hisopados de diferentes porciones de intestino (ciego, colon e íleon) crecieron tanto en caldo, observándose turbidez, como en placa.

5.2. Caracterización fenotípica de las colonias individuales:

Las muestras de ciego, colon e íleon presentaron diferente morfología de colonias. Se observaron colonias grandes y pequeñas, con distintas texturas, mucosas, de color blanco (mayor tamaño) y transparentes (menor tamaño). En algunos casos se observó una pátina en la placa.

En cuanto a la observación al microscopio óptico, se pudieron observar distintas morfologías bacterianas: cocos, cocobacilos y bacilos, tanto Gram + como Gram – (Tabla 1).

Comparando los resultados obtenidos con los expuestos por Ávila, en su trabajo de capacidad probiótica de cepas del género Lactobacillus extraídas del tracto intestinal de animales de granja, podemos decir que obtuvieron, en su mayoría, morfologías del tipo bacilo a diferencia con nuestros resultados donde también se obtuvieron cocos (Ávila et al., 2010).

(19)

13 Tabla 1: Caracterización fenotípica de las colonias

Animal Gram Morfología de las colonias

encontradas en la placa

Morfología al microscopio

1 (cie) + Colonias blancas grandes mucosas y

colonias chiquitas transparentes.

Cocos en racimos G+ y bacilos G-.

1 (col) Crecimiento exagerado, colonias

transparentes, levaduras.

No se pudo realizar.

1 (ile) + Crecimiento exagerado, colonias

transparentes.

Cocobacilos y bacilos.

2 (cie) + Crecimiento exagerado, colonias

transparentes.

Cocobacilos, cocos y bacilos.

2 (col) Crecimiento exagerado, colonias

transparentes.

No se pudo realizar.

2 (ile) Colonias blancas mucosas. No se pudo realizar, todas las

colonias eran catalasa +.

3 (cie) Descarte. Descarte.

3 (col) + Morfología variada. Bacilos G+ y G-.

3 (col) - Morfología variada. Bacilos largos.

3 (ile) Colonias transparentes. No se pudo realizar.

4 (cie) + Colonias transparentes. Bacilos cortos en abundancia.

4 (col) + Colonias transparentes. Bacilos cortos en abundancia G+

y G-.

4 (col) + Colonias blancas mucosas, hongos y

patina.

Cocobacilos.

4 (ile) + Cocobacilos G+ y G-.

5 (cie) + Colonias pequeñas, homogénea,

crecimiento masivo, no hay patina.

Cocos.

5 (col) + Pocas colonias medianas blancas

mucosas, patina muy transparente.

Cocobacilos.

6 (cie) + Colonias blancas mucosas chicas,

colonias transparentes/translucidas, levadura

Cocobacilo G+ y pocos G-.

7 (cie) + Mucho crecimiento, colonias blancas

mucosas medianas, colonias translucidas.

Cocos.

7 (col) + Cocos.

7 (col) + Menos crecimiento, colonias blancas

mucosas medianas, colonias translucidas

Bacilos G+ y G-.

7 (ile) + Cocobacilos.

8 (cie) + Mucho crecimiento, colonias pequeñas

blancas mucosas y patina translucida.

Cocos G+ y bacilos G-.

8 (col) - Menor crecimiento, colonias pequeñas

blancas mucosas.

Cocos.

(20)

14

5.3 Pruebas bioquímicas básicas de las colonias individuales:

Se seleccionaron 6 colonias con características del género Lactobacillus para realizar las pruebas bioquímicas básicas.

Todas fueron Gram positivas, catalasa negativa y nitrato negativo, mientras que una sola colonia fue heterofermentativa (Tabla 2).

Estos resultados son similares a los obtenidos en los trabajos de Vélez Zea, donde todas las cepas seleccionadas fueron catalasa negativas, y no se observó la producción de burbuja en presencia del peróxido de hidrogeno, debido a que las BAL del género Lactobacillus carecen de la enzima (Vélez Zea, 2014).

