Inhibición del crecimiento de Escherichia coli por
bacterias ácido lácticas: presencia de quórum sensing?
Catalina Aguilar1 y Bernadette Klotz2
Facultad de Ingeniería. Grupo de Investigación: Procesos Agroindustriales. Campus Puente del Común, Universidad de la Sabana.
Autopista Norte Km 21. Chía, Cundinamarca, Colombia. Teléfono: 8615555 ext.: 2513/2532.
RESUMEN
Estudios preliminares evidenciaron que en cocultivos de Lactobacillus plantarum WS4174 o de Lactobacillus plantarum LB279 con Escherichia coli iniciados a iguales concentraciones (2 log10 UC/mL), el crecimiento del patógeno se reducía en 3 ciclos
logarítmicos. Sin embargo, en este trabajo, al iniciarlos a distintas concentraciones, se obtuvo un comportamiento diferente y las curvas de crecimiento demostraron que la inhibición de E. coli no estaba directamente correlacionada con falta de nutrientes, bajo pH o acumulación de tóxicos. Y aunque la acción antagónica de ácido láctico sin disociar o de bacteriocinas no puede descartarse, una respuesta dependiente de la densidad poblacional (quórum sensing) parece estar involucrado en el mecanismo de inhibición.
Palabras clave: Lactobacillus plantarum, Escherichia coli, bacterias acidolácticas.
I. INTRODUCCIÓN
Debido a sus características fermentativas y antagónicas, las bacterias ácido lácticas (BAL) han adquirido un fuerte interés por parte de la industria alimentaria, para su aplicación en procesos de biopreservación, como cultivos biocontroladores de flora deteriorativa y patógena. Estas condiciones, además de incrementar la vida comercial y la seguridad microbiológica de los alimentos, traen beneficios para la salud, por sus propiedades probióticas, ampliamente reconocidas1. Las BAL protegen directamente a los alimentos de microorganismos patógenos y alteradores produciendo ácido láctico, peróxido de
hidrógeno, diacetilos2, compuestos antifúngicos3,4, ácido fenilacético5,6 y bacteriocinas7, entre otros, siendo éstas últimas potenciales sustitutos naturales de los preservantes químicos que hoy en día se usan en alimentos. Sin embargo, existe evidencia que el comportamiento microbiano dependiente de la densidad poblacional conocido como Quorum sensing o fenómenos de autoinducción, también podría estar implicado en dicho antagonismo.
quórum sensing en diversos procesos celulares: la bioluminiscencia8,27 la formación de esporas 9 la movilidad10,11, competencia microbiana 12, procesos de conjugación13, síntesis de antibióticos14,15,
virulencia16,17,18, producción de bacteriocinas19 y formación de bio películas20,. Sin embargo, estos fenómenos de autoinducción han sido poco estudiados a nivel alimentario y se han restringido principalmente a los campos clínicos y farmacéuticos. Por esta razón y en busca de aportar nuevas hipótesis al mecanismo de inactivación de las BAL frente a patógenos en alimentos, se propone en este estudio determinar el efecto de la densidad poblacional sobre el comportamiento grupal de poblaciones bacterianas de Escherichia coli que se encuentran en cultivo mixto con BAL, cuyos co-cultivos son iniciados a diferentes concentraciones celulares.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Selección de cepas y estandarización de inóculos.
Lactobacillus plantarum WS4174, L. plantarum LB279 y E. coli ECO25 fueron aisladas de productos lácteos. La actividad antimicrobiana de las BAL contra la cepa indicadora fue determinada mediante el método “spot-on-lawn” 22, 23,24. Los sobrenadantes de cultivos individuales de L. plantarum WS4174 presentaron actividad antimicrobiana frente al patógeno mientras que L. plantarum LB279 sólo la presentó a partir de sus sobrenadantes provenientes de cultivos mixtos con el patógenos. Se utilizó como inóculo inicial cultivos en fase estacionaria (24 h) desarrollados en caldo MRS con concentraciones de 1.0 x 109 a 1.6 x 109 UFC/mL.
2.2 Generación de curvas de crecimiento
Se construyeron curvas de crecimiento de 34 horas a 37°C en caldo MRS a partir de los cultivos individuales y mixtos de las tres cepas estudiadas con al menos 54 datos experimentales provenientes de tres experimentos independientes.