En cuanto a capacidad fermentativa, en el trabajo de Ávila se observaron coincidencias con los resultados de nuestro trabajo de Tesis, donde las bacterias estudiadas tenían la capacidad de fermentar varios hidratos de carbono como así también algunas bacterias sólo fermentaban un solo tipo de carbohidratos (Ávila et al, 2010). Sin embargo el trabajo de Zamudio, reportó diferencias ya que todas las bacterias eran heterofermentativas, mientras que en nuestro trabajo solamente una presentó esa característica (Zamudio et al, 2003).

(21)

15 Tabla 2: Pruebas bioquímicas básicas de colonias seleccionadas.

Animal Gram Catalasa Nitrato Capacidad fermentativa

4 (cie) + - - Heterofermentativa

4 (cie) + - - Homofermentativa

4 (col) + - - Homofermentativa

5 (col) + - - Homofermentativa

6 (col) + - - Homofermentativa

7 (cie) + - - Homofermentativa

Cie: ciego; Col: colon; Ile: íleon.

5.4 Evaluación de la capacidad probiótica in vitro:

Se evaluó el potencial probiótico de las 6 colonias mencionadas anteriormente. Se observó que, si bien las pruebas se realizaron in vitro, se trabajó en contextos que pretenden simular las condiciones gástricas.

5.4.1 Crecimiento a diferentes temperaturas:

A las 24 hs se observaron resultados similares en las temperaturas extremas (15ºC y 45ºC), la mitad de las muestras no creció y el resto presentaron colonias pequeñas; mientras que a 37ºC se observó mayor crecimiento.

A las 48 hs todas las muestras presentaron crecimiento a las tres temperaturas, observándose colonias blancas y transparentes de tamaño pequeño. Algunas muestras presentaron contaminación y/o pátina (Tabla 3).

(22)

16 Tabla 3: Crecimiento a diferentes temperaturas (15ºC, 37ºC y 45ºC) en caldo y agar MRS durante 24 y 48 horas.

Cie:ciego; Col:colon; Ile:íleon; S/:sin; -:muestra contaminada.

Animal 24 horas 48 horas

15ºC 37ºC 45ºC 15ºC 37ºC 45ºC

4 (cie) S/ crecimiento Colonias

pequeñas

S/ crecimiento Pátina Pátina Pátina

4 (col) S/ crecimiento No creció S/ crecimiento Pocas colonias

pequeñas transparentes Colonias pequeñas blancas Colonias medianas y blancas

4 (col) S/ crecimiento No creció S/ crecimiento Colonias blancas

pequeñas Colonias pequeñas blancas Colonias blancas pequeñas

5 (col) Colonias pequeñas

y transparentes Colonias blancas Colonias blancas y pequeñas Colonias blancas pequeñas Colonias blancas patina transparentes Colonias blancas pequeñas

6 (cie) Colonias pequeñas

blancas Colonias pequeñas blancas Colonias blancas Colonias blancas pequeñas Colonias pequeñas blancas Pátina

7 (col) Colonias blancas

grandes y mucho crecimiento

-

Colonias

blancas y crecimiento

masivo.

(23)

17

5.4.2 Crecimiento a distintos pH:

A las 24 hs de incubación a pH 2, se observó crecimiento en dos muestras solamente, mientras que a pH 4 todas crecieron. A las 48 hs se registró mayor desarrollo en ambos pH (Tabla 4).

Los resultados obtenidos coinciden con el trabajo deÁvila, observándose que, al incrementar las condiciones ácidas, el crecimiento se reduce significativamente (Ávila et al, 2010).

En el trabajo de tesis de Vélez Zea, los resultados obtenidos fueron similares a nuestro trabajo de investigación. Comprobando que un microorganismo para ser probiótico, debe tener una viabilidad alta a las concentraciones ácidas del estómago (Vélez Zea, 2014).

En el trabajo de Jurado se puede observar que, exponiendo las bacterias a pH extremos como 2, 3 y 4 similares a los evaluados en este trabajo, no hubo crecimiento alguno (Jurado et al, 2009).