Adicionalmente, para cada una de las curvas desarrolladas, se obtuvo el perfil del pH a través del tiempo. La media de los datos de las curvas de crecimiento en co-cultivo de E. coli con L. plantarum WS4174 y con L. plantarum LB279 presentaron desviaciones estándar entre 0.16 y 0.246, y 0.009 y 0.151 respectivamente
2.3 Análisis estadístico.
Los datos experimentales se analizaron mediante ANOVA (p <0.05) y test de Tukey (nivel de significancia de 5%) con el programa estadístico SPSS (versión 13.0, SSPS Inc, Chicago).
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (h)
log C
F
U
/m
L
2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
pH
Figura 1. Curvas de crecimiento de E. coli en cultivos individual y mixtos con el perfil de pH.
♦ Cultivo individual, ▲ Co-cultivo con L. plantarum WS4174, ▲ Co-cultivo con L. plantarum LB279, — pH de cultivo individual, --- p<h de co.cultivo con L. plantarum WS4174 ---- pH
de co-cultivo conL. plantarum LB279.
Para determinar la participación del quórum sensing en el mecanismo de restricción del crecimiento de E. coli en presencia de BAL, los co-cultivos fueron iniciados con diferentes concentraciones celulares (BAL:E. coli). La figura 2 muestra que el comportamiento poblacional no puede explicarse directamente por la acción de factores producidos por las BAL como ácidos, decrecimiento del pH y/o producción de bacteriocinas. El cultivo simultáneo de E. coli con BAL redujo el crecimiento de la cepa patógena pero la densidad celular de las BAL en las curvas no afectó significativamente el patrón de
crecimiento de E. coli. Cuando los cultivos se generaron con concentraciones iniciales de 2.5 y 4.5 log10 UFC/mL de E. coli, la población
bacteriana creció a una concentración máxima de 6 log10 UFC/mL con una
tendencia a decrecer después de 15 h de incubación. Esta fase de muerte estuvo más marcada cuando los co-cultivos se iniciaron con concentraciones de 6.5 log10 UFC/mL del patógeno, donde
únicamente se obtuvo una concentración máxima de 7 log10 UFC/mL después de 5
.Figura 2. Curvas de crecimiento en cultivo mixto de BAL y Escherichia coli iniciados a diferente concentración celular
A: Co-cultivos con L. plantarum WS4174 (s.d. 0.016-0.247). B: Co-cultivos con L. plantarum LB279. (s.d. 0.009-0.151). 1: Concentración inicial (CI) de BAL 2 log10 CFU/mL.
2: CI de BAL 4 log10 CFU/mL. 3: CI de BAL 6 log10 CFU/mL. ♦ : CI de E. coli 2 log10
CFU/mL, ♦ CI de E. coli 4 log10 CFU/mL, ♦CI de E. coli 6 log10 CFU/mL. (s.d.: desviación
estándar).
Los resultados obtenidos muestran (1) que el crecimiento de E. coli estuvo restringido directa o indirectamente por las BAL y (2) que el patógeno parece tener un propio sistema de respuesta que se activa bajo la interacción de pequeñas moléculas difusibles de señalamiento (autoinductores) que permitieron la comunicación intercelular25. Estos autoinductores se difunden desde las células bacterianas y se acumulan en el ambiente como una función del crecimiento celular. Y así, cuando determinada concentración celular es alcanzada por una población (para este caso entre 5 y 6 log10 UFC/mL), las
señales comienzan a secretarse y sirven como inductores para regular la transcripción de ciertos genes. La entrada a fase estacionaria a nivel bacteriano está regulada en gran parte por el regulador transcripcional σs, el cual
afecta positiva o negativamente la expresión de más de 50 genes26. En este caso, con los resultados obtenidos, se puede decir que la fase estacionaria no fue inducida por agotamiento de nutrientes o factores extrínsecos, pero sí por factores asociados a la fisiología de las BAL o de E. coli en co-cultivo que pueden estar mediados por fenómenos de quórum sensing.
B
1 2 3
V. CONCLUSIONES
El mecanismo exacto de la inhibición del crecimiento del patógeno, así como la participación de todos los factores involucrados en estas interacciones no están completamente elucidados. Y aunque la producción de ácidos y/o bacteriocinas por parte de las BAl son principalmente los factores asociados a estos fenómenos, otros sistemas como las señales del quórum sensing también pueden estar involucrados. Finalmente, con los resultados obtenidos de este estudio, se soporta una vez más el uso y aplicación de BAL en los procesos de biocontrol para la industria alimentaria.
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AGRADECIMIENTOS