Tabla 4: crecimiento a distintos pH

Animal 24 hs.

pH2 pH4

48 hs.

pH2 pH4

4 (cie) s/ crecimiento Colonias

blancas pequeñas Colonias blancas medianas Colonias pequeñas blancas

4(cie) s/ crecimiento Colonias muy

pequeñas

s/ crecimiento Colonias grandes blancas

4(col) s/ crecimiento Colonias

pequeñas transparentes Y blancas Colonias blancas medianas Colonias pequeñas blancas

5(col) s/ crecimiento Colonias

transparentes y blancas Colonias blancas Patina y colonias pequeñas blancas

6(cie) Colonias

blancas pequeñas Colonias blancas pequeñas Colonias blancas Colonias pequeñas blancas

7(col) Colonias

blancas grandes

-

-

-

(24)

18

5.4.3 Tolerancia a sales biliares:

El 50 % de las muestras no presentó crecimiento a las 24 hs de incubación, mientras que la mayoría lo desarrolló a las 48 hs (Tabla 4).

Los resultados de este trabajo de Tesis son similares a los reportados por Ávila, quienes obtuvieron crecimiento de Lactobacillus en las mismas condiciones utilizadas en el presente ensayo (Ávila et al, 2010).

En 2003 Brizuela, determinó la tolerancia de los probióticos que crecen en presencia de altas concentraciones de bilis (0,15%), mayores a las que se pueden encontrar en el intestino (Brizuela, 2003). Esta característica se puede correlacionar con la supervivencia in vivo en el tracto gastrointestinal, después de permanecer durante 4 horas en caldo MRS, que es el tiempo más extremo de permanencia en dicho sistema, ya que en condiciones normales el tiempo de permanencia es de 2 a 4 horas.

En el trabajo de Jurado, se analizaron concentraciones superiores a las de nuestro estudio (10%), observándose que el 50 % de las bacterias crecieron, al igual que en nuestro trabajo de Tesis (Jurado et al, 2009).

Tabla 5: Tolerancia a sales biliares.

Animal 24 horas 48 horas

4 (cie) No creció Pátina

4 (cie) No creció Colonias pequeñas blancas

4 (col) No creció Colonias pequeñas blancas

5 (col) Colonias blancas y

transparentes pequeñas

Colonias pequeñas blancas

6 (cie) Colonias pequeñas blancas Colonias pequeñas blancas

7 (col)

-

-

(25)

19

5.5 Actividad antimicrobiana contra patógenos productores de ETA’s:

En base a las características fenotípicas y las pruebas probióticas in vitro, se seleccionó la cepa 6 (cie) para evaluar su capacidad inhibitoria contra patógenos productores de ETA`s como Salmonella Enteritidis.

Tanto el cultivo bacteriano (CB) como el resuspendido libre de células (RLC) de la colonia seleccionada, presentaron actividad inhibitoria contra patógenos productores de ETA´s.

Los halos promedio de inhibición para el CB fueron de 1,55 cm y para el RLC fueron de 1,35 cm.

Estos datos coinciden con los reportados por Sánchez y Tromps, quienes observaron que cepas de Lactobacillus aisladas presentaron halos de inhibición contra Salmonella typhimirium(Sánchez y Tromps, 2014).

También, los resultados coinciden con lo expuesto por Vélez Zea, donde la actividad bactericida se detectó con la formación de halos de inhibición de 7 mm aproximadamente, representada por zonas claras sin crecimiento de colonias de Salmonella Thipymurium (Vélez Zea, 2014).

(26)

20

6. Conclusiones:

En este trabajo de Tesis se caracterizaron fenotípicamente bacterias del género Lactobacillus, provenientes del tracto gastrointestinal de cerdos de la zona de Tandil, mediante pruebas bioquímicas básicas.

(27)

21

7. Bibliografía:

- Agudelo Londoño, N. (2014).Tesis doctoral: Estado del arte de la obtención de bacteriocinas a partir de bacterias ácido lácticas y su aplicación en la industria de alimentos. Universidad Pontificia Bolivariana. Medellín, Colombia.

- Ávila, J.; Ávila, M.; Tovar, B.; Brizuela, M.; Perazzo, Y.; Hernández, H. (2010). Capacidad probiótica de cepas del genero Lactobacillus extraídas del tracto intestinal de animales de granja. Revista científica, FCV-LUZ. 20(2), 161-169, 2010.

- -Basualdo, J. A.; Coto, C. E.; De Torres, R. A. (2006). Tinción de Gram, pp.59. En: Microbiología biomédica (ed) Atlante Argentina, Buenos Aires. - Bergey, J.; Hendriks, D. and Holt, J. (2000). Bergey's manual of determinative bacteriology. Sneathy Stanley, J. T. (Eds.).Ed. The Williams and Wilkins Co. Philadelphia. 787 p.

- Brizuela, M.A. 2003. Selección de cepas de bacterias ácido lácticas para la obtención de un preparado con propiedades probiótica y su evaluación en cerdos. [Tesis doctoral] La Habana: Instituto Cubano de los Derivados de la Caña de Azúcar, ICIDCA, Facultad de Ciencias Veterinarias.

- Carro M. D., Ranilla M.J. (2011). Los Aditivos Antibióticos Promotores del Crecimiento de los Animales: Situación Actual y Posibles Alternativas. Departamento de Producción Animal I. Disponible en:

http://www.produccionanimal.com.ar/informacion_tecnica/invernada_pro

motores_crecimiento/00 invernada_promotores_del_crecimiento.htm.

(28)

22

- Devlieguere F., Vermeiren L., Debevere J. J, (2004). New preservation technologies possibilities and limitations. Rev int dairy. J 14- 273-285.

- FAO/OMS. (2002). Probióticos de los alimentos. Propiedades saludables y nutrición y directrices para la evaluación (ISSN 1014-2916). Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. Roma. Disponible en el URL:

ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0512s/a0512s00.pdf. (fecha de consulta:

15/8/2016).

- Fox S. 2005. Probióticos en la nutrición animal. Mundo Porcino- No 17 Ene-Feb 1994. 28-32p.

- García Ibarra, J. A. (2007). Identificación de bacterias ácido lácticas mediante perfiles de fermentación y ribotipificación. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo. Hidalgo.

- Gutiérrez, Ramírez L, A; Montoya O, I; Zea J, M. (2013). Probióticos: una alternativa de producción limpia y de remplazo a los antibióticos promotores de crecimiento en la alimentación animal. Vol.8, No.1. 135 – 146.

- Jurado, H; Aguirre, D; Ramírez, C. (2009). Caracterización de bacterias probióticas aisladas del intestino grueso de cerdos como alternativa al uso de antibióticos. Rev.MVZ Córdoba 14. pp:1723-1735.

- Leroy, F., & De Vuyst, L. (2004). Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry. Trends in Food Science & Technology, 15(2), 67-78.

(29)

23

- Rondón, A.J; Samaniego, L.M; Bocourt, R; Rodríguez, S; Milián, G; Ranilla, M.J; Laurencio, M; Pérez, M. (2008). Aislamiento, identificación y caracterización parcial de las propiedades probióticas de cepas de

Lactobacillus spp. procedentes del tracto gastrointestinal de pollos de ceba. Ciencia Tecnología Alimentaria6, 56-63.

- MINAGRI (Ministro de Agricultura, Ganadería y Pesca). (2016). Boletín

porcino. Disponible en el URL:

http://www.minagri.gob.ar/site/ganaderia/porcinos/02Informes/_archivos/

000005-Anuario/140000-Anuario%202014.pdf. (fecha de consulta

11/5/1026).

- Parra Huertas, R. A. (2010). review lactic acid bacteria: functional role in the foods. Biotecnología en el Sector Agropecuario y Agroindustrial, 8(1), 93-105.

- Pineda, D., Carolina, M., Zambrano Esguerra, C., & Caberio, K. (2012). Tesis (Ingeniería de Producción Agroindustrial). Evaluación del efecto conservador de la aplicación directa de Lactobacillus casei y de sustancias blis sobre carne bajo condiciones de refrigeración.

- Sánchez, L. Tromps, J. (2014). Caracterización in vitro de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico. Rev. Salud Anim. Vol. 36 No. 2: 124-129.

- Tuomola EM, Crittenden R, Playne M, Isolauri E, Salminen SJ. Quality assurance criteria for probiotic bacteria. Am J Clin Nutr 2001; 73: 393– 398.

(30)

24

Figure

Actualización...